CN110951702A - 水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21及其编码基因与应用。本发明所提供的水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，本发明的水稻萜烯同系物合成酶基因OsCYP92C21转入水稻中并与DMNT和TMTT前体合酶PTH3‑PlTPS4转基因植株杂交后得到的双基因聚合水稻，与野生型水稻相比，获得的转基因水稻能够释放出较多的DMNT和TMTT，并且显著吸引二化螟盘绒茧蜂，对水稻合成DMNT和TMTT以及培育新型抗虫水稻具有重要的理论和应用意义。

Description

水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21及其编码基因与 应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21及其编码基因与应用。

背景技术

地球上有数百万种昆虫，它们大多数以植物为食，而植物由于固着生长的特性在受到害虫为害时不能通过移动逃避。为了生存，植物体随之进化出高效的直接或间接防御机制以保护自己免受植食性昆虫的危害。在间接防御过程中，植物主要是通过散发一些挥发性气体以趋避植食性昆虫或者吸引其天敌，从而达到防御的目的。在这些挥发物中，发现最多的是芳樟醇，石竹烯，β-法尼烯和两种萜烯同系物(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯((E)-4， 8-dimethyl-1，3，7-nonatriene，DMNT)和(E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7， 11-十三碳四烯((E，E)-4，8，12-trimethyltrideca-1，3，7，11-tetraene，TMTT) 等。在这几种物质中，DMNT和TMTT是一类广泛存在于高等植物中的间接防御物质，它们能够在植食性昆虫为害后散发出来从而吸引相应害虫的天敌前来以达到防虫驱虫的目的。如玉米、拟南芥、番茄、胡椒、立马豆、黄瓜、棉花等植物在相应害虫为害后能释放出这两种物质以趋避害虫或吸引相应天敌。

自从DMNT和TMTT这两种物质被发现以来，科学工作者们就在不断地探索它们在植物体中的代谢途径。DMNT和TMTT的合成途径最早由 Boland提出的，他把用氘标记的橙花叔醇和香叶基芳樟醇加入到利马豆叶中，后在DMNT和TMTT中检测到了同位素信号，表明DMNT和TMTT 的生物合成可能是通过橙花叔醇和香叶基芳樟醇氧化降解产生的。随后，通过进一步的研究发现DMNT和TMTT的合成主要分为两步，第一步是在萜类合酶的作用下生成叔醇类前体物质——橙花叔醇和香叶基芳樟醇；第二步是前体物质在细胞色素单氧化酶P450家族的参与下发生氧化反应产生 DMNT和TMTT。丙甲菌素(Ala，一种能够提高GES表达量和TMTT产量的激发子)处理拟南芥后通过表达量上调的CYP基因和与数据库中与GES 共表达这两个筛选条件最终找到了候选基因CYP82G1(At3g25180)。该基因在酵母中表达的蛋白能与橙花叔醇和香叶基芳樟醇反应生成DMNT和 TMTT，同时能够回补该基因突变体不能产生TMTT的表型，因此被最终认为是拟南芥中TMTT合成的关键酶。随后在玉米和棉花中也鉴定到了相应的萜烯同系物合酶。

到目前为止DMNT和TMTT合成通路只有在拟南芥、棉花和玉米中被解析。在其他物种中的研究还较少，特别是在我国农业生产中最重要的粮食作物之一的水稻。其在萜烯同系物的研究还太少，仅在2006年有水稻在JA 处理后能产生DMNT和TMTT的报道。这限制了我们对DMNT和TMTT 合成代谢路径的了解，也给我们在水稻中使用这两种物质进行绿色防控害虫带来了诸多不便。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种与水稻DMNT和 TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21及其编码基因与应用。

本发明所提供的水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21，所述蛋白OsCYP92C21如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了编码上述水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92 的核酸分子。

所述核酸分子是编码权利要求1所述的蛋白质OsCYP92C21的基因；所述基因是如下(1)至(2)中任一项所述的DNA分子：

(1)序列为SEQ ID NO：2；

(2)编码序列为SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA分子杂交且编码蛋白 OsCYP92C21的DNA分子。

本发明还提供了含有上述核酸分子的重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组工程菌。

同时，本发明还提供了含有上述蛋白OsCYP92C21、核酸分子、重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组工程菌的应用：能够趋避植食性害虫或吸引植食性害虫的天敌。

同时还提供了上述蛋白OsCYP92C21、核酸分子、重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组工程菌在转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种培育新型抗虫水稻的方法，其包括将编码上述蛋白OsCYP92C21的基因、或上述核酸分子导入目的植物水稻中得到转基因水稻的步骤。

具体的，所述培育新型抗虫水稻的方法包括以下步骤：

S1，将编码上述蛋白OsCYP92C21的基因、或上述核酸分子导入目的植物中得到转基因水稻株系；

S2，筛选步骤S1中的纯合阳性转基因单株；

S3，将步骤S2中筛选得到的纯合阳性转基因单株与PTGH3-PlTPS4纯合株系杂交得到双基因聚合水稻。

其中，步骤S2中纯合阳性转基因单株的筛选包括以下步骤：

S2-1，对步骤S1中的转基因水稻株系进行拷贝数分析，得到单拷贝转基因株系；

S2-2，将S2-1中的单拷贝株系进行自交得到T1代；

S2-3，将S2-2中得到的T1代单株的成熟种子在含有甘草磷的培养基上进行发芽试验，所述成熟种子是T1代自交得到；

S2-4，成熟种子能够同时在0mg/L和200mg/L的草甘膦的1/2MS培养基上发芽且发芽率为100％的T1代单株即为纯合阳性转基因单株。

其中，上述步骤S3中PTGH3-PlTPS4纯合株系通过以下步骤得到：将立马豆来源的PlTPS4基因连入PTGH3植物表达载体，然后将该载体通过农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻中，在T2代转化苗中筛选出单拷贝的 TGH3-PlTPS4纯合株系。

本发明：(1)对水稻基因组和害虫处理转录组进行生物信息学分析，筛选DMNT和TMTT合成代谢基因；(2)根据水稻筛选出的基因片段设计引物，提取目的基因OsCYP92C21(如SEQ ID NO:2所示)全长；(3)将OsCYP92C21(如SEQ ID NO:2所示)基因克隆到真核表达载体PYES2的限制性内切酶HindIII和BamH I位点间，构建带有OsCYP92C21基因的重组酵母表达载体PYES2-OsCYP92C21；转入酵母菌株WAT11表达宿主菌中并用半乳糖诱导表达，诱导的蛋白能以(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇为底物生成DMNT和TMTT；(4)将SEQ IDNO:2基因克隆到植物表达载体 PTH-3的限制性内切酶BamH I和SacI位点间，构建带有OsCYP92C21基因的重组植物表达载体PTH3-OsCYP92C21，并通过农杆菌介导法转入水稻品种ZH11；(5)将获得的T0代转基因水稻植株进行荧光定量PCR检测和 southern blot检测，筛选出目的基因OsCYP92C21表达量高的单拷贝T0代转基因阳性植株收集并鉴定转基因水稻挥发物；(6)由于水稻中萜烯同系物前体橙花叔醇和香叶基芳樟醇的缺乏，将筛选出的单拷贝高表达植株与含有DMNT和TMTT前体合酶PTH3-PlTPS4转基因植株进行杂交，筛选后代同时具有两个基因的植株，随后收集并鉴定转基因水稻挥发物。

本发明的水稻萜烯同系物合成酶基因OsCYP92C21转入水稻中并与 DMNT和TMTT前体合酶PTH3-PlTPS4转基因植株杂交后得到的双基因聚合水稻，与野生型水稻和仅含有OsCYP92C21基因或仅含有PlTPS4基因的重组水稻相比，仅含有OsCYP92C21基因的重组水稻释放出的DMNT和 TMTT与野生型水稻无明显差异，均不能检测到DMNT和TMTT；仅含有PlTPS4基因的重组水稻释放出的DMNT和TMTT高于野生型水稻，但是含量仍比较低且不稳定；双基因聚合水稻释放出的DMNT和TMTT显著高于仅含有OsCYP92C21基因或仅含有PlTPS4基因的重组水稻，并且双基因聚合水稻能够显著吸引二化螟盘绒茧蜂，对水稻合成DMNT和TMTT以及培育新型抗虫水稻具有重要的理论和应用意义。

附图说明

图1为OsCYP92C21 PCR扩增电泳图；其中1为Marker，2为 OsCYP92C21开放阅读框扩增产物。

图2为构建的酵母表达载体PYES2-OsCYP92C21结构示意图。

图3为水稻OsCYP92C21基因在酵母WAT11中反应产物的GC-MS图；其中A、D为空载体，B、C为带有OsCYP92C21基因的载体，1为1.DMNT；2.(E)-Nerolidol；3.TMTT；4.(E,E)-Geranyllinalool。

图4为植物表达载体PTGH-3结构示意图。

图5为植物表达载体PTGH3-OsCYP92C21酶切检测胶图；其中1为 Marker，2为HindIII+BamH1酶切后的PTGH3-OsCYP92C21质粒。

图6为构建的植物表达载体PTGH3-OsCYP92C21结构示意图。

图7为构建的植物敲除载体PYKCRISPR/Cas9-OsCYP92C21结构示意图。

图8为获得的转基因家系PTGH3-OsCYP92C21的拷贝数检测结果；其中M为DIG标记marker，N为野生型ZH11，泳道1-36为36个 PTGH3-OsCYP92C21转基因水稻家系。

图9为杂交种PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4的分子检测结果图；其中M为Marker，1为PlTPS4YJ-F/PlTPS4YJ-R扩杂交种基因组DNA 的PCR产物，2为NU-F/CYP92C21JC-R扩杂交种基因组DNA的PCR产物， 3为PlTPS4YJ-F/PlTPS4YJ-R扩PTGH3-PlTPS4基因组DNA的PCR产物； 4，NU-F/CYP92C21JC-R扩PTGH3-PlTPS4基因组DNA的PCR产物；5， PlTPS4YJ-F/PlTPS4YJ-R扩PTGH3-OsCYP92C21-4基因组DNA的PCR产物；6，NU-F/CYP92C21JC-R扩PTGH3-OsCYP92C21-4基因组DNA的PCR 产物。

图10为水稻挥发物GCMS检测结果；其中A为转基因水稻 PTGH3-OsCYP92C21-4、B为转基因水稻PTGH3-PlTPS4、C为杂交聚合转基因水稻PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4、D为野生型ZH11，1为 DMNT、IS为内标癸酸乙酯、2为TMTT。

图11为二化螟盘绒茧蜂雌虫对转基因水稻PTGH3-OsCYP92C21-4、 PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4、PTGH3-PlTPS4与野生型水稻植株的选择行为试验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1 OsCYP92C21基因的获得

根据已有报道，在植物中DMNT和TMTT的最后合成途径都是由P450 酶催化完成的，如双子叶植物拟南芥中的AtCYP82G1，棉花中的GhCYP82L1 和GhCYP82L2，单子叶植物玉米中的ZmCYP92C5和ZmCYP92C6。根据这种思路，我们从的褐飞虱取食水稻(RH/TN1)前后芯片数据中以及丙甲菌素处理水稻(ZH11)转录组数据中找到了一些共同上调的P450s。我们将这些基因进行了qPCR鉴定，最终发现相比于对照植株，OsCYP92C21等基因在褐飞虱取食后表达量显著升高。我们最终将OsCYP92C21等基因作为候选基因，用于进一步在酵母中的酶活检测。

实施例2水稻DMNT和TMTT合成酶OsCYP92C21基因的克隆

当野生型ZH11生长至苗期，用褐飞虱处理24h后取其叶片进行RNA 抽提。水稻叶片总RNA的提取参照北京全式金生物技术有限公司Transzol (ET101-01)RNA提取试剂盒中的说明手册提取，琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量并通过NanoDrop测定浓度。cDNA第一链的合成采用赛默飞世尔科技 (中国)有限公司的M-MLV Reverse Transcriptase(28025013)反转录试剂盒，方法参照试剂盒中的说明手册。设计合成特异性引物OsCYP92C21-F： 5’-ATGGCCATGTCTTCGTGG-3’(SEQ ID NO:3)和OsCYP92C21-R(SEQ ID NO:4)：5’-TCATGCGGCGGTGCCGG-3’进行PCR扩增反应，获得 OsCYP92C21基因全长ORF序列(电泳结果见图1)，测序正确后待用。 OsCYP92C21基因cDNA全长1614bp，如SEQ ID NO：2所示，编码537个氨基酸，如SEQ ID NO：1所示。获得OsCYP92C21基因全长ORF序列的PCR扩增的反应体系为：DNA模板(50ng/μL)2μL、2×KODBuffer 10μL、 10μM CYP92C21-F 0.2μL、10μMCYP92C21-R 0.2μL、KOD(Toyobo) 0.2μL、10mMdNTPs 0.4μL、ddH207μL。获得OsCYP92C21基因全长ORF 序列的PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃30s、66℃30s、68℃1min20s、 35个循环；68℃7min；25℃1s。

实施例3 OsCYP92C21基因酵母表达载体的构建与在酵母中的诱导表达

采用pYES2质粒和WAT11酵母菌株真核表达系统对OsCYP92C21基因进行诱导表达。具体步骤如下：

(1)酵母表达载体的构建

以OsCYP92C21的全长cDNA的PCR产物为模板，CYP92C21-PYES2F (SEQ ID NO:5)：5-ctatagggaatattaagcttATGGCCATGTCTTCGTGGGTCGCCACCATC-3 和CYP92C21-PYES2R(SEQID NO:6)： 5-ggccgttactagtggatccTCATGCGGCGGTGCCGGCG-3扩增OsCYP92C21。具体扩增OsCYP92C21的PCR反应体系为：DNA模板(50ng/μL)1μL、2×KODBuffer 25μL、10μMCYP92C21-PYES2F 0.5μL、10μM CYP92C21-PYES2R 0.5μL、KOD (Toyobo)0.5μL、10mMdNTPs1μL、ddH2021.5μL。扩增OsCYP92C21 的PCR反应程序为：98℃3min；98℃30s、66℃30s、68℃1min20s、35个循环；68℃7min；25℃1s。

采用上述方案进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收。同时用HindIII+BamHI双酶切pYES2载体，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收。 HindIII+BamHI双酶切pYES2载体，在37℃反应1h，双酶切的反应体系如下：10×Buffer 10μl、pYES2载体5μg、HindIII 1μl、BamHI 1μl、补水至100 μl。采用公司One Step Cloning Kit进行重组反应，体系如下：5×CE II Buffer 4μl、线性化克隆载体50～200ng、插入片段扩增产物20～200ng、

II 2μl、补水至20μl。

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。取20μl冷却反应液，加入到200μl 感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90 秒，冰水浴孵育2min。加入600μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。 37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有Amp+(50mg/ml)的LB 平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。

挑取单克隆进行质粒抽提(常规质粒抽提方法即可)并用HindIII+BamHI 进行酶切，37℃反应20min，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，把阳性克隆送测序，测序正确的质粒即为pYES2-OsCYP92C21(载体图谱见图2)。该载体是在PYES2的基础上改造而来，在多克隆位点处连接了基因 OsCYP92C21的表达框架。HindIII+BamHI双酶切的反应体系和反应条件如下：10×Buffer 2μl、重组质粒2μl、HindIII 0.2μl、BamHI 0.2μl、补水至20 μl。

(2)OsCYP92C21蛋白的诱导表达

将构建的pYES2-OsCYP92C21重组质粒采用Clontech公司提供的 LiAc/ssDNA/PEG法转化表达宿主菌WAT11，涂布在SC-U培养基上30℃培养2d。挑选单克隆酵母转化子进行菌液PCR检测，以表达载体pYES2的通用引物GAL1-F(SEQ ID NO:7)：5-AATATACCTCTATACTTTAACGTC-3、 CYC1-R(SEQ ID NO:8)：5-GCGTGAATGTAAGCGTGAC-3为引物进行阳性克隆筛选，具体反应体系(20μL)如下：菌液1μL、10×PCR Buffer 2μL、 10μMGAL1-F 0.2μL、10μM GAL1-R 0.2μL、rTaq(Takara)0.2μL、 10mMdNTPs 0.4μL、ddH2016μL。阳性克隆的PCR反应程序为：95℃5min； 95℃30s、58℃30s、72℃1min20s、32个循环；72℃7min；25℃1s。

选取PCR检测为阳性的菌落进行后续试验。以转入pYES2空载体的 WAT11作为对照。将酵母阳性克隆接种到10mL含2％棉籽糖的SC-U液体培养基中培养，于30℃,280r/min培养至OD₆₀₀达到1，培养物于4℃1100g 离心5min。细胞沉淀用50mL含2％半乳糖和1％棉籽糖SC-U液体培养基重悬，于30℃,280r/min培养诱导48h。培养物于4℃1100g离心5min，将所得菌体制成微粒体用于进行酶活检测。含有pYES2-OsCYP92C21表达蛋白微粒体在如下反应体系进行酶活反应：50mM的Tric-HCl(PH 7.4)、1mM的 EDTA、20％的甘油，1mMNADPH和10μM底物(E)-橙花叔醇或(E,E)-香叶基芳樟醇(溶于DMSO)。30℃反应4h，加入盐酸酸化终止反应， SPME-PDMS/DVB 30℃萃取1h，随后进行GC-MS检测。

GC-MS检测采用岛津气相色谱-质谱联用仪GCMS-QP2010 (SHIMADZU/岛津,日本)，色谱柱为SH-Rsi-5sil-MS柱(30m×0.25mm 内径×0.25μm膜厚，岛津)进行分析。载气为氦气，不分流进样，进样口流速为10mL/min,柱流量为0.8mL/min，进样口温度为250℃，MS扫描范围为40-550m/z。升温程序为:50℃保持1min，以5℃/min的增量升到60℃，然后保持50分钟再10℃/min，升到250℃，最后250℃保持5min，共32min。结果显示，与空载体pYES2相比，重组表达载体pYES2-OsCYP92C21组加入底物(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇后有新物质产生，时间与质谱图与DMNT和TMTT标准样品相一致，产物鉴定为DMNT和TMTT。说明OsCYP92C21基因编码的蛋白能以(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇为底物，催化生成DMNT和TMTT(GCMS结果见图3)，图3为水稻OsCYP92C21 基因在酵母WAT11中反应产物的GC-MS图。OsCYP92C21基因(B和C) 在酵母中分别以(E)-Nerolidol和(E,E)-Geranyllinalool为底物反应产生DMNT (1)和TMTT(3)；而空载体(A和D)不能产生相应产物。1.DMNT；2.(E)-Nerolidol；3.TMTT；4.(E,E)-Geranyllinalool。

实施例4植物表达载体的构建

本发明所用的转化载体PTGH-3为农杆菌Ti双元载体pCAMBIA1300 (由澳大利亚pCAMBIA实验室，Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture提供)改造而来(载体图见图4)。用 BamHⅠ+SacⅠ双酶切该载体后，连入OsCYP92C21(SEQ ID NO：2所示的序列)形成最终表达载体PTGH3-OsCYP92C21(序列见SEQ ID NO：21)。 BamHⅠ+SacⅠ双酶切验证正确后(胶图见图5，载体图见图6)，将 PTGH3-OsCYP92C21转化到农杆菌EHA105中，将转化后的农杆菌菌株置于-70℃保存待用。BamHⅠ+SacⅠ双酶切农杆菌Ti双元载体pCAMBIA1300 的体系为：10×Buffer2μl、重组质粒2μl、SacⅠ0.2μl、BamHI 0.2μl、补水至20μl。反应条件为37℃反应20min。

实施例5水稻CRISPR/Cas9-CYP92C21敲除载体的构建

参考刘耀光课题组的方法，利用PCR和酶切连接的方法构建U6a驱动的gRNA1,U3驱动的gRNA2和Ubiqutin启动子驱动Cas9蛋白的表达载体，最终将这两个片段同时连入经BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9-MH中。具体过程如下：

根据gRNA1(SEQ ID NO:9)：5-GGGATCGTGCACACCCCGTACGG-3 和gRNA2(SEQ ID NO:10)：5-ACTTCTGCAACTCTCCGGCGAGG-3靶标，设计4条引物，分别为92gRNA1-F(SEQ ID NO:11)： 5-GCCGGGATCGTGCACACCCCGTA-3、92gRNA1-R(SEQ ID NO:12)： 5-AAACTACGGGGTGTGCACGATCC-3、92gRNA2-F(SEQ ID NO:13)： 5-GGCACTTCTGCAACTCTCCGGCG-3、92gRNA2-R(SEQ ID NO:14)： 5-AAACCGCCGGAGAGTTGCAGAAG-3,两对引物分别在98℃下变性30s, 然后置于室温下使其成为接头。然后92gRNA1-F和92gRNA1-R形成的接头与pYLgRNA-OsU6a连接，92gRNA2-F和92gRNA2-R形成的接头与 pYLgRNA-OsU3/LacZ连接，连接体系和反应条件如下：1x Bsa I-内切酶 Buffer，加入约20ng pYLgRNA-OsU3/LacZ或pYLgRNA-OsU6a质粒，0.5μl 接头(最终浓度0.05μM)，5U BsaI，35U T4 DNAligase，0.3μl10x NEB T4 DNAligase buffer，补水至10μl。用PCR仪循环反应5个循环：37℃5min， 20℃5min。分别以连接产物为模板(1μl)、引物UF/接头反向引物(U-F: 5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3，见SEQ ID NO:15)(反应1)、接头正向引物/gRNA-R(gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3，见SEQ ID NO:16)(反应2)各0.2μM，KOD酶0.2μl，dNTP(10μM)0.4μl，2xKOD buffer10μl,最后补水至20μl，进行第一轮PCR扩增(25-28个循环：95℃10s、 60℃15s、68℃20s)。

预先将位置特异引物对混合成10x工作液，每种1.5μM：B1’ (5-TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3，见SEQ ID NO:17)+B2(5-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3，见 SEQ ID NO:18)(PT1),B2’ (5-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3，见SEQ ID NO:19)+BL (5-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3，见SEQID NO:20)(PT2L)；取第一轮PCR反应1，2产物1μl用H₂O稀释10倍，各取1μl混合为模板，使用引物对PT13μl扩增U3启动子，使用引物对PT2L 3μl扩增U6a启动子,KOD酶0.3μl，dNTP(10μM)0.6μl，2xKOD buffer15μl, 最后补水至30μl(扩增15-20个循环：95℃10s、58℃15s、68℃20s)。随后用PCR产物纯化试剂盒纯化第二轮PCR产物。

取约70ng第二轮PCR产物，加入约80ng未切割的 pYLCRISPR/Cas9-MH(B)质粒(预先稀释成约100ng/l冷冻保存)，在15μl 反应(1x Bsa I-内切酶Buffer)用10U BsaI 37℃酶切10min。加0.5μl 10x NEB T4 DNAligase buffer 35U T4 ligase。用PCR仪酶切连接约10-15循环: 37℃2min；10℃3min，20℃5min；最后37℃2min。最后，我们获得了Cas9 的表达载体：pYLCRISPR/Cas9-CYP92C21(载体图见图7)。将 pYLCRISPR/Cas9-CYP92C21转化到农杆菌EHA105中，将转化后的农杆菌菌株置于-70℃保存待用。

实施例6农杆菌介导的水稻ZH11的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化具体步骤如下：

(1)愈伤组织诱导

将成熟的ZH11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟， 0.15％氯化汞种子表面消毒15-20分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上；将接种后的培养基置于黑暗处培养4-6周，温度28±1℃。

(2)愈伤组织继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基上黑暗下培养3周，温度28±1℃。

(3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度28±1℃。

(4)农杆菌培养

在带有卡那霉素抗性的LA培养基预培养农杆菌2天，温度为28±1℃；将农杆菌转移至AA悬浮培养基里，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养 2-3小时。

(5)农杆菌侵染

将预培养的愈伤组织转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至 OD600值为0.3左右；将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20℃。

(6)愈伤组织洗涤和选择培养

灭菌水洗涤愈伤组织7-8次；浸泡在含400mg/L的羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤组织至选择培养基上选择培养3次，每次2周。

(7)分化

将抗性愈伤组织转移至预分化培养基上于黑暗处培养7天，温度 26±1℃；转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基上，光照(光照强度2000 Lx)下培养，温度26±1℃。

(8)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(光照强度 2000Lx)下培养2-3周，温度26±1℃。

(9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

实施例7转基因植株的PCR检测

采用CTAB法提取水稻叶片总DNA。利用PCR对T0代转基因植株进行阳性检测，PCR所用的引物序列为I.variabilis-mEPSPS-F(SEQ ID NO： 22)：5-attagcgctagggacgtgag-3和I.variabilis-mEPSPS-R(SEQ ID NO：23)： 5-atacgctcccacatcctgtc-3。用引物I.variabilis-mEPSPS-F和 I.variabilis-mEPSPS-R扩增得到的PCR产物大小是576bp。PCR反应体系： 50ng模板DNA，2μL 10×PCRbuffer(Mg2+plus)，0.4μL dNTP(10mM)， 0.2μLI.variabilis-mEPSPS–F引物(10μM)，0.2μL I.variabilis-mEPSPS–R 引物(10μM)，1U TaqDNApolymerase，补ddH2O至20μL。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s；重复 32个循环；72℃终延伸7min。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行检测。对所有T0代植株进行PCR检测，分析I.variabilis-mEPSPS在转基因植株中的整合情况。一共检测50株T0代转化植株株，其中36株转化植株为I.variabilis-mEPSPS阳性植株。

实施例8转基因植株拷贝数检测

利用Southern杂交对36个PTGH3-OsCYP92C21家系进行 PTGH3-OsCYP92C21拷贝数分析。利用CTAB法抽提转基因水稻植株叶片总DNA，Southern杂交分析方法参见Roche公司的地高辛应用手册。总DNA 用Hind III酶切，以地高辛标记的I.variabilis-mEPSPS基因的PCR扩增产物为杂交探针进行检测。根据Southern杂交结果，共确定16个转基因株系为单拷贝转基因株系(图8)。图8为本发明获得的转基因家系 PTGH3-OsCYP92C21的拷贝数检测结果。用HindⅢ对水稻基因组DNA进行酶切，用DIG标记I.variabilis-mEPSPS探针进行杂交，野生型(非转基因) 水稻ZH11没有杂交条带，转化载体PTGH3-OsCYP92C21有杂交条带。附图标记说明：M：为DIG标记marker；N为野生型ZH11；泳道1-36为36 个PTGH3-OsCYP92C21转基因水稻家系。

实施例9纯合阳性转基因单株筛选

对转基因家系PTGH3-OsCYP92C21自交得到的T1代株系分单株收种，将收获后的成熟种子在含有草甘膦的培养基上进行发芽试验。草甘膦培养基发芽试验具体操作步骤如下：将转基因家系PTGH3-OsCYP92C21的T1代自交得到的成熟种子去壳，先用75％的乙醇浸泡消毒1min，然后将75％的乙醇倒掉，再用0.15％的升汞溶液消毒15min；最后将0.15％的升汞倒掉，用灭菌水洗5次。将消毒后的种子分别接种于草甘膦浓度为0和30mg/L的 1/2MS培养基上(MS培养基为本领域常用培养基)，2000Lux光照培养 (培养温度为26±1℃，培养时间为16小时光照/8小时暗培养)5天后统计发芽率。以理论值计算，若消毒的种子在含200mg/L草甘膦的条件下应具有100％的发芽活力，则在含草甘膦的1/2MS培养基上，阳性纯合转基因单株的发芽率为100％，杂合转基因单株的发芽率为75％左右，阴性纯合单株的发芽率为0％。通过草甘膦培养基发芽试验挑选出PTGH3-OsCYP92C21 纯合阳性转基因单株，并利用其进行后续实验，发现PTGH3-OsCYP92C21 纯合阳性转基因单株与PTGH3-PlTPS4纯合株系杂交得到的双基因聚合水稻释放出的DMNT和TMTT均显著高于仅含有OsCYP92C21基因或仅含有PlTPS4基因的重组水稻，并且能够显著吸引二化螟盘绒茧蜂，下面以 PTGH3-OsCYP92C21-4为例进行后续实验效果的详细说明。

实施例10 PTGH3-OsCYP92C21-4与PTGH3-PlTPS4的杂交及杂种 PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4的分子检测

将PTGH3-OsCYP92C21-4纯合株系和PTGH3-PlTPS4纯合株系(该株系由本实验室按照常规构建方法构建得到)播种于田间，保证它们花期相遇。待PTGH3-PlTPS4抽穗开花后，授予PTGH3-OsCYP92C21-4转基因纯合株系的花粉。待种子成熟后，收获杂种PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4。将杂种PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4播种到田间，在苗期提取基因组DNA，分别对两个基因进行阳性检测。

利用引物NU-F(SEQ ID NO:24)：5-ggcatatgcagcatctattc-3和 CYP92C21JC-R(SEQ ID NO:25)：5-TCGTGGGTCTTGAGGACGAG-3进行PCR检测PTGH3-OsCYP92C21-4，引物PlTPS4YJ-F(SEQ ID NO:26)： 5-CCAATGATTTCGCTGAAGAG-3和PlTPS4YJ-R:(SEQ ID NO:27)： 5-TGGAGAGGCATGGATTACTG-3进行PCR检测PTGH3-PlTPS4(胶图见图9)，找出同时具有两个基因的植株进行后续试验。分子检测PCR反应体系为：DNA模板(50ng/μL)2μL、10×PCRBuffer 2μL、10μM NU-F/PlTPS4YJ-F 0.2μL、10μM CYP92C21JC-R/PlTPS4YJ-R 0.2μL、rTaq (Takara)0.2μL、10mMdNTPs 0.4μL、ddH2015μL。分子检测PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s、55℃30s、72℃30s、32个循环；72℃7min； 25℃1s。图9为杂交种PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4的分子检测结果图；其中1为PlTPS4YJ-F/PlTPS4YJ-R扩杂交种基因组DNA的PCR产物，2为NU-F/CYP92C21JC-R扩杂交种基因组DNA的PCR产物，3为 PlTPS4YJ-F/PlTPS4YJ-R扩PTGH3-PlTPS4基因组DNA的PCR产物；4， NU-F/CYP92C21JC-R扩PTGH3-PlTPS4基因组DNA的PCR产物；5， PlTPS4YJ-F/PlTPS4YJ-R扩PTGH3-OsCYP92C21-4基因组DNA的PCR产物；6，NU-F/CYP92C21JC-R扩PTGH3-OsCYP92C21-4基因组DNA的PCR 产物。

实施例11水稻挥发物的收集与检测

采用动态顶空法分别收集野生型水稻和转基因水稻的挥发物。将生长 50d左右水稻植株用锡箔纸包住根部后置于圆柱形玻璃缸(直径×高:35cm× 90cm)，每缸1盆。空气由大气采样仪通过活性炭过滤后进入玻璃缸中，气流携带植物挥发物被50mg吸附剂(TenaxTA 60/80Mesh)吸附后回流入大气采样仪。空气流速1.5L/min，收集24小时后，用700μL正己烷分2次洗脱至进样瓶中，加入终浓度为1ng/μL癸酸乙酯作为内标。密封后置于-20℃冰箱中保存或直接吸取1μL在岛津单四极杆气质联用仪(GCMS-QP2010SE)上进行定性与定量检测。从图10可以看出，野生型水稻和 PTGH3-OsCYP92C21-4中未检测到DMNT和TMTT，PTGH3-PlTPS4纯合株系中仅能检测到少量DMNT，但是不能检测到TMTT，而 PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4聚合水稻中均能检测到这两种物质，说明OsCYP92C21在水稻体内确实能将(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇催化形成DMNT和TMTT。

实施例12 OsCYP92C21在吸引二化螟盘绒茧蜂雌虫中的应用

用Y型嗅觉仪检测上述水稻植株挥发物对二化螟盘绒茧蜂雌虫行为的影响，具体如下:二化螟盘绒茧蜂在光照培养箱中用二化螟饲养，挑选二化螟盘绒茧蜂雌虫进行行为研究。Y形嗅觉仪主臂20cm，两侧臂15cm，侧臂间夹角60°。通过气泵吸取空气进入系统，气流经活性炭、蒸馏水净化加湿后通过流量计进入Y形管两侧，流速控制在0.4L/min。测试时，把PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4转基因水稻植株放到一个玻璃罐中，作为气味源，放入某一侧臂，以ZH11水稻作为对照放入另一侧臂。从基管端部接入寄生蜂，每头寄生蜂观察5min，如寄生蜂爬过侧壁1/3处并停留 5s以上记为对该物质有反应，否则记为无反应。每测试5头交换一下左右两臂，交换气体的方向并更换Y型管。测试温度为(25±2)℃，共测试60头雌性寄生蜂。结果如图11所示，为Y型嗅觉仪检测PTGH3-PlTPS4、 PTGH3-OsCYP92C21-4和PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4的水稻挥发物对二化螟盘绒茧蜂雌虫的行为反应的影响，结果显示，经卡方测验 PTGH3-OsCYP92C21-4与野生型ZH11无明显差异(x²＝0.2195，DF＝1,P＝0.6394),PTGH3-PlTPS4能够显著吸引二化螟盘绒茧蜂雌虫(x²＝5。 12，DF＝1,P＝0.0237)，PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4能够极显著吸引二化螟盘绒茧蜂雌虫(x²＝17.3077，DF＝1,P<0.01)，说明PTGH3-OsCYP92C21-4×PTGH3-PlTPS4水稻挥发物样品对二化螟盘绒茧蜂具有极显著的吸引作用。

本实验中所用到的培养基如下：

LB培养液

10g Tryptone，5gYeast Extract，10g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。

LA培养基：10g Tryptone，5gYeast Extract，10g NaCl，15g agar双蒸水定容至1000mL，高压灭菌

SC-ura固体培养基：Yeast nitrogen base 1.675g、-ura DO 0.17g、Add ddH2Oto 250ml、agar(add for solid medium)5g/250ml、用 1M KOH调PH约至6.5

SC-ura液体培养基：Yeast nitrogen base 1.675g、-ura DO 0.17g、Add ddH2Oto 250ml，用1M KOH调PH约至6.5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21及其编码基因与应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 537

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(OsCYP92C21)

<400> 1

Met Ala Met Ser Ser Trp Val Ala Thr Ile Val Thr Leu Leu Ile Gly

1 5 10 15

Val Ala Val Ala Ser Leu Arg Gly Arg Gln Arg Arg Thr Lys Ala Arg

20 25 30

Leu Asn Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Phe Gly Ser Leu

35 40 45

Gly Ala Leu Ala Gly Ala Leu Pro Pro His Arg Ala Leu Ala Ala Leu

50 55 60

Ala Ala Arg His Gly Pro Leu Met His Leu Arg Leu Gly Ser Phe Asp

65 70 75 80

Ala Val Val Ala Ser Ser Ala Gly Ala Ala Arg Leu Val Leu Lys Thr

85 90 95

His Asp Ala Ala Phe Ala Asp Arg Ala Arg Thr Ala Ala Gly Glu Leu

100 105 110

Val Ala Tyr Asn Tyr Lys Gly Ile Val His Thr Pro Tyr Gly Ala Tyr

115 120 125

Trp Arg Met Ala Arg Lys Leu Cys Ala Thr Glu Leu Phe Ser Pro Arg

130 135 140

Arg Val Asp Ser Tyr Glu Arg Ile Arg Ala Glu Glu Ile Gly Ala Leu

145 150 155 160

Ala Arg Asp Leu Phe Gly Arg Ala Gly Arg Ala Val Ala Val Arg Glu

165 170 175

Arg Leu Ala Ser Ala Thr Leu Arg Asn Ile Leu Arg Met Ser Val Gly

180 185 190

Asp Lys Trp Ser Gly Val Tyr Gly Ser Ala Asp Gly Glu Ala Phe Arg

195 200 205

Arg Thr Leu Asp Glu Ala Phe Glu Val Ser Gly Ala Val Ser Asn Val

210 215 220

Gly Glu Trp Val Ser Leu Leu Gly Trp Leu Asp Val Gln Gly Phe Arg

225 230 235 240

Arg Arg Met Lys Arg Leu Ser Lys Met Tyr Asp Arg Phe Leu Glu Gln

245 250 255

Ile Leu His Glu His Glu Ala Ser Met Ala Ala Ala Gly Asp Gly Gly

260 265 270

Gln Pro Ala Ala Ala Ala Cys Asp Leu Val Asp Val Leu Leu Gln Leu

275 280 285

Ser Gly Glu Glu Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ala Asp Ser Glu

290 295 300

Ala Arg Leu Thr Arg Asp Gly Val Lys Ala Phe Ile Leu Asp Ile Ile

305 310 315 320

Ala Gly Gly Thr Glu Ser Ser Ala Val Ala Met Glu Trp Ala Met Ala

325 330 335

Glu Leu Leu Arg Arg Pro Asp Ala Met Ala Ala Ala Thr Asp Glu Leu

340 345 350

Asp Arg Val Val Gly Thr Ala Arg Trp Val Thr Glu Arg Asp Ile Pro

355 360 365

Asp Leu Pro Tyr Val Asp Ala Val Val Lys Glu Ala Leu Arg Leu His

370 375 380

Pro Val Gly Pro Leu Leu Val Pro His His Ala Met Glu Asp Thr Val

385 390 395 400

Val Ala Gly Gly Tyr Val Val Pro Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Asn

405 410 415

Ala Trp Ala Ile Ala Arg Asp Pro Ala Ser Trp Pro Asp Arg Pro Asp

420 425 430

Ala Phe Leu Pro Glu Arg Phe Leu Pro Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala

435 440 445

Gly Leu Asp Val Arg Gly Gln His Tyr Glu Leu Leu Pro Phe Gly Ser

450 455 460

Gly Arg Arg Val Cys Pro Ala Thr Asn Leu Ala Met Lys Met Val Ala

465 470 475 480

Leu Gly Val Ala Ser Leu Val Gln Gly Phe Ala Trp Arg Leu Pro Asp

485 490 495

Gly Val Ala Ala Glu Asp Val Ser Met Glu Glu Leu Val Gly Leu Ser

500 505 510

Thr Arg Arg Lys Val Pro Leu Val Ala Val Ala Glu Pro Arg Leu Pro

515 520 525

Ala His Leu Tyr Ala Gly Thr Ala Ala

530 535

<210> 2

<211> 1614

<212> DNA

<213> 水稻OsCYP92C21(Oryza sativa)

<400> 2

atggccatgt cttcgtgggt cgccaccatc gtcaccctcc tcatcggcgt cgccgtggct 60

tcgttgcgtg gccgccagcg ccggacgaag gcgcggctga acctcccgcc ggggccgcgc 120

gggtggccgg tgttcggcag cctcggcgcc ctggcgggcg cgctcccgcc gcaccgcgcc 180

ctggcggcgc tcgcggcgcg ccacggcccg ctcatgcacc tccggctggg ctcgttcgac 240

gccgtggtcg cctcctccgc cggcgccgcc aggctcgtcc tcaagaccca cgacgccgcc 300

ttcgccgacc gcgcgcgcac cgccgccggc gagctcgtcg cgtacaacta caaggggatc 360

gtgcacaccc cgtacggcgc ctactggcgc atggcgcgca agctctgcgc caccgagctc 420

ttctccccgc gccgcgtcga ctcctacgag cgcatccgcg cggaggagat cggggcgctc 480

gcccgcgacc tgttcggccg cgccggccgc gccgtcgccg tgcgggagcg cctcgcgagc 540

gcgacgctgc ggaacatcct ccgcatgtcg gtcggcgaca agtggtcggg cgtctacggc 600

agcgccgacg gcgaggcgtt ccggcgcacg ctcgacgagg cgttcgaggt gtccggcgcg 660

gtgagcaacg tcggcgagtg ggtctccttg ctggggtggc tcgacgtgca ggggtttcgc 720

cggaggatga agcggctgag caagatgtac gaccggttcc tcgagcagat ccttcacgag 780

cacgaggcga gcatggcggc cgccggtgac ggcggccagc ccgcggcggc ggcgtgcgac 840

ctcgtcgacg tacttctgca actctccggc gaggaggagg agggcagcgc gggcgcgggc 900

gcggactcgg aggcgaggct gacgcgcgac ggcgtgaagg cgttcatcct ggacatcatc 960

gccggcggca cggagagcag cgcggtggcg atggagtggg cgatggcgga gctcctccgc 1020

cgccccgacg ccatggccgc cgccaccgac gagctcgacc gcgtggtcgg gacggcgcgg 1080

tgggtgacgg agcgcgacat ccccgacctc ccctacgtcg acgccgtcgt gaaggaggcg 1140

ctgcggctgc acccggtggg cccgctgcta gtcccgcacc acgccatgga ggacacggtg 1200

gtcgccggcg gctacgtcgt ccccgccggc gcgcgcgtgc tggtgaacgc gtgggccatc 1260

gcgcgcgacc cggcgtcgtg gcccgaccgc cccgatgcgt tcctgccaga gcgcttcctc 1320

cccggcggcg gcgccgccgc cgccggattg gacgtgcgcg ggcagcacta cgagctgctg 1380

ccgttcgggt cggggcggcg ggtctgcccg gcgacgaacc tggcgatgaa gatggtggcg 1440

ctgggcgtgg cgagcttggt gcaggggttc gcgtggcggc tgccggacgg cgtggcggcg 1500

gaggacgtga gcatggagga gctggtcggg ctgtccacgc gccggaaggt gccgctcgtc 1560

gccgtcgccg agcccaggct gccggcgcat ctctacgccg gcaccgccgc atga 1614

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(OsCYP92C21-F)

<400> 3

atggccatgt cttcgtgg 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(OsCYP92C21-R)

<400> 4

tcatgcggcg gtgccgg 17

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(CYP92C21-PYES2F)

<400> 5

ctatagggaa tattaagctt atggccatgt cttcgtgggt cgccaccatc 50

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(CYP92C21-PYES2R)

<400> 6

ggccgttact agtggatcct catgcggcgg tgccggcg 38

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(GAL1-F)

<400> 7

aatatacctc tatactttaa cgtc 24

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(CYC1-R)

<400> 8

gcgtgaatgt aagcgtgac 19

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(gRNA1)

<400> 9

gggatcgtgc acaccccgta cgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(gRNA2)

<400> 10

acttctgcaa ctctccggcg agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(92gRNA1-F)

<400> 11

gccgggatcg tgcacacccc gta 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(92gRNA1-R)

<400> 12

aaactacggg gtgtgcacga tcc 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(92gRNA2-F)

<400> 13

ggcacttctg caactctccg gcg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(92gRNA2-R)

<400> 14

aaaccgccgg agagttgcag aag 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(U-F)

<400> 15

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(gRNA-R)

<400> 16

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(B1’)

<400> 17

ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(B2)

<400> 18

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(B2’)

<400> 19

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(BL)

<400> 20

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40

<210> 21

<211> 13497

<212> DNA

<213> 载体序列(PTGH3-OsCYP92C21)

<400> 21

gaattctctt aggtttaccc gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taattcccga 60

tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg 120

ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata 180

aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat 240

atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg 300

tttgaacgat cgggggaatt cgagctggtc agagctctca tgcggcggtg ccggcgtaga 360

gatgcgccgg cagcctgggc tcggcgacgg cgacgagcgg caccttccgg cgcgtggaca 420

gcccgaccag ctcctccatg ctcacgtcct ccgccgccac gccgtccggc agccgccacg 480

cgaacccctg caccaagctc gccacgccca gcgccaccat cttcatcgcc aggttcgtcg 540

ccgggcagac ccgccgcccc gacccgaacg gcagcagctc gtagtgctgc ccgcgcacgt 600

ccaatccggc ggcggcggcg ccgccgccgg ggaggaagcg ctctggcagg aacgcatcgg 660

ggcggtcggg ccacgacgcc gggtcgcgcg cgatggccca cgcgttcacc agcacgcgcg 720

cgccggcggg gacgacgtag ccgccggcga ccaccgtgtc ctccatggcg tggtgcggga 780

ctagcagcgg gcccaccggg tgcagccgca gcgcctcctt cacgacggcg tcgacgtagg 840

ggaggtcggg gatgtcgcgc tccgtcaccc accgcgccgt cccgaccacg cggtcgagct 900

cgtcggtggc ggcggccatg gcgtcggggc ggcggaggag ctccgccatc gcccactcca 960

tcgccaccgc gctgctctcc gtgccgccgg cgatgatgtc caggatgaac gccttcacgc 1020

cgtcgcgcgt cagcctcgcc tccgagtccg cgcccgcgcc cgcgctgccc tcctcctcct 1080

cgccggagag ttgcagaagt acgtcgacga ggtcgcacgc cgccgccgcg ggctggccgc 1140

cgtcaccggc ggccgccatg ctcgcctcgt gctcgtgaag gatctgctcg aggaaccggt 1200

cgtacatctt gctcagccgc ttcatcctcc ggcgaaaccc ctgcacgtcg agccacccca 1260

gcaaggagac ccactcgccg acgttgctca ccgcgccgga cacctcgaac gcctcgtcga 1320

gcgtgcgccg gaacgcctcg ccgtcggcgc tgccgtagac gcccgaccac ttgtcgccga 1380

ccgacatgcg gaggatgttc cgcagcgtcg cgctcgcgag gcgctcccgc acggcgacgg 1440

cgcggccggc gcggccgaac aggtcgcggg cgagcgcccc gatctcctcc gcgcggatgc 1500

gctcgtagga gtcgacgcgg cgcggggaga agagctcggt ggcgcagagc ttgcgcgcca 1560

tgcgccagta ggcgccgtac ggggtgtgca cgatcccctt gtagttgtac gcgacgagct 1620

cgccggcggc ggtgcgcgcg cggtcggcga aggcggcgtc gtgggtcttg aggacgagcc 1680

tggcggcgcc ggcggaggag gcgaccacgg cgtcgaacga gcccagccgg aggtgcatga 1740

gcgggccgtg gcgcgccgcg agcgccgcca gggcgcggtg cggcgggagc gcgcccgcca 1800

gggcgccgag gctgccgaac accggccacc cgcgcggccc cggcgggagg ttcagccgcg 1860

ccttcgtccg gcgctggcgg ccacgcaacg aagccacggc gacgccgatg aggagggtga 1920

cgatggtggc gacccacgaa gacatggcca tggatcctct agagtcgacc tgcagaagta 1980

acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa agaaacagta ccaagcaaat aaatagcgta 2040

tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata gctgctgcat atgccatcat ccaagtatat 2100

caagatcaaa ataattataa aacatacttg tttattataa tagataggta ctcaaggtta 2160

gagcatatga atagatgctg catatgccat catgtatatg catcagtaaa acccacatca 2220

acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat 2280

gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta ataaatacac caggtagttt gaaacagtat 2340

tctactccga tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac accacatcat cacaaccaag 2400

cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc 2460

ctagatcgat atttccatcc atcatcttca attcgtaact atgaatatgt atggcacaca 2520

catacagatc caaaattaat aaatccacca ggtagtttga aacagaattc tactccgatc 2580

tagaacgacc gcccaaccag accacatcat cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag 2640

atgacccgac aaacaagtgc acggcatata ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc 2700

ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca 2760

tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac 2820

aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc acggatctaa cacaaacacg gatctaacac 2880

aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag 2940

aaggtagaga gggggggggg gggaggacga gcggcgtacc ttgaagcgga ggtgccgacg 3000

ggtggatttg ggggagatct ggttgtgtgt gtgtgcgctc cgaacaacac gaggttgggg 3060

aaagagggtg tggagggggt gtctatttat tacggcgggc gaggaaggga aagcgaagga 3120

gcggtgggaa aggaatcccc cgtagctgcc gtgccgtgag aggaggagga ggccgcctgc 3180

cgtgccggct cacgtctgcc gctccgccac gcaatttctg gatgccgaca gcggagcaag 3240

tccaacggtg gagcggaact ctcgagaggg gtccagaggc agcgacagag atgccgtgcc 3300

gtctgcttcg cttggcccga cgcgacgctg ctggttcgct ggttggtgtc cgttagactc 3360

gtcgacggcg tttaacaggc tggcattatc tactcgaaac aagaaaaatg tttccttagt 3420

ttttttaatt tcttaaaggg tatttgttta atttttagtc actttatttt attctatttt 3480

atatctaaat tattaaataa aaaaactaaa atagagtttt agttttctta atttagaggc 3540

taaaatagaa taaaatagat gtactaaaaa aattagtcta taaaaaccat taaccctaaa 3600

ccctaaatgg atgtactaat aaaatggatg aagtattata taggtgaagc tatttgcaaa 3660

aaaaaaggag aacacatgca cactaaaaag ataaaactgt agagtcctgt tgtcaaaata 3720

ctcaattgtc ctttagacca tgtctaactg ttcatttata tgattctcta aaacactgat 3780

attattgtag tactatagat tatattattc gtagagtaaa gtttaaatat atgtataaag 3840

atagataaac tgcacttcaa acaagtgtga caaaaaaaat atgtggtaat tttttataac 3900

ttagacatgc aatgctcatt atctctagag aggggcacga ccgggtcacg ctgcactgca 3960

ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 4020

ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 4080

aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca 4140

gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt taaactatca gtgtttgaca 4200

ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac ggatatttaa 4260

aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac cacagggttc 4320

ccctcgggat caaagtactt tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag tcggcttctg 4380

acgttcagtg cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca 4440

ggctgccgcc ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta 4500

gaatacttgc gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg ccgctggcct 4560

gctgggctat gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac gggccgaact 4620

gcacgcggcc ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg 4680

cccggagctg gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga cagtgaccag 4740

gctagaccgc ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc gcatccagga 4800

ggccggcgcg ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg 4860

ccgcatggtg ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga 4920

ccgcacccgg agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc 4980

taccctcacc ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac 5040

cgtgaaagag gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga 5100

gcgcagcgag gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc 5160

attgaccgag gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg 5220

aaaccgcacc aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag 5280

atgatcgcgg ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat 5340

gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag cttggccgct 5400

gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt 5460

catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca 5520

tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc 5580

atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc 5640

agggcagtgc ccgcgattgg gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc gttgtcggca 5700

tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga 5760

tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg 5820

tgctgattcc ggtgcagcca agcccttacg acatatgggc caccgccgac ctggtggagc 5880

tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc 5940

gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc 6000

tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg 6060

gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg 6120

ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag 6180

cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc 6240

cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca 6300

caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc tgctatctga 6360

atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga tgaattttag 6420

cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc 6480

ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct 6540

gcaatggcac tggaaccccc aagcccgagg aatcggcgtg acggtcgcaa accatccggc 6600

ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag 6660

gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc 6720

gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg 6780

aagccgccca agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc 6840

acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga 6900

cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg 6960

ccggccggca tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta 7020

accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt 7080

ccacacgttg cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac 7140

gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag 7200

aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat tagccgctac 7260

aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct agctgattgg 7320

atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac 7380

tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc 7440

aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag cgccggagag 7500

ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac 7560

gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg 7620

atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc 7680

ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac 7740

ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc gtacattggg 7800

aaccggtcac acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa 7860

aactctttaa aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc 7920

cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc 7980

cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg 8040

ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca 8100

catcaaggca ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 8160

gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 8220

gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga 8280

tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 8340

catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct 8400

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 8460

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 8520

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 8580

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 8640

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 8700

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 8760

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 8820

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 8880

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 8940

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 9000

aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 9060

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 9120

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 9180

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 9240

atgcattcta ggtactaaaa caattcatcc agtaaaatat aatattttat tttctcccaa 9300

tcaggcttga tccccagtaa gtcaaaaaat agctcgacat actgttcttc cccgatatcc 9360

tccctgatcg accggacgca gaaggcaatg tcataccact tgtccgccct gccgcttctc 9420

ccaagatcaa taaagccact tactttgcca tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg 9480

tcgccgtggg aaaagacaag ttcctcttcg ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc 9540

tcgcgcggat ctttaaatgg agtgtcttct tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga 9600

tcgttattca gtaagtaatc caattcggct aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga 9660

caatccgata tgtcgatgga gtgaaagagc ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc 9720

ttttcagggc tttgttcatc ttcatactct tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc 9780

atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc 9840

tttccttcca gccatagcat catgtccttt tcccgttcca catcataggt ggtcccttta 9900

taccggctgt ccgtcatttt taaatatagg ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc 9960

ttagcaggag acattccttc cgtatctttt acgcagcggt atttttcgat cagttttttc 10020

aattccggtg atattctcat tttagccatt tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt 10080

taaagatacc ccaagaagct aattataaca agacgaactc caattcactg ttccttgcat 10140

tctaaaacct taaataccag aaaacagctt tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata 10200

acatagtatc gacggagccg attttgaaac cgcggtgatc acaggcagca acgctctgtc 10260

atcgttacaa tcaacatgct accctccgcg agatcatccg tgtttcaaac ccggcagctt 10320

agttgccgtt cttccgaata gcatcggtaa catgagcaaa gtctgccgcc ttacaacggc 10380

tctcccgctg acgccgtccc ggactgatgg gctgcctgta tcgagtggtg attttgtgcc 10440

gagctgccgg tcggggagct gttggctggc tggtggcagg atatattgtg gtgtaaacaa 10500

attgacgctt agacaactta ataacacatt gcggacgttt ttaatgtact gaattaacgc 10560

cgaattaatt cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt 10620

ttattgatag aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac 10680

acatgagcga aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattat 10740

tatggagaaa ctcgagttat caagcaccgg ctcccacggt cctgccggca gcgagcatac 10800

gctcccacat cctgtcgaag cctgggaggg tcttcgcagt cgtaccgacg ttctccacct 10860

gcacacccgg caccctaaga ccgagcacag cggcggatgt agccatgcga tggtcggcgt 10920

aggtacggaa ggtggcgccg tgcaatggcc tcggggtgat aacgagtcca tccctggtct 10980

cctcgcacct gcctccgagc cttgtgatct ctgtagcaag agcggcgagc ctgtcggtct 11040

catggccgcg aaggtgagcg atgccgcgga gcctgctcgg ggaatccgcc agagcggcga 11100

gagcggcgaa cgttggagcc agttcgccag cggcgtgcag gtcaacgtcg atgccgtgaa 11160

tctctccagt gccggtgaca gcgagcacgc ttgtgccatc gtcagcagtg tgttccacgg 11220

taaccctgcc acccatgcgc tcaagcagct ctggcaccat agctcccggc tgggtggtgc 11280

tggcaggcca tcccggcacc ctcacggttc caccggcagc gagggcggca gcaaggaacg 11340

gagcggcgtt ggagaggtct ggctcgaccc tcacgtccct agcgctaatc gcgcccggtg 11400

aaacgtgcca gatgccgtcc ctgctatcgt ccacagcgac gcccacttcc ctgagggtag 11460

ccactgtcat ctcgatgtgc gggagggatg ggagggtggc tccgatgtgg cggagggcga 11520

ggccgtcgtc gaaccttggg gcggcgagca gcaggccgga cacgaactgc gagctagcag 11580

aggcgtccac atccacagct ccgccgcgca gggaaccctt gccgtgaacg gtgaatggaa 11640

ggtgggacgg gaagtctggt ccgtcgccgg tgaccttcac gccgagggcg cgcagcgcgg 11700

cgagcaccgg gagcatcggc ctcaccctgg cctctggatc gccgtcgaac ctaaccggac 11760

cgtcagcgag ggcagccact ggtgggagga acctcatcac ggttccggca aggccagtga 11820

acacgtcgac atcgcccctc actggacccg gagtaacgtg cagggtgctt ggctcagtgc 11880

cctcggtgat ctcagcgcca agagccctga gggcggcgat catcagatcg gcgtccctgg 11940

acctgagggc tcccctcagc acacctgggc cgtctgcgag agcggcaagc accaggagcc 12000

tgttggtgag ggacttgctg cctgggatct ccacggtagc gtccagctct cctggcgcca 12060

ccggggcctc ccacggagcc tcggacgctg gagccgggct ggtggcgtct ggggaagctg 12120

gggccggggt catgcatgcg gtggacacgc tggacatcac cttgagcggc ctcagctcgg 12180

agccgatgag ggtcatgccg ctcttcttga ggccccagga gctggagatc gggtaggccc 12240

tcgggtgctg ctgggtcttg agggacacgg agagcgggga cttcctctgg ctggacttgg 12300

agaggttgct gatgaggctc gggttctgca cgccgttgca gatcctggac acctgggcca 12360

tggtaccagc cttacctttg ggtggggggg ttttcgcttt aaggaaaccg gttacaggca 12420

aatgatatcc cgcacaagct gcgtgtgacg acgctcagag tgagtctctc gagagagata 12480

gatttgtaga gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt 12540

atatagagga aggtcttgcg aaggatagtg ggattgtgcg tcatccctta cgtcagtgga 12600

gatatcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat 12660

gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat 12720

agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct 12780

tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct 12840

ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga 12900

gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt 12960

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc 13020

actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta 13080

ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa 13140

tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc 13200

tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttggc 13260

aagctgctct agccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 13320

agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg 13380

agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg 13440

tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattac 13497

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(I.variabilis-mEPSPS-F)

<400> 22

attagcgcta gggacgtgag 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(I.variabilis-mEPSPS-R)

<400> 23

atacgctccc acatcctgtc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(NU-F)

<400> 24

ggcatatgca gcatctattc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CYP92C21JC-R)

<400> 25

tcgtgggtct tgaggacgag 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(PlTPS4YJ-F)

<400> 26

ccaatgattt cgctgaagag 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(PlTPS4YJ-R)

<400> 27

tggagaggca tggattactg 20

Claims (10)

1.水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92C21，其特征在于，所述蛋白OsCYP92C21的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述水稻DMNT和TMTT合成相关蛋白OsCYP92的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是编码权利要求1所述的蛋白OsCYP92C21的基因；所述基因是如下(1)至(2)中任一项所述的DNA分子：

(1)序列为SEQ ID NO：2；

(2)编码序列为SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA分子杂交且编码蛋白质OsCYP92C21的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述的核酸分子的重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组工程菌。

5.权利要求1所述的蛋白OsCYP92C21、或权利要求2或3所述的核酸分子、或权利要求4所述的重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组工程菌的应用：能够趋避植食性害虫或吸引植食性害虫的天敌。

6.根据权利要求5所述的蛋白OsCYP92C21、或权利要求2或3所述的核酸分子、或权利要求4所述的重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组工程菌在转基因植物中的应用。

7.一种培育新型抗虫水稻的方法，其特征在于，包括将编码权利要求1所述的蛋白OsCYP92C21的基因、或权利要求2或3所述的核酸分子导入目的植物水稻中得到转基因水稻的步骤。

8.根据权利要求7所述的培育新型抗虫水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将编码权利要求1所述的蛋白OsCYP92C21的基因、或权利要求2或3所述的核酸分子导入目的植物中得到转基因水稻株系；

S2，筛选步骤S1中的纯合阳性转基因单株；

S3，将步骤S2中筛选得到的纯合阳性转基因单株与PTGH3-PlTPS4纯合株系杂交得到双基因聚合水稻。

9.根据权利要求8所述的培育新型抗虫水稻的方法，其特征在于，步骤S2中纯合阳性转基因单株的筛选包括以下步骤：

S2-1，对步骤S1中的转基因水稻株系进行拷贝数分析，得到单拷贝转基因株系；

S2-2，将S2-1中的单拷贝株系进行自交得到T1代；

S2-3，将S2-2中得到的T1代单株的成熟种子在含有甘草磷的培养基上进行发芽试验，所述成熟种子是T1代自交得到；

S2-4，成熟种子能够同时在不含草甘膦的对照培养基和含有草甘膦的实验组培养基上发芽且发芽率为100％的T1代单株即为纯合阳性转基因单株。

10.根据权利要求8所述的培育新型抗虫水稻的方法，其特征在于，步骤S3中PTGH3-PlTPS4纯合株系通过以下步骤得到：将立马豆来源的PlTPS4基因连入PTGH3植物表达载体，然后将该载体通过农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻中，在T₀代转化苗中筛选出单拷贝的PTGH3-PlTPS4纯合株系。

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