CN105647880A - 一个参与dmnt和tmtt生物合成的cyp450基因及其编码产物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因及其编码产物与应用，属于植物分子生物领域，本发明提供的蛋白如SEQ？ID？NO2所示的氨基酸序列。本发明的实验证明，本发明得到立马豆PlCYP82的cDNA核酸序列及PlCYP82编码蛋白序列；在酵母WAT21细胞中表达的PlCYP82蛋白具有催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇的活性；采用浸花法获得转PlCYP82基因拟南芥，结果表明转PlCYP82的拟南芥植株可显著吸引小菜蛾绒茧蜂雌虫。

Description

一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因及其编码产物与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及DMNT和TMTT化合物合成相关的蛋白，编码其的基因及其应用。

背景技术

在植物的众多化合物中，有一些是挥发性物质。植物挥发物在植物抵御虫害的过程中发挥着重要的作用。当植物受到害虫的危害之后，植物会感知到，并通过合成释放挥发性物质来趋避害虫或引诱植食性昆虫的天敌来减轻害虫危害，从而提高植物的抗虫性。萜烯类挥发物包括单萜类，倍半萜类，二萜类和萜烯同系物(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯((E)-4，8-dimethyl-1，3，7-nonatriene，DMNT)和(E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳四烯((E，E)-4，8，12-trimethyltrideca-1，3，7，11-tetraene，TMTT)等。DMNT和TMTT是植物花香挥发物和害虫诱导挥发物中最常见的一类，这两种物质在单子叶植物和双子叶植物中广泛存在，包括杨树和胡桃树等树种，还有玉米、拟南芥、棉花、利马豆、黄瓜、番茄和大白菜等作物。DMNT和TMTT在生态系统能吸引多种害虫的寄生性天敌和捕食性天敌，如智利小植绥螨、微红盘绒茧蜂和盔奥啮小蜂等。此外，DMNT和TMTT能诱导或预警未被危害的邻近植物或同一植物内的防御反应。

DMNT和TMTT的前体分别为(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇。但是，把橙花叔醇和香叶基芳樟醇转化为DMNT和TMTT的关键酶很久都未解决。氘标记的代谢物探针研究表明叔醇通过碳碳骨架沟的氧化反应而形成萜烯同系物。通过拟南芥的共表达数据库鉴定出一批在多种压力胁迫下与香叶基芳樟醇合成酶基因共表达的P450基因，该方法结合对诱导处理叶片的RT-PCR研究，鉴定到一个候选的P450基因。通过酵母表达和对拟南芥突变体株系的回补实验研究，发现植物的CYP82家族成员CYP82G1(At3g25180)负责着拟南芥TMTT的合成。

CYP450酶为血红蛋白结合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一个保守的血红素结合域，是鉴定该基因的一个重要特征。拟南芥基因组中有272个CYP450基因，拟南芥基因组注释显示有457个CYP450基因，如此庞大的基因家族反映了植物次生代谢物的复杂多变。各种CYP450酶催化的反应广泛并且复杂，包括羟基化、N-、0-和S-端的脱烷基化、环氧基化、脱氨基作用、脱硫、脱卤作用和过氧化反应等。尽管催化反应各异，催化机理却相同，即通过NADPH或者NADH为CYP450传递电子，激活氧分子，将其中的一个氧插入到底物上，同时生成一分子水。CYP450酶作为萜类、黄酮类、脂肪酸类和植物激素等合成代谢途径的一类重要酶蛋白，不但催化相关代谢反应，由于大多数的CYP450蛋白均有一段内质网膜定位蛋白，因此在代谢区室(Metabolon)的酶复合体中还具有固定酶复合体的作用。随着分子生物学以及相关检测技术的不断发展，次生代谢途径相关的CYP450基因功能逐渐得以验证。真核表达、原核表达以及RNA干扰(RNAInterference)等技术在CYP450基因的功能验证中发挥了重要作用。近年来利用真核表达使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物挥发物等代谢途径中的重要作用逐渐被解析。但是作为在植物次生代谢中发挥作用的CYP450表达量相对较低，并且大多CYP450蛋白具有严格的催化底物结构特异性，同时基因组中广泛存在的CYP450基因为次生代谢相关基因的克隆和功能验证提供了难度，使之成为了近年来国际学术界的研究热点之一。

到目前为止DMNT和TMTT合成通路只有在拟南芥中被解析。在其他物种中的研究尚停留在化合物鉴定和行为学研究方面，尚未有DMNT和TMTT合成通路基因被报道。特别是在农业生产中重要的植物，如蔬菜和农作物等方面的研究更为有限，这限制了我们对于DMNT和TMTT合成通路的认识，也限制了DMNT和TMTT在绿色农业生产中的应用。这极大的限制了DMNT和TMTT在农作物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一个立马豆DMNT和TMTT生物合成代谢途径的CYP450基因PlCYP82，其编码的蛋白在含有NADPH的缓冲体系中能催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇生成DMNT和TMTT。

本发明提供了一种与DMNT和TMTT合成代谢有关的基因PlCYP82，它是序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。以及一种由上述基因CYP450编码的蛋白质，具有序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列以及具有SEQIDNo.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNo.2衍生的蛋白质。

本发明SEQIDNo.1的DNA序列由1713个碱基组成，其中71-1657的碱基编码528个氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQIDNo.2。

含有本发明基因PlCYP82的表达载体、细胞系及宿主菌和使用该基因在调节和生产植物DMNT和TMTT化合物及植物抗虫育种中的应用也在本发明的保护范围之内。

将SEQIDNo.1基因克隆到真核表达载体PYES2的限制性内切酶BamHI和NheI位点间，构建带有PlCYP82基因的重组表达载体pESC-TRP-PlCYP82；转入酵母菌株WAT21表达宿主菌采用半乳糖诱导表达。通过提取表达菌株微粒体，加入到以(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇为底物的体外酶促反应体系中，正己烷萃取反应产物，GC-MS分析。GC-MS分析结果表明(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇在PlCYP82蛋白酶的催化下，生成了新的物质，通过分析新产物的分子离子峰与DMNT和TMTT标样对比，认为该产物为DMNT和TMTT。

研究结果表明，本发明与立马豆DMNT和TMTT合成有关的基因具有细胞色素P450基因的特征结构域，酶促反应分析发现该基因催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇形成防御性挥发物DMNT和TMTT，对于调节和生产植物DMNT和TMTT挥发物及培育新的抗虫作物具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1.立马豆PlCYP82基因的PCR克隆

M：DNA分子量标准(D2000)；P：PCR产物

图2.重组质粒pESC-TRP-PlCYP82的PCR鉴定

M：DNA分子量标准(D2000)；P：PCR产物

图3.利马豆PlCYP82基因在酵母中反应产物的GC-MS图

PlCYP82基因以(E)-Nerolidol和(E,E)-Geranyllinalool为底物的酵母反应产物(A和C)；空载体以(E)-Nerolidol和(E,E)-Geranyllinalool为底物的酵母反应产物(B和D)；1.DMNT；2.(E)-Nerolidol；3.TMTT；4.(E,E)-Geranyllinalool；E：DMNT产物质谱图；F:DMNT标样质谱图；G:DMNT产物质谱图；H:TMTT标样质谱图。

图4.转PlCYP82拟南芥的分子检测

M：DL2000marker.1-3是拟南芥转基因阳性植株，4是野生型拟南芥，5是GK377A01拟南芥植株。

图5.过表达PlCYP82基因、野生型和GK377A01拟南芥植株的挥发物分析

A:过表达PlCYP82基因拟南芥植株；B:野生型拟南芥植株；C:GK377A01拟南芥植株；D:TMTT标样。

图6.过表达PlCYP82基因、野生型和GK377A01拟南芥植株的TMTT释放量

A:过表达PlCYP82基因拟南芥植株；B:野生型拟南芥植株；C:GK377A01拟南芥植株

图7.小菜蛾绒茧蜂雌虫对过表达PlCYP82基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株的选择

具体实施例方式

实施例1.立马豆总RNA的提取和cDNA的合成

立马豆的总RNA的提取参照天根生化科技有限公司RNAsimple总RNA提取试剂盒中的说明手册提取。琼脂糖凝胶电泳检测并通过NanoDrop测定浓度。cDNA第一链的合成采用TAKATA公司的primerscriptTM1ststrandcDNASynthesisSystem反转录试剂盒，方法参照试剂盒中的说明手册。同时，为了获得基因全长，用SMARTer^TMRACEcDNA扩增试剂盒，进行cDNA的合成，方法参照试剂盒中的说明手册。

实施例2.引物设计与基因克隆

根据拟南芥CYP82基因(at3g25180)，在菜豆基因组网站http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#；！info？alias＝Org_PvulgarisV1.0上进行blast，获得立马豆CYP基因部分保守序列。根据该基因的序列设计保守引物，通过RACE技术在克隆立马豆中的同源基因。5RACEprimer1:TCCTGAAATAGGGTATTCTAGCATT；5RACEprimer2:CGGGTACTTTGGTGCCCTTTTTAGG；3RACEprimer1:GGCATGACATTTGGGCTGCAAGTGC；3RACEprimer2:GTTAGGAGTGGCTTTGCCTAAAGAA，引物由北京华大基因公司合成。通过巢氏PCR获得基因全长。

立马豆种子，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

以立马豆的cDNA为模板，通过RACE扩增，得到1713bp的PCR产物(图1)(含70bp的5'UTR和56bp的3'UTR序列)。目的片段利用TA克隆的方法连接到T-easy载体(购自北京全式金公司)后，构建成PlCYP82测序载体，经过测序(序列见SEQIDNO1)，该1713bp的PCR产物含有的基因编码区位于第71-1657位，将该基因命名为PlCYP82，该基因编码的蛋白命名为PlCYP82；该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQIDNO2，共528个氨基酸。经过序列比对，PlCYP82与拟南芥at3g25180基因核苷酸的相似性为43％。

PlCYP82测序载体为将序列表中的序列1插入T-easy载体得到的载体。

实施例3.PlCYP82在合成TMTT和DMNT中的应用

1.载体构建

以T-PlCYP82测序载体为模板，利用高保真酶TranStartFastPfuDNAPolymerase及引物PlCYP82F1(5'-GATCGGACTACTAGCAGCTGTAATACGACT-3')/PlCYP82R1(5'-GGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCG-3')，得到1713bp的带有A末端的目的片段(具有序列表中序列1的核苷酸)。将上述带有A末端的目的片段参照全式金生物有限公司pEASY-ElExpressionKit说明书与载体pEASY-El连接，得到的连接产物转入普通大肠杆菌后涂于含Amp(50mg/ml)的LB平板上过夜培养。

挑取单克隆利用T7F(5’-TAATACGACTCACTATA-3')及目的基因下游引物PlCYP82R1进行检测，得到阳性克隆。将阳性克隆提取质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列1自5’末端第71-1657位核苷酸利用TA克隆的方法插入载体pESC-TRP的BamHI和NheI酶切位点间得到的载体，命名为pESC-TRP-PlCYP82。

将pESC-TRP-PlCYP82转化DH5a感受态细胞，转化过程见天根生化科技(北京)有限公司DH5a感受态细胞说明书，将DH5a/pESC-TRP-PlCYP82利用目的基因特异引物进行PCR检测,证明pESC-TRP-PlCYP82已转入大肠杆菌中(图2)。

2.PlCYP82蛋白的诱导表达

采用Clontech公司提供的LiAc/ssDNA/PEG法制备酿酒酵母感受态细胞并进行重组质粒的转化。将构建的pESC-TRP-PlCYP82质粒转化表达宿主菌WAT21，获得的酵母转化子经菌液PCR检验，20ul反应体系为:EasyTaqDNA聚合酶0.2ul、10倍buffer2ul,dNTP混合物1.6ul(2.5mmol/L)、PlCYP82基因的上下游引物各0.5ul(10.0umol/L),经玻璃珠破壁处理的模板适量，用ddH₂O补足至20ul。反应程序为:94℃预变性10min，94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1.5min,32个循环，最后72℃延伸10min。选取PCR检验为阳性的菌落进行下一步试验。以转入pESC-TRP空载体的酿酒酵母作为对照。将酵母阳性克隆接种到5mL含2％葡萄糖的SC-TRP液体培养基中，于300C,300r/min过夜培养，10mL体积扩大培养至OD₆₀₀达到0.8,3次重复，培养物于4℃1100g离心5min，细胞沉淀用等体积ddH₂O洗涤3次后换用含2％半乳糖的SC-TRP液体培养基重悬，所得菌体制成微粒体用于进行酶活检测。

在含有pESC-TRP-PlCYP82表达蛋白微粒体的缓冲体系加入NADPH和底物(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇进行催化反应，缓冲体系包括50mM的Tric-HCl(PH7.4)、1mM的EDTA、0.6M的山梨醇、20％的甘油，1mMNADPH和40μM底物(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇，另外在PH范围7.4-8.0的缓冲体系中均有相同的功能。催化反应温度20-40度之间，15分钟以上。反应完全后用正己烷萃取催化产物，进行GC-MS分析。取lμl样品进样，利用气质联用系统GC-MS(HP6890/HP5973,Hewlett-Packard公司)，色谱柱HP-5MS(60m×250μm×0.25μm；Hewlett-Packard公司),GC-MS仪器进行分析。升温程序为:40℃保持1min，以5min5℃的增量升到250℃(1℃/min)，最后250℃保持17min。MS检测范围为40-550,温度为170℃。结果发现以(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇为底物，包含有PlCYP82基因重组表达载体pESC-TRP-PlCYP82催化组与空载体对照以及其他基因表达载体反应产物相比有新物质产生(图3)，气质谱图如图3，与DMNT和TMTT质谱图相一致，产物鉴定为DMNT和TMTT。说明CYP450基因编码的蛋白在DMNT和TMTT合成代谢途径中能催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇生成DMNT和TMTT(图3)。

实施例5.PlCYP82在拟南芥挥发TMTT中的应用

1.转PlCYP82回补拟南芥at3g25180突变体的获得

1)表达载体的构建

对目的基因引物PlCYP82F2：ATGGATTCCCATGTCCCAAC和PlCYP82R2：TCAAAGGCTTTCATAAAGCATCA增加SpeI和SstI酶切位点，以立马豆cDNA为模板，利用高保真酶进行扩增。PCR反应体系为5×TansFastPfuBuffer10μ1,dNTP(2.5mmol·1-1^-1)5μ1,TansFastPfuDNAPolymerase1μ1，Forwardprimer(l0μmol·L^-1)lμl、Reverseprimer(10μmol·1^-1)1μ1,cDNA1μ1，用ddH₂O补足至50μ1。PCR的反应条件为95℃2min；95℃20s,60℃20s,72℃15s,40个循环；72℃5min；4℃保存。

1％琼脂糖凝胶电泳，结果为得到1587bp的PCR扩增产物，切胶回收，得到回收片段。将pCB302-3过表达载体质粒与回收片段同时利用SpeI和SstI进行4h双酶切，该载体含有CaMV35S启动子，可驱动目的基因的过量表达。连接载体的酶切体系为10×NEBBuffer45μ1,100×BSA0.5μ1,PlCYP82质粒或回收片段2μg,SpeI1μ1,SstIlμl，用ddH₂O补足至50μ1。纯化回收酶切产物。T₄连接酶4℃过夜连接，连接体系为pCB302-3片段3μ1，目的基因酶切片段2μ1,l0×Buffer1μ1,T₄DNALigase0.5μ1，用ddH₂O补足至10μ1。连接产物转化大肠杆菌后，得到转化子。提取转化子的质粒，用引物PlCYP82F/R进行PCR检测、酶切鉴定，测序结果表明该质粒为将序列表中序列1自5’末端第71-1657位核苷酸插入pCB302-3的SpeI和SstI酶切位点得到的质粒，将该质粒命名为pCB302-3-PlCYP82。

2)农杆菌介导的拟南芥转化(浸花法)

A:拟南芥at3g25180突变体

拟南芥at3g25180的T-DNA插入突变体，编号为GABIKat(GK)377A01从NASC(uropeanArabidopsisStockCentre)购买获得。该突变体的回补实验可用于证实TMTT通路上P450候选基因的功能，详细请参考LeeS,BadieyanS,BevanDR,etal.Herbivore-inducedandfloralhomoterpenevolatilesarebiosynthesizedbyasingleP450enzyme(CYP82G1)inArabidopsis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(49):21205-21210.选择纯合的GK377A01突变体用于基因回补实验。

B:农杆菌电击感受态的制备

(1)挑取农杆菌AGLl单菌落接种到lml的LB液体培养基中，短暂涡旋使细胞充分悬浮，将悬浮液接种到l0ml含梭苄霉素400mg/L的LB液体培养基中，28℃,250rpm震荡培养过夜；

(2)将l0ml已培养的菌液接种到100m1含400mg/L羧苄霉素的LB液体培养基中，28℃,250rpm震荡培养，在OD值为0.5左右时，进行操作；

(3)将在冰上静置30min后菌液的，在4℃条件下，4000rpm离心l0min，去上清，加入20m110％的甘油重悬菌体；

(4)在4℃条件下，4000rpm离心l0min，弃上清，加入l0ml含有10％甘油重悬菌体；

(5)在4℃条件下，4000rpm离心l0min，弃上清，缓慢加入2m1含有10％甘油重悬菌体；

(6)将制好的感受态分装(每管50μ1)，液氮冷冻后于-80℃保存备用。

C:电击转化农杆菌

(1)在冰上将lμl的重组质粒pCB302-3-PlCYP82加入50μ1电击农杆菌感受态中，轻轻混和均匀；

(2)将混合物加入电极杯的中央后再把电极杯放入槽孔中；

(3)调农杆菌电击参数，电击混合物；

(4)加入100μ1LB液体培养基后将混合物吸出，再加入500μ1LB液体培养基，28℃，230rpm复苏2h；

(5)将上述混合物均匀涂在含100mg/LKan和100mg/LCarb的LB平板上；

(6)在28℃黑暗温箱中倒置培养2-3d；

(7)挑取单克隆菌株进行PCR检测。

D:浸花法拟南芥转化

lml:20m1接种农杆菌。28℃,250rpm过夜培养，次日按5m1:100m1接种，28℃,250rpm过夜培养，次日上午测OD值，用LB+Kan+Carb作为空白对照，当菌液达到OD600为0.8左右时，4℃,5000g离心12min收集菌体。100m1悬浮液(1/2MS,l0mMMgC1₂,5％蔗糖，500μ1/LSilwelt)悬浮后，导入小烧杯中用于转化。转化时将GK377A01拟南芥的花在溶液中浸泡lmin左右，浸泡结束后，将pCB302-3-PlCYP82放倒并将每个花枝与其他花枝分开，避光保温保湿过夜。侵染后得到T₀代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥种子。

E:转pCB302-3-PlCYP82拟南芥的筛选及分子鉴定

将2000个T₀代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥种子消毒灭菌后，点种于MS+Kan(50mg/L)平板筛选，获得10棵T₀代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥。

从T₀代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥收获种子、播种，得到T₁代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥。

提取T₁代转PlCYP82拟南芥的cDNA为模板，利用PlCYP82F2：ATGGATTCCCATGTCCCAAC和PlCYP82R2：TCAAAGGCTTTCATAAAGCATCA为引物对，进行PCR扩增；

电泳结果如图4所示，M:Trans2KDNAmarker；WT为GK377A01拟南芥，1-3为T₁代转PlCYP82拟南芥，得到阳性T₁代转PlCYP82拟南芥，表明PlCYP82已转到野生型拟南芥中。T₁代植株进行PCR鉴定表明凡是经过筛选成活的全被检测为阳性。

从T₁代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥收获种子、播种，得到T₂代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥。

2.回补PlCYP82拟南芥植株产生TMTT

A:拟南芥的气体收集

为了避免土壤中挥发物的影响，利用ddH₂O将土洗净后，将植物放入玻璃瓶中，并灌满ddH₂O以保证植物正常生长。利用顶端开小口的玻璃容器、密闭的铝质金属底座以及金属夹子组装成相对封闭的系统，对拟南芥进行气体收集。按照密闭的原则组装装置，使气体利用真空泵通过炭柱过滤后进入装置，含有吸附剂的玻璃管连接于出气口。进气的流速(600m1/min)略大于出气的流速(400m1/min)。

选择播种后第28天的T₂代转PlCYP82拟南芥进行气体采集。鉴于拟南芥植株较小，挥发物较少，吸附剂在开花前期采用50mgTenaxTA聚合物，开花后采用50mgPorapaKQ聚合物。Tenax玻璃管使用前利用5m1重蒸乙醚清洗3次后，在持续的氮气通过的条件下220℃加热2h；PorapaKQ玻璃管则使用前利用1mL超纯乙醚清洗3次以上后，在持续的氮气通过的条件下132℃加热2h。气体收集完毕后，Tenax玻璃管直接用于GC-MS分析，PorapaKQ玻璃管则需要利用250μ1重蒸乙醚洗脱2次(共500μ1)至安捷伦玻璃瓶中待用。以GK377A01拟南芥和野生型拟南芥(columbia型)为对照。分别得到T₂代转PlCYP82拟南芥挥发物样品、GK377A01拟南芥挥发物样品和野生型拟南芥挥发物样品。

B:用GC-MS对过表达PlCYP82基因、野生型和GK377A01拟南芥植株的

TMTT的释放量的比较分析

用GC(Agilent公司6890N，色谱柱参数:长50m×内径0.32mm×薄膜厚度0.52μm的非极性色谱柱；电离参数:70eV,220℃；气相色谱炉温度保持在30℃1分钟，然后编程在5℃/min升温至150℃，接着10℃/min升温至150℃)对T₂代转PlCYP82拟南芥挥发物样品、GK377A01拟南芥挥发物样品和野生型拟南芥挥发物样品进行检测，对人工合成的TMTT标准样品也按该方法来处理，建立标准曲线。

结果如图5所示，其中，5A为T₂代过表达PlCYP82拟南芥挥发物在24.01min的GC峰图；5B为野生型拟南芥挥发物的GC峰图；5C为GK377A01拟南芥挥发物样品GC峰图；5D为TMTT标样在24.01min的GC峰图。对人工合成的TMTT标准样品进行对比后显示挥发物结果为TMTT(图5)。通过定量分析，发现转PlCYP82拟南芥挥发物中TMTT的含量明显增多(图6)。

实施例6.PlCYP82在吸引小菜蛾绒茧蜂雌虫中的应用

用Y型嗅觉仪检测上述花期各植株挥发物对小菜蛾绒茧蜂雌虫行为的影响，具体如下:

小菜蛾绒茧蜂在光照培养箱中用二化螟饲养，挑选小菜蛾绒茧蜂雌虫进行行为研究。Y形嗅觉仪主臂20cm，两侧臂15cm，侧臂间夹角60°。通过LS-2800型气泵推动空气进入系统，气流经活性炭、蒸馏水净化加湿后通过玻璃转子流量计进入Y形管两侧，流速控制在0.5L/min。测试时，把PlCYP82转基因拟南芥植株放到一个玻璃罐中，作为气味源，放入某一侧臂，以GK377A01拟南芥作为对照放入另一侧臂。从基管端部接入寄生蜂，每头寄生蜂观察5min，如寄生蜂爬过侧壁1/3处并停留1min以上记为对该物质有反应，否则记为无反应。测试温度为(25±2)℃。重复3次，每次测试30头寄生蜂。

结果如图7所示，为Y型嗅觉仪检测转PlCYP82的拟南芥挥发物对小菜蛾绒茧蜂雌虫的行为反应的影响，结果显示，经卡方测验转基因株系与野生型对照植株差异极其显著(χ²＝36.54,P<0.01)。说明T₂代转PlCYP82挥发物拟南芥样品对小菜蛾盘绒茧蜂具有显著的吸引作用。

Claims (9)

1.一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因蛋白,其具有如SEQIDNO2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，具有如SEQIDNO1所示核苷酸序列或SEQIDNO1中第71-1657的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求4所述的重组载体，为将权利要求2或3所述的编码基因插入到表达载体中，得到表达所述蛋白的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，所述编码基因具有SEQIDNO1所述的序列，该序列插入真核表达载体PYES2的限制性内切酶BamHI和NheI位点。

7.权利要求4所述的重组菌，为将权利要求6或7所述的重组载体导入目的菌得到的重组菌，所述目的菌具体为酵母菌株WAT21。

8.根据权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述编码基因或权利要求4-7任一重组载体或重组菌在生物合成DMNT和TMTT以及吸引小菜蛾绒茧蜂雌虫中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，为将表达的CYP450基因蛋白加入到以(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇为底物的体外酶促反应体系中，得到DMNT和TMTT。