CN112410332A - 一种抗叶霉病番茄材料的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗叶霉病番茄材料的制备方法，包括通过农杆菌浸染将叶霉病抗性基因Cf‑5转入番茄子叶外植体中，经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了叶霉病抗性植株。通过病原真菌接种试验抗性筛选，获得叶霉病抗性材料，以克服现有抗叶霉病番茄材料不足的问题。

Description

一种抗叶霉病番茄材料的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗叶霉病番茄材料的制备方法。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum)是我国重要的蔬菜作物，在促进我国农村经济发展中发挥重要作用。番茄叶霉病（Fulvia fulva Ciferri）是番茄生产中的主要病害之一，一旦发病，即迅速蔓延，造成严重减产，最高可达80%。国内外在番茄抗叶霉病育种的研究上取得了一定进展，到目前已有许多抗病品种应用到生产实践中。由于番茄叶霉病病菌生理小种分化速度较快，以前抗叶霉病的品种有的已经表现为感病，在某些地区表现抗性，但在另一个地区抗性较差。防治叶霉病的最有效方法是培育抗病品种，亟需培育含有叶霉病抗性基因且具有持久抗性的番茄品种。培育抗病品种比较普遍的做法是采用常规育种导入抗性基因，再用相应的分子标记多次进行抗性基因鉴定、筛选。常规育种可控性差，选择优良品系的时间较长，通过分子技术手段的高科技育种目标性强，可有目的的进行抗性目的基因的筛选，育种进程快。本发明通过把叶霉病抗性基因Cf-5通过根瘤农杆菌介导转化到番茄中，进而筛选获得阳性过表达番茄株系，通过抗病性筛选获得抗病番茄材料，为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗叶霉病番茄材料的制备方法，以克服现有抗叶霉病番茄材料不足的问题。本发明通过农杆菌介导法将含有叶霉病抗性基因Cf-5植物表达载体转入番茄子叶外植体中，经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了叶霉病抗性植株。通过病原真菌接种试验抗性筛选，获得叶霉病抗性材料。

本发明是通过以下技术方案实现的:

一种用于提高抗叶霉病番茄材料的基因Cf-5引物：

(+):cagtCGTCTCacaacatgatgatggttactagcaa (-):cagtCGTCTCatacactagaagcgattatttcttc。

本发明进一步公开了一种用于提高抗叶霉病番茄材料的基因Cf-5引物制备抗叶霉病番茄材料的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）通过番茄叶霉抗性目的基因Cf-5的保守DNA序列设计引物；

2）利用引物进行扩增，并纯化扩增产物；

3）将扩增后的产物与载体链接，得到含有目的基因的载体；

4)利用农杆菌侵染法将上述含有目的基因序列的载体转化到番茄中，以番茄子叶为外植体，通过愈伤组织诱导培养基诱导愈伤，愈伤组织转到分化培养基上诱导芽，待芽长至5厘米左右再转到生根培养基上生根。遗传转化卡那霉素抗性筛选，愈伤组织再生，获得遗传转化植株，并进行PCR验证；

5)利用室内离体叶片抗病性鉴定，筛选抗叶霉病植株，获得抗叶霉病新材料。

其中所述的遗传转化培养基指的是 ：

愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.7mg/L+3%蔗糖；

分化培养基:MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+3%蔗糖；

生根培养基：1/2MS+IAA0.1mg/L+3%蔗糖。

本发明更进一步公开了一种抗叶霉病番茄材料的制备方法及应用在用于番茄改良育种方面的应用，实验结果显示：通过农杆菌介导法将含有叶霉病抗性基因Cf-5转入番茄中，获得了叶霉病抗性植株。抗病性鉴定结果显示,含Cf-5基因转基因植株表现出较强的抗病性反应。进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要的技术基础，同时提供了新种质。

本发明更加详细的描述如下：

（1）通过番茄叶霉抗性目的基因Cf-5的保守DNA序列，设计引物：

(+):cagtCGTCTCacaacatgatgatggttactagcaa (-):cagtCGTCTCatacactagaagcgattatttcttc

（2）利用引物进行扩增，并纯化扩增产物。

（3）将扩增后的产物与载体pBWA(v)H链接，得到含有目的基因的载体。

（4）利用农杆菌侵染法将上述含有目的基因序列的载体转化到番茄中，以番茄子叶为外植体进行遗传转化，经卡那霉素抗性筛选，愈伤组织再生，获得遗传转化植株，并进行PCR验证。

（5）利用室内离体叶片抗病性鉴定，筛选抗叶霉病植株，获得抗叶霉病新材料。

步骤(4)的筛选方法为：

1）取番茄种子用75%酒精清洗10s，再用5%的次氯酸溶液浸泡5min，无菌水清洗3次， 将灭菌好的种子播种于培养瓶中。置于暗处2～3天，待种子露白发芽后置于光照组培箱内。培养条件：23±2℃，16h/d光照8h/d黑暗。

2）番茄种子生长7～8d后，子叶完全展开，切除子叶柄及子叶尖，留中间部分切为2～3段作为外植体，然后将番茄外植体预培养1d使外植体边缘膨大，有利于番茄侵染转化。

3）制备农杆菌MS悬浮液，用农杆菌划线，在28度培养箱中培养两天，挑取单菌落接种于含有抗生素的YEB液体培养基，小摇24小时（28℃，200rpm）；第二天转接120ul的菌液到50ml YEB培养基中进行大摇（28℃，200rpm），大摇8小时，菌液OD值要在0.7～0.8之间。

4）菌液重悬好后倒入玻璃皿中，将剪好的叶片也放入玻璃皿中，侵染15min，而后将菌液倒掉，将侵染好的叶片叶背朝上，将外植体置于共培培养基中，在暗处培养2d。温度：23±2℃。

5）将外植体接到愈伤诱导培养基上，诱导愈伤。

6)20天后，将愈伤组织转入分化培养基上。每20天继代一次。

7)待芽长至1厘米时转入生根培养基上。

8)利用CTAB法提取再生植株基因组DNA，进行PCR验证。

步骤(4)所述中遗传转化用到的诱导愈伤培养基为：MS+6-BA1.0mg/L +NAA0.7mg/L +3%蔗糖;分化培养基:MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+3%蔗糖;生根培养基：1/2MS+IAA0.1mg/L+3%蔗糖；培养条件：光照16h，强度2000-3000lx，温度：25±2℃。

步骤（5）的筛选方法为番茄离体叶片用含叶霉病病原菌孢子5×10⁶浓度的孢子悬浮液喷在叶片背面，15天后观察每片叶病斑面积和菌丝层，根据离体叶片病情分级标准进行调查。

本发明提供的叶霉病抗性基因Cf-5特异度高的引物，可用于制备抗叶霉病番茄材料，应用于番茄改良育种。本发明制备抗叶霉病番茄材料的方法简单易行，一年之内即可获得抗性提高的材料。本发明为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。

附图说明

图1再生植株PCR检测；阳性材料：1-12、13、14、17-19

右边阳性对照，marker，阴性对照（野生苗）。

图2 阳性株叶片抗病性检测；上部为接种叶霉菌的15天抗性阳性株叶片，下部为接种叶霉菌15天的对照叶片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

含目的基因载体的构建

对与叶霉抗性有关基因进行序列分析，在番茄参考基因组中进行 BLAST，获得通过番茄叶霉抗性目的基因Cf-5的保守DNA序列，设计引物，连接到载体上，并将载体转化到农杆菌菌株中。

（1）引物合成

(+):cagtCGTCTCacaacatgatgatggttactagcaa (-):cagtCGTCTCatacactagaagcgattatttcttc

（2）扩增目的片段

做1个50ul体系的PCR反应，扩增目的片段。

The PCR system & cycles：Total:50ul ，H2O: 31ul ，buffer: 5ul ，dNTP mix:10ul ，P+:1ul，P-:1ul，KOD: 1ul ，Template:1ul 。

PCR体系：94℃ for 5 min ；30 cycles ，94℃ for 30 sec ，50℃ for 45 sec，72℃ for 180 sec ；72℃ for 5 min ，16℃ for 3 min。

将2907bp的电泳片段切下，放在同一个体系中进行溶胶回收，用总体积30ul的水溶解回收DNA，检测无误后与载体进行连接。

（3）酶切/连接反应

酶切：

total:20ul，H2O: 13ul ，Buffer: 2ul ，BsaI/Eco31I: 1ul ；载体:4ul，Digestingprocedure，37℃ for 1 hours 。 total:20ul ，H2O: 13ul ，Buffer: 2ul ，BsmBI/Esp3I:1ul；4ul ，Digesting procedure，37℃ for 1 hours 。

将载体酶切物和回收片段酶切产物合并一起用PCR纯化试剂盒纯化，用于下一步的连接反应连接反应：

total:10ul ，P-rDNAG1:2.5 ul，H2O: 5.5ul ，Buffer: 1ul ，T4-ligase: 1ul ，20℃for 1 hours 。 （4）将连接产物转化感受态 将5-10ul连接产物转化大肠杆菌感受态。转化涂(卡那霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。

（5）菌斑PCR鉴定

挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴，番茄菌检-F：ctatactggaatcactagacctttcg，NOSseq-R:caagaccggcaacaggattcaatc。

做10个25ul体系的PCR反应:Total:25ul ，H2O:16.5ul ，buffer:2.5ul ，Mg2+:2ul ，dNTP:1ul ，番茄菌检-F1ul ，NOSseq-R:1ul ，taq:1U ，Template:1ul反应体系： 94℃ for 5 min ；30 cycles ，94℃ for 30 sec ，50℃ for 45 sec ，72℃ for40sec ；72℃ for 10min ，16℃ for 30min 。

检测电泳条带600bp的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100ul送样测序，其余400ul菌液接种到含有5-10ml(卡纳霉素)抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。

(6)质粒序列：

tagaatagcatcggtaacatgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccggactgatgggctgcctgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctgttggctggctggtggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgttagactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatacgcccggagtcgtggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatagcctccgcgaccggttgtagaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcgggagatgcaataggtcaggctctcgctaaactccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagctatttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttcgccctccgagagctgcatcaggtcggagacactgtcgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcggtgagttcaggctttttcatatctcattgcccccccggatctgcgaaagctcgagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgtgtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctgcaggtctagacatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggactttgcaacatgatgatggttactagcaaagtattctcttcacttcagtttttcactgttttctacctctttacagttgcatttgcttcgactgaggaggcaactgccctcttgaaatggaaagcaactttcaagaaccagaataattcctttttggcttcatggacgacaagttctaatgcatgcaaggactggtatggagttgtatgcttgaatggtagggtaaacacgttgaatattacaaatgccagtgtcattggtacactttatgcttttccattttcatccctcccttttctcgagaatcttgatcttagcaacaacaatatctctggtaccattccacctgagattggtaatctcacaaatcttgtctatcttgacttgaacaccaatcagatttcaggaacaattccaccacaaatcggttcactagccaagcttcagatcatccgcatatttaacaatcatttaaatggctttattcctgaagaaataggttacctaaggtctcttactaagctatctttgggtatcaactttcttagtggttctattcctgcttcattgggcaatatgaccaacttgtcttttttatttctttatgaaaatcagctttctggctttattcctgaagaaataggttacctaaggtctcttactaagctatctttggatatcaactttcttagtggttccattcctgcttcattggggaatctgaacaacttgtcttttttgtatctttacaataatcagctttctggctctattcctgaagaaataggttacctaaggtcacttactaagctatctttgggtatcaactttcttagtggttccattcctgcttcattggggaatctaaacaacttgtctaggttggatctttacaataataagctttctggctctattcctgaagaaataggttacctaaggtctcttacttacctagatttgggtgagaatgctcttaatggctctattccttcttcattggggaatctaaacaacttgtctaggttggatctttacaataataagctttctggctctattcctgaagaaataggttacctaaggtctcttacttacctagatttgggtgagaatgctcttaatggctctattcctgcttcattggggaatctgaacaacttgtttatgttgtatctttacaataatcagctttctggctctattcctgaagaaataggttacctgagttctcttactgaactatatttgggtaataactctcttaatggctctattcctgcttcattggggaatctgaacaacttgtttatgttgtatctttacaataatcagctttctggctctattcctgaagaaataggttacctgagttctcttactgaactatttttgggtaataactctcttaatggctctattcctgcttcattggggaatctaaacaacttgtctaggttgtatctttacaataatcagctttctggctctattcctgcttcatttggcaatatgagaaatctgcaaactctgtttctcagtgataacgatctcattggggaaattccttcatttgtgtgcaatttgacatcactggaagtgttgtatatgtcgagaaacaatttgaagggaaaagttccgcaatgtttgggtaatatcagtgaccttcacattttgtcgatgtcatctaatagtttcagaggagagctcccttcatctatttccaatttaacatcactaaaaatacttgattttggcagaaacaatctggagggagcaataccacaattttttggcaatattagtagcctccaggtttttgatatgcagaataacaaactttctgggactcttccaacaaattttagcattggatgttcactgataagtctcaacttgcatggcaatgaactagcagatgaaatccctcggtctttggacaattgcaaaaagctgcaagttcttgatttaggagacaatcaactcaacgacacatttcccatgtggttgggaactttgccagagctgagagttttaaggttgacatcgaataaattgcatggacctataagatcatcaggggctgaaatcatgtttcctgatctccgaatcatagatctctctcgcaatgcattctcgcaagacttaccaacgagtctatttgaacatttgaaagggatgaggacagttgataaaacaatggaggaaccaagttatgaaagctattacgatgactcggtggtagttgtgacaaagggattggagcttgaaattgtgagaattctgtctttgtacacaattatcgatctttcaagcaacaaatttgaaggacatattccttctgtcctgggagatctcattgcgatccgtgtacttaatgtatctcataatgcattgcaaggctatataccatcatcacttggaagtttatctatactggaatcactagacctttcgtttaaccaactttcgggagagataccacaacaacttgcttctcttacgtttcttgaagtcttaaatctctcccacaattatctccaaggatgcatccctcaaggacctcaattccgtacctttgagagcaattcatatgaaggtaatgatggattacgtggatatccagtttcaaaaggttgtggcaaagatcctgtgtcagagaaaaactatacagtgtctgcgctagaagatcaagaaagcaattctgaatttttcaatgatttttggaaagcagctctgatgggctatggaagtggactgtgtattggcatatccataatatatatcttgatctcgactggaaatctaagatggcttgcaagaatcattgaagaactggaacacaaaattatcgtgcaaaggagaaagaagcagcgaggtcaaagaaattacagaagaagaaataatcgcttctagtgtaactagctctgtcttcagtactgggcccgaagactgaccagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggccatccgcactgtagcggatggcctaaaaaaaaaactagaagagacgagtctgagactcagcgtctcggtcgcagtcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgggccgcattaccctgttatccctaggccgcataacttcgtatagcctacattataggatggagggatatcctctcttaaggtagcgagcaagctctaagaggagtgtcgacaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgtttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataacggatatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagtactttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcaggagatgatcgcggccgggtacgtgttcgagccgcccgcgcatgtctcaaccgtgcggctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaagctggcggcctggccggccagcttggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacagcttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggggaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatcgcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccggggccgatgttctgttagtcgattccgatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgttgtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttcgtagtgatcgacggagcgccccaggcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagccgacttcgtgctgattccggtgcagccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctggtggagctggttaagcagcgcattgaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtcgtgtcgcgggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccgggtacgagctgcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgccgccgccggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccaggcgctggccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagttaatgaggtaaagagaaaatgagcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcgcacgcagcagcaaggctgcaacgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcgggtcaactttcagttgccggcggaggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgccaaggcaagaccattaccgagctgctatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgagcaaatgaataaatgagtagatgaattttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaagaacaaccaggcaccgacgccgtggaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttggccaggcgtaagcggctgggttgtctgccggccctgcaatggcactggaacccccaagcccgaggaatcggcgtgacggtcgcaaaccatccggcccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgatgacctggtggagaagttgaaggccgcgcaggccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaagcacgccccggtgaatcgtggcaagcggccgctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaaccgccggcagccggtgcgccgtcgattaggaagccgcccaagggcgacgagcaaccagattttttcgttccgatgctctatgacgtgggcacccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggccgttttccgtctgtcgaagcgtgaccgacgagctggcgaggtgatccgctacgagcttccagacgggcacgtagaggtttccgcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattacgacctggtactgatggcggtttcccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaagggaagggagacaagcccggccgcgtgttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgccggcgagccgatggcggaaagcagaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaacaccacgcacgttgccatgcagcgtacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggtatccgagggtgaagccttgattagccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccggagtacatcgagatcgagctagctgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaagaacccggacgtgctgacggttcaccccgattactttttgatcgatcccggcatcggccgttttctctaccgcctggcacgccgcgccgcaggcaaggcagaagccagatggttgttcaagacgatctacgaacgcagtggcagcgccggagagttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaagctgatcgggtcaaatgacctgccggagtacgatttgaaggaggaggcggggcaggctggcccgatcctagtcatgcgctaccgcaacctgatcgagggcgaagcatccgccggttcctaatgtacggagcagatgctagggcaaattgccctagcaggggaaaaaggtcgaaaagatctctttcctgtggatagcacgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggaacccgtacattgggaacccaaagccgtacattgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatataaaagagaaaaaaggcgatttttccgcctaaaactctttaaaacttattaaaactcttaaaacccgcctggcctgtgcataactgtctggccagcgcacagccgaagctcccggatacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgttcatccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgcattctaggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcctcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggctgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgataatcttttcagggctttgttcatcttcatactcttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggttttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtatttttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaataccagaaaacagctttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccgcggtgatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatgctaccctccgcgagatcatccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaatagcatcggtaacatgagcaaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgt

实施例2 遗传转化获得抗病新材料

（1）取番茄种子用75%酒精清洗10s，再用5%的次氯酸溶液浸泡5min，无菌水清洗3次，将灭菌好的种子播种于培养瓶中。置于暗处2～3天，待种子露白发芽后置于光照组培箱内。培养条件：23±2℃，16h/d光照8h/d黑暗。

（2）番茄种子生长7～8d后，子叶完全展开，切除子叶柄及子叶尖，留中间部分切为2～3段作为外植体，然后将番茄外植体预培养1d使外植体边缘膨大，有利于番茄侵染转化。

(3)制备农杆菌MS悬浮液，用农杆菌划线，在28度培养箱中培养两天，挑取单菌落接种于含有抗生素的YEB液体培养基，小摇24小时（28℃，200rpm）；第二天转接120ul的菌液到50ml YEB培养基中进行大摇（28℃，200rpm），大摇8小时，菌液OD值要在0.7～0.8之间。

(4)菌液重悬好后倒入玻璃皿中，将剪好的叶片也放入玻璃皿中，侵染15min，而后将菌液倒掉，将侵染好的叶片叶背朝上，将外植体置于共培培养基中，在暗处培养2d。温度：23±2℃。

(5)将外植体接到愈伤诱导培养基上，诱导愈伤。

(6)20天后，将愈伤组织转入分化培养基上。每20天继代一次。

（7）待芽长至1厘米时转入生根培养基上。

（8）利用CTAB法提取再生植株基因组DNA。进行PCR验证。

(9)利用室内离体叶片抗病性鉴定，筛选抗叶霉病植株，获得抗叶霉病新材料。番茄离体叶片用含叶霉病病原菌孢子5×10⁶浓度的孢子悬浮液喷在叶片背面，15天后观察每片叶病斑面积和菌丝层，根据离体叶片病情分级标准进行调查。

通过将含有叶霉抗性基因Cf-5的表达载体转入番茄子叶愈伤组织中，经过共培养、抗生素筛选和分化再生，通过对再生植株PCR 检测，获得了 17 株卡那霉素抗性植株。通过病原真菌接种试验证明，有5株转基因植株表现出较强的抗病性反应。 为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市农业科学院

<120> 一种抗叶霉病番茄材料的制备方法及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagtcgtctc acaacatgat gatggttact agcaa 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagtcgtctc atacactaga agcgattatt tcttc 35

<210> 3

<211> 11657

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg 60

ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg 120

gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga 180

caacttaata acacattgcg gacgttttta atgttagact gaattaacgc cgaattaatt 240

cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga attagaaatt ttattgatag 300

aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta tatgctcaac acatgagcga 360

aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact cacacattat tatggagaaa 420

ctcgagcttg tcgatcgaca gatccggtcg gcatctactc tatttctttg ccctcggacg 480

agtgctgggg cgtcggtttc cactatcggc gagtacttct acacagccat cggtccagac 540

ggccgcgctt ctgcgggcga tttgtgtacg cccgacagtc ccggctccgg atcggacgat 600

tgcgtcgcat cgaccctgcg cccaagctgc atcatcgaaa ttgccgtcaa ccaagctctg 660

atagagttgg tcaagaccaa tgcggagcat atacgcccgg agtcgtggcg atcctgcaag 720

ctccggatgc ctccgctcga agtagcgcgt ctgctgctcc atacaagcca accacggcct 780

ccagaagaag atgttggcga cctcgtattg ggaatccccg aacatcgcct cgctccagtc 840

aatgaccgct gttatgcggc cattgtccgt caggacattg ttggagccga aatccgcgtg 900

cacgaggtgc cggacttcgg ggcagtcctc ggcccaaagc atcagctcat cgagagcctg 960

cgcgacggac gcactgacgg tgtcgtccat cacagtttgc cagtgataca catggggatc 1020

agcaatcgcg catatgaaat cacgccatgt agtgtattga ccgattcctt gcggtccgaa 1080

tgggccgaac ccgctcgtct ggctaagatc ggccgcagcg atcgcatcca tagcctccgc 1140

gaccggttgt agaacagcgg gcagttcggt ttcaggcagg tcttgcaacg tgacaccctg 1200

tgcacggcgg gagatgcaat aggtcaggct ctcgctaaac tccccaatgt caagcacttc 1260

cggaatcggg agcgcggccg atgcaaagtg ccgataaaca taacgatctt tgtagaaacc 1320

atcggcgcag ctatttaccc gcaggacata tccacgccct cctacatcga agctgaaagc 1380

acgagattct tcgccctccg agagctgcat caggtcggag acactgtcga acttttcgat 1440

cagaaacttc tcgacagacg tcgcggtgag ttcaggcttt ttcatatctc attgcccccc 1500

cggatctgcg aaagctcgag agagatagat ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg 1560

tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg tcttgcgaag gatagtggga 1620

ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt 1680

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc 1740

actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta 1800

ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa 1860

tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc 1920

tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttatc 1980

acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct 2040

cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt 2100

tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat 2160

gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg 2220

aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac 2280

gagagtgtcg tgctccacca tgttggcaag ctgctctagc caatacgcaa accgcctgca 2340

ggtctagaca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa cagaactcgc cgtaaagact 2400

ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga ctcaatgaca agaagaaaat cttcgtcaac 2460

atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac 2520

caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccat 2580

tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa 2640

tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc 2700

aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct 2760

tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac 2820

tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gagaacacgg 2880

gggactttgc aacatgatga tggttactag caaagtattc tcttcacttc agtttttcac 2940

tgttttctac ctctttacag ttgcatttgc ttcgactgag gaggcaactg ccctcttgaa 3000

atggaaagca actttcaaga accagaataa ttcctttttg gcttcatgga cgacaagttc 3060

taatgcatgc aaggactggt atggagttgt atgcttgaat ggtagggtaa acacgttgaa 3120

tattacaaat gccagtgtca ttggtacact ttatgctttt ccattttcat ccctcccttt 3180

tctcgagaat cttgatctta gcaacaacaa tatctctggt accattccac ctgagattgg 3240

taatctcaca aatcttgtct atcttgactt gaacaccaat cagatttcag gaacaattcc 3300

accacaaatc ggttcactag ccaagcttca gatcatccgc atatttaaca atcatttaaa 3360

tggctttatt cctgaagaaa taggttacct aaggtctctt actaagctat ctttgggtat 3420

caactttctt agtggttcta ttcctgcttc attgggcaat atgaccaact tgtctttttt 3480

atttctttat gaaaatcagc tttctggctt tattcctgaa gaaataggtt acctaaggtc 3540

tcttactaag ctatctttgg atatcaactt tcttagtggt tccattcctg cttcattggg 3600

gaatctgaac aacttgtctt ttttgtatct ttacaataat cagctttctg gctctattcc 3660

tgaagaaata ggttacctaa ggtcacttac taagctatct ttgggtatca actttcttag 3720

tggttccatt cctgcttcat tggggaatct aaacaacttg tctaggttgg atctttacaa 3780

taataagctt tctggctcta ttcctgaaga aataggttac ctaaggtctc ttacttacct 3840

agatttgggt gagaatgctc ttaatggctc tattccttct tcattgggga atctaaacaa 3900

cttgtctagg ttggatcttt acaataataa gctttctggc tctattcctg aagaaatagg 3960

ttacctaagg tctcttactt acctagattt gggtgagaat gctcttaatg gctctattcc 4020

tgcttcattg gggaatctga acaacttgtt tatgttgtat ctttacaata atcagctttc 4080

tggctctatt cctgaagaaa taggttacct gagttctctt actgaactat atttgggtaa 4140

taactctctt aatggctcta ttcctgcttc attggggaat ctgaacaact tgtttatgtt 4200

gtatctttac aataatcagc tttctggctc tattcctgaa gaaataggtt acctgagttc 4260

tcttactgaa ctatttttgg gtaataactc tcttaatggc tctattcctg cttcattggg 4320

gaatctaaac aacttgtcta ggttgtatct ttacaataat cagctttctg gctctattcc 4380

tgcttcattt ggcaatatga gaaatctgca aactctgttt ctcagtgata acgatctcat 4440

tggggaaatt ccttcatttg tgtgcaattt gacatcactg gaagtgttgt atatgtcgag 4500

aaacaatttg aagggaaaag ttccgcaatg tttgggtaat atcagtgacc ttcacatttt 4560

gtcgatgtca tctaatagtt tcagaggaga gctcccttca tctatttcca atttaacatc 4620

actaaaaata cttgattttg gcagaaacaa tctggaggga gcaataccac aattttttgg 4680

caatattagt agcctccagg tttttgatat gcagaataac aaactttctg ggactcttcc 4740

aacaaatttt agcattggat gttcactgat aagtctcaac ttgcatggca atgaactagc 4800

agatgaaatc cctcggtctt tggacaattg caaaaagctg caagttcttg atttaggaga 4860

caatcaactc aacgacacat ttcccatgtg gttgggaact ttgccagagc tgagagtttt 4920

aaggttgaca tcgaataaat tgcatggacc tataagatca tcaggggctg aaatcatgtt 4980

tcctgatctc cgaatcatag atctctctcg caatgcattc tcgcaagact taccaacgag 5040

tctatttgaa catttgaaag ggatgaggac agttgataaa acaatggagg aaccaagtta 5100

tgaaagctat tacgatgact cggtggtagt tgtgacaaag ggattggagc ttgaaattgt 5160

gagaattctg tctttgtaca caattatcga tctttcaagc aacaaatttg aaggacatat 5220

tccttctgtc ctgggagatc tcattgcgat ccgtgtactt aatgtatctc ataatgcatt 5280

gcaaggctat ataccatcat cacttggaag tttatctata ctggaatcac tagacctttc 5340

gtttaaccaa ctttcgggag agataccaca acaacttgct tctcttacgt ttcttgaagt 5400

cttaaatctc tcccacaatt atctccaagg atgcatccct caaggacctc aattccgtac 5460

ctttgagagc aattcatatg aaggtaatga tggattacgt ggatatccag tttcaaaagg 5520

ttgtggcaaa gatcctgtgt cagagaaaaa ctatacagtg tctgcgctag aagatcaaga 5580

aagcaattct gaatttttca atgatttttg gaaagcagct ctgatgggct atggaagtgg 5640

actgtgtatt ggcatatcca taatatatat cttgatctcg actggaaatc taagatggct 5700

tgcaagaatc attgaagaac tggaacacaa aattatcgtg caaaggagaa agaagcagcg 5760

aggtcaaaga aattacagaa gaagaaataa tcgcttctag tgtaactagc tctgtcttca 5820

gtactgggcc cgaagactga ccagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata 5880

aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt 5940

gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt 6000

ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg 6060

cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gggccatccg 6120

cactgtagcg gatggcctaa aaaaaaaact agaagagacg agtctgagac tcagcgtctc 6180

ggtcgcagtc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgggccg cattaccctg 6240

ttatccctag gccgcataac ttcgtatagc ctacattata ggatggaggg atatcctctc 6300

ttaaggtagc gagcaagctc taagaggagt gtcgacaagc ttggcactgg ccgtcgtttt 6360

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 6420

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 6480

gcgcagcctg aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg gatcagattg tcgtttcccg 6540

ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa 6600

gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca 6660

tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc 6720

ctccgctgct atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc aggagatgat cgcggccggg 6780

tacgtgttcg agccgcccgc gcatgtctca accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt 6840

ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc 6900

cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct tgcgtcatgc ggtcgctgcg 6960

tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga acgcatgaag gttatcgctg 7020

tacttaacca gaaaggcggg tcaggcaaga cgaccatcgc aacccatcta gcccgcgccc 7080

tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag tcgattccga tccccagggc agtgcccgcg 7140

attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt cggcatcgac cgcccgacga 7200

ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc 7260

aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc 7320

agccaagccc ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca 7380

ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca 7440

cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta cgagctgccc attcttgagt 7500

cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc cgccggcaca accgttcttg 7560

aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc gctggccgct gaaattaaat 7620

caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc aaaagcacaa acacgctaag 7680

tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac 7740

gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag gatcacacca agctgaagat 7800

gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct 7860

accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg 7920

gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa 7980

cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg gccctgcaat ggcactggaa 8040

cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc 8100

gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa 8160

cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc 8220

aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc 8280

gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc 8340

agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg 8400

atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc 8460

agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac 8520

cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac 8580

gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc 8640

tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc 8700

cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc 8760

gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc 8820

acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc 8880

ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga 8940

tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt 9000

ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag 9060

gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca 9120

tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa 9180

ggtcgaaaag atctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt 9240

gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg 9300

taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt 9360

attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa 9420

gctcccggat acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 9480

gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga 9540

tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 9600

catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgttca 9660

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 9720

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 9780

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 9840

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 9900

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 9960

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 10020

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 10080

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 10140

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 10200

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 10260

aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 10320

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 10380

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 10440

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 10500

atgcattcta ggtactaaaa caattcatcc agtaaaatat aatattttat tttctcccaa 10560

tcaggcttga tccccagtaa gtcaaaaaat agctcgacat actgttcttc cccgatatcc 10620

tccctgatcg accggacgca gaaggcaatg tcataccact tgtccgccct gccgcttctc 10680

ccaagatcaa taaagccact tactttgcca tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg 10740

tcgccgtggg aaaagacaag ttcctcttcg ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc 10800

tcgcgcggat ctttaaatgg agtgtcctct tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga 10860

tcgttattca gtaagtaatc caattcggct aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga 10920

caatccgata tgtcgatgga gtgaaagagc ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc 10980

ttttcagggc tttgttcatc ttcatactct tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc 11040

atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc 11100

tttccttcca gccatagcat catgtccttt tcccgttcca catcataggt ggtcccttta 11160

taccggctgt ccgtcatttt taaatatagg ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc 11220

ttagcaggag acattccttc cgtatctttt acgcagcggt atttttcgat cagttttttc 11280

aattccggtg atattctcat tttagccatt tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt 11340

taaagatacc ccaagaagct aattataaca agacgaactc caattcactg ttccttgcat 11400

tctaaaacct taaataccag aaaacagctt tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata 11460

acatagtatc gacggagccg attttgaaac cgcggtgatc acaggcagca acgctctgtc 11520

atcgttacaa tcaacatgct accctccgcg agatcatccg tgtttcaaac ccggcagctt 11580

agttgccgtt cttccgaata gcatcggtaa catgagcaaa gtctgccgcc ttacaacggc 11640

tctcccgctg acgccgt 11657

Claims (4)

1.一种用于提高抗叶霉病番茄材料的基因Cf-5引物：

(+):cagtCGTCTCacaacatgatgatggttactagcaa (-):cagtCGTCTCatacactagaagcgattatttcttc。

2.采用权利要求1所述用于提高抗叶霉病番茄材料的基因Cf-5引物制备抗叶霉病番茄材料的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）通过番茄叶霉抗性目的基因Cf-5的保守DNA序列设计引物；

2）利用引物进行扩增，并纯化扩增产物；

3）将扩增后的产物与载体链接，得到含有目的基因的载体；

4)利用农杆菌侵染法将上述含有目的基因序列的载体转化到番茄中，以番茄子叶为外植体，通过愈伤组织诱导培养基诱导愈伤，愈伤组织转到分化培养基上诱导芽，待芽长至5厘米左右再转到生根培养基上生根；遗传转化经卡那霉素抗性筛选，愈伤组织再生，获得遗传转化植株，并进行PCR验证；

5)利用室内离体叶片抗病性鉴定，筛选抗叶霉病植株，获得抗叶霉病新材料。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的遗传转化培养基指的是 ：

愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.7mg/L+3%蔗糖；

分化培养基:MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+3%蔗糖；

生根培养基：1/2MS+IAA0.1mg/L+3%蔗糖。

4.权利要求1所述用于提高抗叶霉病番茄材料的基因Cf-5引物在用于番茄改良育种方面的应用。

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