CN107541512A - 两个花药发育特异启动子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及两个花药发育特异启动子及应用。从拟南芥哥伦比亚野生型中得到两个花药后期高效特异表达并能受到高温诱导表达的启动子PAtCKL2和PAtCKL7，这两个启动子的核酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。这两个启动子在花药发育后期特异高效表达。通过高温处理启动子PAtCKL2和PAtCKL7的转基因拟南芥植株，表明在高温胁迫下PAtCKL2和PAtCKL7启动子能驱动GUS基因在拟南芥花药的早期组织中表达。还公开了所述启动子构建的表达盒的结构以及其在拟南芥和各作物中的基因工程改良，以最终创制雄性不育系或者改良高温胁迫下对雄性生殖器官发育的调控的应用。

Description

两个花药发育特异启动子及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及两个花药发育特异启动子(PAtCKL2和PAtCKL7)及应用。所述的启动子是从野生型哥伦比亚拟南芥的花药后期中分离得到。这两个启动子驱动目的基因在花药后期高效特异达，在开花当天的花药中的表达量达到最高，且受到高温诱导后能在花药的早期组织中表达。

本发明还涉及拟南芥花药发育特异、高效表达启动子的制备，含有该启动子的植物表达载体与转化子，还涉及该启动子在拟南芥转化和棉花遗传改良中的的应用，本发明的启动子可用于高温胁迫下对雄性发育的调控及雄性不育系的创制。

背景技术

随着全球气候变暖，高温逆境已成为影响作物生产的主要因子之一。植物器官发育对环境温度的变化十分敏感，高温会导致生殖器官的发育异常。雄性生殖器官对于环境温度变化的敏感程度高于雌性生殖器官，特别是雄蕊，发育时期的极端温度都会导致雄蕊或雄配子发育异常造成雄性不育。现有很多关于高温胁迫导致雄性不育的报道，如大麦、拟南芥、水稻和棉花。因此，响应高温胁迫和花中优势表达的基因对雄性发育的调控及雄性不育系的创制有重要作用。

植物生长在外界环境中，它们调节不同基因在时间和空间上有序表达，从而保持其正常的生长发育过程。真核生物对基因的表达和调控有多种调节方式。真核基因从DNA到翻译为蛋白质的过程中，会在DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译水平及翻译后加工水平等环节进行调控。其中，高等植物基因的调控主要是在转录水平上进行的。

启动子是一段位于基因编码区上游的DNA序列，包含能够结合调节基因转录的顺式作用元件。转录因子又称反式作用因子，是能与启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合的蛋白质。在植物的环境胁迫的过程中，转录因子与顺式作用元件相互作用，从而引起基因时空性地表达或抑制表达。所以启动子的分离和功能分析对通过基因工程手段对农作物进行遗传改良有重要作用。

植物基因工程中常用到的启动子按其作用方式和功能分为3类：组成型、组织特异型以及诱导型启动子。通过基因工程手段对农作物进行遗传改良，就需要基因在植物体内以高度受控的方式表达，也就是能调控基因在植物特异组织的特定发育时期表达，从而调节植物特定组织的发育和对环境的适应。

在改良植物花的遗传工程中，让基因在花中特异表达有很多优点：首先，外源基因的特异表达是保存受体植株能量的一种有效方式，并且可以高效地表达；其次，可以减少基因在非花组织表达而引起的负面影响。此外，可以通过非生物因子来调控基因的表达，如在高温胁迫下，通过调控基因在花中的表达时间以及表达水平来调节花发育。

目前，还很少有花药发育特异高效表达并且受到高温诱导表达的启动子，用这样的启动子驱动特异基因的表达也是基因工程改良途径之一。

1969年，Pinna等将酪蛋白激酶分为Ⅰ型酪蛋白激酶(Casein Kinase I，CKI)和Ⅱ型酪蛋白激酶(CaseinKinase II，CKII)两类。I型的酪蛋白激酶(CKI)是一类在真核生物中广泛存在且高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与多种细胞功能及发育过程的调节，对生物的生长发育起着重要的作用。

已有研究结果显示，CKI基因表达、囊泡运输、细胞生长及形态建成、细胞周期、细胞增殖和DNA修复、Wnt、Hedgehog多种信号途径等方面中发挥着重要作用。近年来，随着植物中越来越多的CKI分离、鉴定出来，CKI等植物中的功能等研究被相继报道。

水稻酪蛋白激酶基因OsCKI1组成型表达，并受油菜素内酯(brassinosteroid,BR)和脱落酸(abscisicacid,ABA)诱导表达，影响根的发育。此外，在水稻分离出的另一个CKI基因，可以通过磷酸化DELL蛋白SLENDER RICE1(SLR1)负调控赤霉素(GA)信号路径和heading date 7(Ghd7)基因来调节花期。最新的研究表明，在高温胁迫下，棉花的一个CKI基因在花药绒毡层细胞和小孢子中提前表达。该基因在拟南芥中超量表达后可使花药绒毡层细胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)延迟发生，最后引起花粉发育延缓和花药不开裂。

本发明所述拟南芥casein kinase 1-Like 2(AtCKL2)和casein kinase 1-Like 7(AtCKL7)也是Ⅰ型酪蛋白激酶家族的成员。通过TAIR数据库(The Arabidopsis Information Resource,http://www.arabidopsis.org/)，检索到了AtCKL2和AtCKL7基因的启动子序列。这两个启动子驱动目的基因在花药后期高效特异表达，在开花当天的花药中的表达量达到最高，且受到高温诱导后能在花药的早期组织中表达。

发明内容

本发明的目的在于克服现有花药发育启动子的不足，鉴定出在花药后期高效特异表达并能受到高温诱导表达的启动子PAtCKL2和PAtCKL7，并将这些启动子应用到作物的基因工程改良，以最终创制雄性不育系或者改良高温胁迫下对作物雄性发育的调控。

本发明通过下列技术方案实现：

申请人通过基因克隆方法，从拟南芥哥伦比亚野生型中得到的两个花药后期高效特异表达并能受到高温诱导表达的启动子PAtCKL2和PAtCKL7，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

与此同时，申请人获得了花药后期高效特异表达的启动子PAtCKL2和PAtCKL7的表达载体pGWB433-PAtCKL2和pGWB433-PAtCKL7，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

含有本发明启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述植物表达载体具体为包含有如图8所示表达盒的表达载体或将其它元件替换但包含PAtCKL2和PAtCKL7启动子的表达载体，以及含有PAtCKL2和PAtCKL7启动子的其它植物表达载体。

本发明的有益效果如下：

通过TAIR数据库(The Arabidopsis Information Resource,http://www.arabidopsis.org/)，检索到了基因AtCKL2(登录号为AT1G72710)和AtCKL7(登录号为AT5G44100)的启动子序列，并对其完成了分离克隆、功能验证。

(1)虽然在动物中克隆到了许多Ⅰ型酪蛋白激酶基因，但目前在植物中对于Ⅰ型酪蛋白激酶基因的研究报道还很少，而在启动子水平上的报道更少。本发明克隆的AtCKL2和AtCKL7基因启动子丰富了植物中对这类基因的研究。

(2)目前，还很少有花药发育特异高效表达并且受到高温诱导表达的启动子，本发明克隆的AtCKL2和AtCKL7基因启动子是花药特异高效表达并且受高温诱导表达的启动子。

(3)本发明的AtCKL2和AtCKL7基因启动子在高温胁迫下，驱动目的基因在花药发育的stage9时期就有表达，由此可以用于高温胁迫下对雄性发育的调控。

(4)植物雄性不育是指植物雄性生殖器官不能产生正常功能的雄配子,如花药中无花粉、花粉败育和不裂药等均属雄性不育。鉴于本发明的AtCKL2和AtCKL7基因启动子在高温胁迫下，驱动目的基因在花在花药发育的stage9时期诱导表达，可用于雄性不育系的创制。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的启动子PAtCKL2的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明分离的启动子PAtCKL7的核苷酸序列。

图1：是PAtCKL2或PAtCKL7启动子克隆和验证的技术路线。

图2：是PAtCKL2启动子驱动GUS基因在拟南芥中的表达情况。附图标记说明：图2中的A图为PAtCKL2启动子驱动GUS基因在刚萌发的幼苗期有较强的表达，图2中的B图为随着生长的进行，子叶和真叶中有GUS基因的表达。图2中的C图为在根中没有检测到GUS基因的表达。

图3：是PAtCKL2启动子驱动GUS基因在花序发育的不同时期里的表达情况。附图标记说明：第一排S9-S14显示的是花药不同发育时期。第二排是S9-S14显示的是花药不同发育时期对应的花蕾。由图3可知该启动子能驱动GUS基因在开花当天的S14时期花药里的表达。

图4：是PAtCKL2启动子驱动GUS基因在受到高温处理后在拟南芥中的表达情况。附图标记说明：第一排S9-S14代表的是花药不同发育时期。第二排是S9-S14花药不同发育时期对应的花蕾。由图可知在高温胁迫后，该启动子能驱动GUS基因在花药中提前表达，及在花药发育的S9时期就有表达。

图5：是PAtCKL7启动子驱动GUS基因在拟南芥中的表达情况。附图标记说明：图5中的A图为PAtCKL7启动子驱动GUS基因在刚萌发的幼苗期有表达，图5中的B图为随着生长的进行，子叶和真叶中都没有GUS基因的表达。图5中的C图为在根中没有检测到GUS基因的表达。

图6：是PAtCKL7启动子驱动GUS基因在花序发育的不同时期里的表达情况。附图标记说明：第一排S9-S14显示的是花药不同发育时期。第二排显示的是S9-S14显示花药不同发育时期对应的花蕾。由图6可知该启动子能驱动GUS基因在开花当天的S14时期花药里的表达。

图7：是PAtCKL7启动子驱动GUS基因在受到高温处理后在拟南芥中的表达情况。附图标记说明：第一排S9-S14显示的是花药不同发育时期。第二排显示的是S9-S14花药不同发育时期对应的花蕾。第一排S9-S14代表的是花药不同发育时期。第二排显示的是S9-S14花药不同发育时期对应的花蕾。由图7可知在高温胁迫下该启动子驱动GUS基因在花药中提前表达，及在花药发育的S9时期就有表达，且在开花当天的S14时期花药里的优势表达。

图8：是用启动子PAtCKL2或PAtCKL7构建的驱动下游基因表达载体示意图。图8中的图A图为pGWB407载体物理图谱，Terminator表示转录终止子，6×His表示6个组蛋白的标签基因序列。图8中的B图为含有本发明的启动子pGWB407-PAtCKL2载体物理图。图8中的C图为含有本发明的启动子pGWB407-PAtCKL7载体物理图。

具体实施方式

实施例1：启动子PAtCKL2和PAtCKL7的克隆

本发明的启动子PAtCKL2和PAtCKL7的克隆是基于已有的拟南芥中有13个casein kinase I-like基因成员的报道(Lee,Jung-Youn,Taoka,Ken-ichiro,Yoo,Byung-Chun,Ben-Nissan,Gili,Kim,Dong-Jin,&Lucas,William J.(2005).Plasmodesmal-associated protein kinase in tobacco and Arabidopsis recognizes a subset ofnon-cell-autonomous proteins.The Plant Cell,17(10),2817-2831)。通过TAIR数据库(The ArabidopsisInformation Resource,http://www.arabidopsis.org/)，检索到了基因AtCKL2(登录号为AT1G72710)和AtCKL7(登录号为AT5G44100)的启动子序列。

根据AtCKL2和AtCKL7基因的启动子序列，分别设计了AtCKL2和AtCKL7的启动子正向和反向序列，引物PAtCKL2-TA-F、PAtCKL2-TA-R、PAtCKL7-TA-F、PAtCKL7-TA-R序列如下所述，分别进行PCR扩增。最后PCR扩增产物，通过T4DNA连接酶连接到pGEM-T Easy载体(分别购自Promega公司，Madison公司，WI公司，USA)上并转化到大肠杆菌菌株Top10(购自美国Invitrogen公司)内进行测序分析。将所有片段的测序结果去载体以后通过ClustalX拼接及比对以后得到基因AtCKL2和AtCKL7的启动子序列。

以上所述所用引物为：

PAtCKL2-TA-F：ATACAAAATCTGTTAAGTGAATCTTGACT，

PAtCKL2-TA-R：TAGACTCAGAATTGCTTACACTCTCATT；

PAtCKL7-TA-F：TATGCCACTGAACAACAACCCATA，

PAtCKL7-TA-R：AAAAAAAGGTGTGTGAAGAGGGGA；

以上所述在线工具详细网站及文献如下：

Clustal_X:http://www.clustal.org/,

Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,Jeanmougin F,Higgins DG(1997),The CLUSTAL_X windowsinterface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools,Nucleic AcidsResearch.25(24):4876-82

实施例2：启动子PAtCKL2和PAtCKL7驱动报告基因的表达载体构建

根据启动子PAtCKL2和PAtCKL7设计引物，在引物的两端分别加上用于重组的attB位点序列及保护碱基，分别将该引物命名为引物JPAtCKL2-BP-F、JPAtCKL2-BP-R、JPAtCKL7-BP-F和JPAtCKL7-BP-R，再分别以实施例1中得到的启动子PAtCKL2和PAtCKL7为模板用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，得到的产物通过通过BP和LR重组反应构建到pGWB433(；pGWB433载体见Tsuyoshi等，Improved Gatewaybinary vectors:high-performance vectors for creation of fusion constructs in transgenic analysis of plants.Biosci.Biotechnol.Biochem，2007，71(8):2095–2100)，从而得到驱动报告基因GUS的表达载体PAtCKL2::GUS和PAtCKL7::GUS。

所用引物序列如下，下划线所示为重组的attB序列：

JPAtCKL2-BP-F：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATACAAAATCTGTTAAGTGAATCTTGACT

JPAtCKL2-BP-R：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTAGACTCAGAATTGCTTACACTCTCATT

JPAtCKL7-BP-F：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTATGCCACTGAACAACAACCCATA

JPAtCKL7-BP-R：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAAAAAAAGGTGTGTGAAGAGGGGA

实施例3：利用启动子表达载体PAtCKL2::GUS和PAtCKL7::GUS转化拟南芥

将验证无误的实施例2中所构建的载体质粒转入到农杆菌菌株GV3101中(R Hellens，P Mullineaux.(2000)A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in Plant Science,5(10).446-451.)。本发明中所涉及的转化拟南芥采用的受体材料为哥伦比亚野生型，农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照(Zhang X,Henriques R,Lin SS,Niu QW,Chua NH(2006)Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature Protocols.1:641-646)，具体步骤如下。将活化后的含有目的载体的农杆菌(GV3101)接种到200mL液体LB培养基中，在28℃摇床上200r/min培养过夜等菌液浑浊(OD₆₀₀为0.8-0.9)后离心收集菌体，并用浸染缓冲液(5％蔗糖，0.01％Silwet L-77)将菌体重悬，随后进行花序浸染转化。将收取的T₀代拟南芥种子用酒精消毒后，通过加入卡拉霉素(30mg/L)抗性的培养基进行转基因阳性植株的筛选。转基因阳性植株根部发育正常，子叶为绿色，而阴性植株根系发育不良，叶片呈黄色，后为白色。通过对阳性植株和阴性植株的比例统计，若经卡方检测符合3:1，则表明该转基因系是T₁代单拷贝植株。将筛选出来的单拷贝阳性植株继续收取种子。按照卡拉霉素筛选法观察T₂代幼苗是否出现抗性分离，若不分离，全部呈现阳性，则该阳性植株为纯系植株，取不同组织用于GUS染色。

实施例4：启动子PAtCKL2::GUS和PAtCKL7::GUS表达特性

将转基因植株的不同组织材料取下以后，放入到含有反应底物X-Gluc的染色液中，37℃染色过夜，随后用75％酒精充分脱色，用体式显微镜(Leica MZFLⅢ)观察并照相。GUS染色液的配方如下：0.9g/L X-Gluc(4-甲基-7-氧香豆素-β-D-葡萄糖苷酸，Alfa Aesar)，50mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)，20％(v/v)甲醇和100mg/L氯霉素。

通过对GUS染色，得出如下结论：PAtCKL2::GUS和PAtCKL7::GUS主要在花药发育的后期(stage 14)特异高效表达(见图3和图6)。

实施例5：启动子PAtCKL2::GUS和PAtCKL7::GUS高温诱导后的表达特性

将转基因纯合植株在33℃的培养箱里处理24h，将对照植株在20℃培养箱里生长，处理24h后统一分不同发育时期取花蕾，然后用实施例4中的方法操作。通过对GUS染色，得出如下结论：PAtCKL2::GUS和PAtCKL7::GUS主要在花药发育的后期特异高效表达(见图3和图6)，但经过高温处理后，PAtCKL2::GUS和PAtCKL7::GUS在花药里的表达提前，从花药发育的stage 9开始就有明显的表达(见图4和图7)。

实施例6：将启动子PAtCKL2和PAtCKL7构建到植物载体上

根据pGWB407的载体特点，分别设计含有Hind III和Xba I酶切位点的引物，扩增PAtCKL2及PAtCKL7序列，将PCR产物和载体pGWB407(Improved gateway binary vectors:high-performance vectors forcreation of fusion constructs in transgenic analysis of plants,Bioscience,biotechnology,and biochemistry,2007,71:2095-100)分别用Hind III和Xba I酶双酶切反应。带有启动子的PCR产物酶切后用PCR产物回收试剂盒回收，pGWB407酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，回收载体骨架，用T4DNA连接酶连接。用连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑取具有壮观霉素(Spectinomycin)抗性单克隆，PCR鉴定阳性克隆提取质粒进行酶切和测序鉴定。将获得的两个植物表达载体分别命名为pGWB407-PAtCKL2和pGWB407-PAtCKL7。图8是用启动子PAtCKL2或PAtCKL7构建的驱动下游基因表达载体示意图。图8中的A图为pGWB407载体物理图谱，Terminator表示转录终止子。图8中的B图为含有本发明的启动子pGWB407-PAtCKL2载体物理图谱。图8中图C图为含有本发明的启动子pGWB407-PAtCKL7载体物理图谱。

本发明的两个启动子所对应的基因是Ⅰ型酪蛋白激酶，虽然在动物中克隆到了许多Ⅰ型酪蛋白激酶基因，但目前在植物中对于Ⅰ型酪蛋白激酶基因的研究报道还很少，而在启动子水平上的报道更少。本发明克隆的AtCKL2和AtCKL7基因启动子丰富了植物中对这类基因的研究。此外，还很少有花药发育特异高效表达并且受到高温诱导表达的启动子，本发明克隆的AtCKL2和AtCKL7基因启动子是花药特异高效表达并且受高温诱导表达的启动子。在高温胁迫下，在高温胁迫下本发明克隆的PAtCKL2和PAtCKL7驱动GUS基因在花药中提前表达，及在花药发育的stage9时期就有表达，且在开花当天的stage14时期花药里的优势表达。由此可以在棉花、拟南芥、水稻等植物中用于高温胁迫下对雄性发育的调控和雄性不育系的创制具有重要的理论意义和应用。

Claims (6)

1.一个分离自拟南芥哥伦比亚野生型的在花药后期高效表达并受高温诱导表达的启动子PAtCKL2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一个分离自拟南芥哥伦比亚野生型的在花药后期高效表达并受高温诱导表达的启动子PAtCKL7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一个包含有在花药后期高效表达的启动子PAtCKL2的植物表达载体pGWB407-PAtCKL2，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一个包含有在花药后期高效表达的启动子PAtCKL7的植物表达载体pGWB407-PAtCKL7，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.权利要求1或2所述的花药后期高效表达并受高温诱导表达的启动子启动子在拟南芥、棉花转化中的应用。

6.权利要求3或4所述的在花药后期高效表达的启动子PAtCKL7的植物表达载体在棉花或其它作物遗传改良中的应用。