CN110846334B - 陆地棉转化事件icr24-378及其在棉花育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种陆地棉转化事件ICR24‑378及其在棉花育种中的应用。本发明将GhUER1和GhGAE基因导入陆地棉CCRI24中，使GhUER1和GhGAE基因在陆地棉CCRI24中过表达，得到转基因棉花ICR24‑378，所述转基因棉花为将外源DNA片段插入目的棉花基因组第A08号染色体的第107586006‑107586074位间，替换掉第A08号染色体的第107586006‑107586074位间大小为68bp的碱基序列后得到的棉花。通过试验证明：转基因棉花ICR24‑378吐絮集中、株型紧凑，有利于机械化，能更有效地利用光能，最大限度积累光合产物到棉铃中，有利于提高棉花的产量。

Description

陆地棉转化事件ICR24-378及其在棉花育种中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种陆地棉转化事件ICR24-378及其在棉花育种中的应用。

背景技术

转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。

棉花是我国重要的经济作物，主要种植目的是收获棉花纤维，作为纺织业原料。此外，棉籽油和棉籽蛋白是重要的植物油和蛋白质资源，分别占世界食用植物油和蛋白质总供应量的10％和6％，棉花的短绒、棉籽壳、棉杆、棉酚等都有工业用途。

棉花的株型、棉纤维长短、棉桃多少、植株抗虫抗病能力等各种因素都直接影响着棉花的产量和质量。吐絮集中、株型紧凑的棉花有利于机械化，能更有效地利用光能，最大限度积累光合产物到棉铃中，有利于提高棉花的产量。

我国地域辽阔，棉花的种植面积大，除了最北部的少数地区和青藏高原外，25个省和自治区均有棉花种植。棉花作为我国主要的经济作物之一，只有实现机械化生产，才能尽可能地减少成本，使其具有在国际市场竞争的价格优势。机采棉的大规模推广既可以减轻采棉者的劳动强度，有利于棉区实现棉花规模化经营，达到降低棉花成本、提高生产力的目的，又可以推动棉花生产方式的改革，促进我国棉花产业的发展。机采棉的株型育种显得尤为重要，一旦获得适于机械采摘的株型改良新种质，就有望培育机采棉新品种，其应用前景非常广阔。棉花的株型、棉纤维长短、棉桃多少、植株抗虫抗病能力等各种因素都直接影响着棉花的产量和质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种陆地棉转化事件ICR24-378及其在棉花育种中的应用。

本发明保护一种转基因棉花的培育方法，包括如下步骤：将外源DNA片段插入目的棉花基因组第A08号染色体的第107586006-107586074位之间，替换掉第A08号染色体的第107586006-107586074位之间的大小为68bp的片段，得到转基因棉花；

所述转基因棉花满足如下(a1)-(a4)中至少一种性状：

(a1)株高大于所述目的棉花；

(a2)纤维长度大于所述目的棉花；

(a3)果枝长度小于所述目的棉花；

(a4)株型紧凑程度大于所述目的棉花；

所述外源DNA片段为含有GhGAE3和GhUER1基因的DNA分子。

所述外源DNA片段包括GhGAE3基因表达盒、GhUER1基因表达盒和卡那霉素基因NPTII表达盒。

所述GhGAE3基因全长1362bp，编码葡糖醛酸异构酶，是催化UDP-葡萄糖醛酸向UDP-半乳糖醛酸转化的关键酶。所述GhGAE3基因表达盒依次包括来自花椰菜花叶病毒的CAMV35S启动子、GhGAE3基因和NOS终止子。其中CAMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第4714-5059位核苷酸所示；GhGAE3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第5075-6436位核苷酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第6453-6705位核苷酸所示。所述GhGAE3基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第4714-6705位核苷酸所示。

所述GhUER1基因全长903bp，编码UDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖异构还原酶，是核苷糖转换代谢途径中的关键酶。所述GhUER1基因表达盒依次包括来自花椰菜花叶病毒的CAMV35S启动子、GhUER1基因和NOS终止子。其中CAMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第2670-3015位核苷酸所示；GhUER1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第3031-3933位核苷酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第3950-4202位核苷酸所示。所述GhUER1基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2670-4202位核苷酸所示。

所述卡那霉素基因NPTII表达盒如SEQ ID NO.1第67-1834位核苷酸所示。卡那霉素基因NPTII表达盒依次包括花椰菜花叶病毒的CAMV35S增强启动子、卡那霉素基因NPTII和PloyA终止子。其中CAMV35S增强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1157-1834位所示；卡那霉素基因NPTII的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第297-1094位所示；PloyA终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第67-240位所示。

所述外源DNA片段如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的实施例中，利用上述方法获得了棉花转化事件ICR24-378。棉花转化事件ICR24-378为将序列表中SEQ ID NO.1所示的外源DNA片段插入陆地棉CCRI24基因组第A08号染色体的第107586006-107586074位之间(SEQ ID NO.1所示的外源DNA片段的5’末端紧邻第A08号染色体第107586074位，SEQ ID NO.1所示的外源DNA片段的3’末端紧邻第A08号染色体第107586006位)，替换掉第A08号染色体的第107586006-107586074位之间的大小为68bp的片段，得到的转基因棉花，且自第107586006位上游且紧邻第107586006位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，自第107586074位下游且紧邻第107586074位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的棉花转化事件ICR24-378是利用农杆菌介导法，将含有GhGAE3和GhUER1基因的表达载体(重组载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.4)导入目的棉花的外植体中，利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到表现佳的转化事件。

上述方法中，所述目的棉花为陆地棉CCRI24。

所述棉花转化事件ICR24-378于2019年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，分类命名为陆地棉种子ICR24-378，保藏编号为CCTCC NO：P201918。

本发明还保护一种鉴定目标棉花的方法，包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A；所述DNA片段A由以上任一所述外源DNA片段在所述目标棉花的上游侧翼片段、所述外源DNA片段和所述外源DNA片段在所述目标棉花的下游侧翼片段组成；若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为目标棉花；若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为目标棉花；

所述目标棉花为以上任一所述的转基因棉花或其自交后代。

所述上游侧翼片段如SEQ ID NO.2所示；所述下游侧翼片段如SEQ ID NO.3所示。

所述“检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A”的方法为(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)直接测序；

(b2)用引物对甲对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若扩增得到大小为809bp的条带，则所述待测植物样品的基因组DNA中含有或候选含有DNA片段A；否则，所述待测植物样品中不含有DNA片段A；所述引物对甲由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子组成；

(b3)用引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若扩增得到大小为1053bp的条带，则所述待测植物样品的基因组DNA中含有或候选含有DNA片段A；否则，所述待测植物样品中不含有DNA片段A；所述引物对乙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成。

本发明还保护棉花育种方法，包括如下步骤：将以上任一所述鉴定目标棉花的方法鉴定得到的目标棉花作为育种材料。

本发明还保护下述任一生物材料；

(c1)以上任一所述的上游侧翼片段和下游侧翼片段；

(c2)以上任一所述的外源DNA片段；

(c3)含有(c2)所述外源DNA片段的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

(c4)以上任一所述的引物对甲和/或引物对乙。

本发明还保护下述任一应用；

(1)以上任一所述方法或所述转基因棉花在棉花育种中的应用；

(2)以上任一所述方法或所述转基因棉花在选育株高大和/或纤维长度大和/或株型紧凑程度大和/或果枝长度小和/或适应机械采摘的棉花品种中的应用；

(3)以上任一所述生物材料在调控棉花株高和/或纤维长度和/或果枝长度/或株型紧凑程度中的应用；

(4)以上任一所述生物材料在棉花育种中的应用；

(5)以上任一所述生物材料在选育株高大和/或株型紧凑程度大和/或纤维长度大和/或果枝长度小和/或适应机械采摘的棉花品种中的应用。

上述生物材料中，所述重组载体为含有GhGAE3和GhUER1基因的重组载体。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述重组细胞为含有所述的重组载体的重组农杆菌细胞。在本发明的一个实验方案中，所述重组细胞为含有所述重组载体的重组农杆菌LBA4404细胞。

以上任一所述果枝长度具体可为第一果枝长度。

本发明将GhUER1基因和GhGAE基因导入陆地棉CCRI24中，使GhUER1基因和GhGAE基因在陆地棉CCRI24中过表达，得到转基因棉花ICR24-378，转基因棉花ICR24-378为将外源DNA片段插入目的棉花基因组第A08号染色体的第107586006-107586074位间，替换掉第A08号染色体的第107586006-107586074位间大小为68bp的碱基序列后得到的棉花。通过试验证明：转基因棉花ICR24-378吐絮集中、株型紧凑，有利于机械化，能更有效地利用光能，最大限度积累光合产物到棉铃中，有利于提高棉花的产量。

附图说明

图1为转化事件ICR24-378的图解表示。

图2为转基因棉花ICR24-378和受体材料CCR124的株型比较。

图3为转基因棉花ICR24-378和受体材料CCR124的表型统计。图3A：转基因棉花ICR24-378和受体材料CCR124的第一果枝长度、果枝数及结铃数等表型统计结果；图3B：与受体材料CCR124相比，转基因棉花ICR24-378的细胞伸长受到抑制。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的陆地棉CCRI24在文献“PAG1,a cotton brassinosteroidcatabolism gene,modulates fiber elongation”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。

下述实施例中的农杆菌LBA4404在文献“Constitutive expression of thevirulence genes improves the efficiency of plant transformation byAgrobacterium”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。

实施例1、转GhUER1+GhGAE棉花的获得及农艺性状分析

一、转GhUER1+GhGAE棉花的获得及保藏

1、重组载体的构建

将GhUER1+GhGAE基因表达盒插入pCambia2300载体(该载体购于NTCC典型培养物保藏中心下属的BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号为Biovectorpcambia2300)的KpnI和HindIII酶切位点间，且保持pCambia2300载体的其他序列不变，得到重组载体(重组载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.4)。

上述GhUER1+GhGAE基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2670-6705位核苷酸所示。GhUER1+GhGAE基因表达盒依次包括来自花椰菜花叶病毒的CAMV35S启动子、GhUER1基因，NOS终止子；CAMV35S启动子、GhGAE基因和NOS终止子；其中，GhUER1基因表达盒中CAMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2670-3015位核苷酸所示；GhUER1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第3031-3933位核苷酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第3950-4202位核苷酸所示。GhGAE基因表达盒CAMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第4714-5059位核苷酸所示；GhGAE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第5075-6436位核苷酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第6453-6705位核苷酸所示。

pCambia2300载体自身包括卡那霉素基因NPTII表达盒。卡那霉素基因NPTII表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第67-1834位核苷酸所示。卡那霉素基因NPTII表达盒依次包括花椰菜花叶病毒的CAMV35S增强启动子、卡那霉素基因NPTII和Ploy A终止子。其中CAMV35S增强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1157-1834位所示；卡那霉素基因NPTII的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第297-1094位所示；Ploy A终止子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第67-240位所示。过量表达NPTII可使植物获得对卡那霉素的抗性，同时在组织培养过程中使用卡那霉素来进行阳性苗的筛选。

2、重组菌的获得

将步骤1获得的重组载体导入农杆菌LBA4404中，得到重组菌。

3、转GhUER1+GhGAE基因棉花的获得

采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化陆地棉CCRI24的外植体(1500个)，在含有卡那霉素的培养基上培养诱导形成愈伤组织，选择转化的愈伤组织，愈伤组织在卡那霉素培养基上形成胚性愈伤组织，挑选存活的胚性愈伤转化形成再生成棉花，最后共获得60个T0代转GhUER1+GhGAE基因棉花，并将其用于筛选。

4、转GhUER1+GhGAE棉花的鉴定

(1)在温室种植收获的T1代转GhUER1+GhGAE棉花种子，得到T1代转GhUER1+GhGAE棉花。提取T1代转GhUER1+GhGAE棉花叶片的基因组DNA，采用引物5’-GTAATATCCGGAAACCTCCTCGG-3’和5’-TTGAGCAATTCCTCCACCATAGCT-3’进行PCR扩增，检测目的基因是否存在，并统计材料的分离比，根据孟德尔遗传定律，获得18个单拷贝的T1代转GhUER1+GhGAE棉花。

(2)对T1代转GhUER1+GhGAE棉花进行了果枝长度的测量，结果表明：有9个T1代转GhUER1+GhGAE棉花的株型紧凑，果枝短，适合高密度栽培及机械化采收。

(3)在吐絮期测定上述步骤(2)获得的9个T1代转GhUER1+GhGAE棉花的株型。结果表明：9个T1代转GhUER1+GhGAE棉花中有3个T1代转基因棉花的棉花纤维长度较受体材料CCRI24改良或伸长。

(4)在第一年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估上述步骤(3)获得的3个T2代转GhUER1+GhGAE棉花的农艺学性状(株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、纤维长度)及转基因插入对棉花生长发育、棉花产量的影响。结果表明：3个T2代转GhUER1+GhGAE棉花中共有1个T2代转GhUER1+GhGAE棉花果枝短于受体材料CCRI24，株高高于受体材料CCRI24。

(5)在第二年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估上述步骤(4)获得的1个T2代转GhUER1+GhGAE棉花的农艺学性状(株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、纤维长度)及转基因插入对棉花生长发育、棉花产量的影响。结果表明：该T2代转GhUER1+GhGAE棉花果枝短于受体材料CCRI24，将该T2代转GhUER1+GhGAE棉花的种子命名为ICR24-378。

5、T4代转GhUER1+GhGAE棉花种子的保藏

将T2代转GhUER1+GhGAE棉花ICR24-378进行自交，直至获得T4代转GhUER1+GhGAE棉花纯合株系ICR24-378。并于2019年11月6日将T4代转GhUER1+GhGAE棉花种子(Gossypiumhirsutum L.)ICR24-378保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，分类命名为陆地棉种子ICR24-378，保藏编号为CCTCC NO：P201918。

二、转GhUER1+GhGAE棉花的农艺性状分析

1、纤维品质和籽棉产量

将T4代转GhUER1+GhGAE棉花纯合株系ICR24-378与受体材料CCRI24进行田间产量试验。在河南安阳设计小区试验，设置3个小区，3个小区设置完全相同，小区行长8m，每行种植30株，行间距80cm，每个材料种植3行，小区共6行。采用T检验对T4代转GhUER1+GhGAE棉花纯合株系ICR24-378与受体材料CCRI24株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、纤维长度进行了统计分析。

株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、纤维长度的统计结果如表1所示：与受体材料CCRI24相比，T4代转GhUER1+GhGAE棉花纯合株系ICR24-378的株高增高，果枝变短，更适合机采。其中株高、第一果枝长度、纤维长度与受体材料CCRI24之间呈极显极著性差异。果枝数与受体材料相比呈现显著差异。

表1转基因棉花ICR24-378和受体材料CCR124的农艺性状数据

棉花是世界性的重要经济作物,是纺织工业天然纤维的重要来源。提高棉花产量,适应机械采收,降低生产成本是提升我国棉花国际竞争力,保障可持续发展的必然途径。研究棉花株型及其调控是提高产量,适应机械化需求的高效技术途径。株型是棉花的重要农艺性状，由株高、果枝长度、叶型等多个形态因子共同建成。不仅影响产量，还是影响机械化采收的关键指标。

与WT相比，ICR24-378的株型紧凑，果枝短(如图2所示)，WT的第一果枝长度远远大于ICR24-378的第一果枝长度，ICR24-378的细胞伸长受到了抑制，而结铃数和果枝数未达到显著差异，不影响产量性状(如图3所示)。而果枝短的棉花无需整枝，抹芽，节省人力资本，且更加适合高密度种植，有利于机械化，能更有效地利用光能，最大限度积累光合产物到棉铃中。因此，提高棉花产量，适应机械采收，降低生产成本是解决提升我国棉花国际竞争力，保障可持续发展的必然途径。研究棉花株型及其调控是提高产量，适应机械化需求的高效技术途径。

三、ICR24-378的DNA序列的表征分析

采用分子生物学的方法分析ICR24-378基因组的插入物和与插入物相连接侧翼连接的基因组序列。具体步骤如下：

1、棉花基因组DNA的提取

取转GhUER1+GhGAE棉花ICR24-378的幼嫩叶片约100mg置于2.0mL的EP管中，采用液氮冷冻EP管，然后采用冷冻研磨仪研磨，采用Qiagen公司DNeasy Plant Mini Kit(50)(货号为69104)提取基因组DNA。

2、DNA文库的构建

根据Clontech公司的Universal Genome Walker^TM 2.0User Manual试剂盒(Cat.No.634923)中的说明书，采用4种不同的限制性内切酶(DraI、EcoRV、PvuII、StuI)进行基因组DNA的消化，过夜消化，得到消化产物。采用试剂盒内置的NucleoSpin Gel andPCRClean-Up kit盒子对消化产物回收，然后在回收产物两端采用T4 DNA连接酶加上试剂盒内置的接头，至此4个加接头的DNA文库构建完毕。

3、测序

根据已知的转基因插入物序列，在其5’端和3’端分别设计两条巢式引物，然后采用试剂盒(Clontech公司的Universal Genome Walker^TM 2.0User Manual试剂盒)中提供的方案进行扩增。利用琼脂糖凝胶电泳分离从反应产生的扩增子，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pMD-19T-Simple(货号为D104A)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆至T克隆载体中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，阳性克隆进行单克隆测序。

测序结果表明：转GhUER1+GhGAE棉花ICR24-378为将序列表中SEQ ID NO.1所示的外源DNA片段插入陆地棉CCRI24基因组第A08号染色体的第107586006-107586074位之间(SEQ ID NO.1所示的外源DNA片段的5’末端紧邻第A08号染色体第107586074位，SEQ IDNO.1所示的外源DNA片段的3’末端紧邻第A08号染色体第107586006位)，替换掉第A08号染色体的第107586006-107586074位之间的大小为68bp的片段，得到的转基因棉花，且自第107586006位上游且紧邻第107586006位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，自第107586074位下游且紧邻第107586074位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(图1)。

对于转GhUER1+GhGAE棉花ICR24-378及其自交后代可采用如下方法鉴定：

1、直接测序。

2、用引物对甲对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若扩增得到大小为809bp的条带，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；

所述引物对甲由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子组成；

3、用引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若扩增得到大小为1053bp的条带，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；

所述引物对乙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成。

采用上述方法鉴定为转GhUER1+GhGAE棉花ICR24-378或其后代的棉花均表现出株高、纤维长度和株型紧凑程度大于CCR124，果枝长度小于CCR124的表型。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 陆地棉转化事件ICR24-378及其在棉花育种中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6985

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agacaactta ataacacatt gcggacgttt ttaatgtact gaattaacgc cgaattaatt 60

cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt ttattgatag 120

aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac acatgagcga 180

aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattat tatggagaaa 240

ctcgagcttg tcgatcgact ctagctagag gatcgatccg aaccccagag tcccgctcag 300

aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg 360

taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta 420

gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca 480

gaaaagcggc cattttccac catgatattc ggcaagcagg catcgccatg tgtcacgacg 540

agatcctcgc cgtcgggcat gcgcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc 600

ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt 660

gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta 720

tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat 780

gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg 840

acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct 900

gcctcgtcct ggagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg 960

cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc 1020

cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct 1080

tgttcaatcc ccatggtcga tcgacagatc tgcgaaagct cgagagagat agatttgtag 1140

agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg 1200

aaggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca 1260

tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt 1320

gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc 1380

tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa 1440

gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa 1500

agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag 1560

agtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac 1620

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<210> 2

<211> 988

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttaagact accgaagtat 60

cgtcattaat attccaagga gaatggtaaa ggagtacgaa cgaggaaaat cccgttgaac 120

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tatggatgca aatgctcgaa ctcgttgagt tgagtccaag tttgtgagat gtaactaggc 240

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tatgtactta accctcgggt tgagacttga tacgacacca ataatgtagt aaaacgatga 600

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<210> 3

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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tctccataag tgctccaaat ttttctctcc accatagcta gggtttcaac acttttaagc 120

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gggaactact cacacattat tatggagaaa ctcgagcttg tcgatcgact ctagctagag 6480

gatcgatccg aaccccagag tcccgctcag aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg 6540

atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg 6600

ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc 6660

acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc cattttccac catgatattc 6720

ggcaagcagg catcgccatg tgtcacgacg agatcctcgc cgtcgggcat gcgcgccttg 6780

agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga 6840

tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg 6900

tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg 6960

gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc 7020

aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg 7080

cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtcct ggagttcatt cagggcaccg 7140

gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg 7200

gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa 7260

gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatcc ccatggtcga tcgacagatc 7320

tgcgaaagct cgagagagat agatttgtag agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct 7380

ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg aaggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc 7440

gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg 7500

aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc 7560

ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc 7620

accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag 7680

gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac 7740

tgtatctttg atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca 7800

atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg 7860

tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt 7920

atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg 7980

acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt 8040

ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt 8100

gtcgtgctcc accatgttgg caagctgctc tagccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 8160

cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 8220

gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt 8280

atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 8340

agctatgacc atgattacga attcgagctc ggtaccatgc ctgcaggtcc ccagattagc 8400

cttttcaatt tcagaaagaa tgctaaccca cagatggtta gagaggctta cgcagcaggt 8460

ctcatcaaga cgatctaccc gagcaataat ctccaggaaa tcaaatacct tcccaagaag 8520

gttaaagatg cagtcaaaag attcaggact aactgcatca agaacacaga gaaagatata 8580

tttctcaaga tcagaagtac tattccagta tggacgattc aaggcttgct tcacaaacca 8640

aggcaagtaa tagagattgg agtctctaaa aaggtagttc ccactgaatc aaaggccatg 8700

gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc 8760

atacagagtc tcttacgact caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac 8820

gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt 8880

gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 8940

tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc 9000

gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc 9060

ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 9120

gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 9180

gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga gaacacgggg gactgcgcgc 9240

atggggtttc cggcaaatgg ctcatcggac aaaccattga agttcctgat ctacggtcga 9300

accggttgga tcggtggttt gttaggcaaa ctctgcgaat cccagggaat cgattacgag 9360

tacggctccg gccgtttgga gaaccggatt tcacttgagt ccgacatagc caacgtgaaa 9420

ccgacccatg tattcaatgc cgccggtgtc accggtcgtc cgaacgtcga ttggtgcgaa 9480

tcccataagg tcgagaccat cagaaccaat gtggtcggga cccttaccct cgctgacgtt 9540

tgcagagaca aaggcctcat attgattaat tatgctacag gttgtatctt tgagtacgat 9600

gaggctcatc agatcggaac gggtatcggg tttaaggaag aggatactcc taatttcatc 9660

ggttcctttt attctaagac caaagctatg gtggaggaat tgctcaagaa ttatgaaaat 9720

gtatgtacct tgcgagttag gatgcctatt tcatcggatt tagccaatcc ccgaaacttc 9780

atcacaaaaa taactcggta cgataaagtg gttaacattc ctaactcgat gaccatcctc 9840

gatgagcttc ttccgatttc catcgagatg ggaaagagga acttgaccgg catttggaac 9900

tttacaaacc cgggagtggt cagtcacaat gagatattag aaatgtaccg tgactacatt 9960

gaccctaact tcacctggaa gaacttcaat ctcgaggagc aggccaaagt tatcgtagcc 10020

ccgagaagca acaacgaact tgatgcgacc aaattgaaga cagaattccc tgagctcctt 10080

tcgattaaag agtctcttat taagtatgta ttcgaaccga ataagaagac tggtggagct 10140

tgaggtaccg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 10200

tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 10260

aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 10320

gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt 10380

atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggggatcc atgcctgcag gtccccagat 10440

tagccttttc aatttcagaa agaatgctaa cccacagatg gttagagagg cttacgcagc 10500

aggtctcatc aagacgatct acccgagcaa taatctccag gaaatcaaat accttcccaa 10560

gaaggttaaa gatgcagtca aaagattcag gactaactgc atcaagaaca cagagaaaga 10620

tatatttctc aagatcagaa gtactattcc agtatggacg attcaaggct tgcttcacaa 10680

accaaggcaa gtaatagaga ttggagtctc taaaaaggta gttcccactg aatcaaaggc 10740

catggagtca aagattcaaa tagaggacct aacagaactc gccgtaaaga ctggcgaaca 10800

gttcatacag agtctcttac gactcaatga caagaagaaa atcttcgtca acatggtgga 10860

gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc 10920

aattgagact tttcaacaaa gggtaatatc cggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 10980

tatctgtcac tttattgtga agatagtgga aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca 11040

ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg 11100

acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca 11160

agtggattga tgtgatatct ccactgacgt aagggatgac gcacaatccc actatccttc 11220

gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagagaacac gggggactgt 11280

cgacatgcca acagatacaa gcaaacccat gaaattagaa cgatacgata gctatattcg 11340

taaagtccat agcacgaagc tgttgaatgc ttcatctaaa tttctatttc gtgttaccct 11400

tcttattgct ttagttttga tcttgttttt caccattaac taccctccac tttcggataa 11460

tacccacagt gcacctcacc atcaccaccg tcatagcttt ctttcaactt cacttttctc 11520

cggttcttcc ctcgttggtg gtgcggcgtg ggagaaacaa gtccgtcact cttctactcc 11580

acgtagagtt aatgggtttt ccgttttggt caccggcgcc gctgggttca tcggttctca 11640

ctgttcactt gctttgaaaa aacgcggcga tggggttttg ggattggata attttaacga 11700

ttattacgat ccttcgttga aaagggcgag gcagaatctg ttaagcaagc accaaatttt 11760

catcgtcgaa ggggatttga acgacggccc gttgttgacg aagctgttcg acgtcgtgcc 11820

gttcactcat gtgcttcact tagcggcaca ggccggtgta cggtacgcca tgcaaaaccc 11880

acagtcgtac gttaagtcga acattgctgg gtttgtgaac ttacttgaag tagccaaagc 11940

ggtgaatcca caaccggcga tcgtttgggc ttcgtcgagc tccgtttatg gactcaacac 12000

tgaaaaccca ttctccgaac atgatagaac tgaccgtccg gcgagtcttt acgccgcaac 12060

gaaaaaagcc ggtgaggaaa tcgctcacac ttataaccat atatacggcc tttccctcac 12120

cggacttaga tttttcaccg tttatggtcc atggggaaga cccgatatgg cttacttctt 12180

tttcactaaa gatattcttc aagggaaacc cattgatatc tacagaaccc aagatcaaaa 12240

agcggtggcg cgtgacttca cttacatcga cgacgttgtg aaaggttgtt taggagcgtt 12300

agacacggcg gaaaaaagca ccggtagcgg cggaaaaaag aaaggaccgg ctcaattaag 12360

ggtttacaac ttgggaaata cttcccctgt tcccgtcggc cgattagtct cgattttaga 12420

aggattgctc aacacaaaag ccaagaaaca tgtgatttcg ttgcccagaa atggtgatgt 12480

cccctacaca catgccaatg tcacgttagc ttacaaggat tttgggtata aacccaccac 12540

ggatttagct gctgggttga gaaaattcgt gaaatggtac gtgagttact ttgggattga 12600

atcgaaacgc tcaaaagaaa cccaacattt cgatgaatcc agttaactgc aggaatttcc 12660

ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 12720

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 12780

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 12840

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 12900

ctatgttact agatcggaag cttcggggat cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc 12960

ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 13020

aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 13080

gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg 13140

gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg 13200

cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa 13260

aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg 13290

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtaatatccg gaaacctcct cgg 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgagcaatt cctccaccat agct 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcatttcat ttggagagaa c 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taacgctcct aaacaacctt tcaca 25

Claims (2)

1.一种鉴定目标棉花的方法，包括如下步骤：检测待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A；所述DNA片段A由外源DNA片段在所述目标棉花的上游侧翼片段、所述外源DNA片段和所述外源DNA片段在所述目标棉花的下游侧翼片段组成；若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为目标棉花；若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为目标棉花；

所述目标棉花为转基因棉花或其自交后代；

所述转基因棉花是通过包括如下步骤的方法培育获得的：

将外源DNA片段插入目的棉花基因组第A08号染色体的第107586006-107586074 位之间，替换掉第A08号染色体的第107586006-107586074 位之间的大小为68bp的片段，得到转基因棉花；

所述转基因棉花满足如下（a1）-（a4）四种性状：

（a1）株高大于所述目的棉花；

（a2）纤维长度大于所述目的棉花；

（a3）果枝长度小于所述目的棉花；

（a4）株型紧凑程度大于所述目的棉花；

所述外源DNA片段为含有GhGAE3和GhUER1基因的DNA分子；

所述外源DNA片段如SEQ ID NO.1所示；

所述上游侧翼片段如SEQ ID NO.2所示；所述下游侧翼片段如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“检测待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A”的方法为直接测序。

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