CN1821407B - 一种转基因番茄高效稳定表达体系 - Google Patents

Abstract

本发明克隆获得了我国优良纯种番茄Zhongshu No.5果实特异性启动子E82.2和E81.1基因，分别用番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S-E81.1复合式双启动子驱动疫苗分子并与NOS终止子构成植物表达操纵子单元，导入根癌农杆菌LBA4404获得工程菌；通过优化包括培养基等试剂配方、技术方案以及操作流程建立了番茄高频再生体系、番茄基因转化、抗性筛选、植株培育及其分子鉴定等完整的技术体系，获得能高效稳定表达的疫苗分子重组蛋白及其番茄转化株系(部分植株目的蛋白的表达量可达番茄组织可溶性总蛋白10％以上，且经过蛋白纯化、Western blot、ELISA分析表明所获重组蛋白具有良好的免疫学活性)。本发明构建了可用于外源疫苗分子及药用蛋白生产的番茄高效稳定表达体系技术平台，为深入研发番茄口服疫苗及其药用蛋白提供了良好的技术平台。

Description

一种转基因番茄高效稳定表达体系

技术领域

本发明涉及一种高效表达药用蛋白、疫苗分子等的转基因番茄体系。该体系是以番茄果实特异性E8启动子、增强型的花椰菜花叶病毒35S启动子与E8启动子构成的双启动子驱动疫苗分子等目的蛋白，以及NOS终止子构成的基因表达操纵子，构建中间载体、植物表达载体，转化农杆菌LBA4404后所建立的番茄转化、筛选鉴定以及稳定高效表达外源目的基因的转基因植株品系培育和分子鉴定体系，包括所有涉及的载体、菌种，技术流程、试剂配方、最后所获得的高效稳定表达的疫苗或药用蛋白及其转基因番茄品系与应用情况。

背景技术

(一)植物生物反应器的优越性

植物基因工程的实质就是在分子水平上重组植物遗传物质，以获得人们所期望的作物新品种。植物医药基因工程是将医药用目的基因导入植物遗传物质，获得表达外源基因的转基因植株，以生产医药用重组蛋白、抗体，研制转基因口服疫苗。植物作为新型生物反应器，具有以下几方面的优越性：

1.植物细胞具有全能性。

2.植物具有完整的真核细胞表达系统，可实现表达产物的糖基化、磷酸化，亚基的正确装配以及蛋白的正确折叠等翻译后加工，使其表达产物较原核表达系统具有更好的生物活性和免疫原性。

3.植物主要依靠光合作用生长，能实现大规模种植，是目前最经济、能大规模生产蛋白质的生产系统，故又称之为“生物药田”。

4.果蔬类植物如番茄、香蕉等以其独具的可食(饲)性在疫苗研制方面展示了良好的开发应用潜能。这种予“免疫接种”于“食用”的新型疫苗的开发，将使疫苗的使用变得简便而价廉。一方面，可省去传统疫苗生产所需要的繁琐的下游蛋白分离提纯步骤，节省大量的人力物力；另一方面，比传统的免疫途径更安全，不需要注射器和针头之类的设备，可避免因使用未经消毒的注射器和针头而交叉感染经血液传播的疾病，如艾滋病和乙肝等；另，植物病毒等对人和动物无致病性，不会引起如致弱疫苗等存在的回复突变，以及在常规疫苗制备过程中病毒细菌的污染而引起的潜在致病的担忧。

5.易于储存和分发，不需要常规疫苗的冷链设备，可随时长期给药。

6.可实现大范围给药，可用于人、家畜和野生食草动物等，不需要过多的经过特殊培训的专业医护、技术人员的投入。

7.转基因果蔬疫苗，在服用疫苗的同时，还提供了营养。

8.可实现多基因转化：可在设计构建植物表达载体进行多基因的联接；也可在获得不同单基因转化植株后，将鉴定后的两种不同基因转化的子代进行杂交培育，获得表达双基因产物的新植株品系。对实现多种疾病的同步防治，或对生活史复杂、抗原多变的寄生虫病防治均提供了一条新的疫苗防治思路。

(二)植物转基因技术中“转基因沉默”现象

近年来，用果蔬如番茄等作为口服疫苗蛋白及药用蛋白表达系统，较被看好，有着巨大的开发潜能。但其离实际应用还有一些距离，许多问题尚需深入研究。大量实验结果显示在植物基因转化过程普遍存在外源基因的表达水平低甚至不表达，而且各独立转化体间出现显著差异。这种外源基因在转基因植物中表达受到抑制的现象称之为转基因沉默(transgene silencing)。

基因沉默主要涉及外源基因之间或外源基因和植物内源基因之间的互相作用，最重要的原因是存在多拷贝的同源DNA序列，包括蛋白编码区以及启动子等调控序列。转基因沉默主要可发生在两个阶段：转录水平上(transcriptionalgene silencing，TGS)，转录后水平上(post-transcriptional genesilencing，PTGS)。

(三)提高外源基因表达水平克服转基因沉默的应对策略分析

启动子是基因转录水平最为重要的调控因子之一，在决定基因表达方面作用关键，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性对增强外源基因表达至关重要。

目前在植物基因转化过程中广泛使用的是组成型启动子，其可驱动外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段的表达。双子叶植物多使用CaMV35S启动子。近年来，特异性表达启动子的研究受到重视，其能调控外源基因在植物基因转化体内特定的时空秩序或在外源诱导因子的作用下呈现特异性表达，一方面可提高表达效能和表达水平，另一方面，尚可节省生物能耗，减小外源基因对植物本身的影响。特异性启动子主要包括组织特异性启动子和诱导特异性启动子。组织特异性启动子，如：种子特异性表达启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子等。诱导特异性启动子主要有：环境响应启动子，如：光响应启动子、温度响应启动子等；激素响应启动子，如：IAA响应启动子、乙烯响应启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为实现外源基因在植物中的特异性表达奠定了基础。

在植物基因转化研究中发现，对现有的天然启动子进行改造，构建复合式启动子也是一条提高启动子活性的重要途径。吴瑞等人将诱导型PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍^[32]外源基因的结构，选用的密码子是否符合植物受体的偏好；外源基因片段的大小，以及所选用的启动子等诸多因素，均对转基因遗传稳定性产生影响。外源基因的片段大小可影响其能否稳定表达，大片段的目的基因对DNA截断(truncation)、位置效应(position effect)以及共抑制效应(co-suppression)较为敏感。而启动子则是影响外源基因能否稳定高效表达的最重要、最关键的因素之一。

(四)本发明构建了高效稳定表达外源目的蛋白的转基因番茄体系

本发明克隆获得了我国优良纯种番茄Zhongshu No.5果实特异性启动子E82.2和E81.1基因，分别用番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S-E81.1复合式双启动子驱动疫苗分子以及NOS终止子构成的基因表达操纵子，构建植物表达载体，导入根癌农杆菌LBA4404；建立了番茄高频再生体系和高效转化体系；获得能高效稳定表达的疫苗分子重组蛋白及其番茄转化株系(部分植株目的蛋白的表达量可达番茄组织可溶性总蛋白的10％以上，且经过蛋白纯化、Westernblot、ELISA分析表明所获得的重组蛋白具有良好的免疫学活性)。本发明构建了可用于外源疫苗分子及药用蛋白生产的番茄高效稳定表达体系技术平台，为深入研发番茄口服疫苗及其药用蛋白提供了良好的技术平台。

发明内容

本发明是从我国优良纯种番茄Zhongshu No.5克隆分离了番茄果实特异性启动子E82.2和E81.1基因，获得载体pGEM-T-E82.2和pGEM-T-E81.1。分别用番茄果实特异性E82.2启动子、植物组成型启动子E35S以及以E35S和E81.1构成E35S-E81.1复合式双启动子驱动外源目的基因疫苗分子，与NOS终止子组成表达操纵子单元，亚克隆后构建植物中间载体和表达载体，导入根癌农杆菌LBA4404，获得用于植物转化的疫苗分子表达工程菌；优化含培养基配方及操作流程等的技术方案建立了番茄高频再生体系和番茄基因转化体系，将植物转化工程菌用农杆菌介导的叶盘转化法转染番茄，卡那霉素抗性筛选获取番茄转基因植株：以PCR等方法进行目的基因整合番茄基因组的鉴定；用RT-PCR鉴定目的基因在转录水平的表达情况；用SDS-PAGE、Western blot分析鉴定目的基因在番茄转化植株中的蛋白表达情况，并初步进行了番茄表达重组蛋白的纯化并进行转基因番茄植株T1代初步的遗传分析，获得能高效稳定表达疫苗分子的番茄转化株系(部分植株目的蛋白的表达量可达番茄组织可溶性总蛋白的10％以上，且经过蛋白纯化、Western blot、ELISA分析表明所获得的重组蛋白具有良好的免疫学活性)。本发明构建了可用于外源疫苗分子及药用蛋白生产的番茄高效稳定表达技术平台。

这样，在第一个方面，本发明提供了我国优良纯种番茄Zhongshu No.5番茄果实特异性启动子E82.2基因序列：

Zhongshu No.5番茄果实特异性启动子E82.2基因序列

TCCCTAATGA TATTGTTCAT GTAATTAAGT TTTGTGGAAG TGAGAGAGTC CAATTTTGAT 60

AAGAAAAGAG TCAGAAAACG TAATATTTTA AAAGTCTAAA TCTTTCTACA AATAAGAGCA 120

AATTTATTTA TTTTTTAATC CAATAAATAT TAATGGAGGA CAAATTCAAT TCACTTTGGT 180

TGTAAAATAA ACTTAAACCA ATAACCAAAG AACTAATAAA TCCTGAAGTG GAATTATTAA 240

GGATAAATGT ACATAGACGA TGAAGAAATA ATAGGTTCGA TGAATTAATA ATAATTAAGG 300

ATGTTACAAT CATCATGTGC CAAGTATATA CACAATATTC TATGGGATTT ATAATTTCGT 360

TACTTCACTT AACTTTTGCG TAAATAAAAC GAATTATCTG ATATTTTATA ATAAAACAGT 420

TAATTAAGAA CCATCATTTT TAACAACATA GATATATTAT TTCTAATAGT TTAATGATAC 480

TTTTAAATCT TTTAAATTTT ATGTTTCTTT TAGAAAATAA AAATTCAAAA AATTAAATAT 540

ATTTACAAAA ACTACAATCA AACACAACTT CATATATTAA AAGCAAAATA TATTTTGAAA 600

ATTTCAAGTG TCCTAACAAA TAAGACAAGA GGAAAATGTA CGATGAGAGA CATAAAGAGA 660

ACTAATAATT GAGGAGTCCT ATAATATATA ATAAAGTTTA TTAGTAAACT TAATTATTAA 720

GGACTCCTAA AATATATGAT AGGAGAAAAT GAATGGTGAG AGATATTGGA AAACTTAATA 780

ATTAAGGATT TTAAAATATA TGGTAAAAGA TAGGCAAAGT ATCCATTATC CCCTTTTAAC 840

TTGAAGTCTA CTAGGCGCAT GTGAAAGTTG ATTTTTTGTC ACGTCATATA GCTATAACGT 900

AAAAAAAGAA AGTAAAATTT TTAATTTTTT TTAATATATG ACATATTTTA AACGAAATAT 960

AGGACAAAAT GTAAATGAAT AGTAAAGGAA ACAAAGATTA ATACTTACTT TGTAAGAATT 1020

TAAGATAAAT TTAAAATTTA ATAGATCAAC TTTACGTCTA GAAAGACCCA TATCTAGAAG 1080

GAATTTCACG AAATCGGCCC TTATTCGAAA ATAACTTTTA AATAATGAAT TTTAAATTTT 1140

AAGAAATAAT ATCCAATGAA TAAATGACAT GTAGCATTTT ACCTAAATAT TTCAACTATT 1200

TTAATCCAAT ATTAATTTGT TTTATTCCCA ACAATAGAAA GTCTTGTGCA GACATTTAAT 1260

CTGACTTTTC CAGTACTAAA TATTAATTTT CTGAAGATTT TCGGGTTTAG TCCACAAGTT 1320

TTAGTGAGAA GTTTTGCTCA AATTTTAGGT GAGAAGGTTT GATATTTATC TTTTGTTAAA 1380

TTAATTTATC TAGGTGACTA TTATTTATTT AAGTAGAAAT TCATATCATT ACTTTTGCCA 1440

ACTTGTAGTC ATAATAGGAG TAGGTGTATA TGATGAAGGA ATAAACAAGT TCAGTGAAGT 1500

GATTAAAATA AAATATAATT TAGGTGTACA TCAAATAAAA ACCTTAAAGT TTAGAAAGGC 1560

ACCGAATAAT TTTGCATAGA AGATATTAGT AAATTTATAA AAATAAAAGA AATGTAGTTG 1620

TCAAGTTGTC TTCTTTTTTT TGGATAAAAA TAGCAGTTGG CTTATGTCAT TCTTTTACAA 1680

CCTCCATGCC ACTTGTCCAA TTATTGACAC TTAACTAATT AGTTTGATTC ATGTATGAAT 1740

ACTAAATAAT TTTTTAGGAC TGACTCAAAT ATTTTTATAT TATCATAGTA ATATTTATCT 1800

AATTTTTAGG ACCACTTATT ACTTAATAAT AAATTAACTA CAACTATATT ATTGTTGTGA 1860

AACAACAACG TTTTGGTTGT TATGATGAAA CGTACACTAT ATCAGTATGA AAAATTCAAA 1920

ACGATTAGTA TAAATTATAT TGAAAATTTG ATATTTTTCT ATTCTTAATC AGACGTATTG 1980

GGTTTCATAT TTTAAAAAGG GACTAAACTT AGAAGAGAAG TTTGTTTGAA ACTACTTTTG 2040

TCTCTTTCTT GTTCCCATTT CTCTCTTAGA TTTCAAAAAG TGAACTACTT TATCTCTTTC 2100

TTTGTTCACA TTTTATTTTA TTCTATTATA AATATGGCAT CCTCATATTG AGATTTTTAG 2160

AAATTATTCT AATCATTCAC AGTGCAAAAG A2191

在第二个方面，本发明提供了我国优良纯种番茄Zhongshu No.5番茄果实特异性启动子E81.1基因序列：

Zhongshu No.5番茄果实特异性启动子E81.1基因序列

CGACCTAGTG ATTCCGAAGC TTTCTAGAAG GAATTTCACG AAATCGGCCC TTATTCAAAA 60

ATAACTTTTA AATAATGAAT TTTAAATTTT AAGAAATAAT ATCCAATGAA TAAATGACAT 120

GTAGCATTTT ACCTAAATAT TTCAACTATT TTAATCCAAT ATTAATTTGT TTTATTCCCA 180

ACAATAGAAA GTCTTGTGCA GACATTTAAT CTGACTTTTC CAGTACTAAA TATTAATTTT 240

CTGAAGATTT TCGGGTTTAG TCCACAAGTT TTAGTGAGAA GTTTTGCTCA AAATTTTAGG 300

TGAGAAGGTT TGATATTTAT CTTTTGTTAA ATTAATTTAT CTAGGTGACT ATTATTTATT 360

TAAGTAGAAA TTCATATCAT TACTTTTGCC AACTTGTAGT CATAATAGGA GTAGGTGTAT 420

ATGATGAAGG AATAAACAAG TTCAGTGAAG TGATTAAAAT AAAATATAAT TTAGGTGTAC 480

ATCAAATAAA AACCTTAAAG TTTAGAAAGG CACCGAATAA TTTTGCATAG AAGATATTAG 540

TAAATTTATA AAAATAAAAG AAATGTAGTT GTCAAGTTGT CTTCTTTTTT TTGGATAAAA 600

ATAGCAGTTG GCTTATGTCA TTCTTTTACA ACCTCCATGC CACTTGTCCA ATTGTTGACA 660

CTTAACTAAT TAGTTTGATT CATGTATGAA TACTAAATAA TTTTTTAGGA CTGACTCAAA 720

TATTTTTATA TTATCATAGT AATATTTATC TAATTTTTAG GACCACTTAT TACTAAATAA 780

TAAATTAACT ACTACTATAT TATTGTTGTG AAACAACAAC GTTTTGGTTG TTATGATGAA 840

ACGTACACTA TATCAGTATG AAAAATTCAA AACGATTAGT ATAAATTATA TTGAAAATTT 900

GATATTTTTC TATTCTTAAT CAGACGTATT GGGTTTCATA TTTTAAAAAG GGACTAAACT 960

TAGAAGAGAA GTTTGTTTGA AACTACTTTT GTCTCTTTCT TGTTCCCATT TCTCTCTTAG 1020

ATTTCAAAAA GTGAACTACT TTATCTCTTT CTTTGTTCAC ATTTTATTTT ATTCTATTAT 1080

AAATATGGCA TCCTCATATT GAGATTTTTA GAAATTATTC TAATCATTCA CAGTGCAAAA 1140

GAGGATCCTC TAGAGGCAAT CCCGCGGCCA TGGCGGCCGG GAGCATGCGA CGTCGGGC 1198

在第三个方面，本发明提供了我国优良纯种番茄Zhongshu No.5番茄果实特异性启动子E81.1基因与植物组成型启动子E35S基因构成的E35S-E81.1复合式启动子基因序列：

以E35S和E81.1构建的E35S-E81.1复合式启动子基因序列

AAGCTTTGAG TGGCCGTAGA TTTGCAAAAG CAATGGCTAA CAGACACATA TTCTGCCAAA 60

CCCCAAGAAG GATAATCACT TTTCTTAGAT AAAAAAGAAC AGACCAATAT ACAAACATCC 120

ACACTTCTGC AAACAATACA TCAGAACTAG GATTACGCCG ATTACGTGGC TTTAGCAGAC 180

TGTCCAAAAA TCTGTTTTGC AAAGCTCCAA TTGCTCCTTG GCGTTGAGCA CCGGCGAGCC 240

GGAGTTGCCG CCGGTGGTAT CCAGGTTGGT CAGGAAGTTG ACCGTCTGGG TCTTCAGCGC 300

CGGGTCGGCG GTGCTGCCGA AGTCACCCTT GGCAATCGCC GCCAGCAGCG GCTTGGGCGC 360

ATCGAACGGA TAGGCGTTGG TGTTCTTCTC GACGATGCCG GCCACGGTGG TCACCGGCGA 420

GTAGGTCACG CCATCGCGCG GGTGCAGCGC CTCCACCTTG CCGTAGCTGA TGCGCAGGGT 480

GCGGTTGGCA TCCGGGTACA CATCTCCACT GACGTAAGGG ATGACGCACA ATCCCACTAT 540

CCTTCGCAAG ACCCTTCCTC TATATAAGGA AGTTCATTTC ATTTGGAGAG AACACGGGGG 600

ACTCTAGAAG GAATTTCACG AAATCGGCCC TTATTCAAAA ATAACTTTTA AATAATGAAT 660

TTTAAATTTT AAGAAATAAT ATCCAATGAA TAAATGACAT GTAGCATTTT ACCTAAATAT720

TTCAACTATT TTAATCCAAT ATTAATTTGT TTTATTCCCA ACAATAGAAA GTCTTGTGCA 780

GACATTTAAT CTGACTTTTC CAGTACTAAA TATTAATTTT CTGAAGATTT TCGGGTTTAG 840

TCCACAAGTT TTAGTGAGAA GTTTTGCTCA AAATTTTAGG TGAGAAGGTT TGATATTTAT 900

CTTTTGTTAA ATTAATTTAT CTAGGTGACT ATTATTTATT TAAGTAGAAA TTCATATCAT 960

TACTTTTGCC AACTTGTAGT CATAATAGGA GTAGGTGTAT ATGATGAAGG AATAAACAAG 1020

TTCAGTGAAG TGATTAAAAT AAATATAAT TTAGGTGTAC ATCAAATAAA AACCTTAAAG1 080

TTTAGAAAGG CACCGAATAA TTTTGCATAG AAGATATTAG TAAATTTATA AAAATAAAAG 1140

AAATGTAGTT GTCAAGTTGT CTTCTTTTTT TTGGATAAAA ATAGCAGTTG GCTTATGTCA 1200

TTCTTTTACA ACCTCCATGC CACTTGTCCA ATTGTTGACA CTTAACTAAT TAGTTTGATT 1260

CATGTATGAA TACTAAATAA TTTTTTAGGA CTGACTCAAA TATTTTTATA TTATCATAGT 1320

AATATTTATC TAATTTTTAG GACCACTTAT TACTAAATAA TAAATTAACT ACTACTATAT 1380

TATTGTTGTG AAACAACAAC GTTTTGGTTG TTATGATGAA ACGTACACTA TATCAGTATG 1440

AAAAATTCAA AACGATTAGT ATAAATTATA TTGAAAATTT GATATTTTTC TATTCTTAAT 1500

CAGACGTATT GGGTTTCATA TTTTAAAAAG GGACTAAACT TAGAAGAGAA GTTTGTTTGA 1560

AACTACTTTT GTCTCTTTCT TGTTCCCATT TCTCTCTTAG ATTTCAAAAA GTGAACTACT 1620

TTATCTCTTT CTTTGTTCAC ATTTTATTTT ATTCTATTAT AAATATGGCA TCCTCATATT 1680

GAGATTTTTA GAAATTATTC TAATCATTCA CAGTGCAAAA GAGGATCCTC TAGA 1734

在第四个方面，一种如权利要求1或2所限定的启动子的中间载体pGEM-T-E82.2和pGEM-T-E81.1。

在第五个方面，一种如权利要求1或2或3所限定之启动子或E35S启动子驱动目的疫苗分子，以NOS为终止子构成植物表达外源疫苗分子的操纵子单元，及其构建的植物中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG、pB35tSAG1、pB35E1tSAG1、pBE2tSAG1。其中植物表达操纵子单元构成如下：

pB35MG含操纵子单元：E35S启动子+疫苗分子MAG+NOS终止子

pB35E1MG含操纵子单元：

E35S-E81.1复合式启动子+疫苗分子MAG+NOS终止子

pBE2MG含操纵子单元：E82.2启动子+疫苗分子MAG+NOS终止子

pB35tSAG1含操纵子单元：E35S启动子+疫苗分子tSAG1+NOS终止子

pB35E1tSAG1含操纵子单元：

E35S-E81.1复合式启动子+疫苗分子tSAG1+NOS终止子

pBE2tSAG1含操纵子单元：E82.2启动子+疫苗分子tSAG1+NOS终止子

在第六个方面，一种如权利要求1或2或3或5所限定之启动子或植物表达外源疫苗分子的操纵子单元构建的植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG、pC35tSAG1、pC35E1tSAG1、pCE2tSAG1。

在第七个方面，一种如权力要求1或2或3或5或6所限定之启动子或植物表达外源疫苗分子的操纵子单元构建的植物表达载体的转化农杆菌菌株，即工程菌pC35MG/LBA4404、pC35E1MG/LBA4404、pCE2MG/LBA4404、pC35tSAG1/LBA4404、pC35E1tSAG1/LBA4404、pCE2tSAG1/LBA4404。

在第八个方面，一种限定植物培养基配方、培养条件及其技术方案与操作流程的番茄高频再生体系。

再生培养基1：MS基础培养基，ZT0.2～0.5mg/L，IAA0.1mg/L；

或再生培养基2：MS，ZT0.2～0.5mg/L；

或再生培养基3：MS，ZT0.2～0.5mg/L，6-BA0.5mg/L，IAA0.1mg/L；

培养条件为置人工光照气候箱中，温度条件23℃-25℃，2周继代培养一次。

在第九个方面，一种限定植物培养基配方和培养条件，以及番茄外植体预培养、农杆菌浸染、共培养以及高抗性筛选下的芽诱导、芽伸长、根诱导，以及筛选获得植株后的练苗、移栽与栽培的技术方案与操作流程。包括：

(a)植物表达工程菌浸染悬浮液制备时加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度100μM，番茄外植体经过预培养、浸染与共培养，使用上述再生培养基3。

对上述(a)所获得的番茄转化体进行芽诱导与芽伸长时期的抗性筛选培养，芽诱导选择培养基：由下列组分配制而成MS，ZT0.2-0.5mg/L，6-BA0.5mg/L，IAA0.1mg/L，Cef400mg/L，Kana100mg/L

芽伸长筛选培养基：由下列组分配制而成

MS，ZT0.2mg/L，Cef100-200mg/L，Kana100mg/L；

(b)对上述(b)所获得的芽伸长时期的番茄转化体进行生根诱导抗性筛选培养及转基因番茄植株的再生；使用的培养基为生根选择培养基：MS(备注其中大量元素减半)，IAA0.2mg/l，Cef100mg/L，Kana50-100mg/L。

(c)对上述(f)抗性筛选获得的转基因番茄再生植株经过练苗、移栽、大田培育至自然生长开花结果。

在第十个方面，获得如权力要求1或2或3或5或6或7所限定的转基因番茄植株亲代和子代的高效稳定表达外源目的基因的番茄品系，包含亲代、子代的植株、种子、组织胚胎培养物，以及此转基因番茄品系表达的重组外源目的蛋白或其抗原片段的用途，如用于制备动物或人的弓形虫病诊断试剂或疫苗等。

在第十一个方面，本发明提供了从DNA、RNA、PROTEIN三个水平进行转基因番茄筛选鉴定及子代分析的技术方案与操作流程。

(d)番茄基因组DNA的提取；

(e)番茄总RNA的提取；

(f)番茄可溶性总蛋白的提取；

(g)对上述(e)所获得的番茄基因组DNA以PCR扩增进行转基因番茄外源插入序列的基因组整合分析，确认具有特异性的目的基因扩增带；

(h)对上述(f)所获得的番茄总RNA以RT-PCR进行转基因番茄外源插入目的疫苗分子在转录水平的表达分析，确认具有特异性的目的基因cDNA扩增带；

(i)对上述(g)所获得的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，针对转基因番茄表达外源疫苗蛋白的分子量大小，分别建立了小分子蛋白(20-50kDa)、(2.5-20kDa)区段的最佳电泳系统：Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳系统和Urea-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳系统；

(j)对上述(j)电泳所获得的蛋白质Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶和Urea-Tricine聚丙烯酰胺凝胶，电转移至NC膜或PVDF膜上，进行western blotting，鉴定所获得蛋白免疫反应性。确认转基因番茄具有重组表达特定蛋白质的存在；

与已有技术相比有如下优点：

植物转基因技术中“转基因沉默”以及外源目的蛋白表达量低、表达不稳定仍是目前以植物作为新型生物反应器来生产药用蛋白或疫苗所需要解决的问题。

本发明克隆获得了我国优良纯种番茄Zhongshu No.5果实特异性启动子E82.2和E81.1基因，分别用番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S-E81.1复合式双启动子驱动疫苗分子并与NOS终止子构成植物表达操纵子单元，导入根癌农杆菌LBA4404获得工程菌；通过优化包括培养基等试剂配方、技术方案以及操作流程建立了番茄高频再生体系、番茄基因转化、抗性筛选、植株培育及其分子鉴定等完整的技术体系，获得能高效稳定表达的疫苗分子重组蛋白及其番茄转化株系(部分植株目的蛋白的表达量可达番茄组织可溶性总蛋白10％以上，且经过蛋白纯化、Western blot、ELISA分析表明所获重组蛋白具有良好的免疫学活性)。本发明构建了可用于外源疫苗分子及药用蛋白生产的番茄高效稳定表达体系技术平台，为深入研发番茄口服疫苗及其药用蛋白提供了良好的技术平台。

附图说明

图1 番茄基因组DNA提取和番茄果实特异性E81.1启动子PCR扩增结果

1 番茄基因组DNA

2，3 番茄果实特异性E81.1核心启动子区PCR扩增片段

4 E81.1PCR产物纯化片段 5 DNA标准分子量

图2番茄果实特异性E82.2启动子基因PCR扩增结果

1 DNA标准分子量

2 番茄果实特异性E82.2启动子全长PCR扩增片段

3 番茄果实特异性E81.1核心启动子区PCR扩增片段

图3番茄果实特异性E81.1启动子基因重组质粒酶切鉴定图

1 DNA标准分子量           2 pGEM-T空载体Apa I单酶切

3 E81.1PCR产物纯化片段    4 pGEM-T-E81.1Xba I单酶切

5，6 pGEM-T-E81.1HindIII+BamH I双酶切

图4番茄果实特异性E82.2启动子基因重组质粒酶切鉴定图

1，2 E82.2PCR产物纯化片段 3 pGEM-T空载体Apa I单酶切

4 pGEM-T-E82.2HindIII+B mH I双酶切 5 DNA标准分子量

图5 以植物组成型启动子E35S驱动MAG与终止子NOS组成的操纵子单元构建植物

中间载体pB35MG及植物表达载体pC35MG的构建示意图

图6 以E35S和番茄果实特异性E81.1启动子双启动子驱动MAG与终止子NOS组成的操纵子单元构建植物中间载体pB35E1MG及植物表达载体pC35E1MG的构建示意图

图7 以番茄果实特异性E82.2启动子驱动MAG与终止子NOS组成的操纵子单元构建植物中间载体pBE2MG及植物表达载体pCE2MG的构建示意图

图8 番茄子叶在ZB3培养基中获得高效再生

图9 抗性筛选下的转基因番茄芽的诱导与伸长

图10、11 抗性筛选转基因番茄诱导生根

图12 转基因番茄生根练苗后营养土栽培

图13 转基因番茄大田栽种后开花

图14、15 转基因番茄大田栽种后结果

图16 部分转基因番茄植株中MAG的PCR扩增结果图

1，4 pC35MG/LBA4404转化番茄植株 2，6 pC35E1MG/LBA4404转化番茄植株

3，5，7 pCE2MG/LBA4404转化番茄植株 8 阳性质粒对照

9 阴性对照植株 M DNA标准分子量

图17 部分转基因番茄植株果实和叶片总RNA的提取结果图

1 正常组胚对照植株 2.3 转基因植株果实 4 转基因植株叶片

图18 部分转基因番茄植株中MAG的RT-PCR扩增结果图

1，5 pCE2MG/LBA4404转化番茄植株叶片 2，6 pCE2MG/LBA4404转化番茄植株果实

3，7 pC35MG/LBA4404转化番茄植株果实 4 pC35MG/LBA4404转化番茄植株叶片

8 阴性对照植株 9 阳性质粒对照 M DNA标准分子量

图19 HRP标记的弓形虫tSAG1单克隆抗体K₇H₃(HRP-K₇H₃)

对部分弓形虫MAG转基因番茄植株果实蛋白的Western-blot识别结果图

1 76号(pC35MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

2 98号(pCE2MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR^-)

3 28号(pCE2MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

4 122号(pCE2MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

5 79号(pC35MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

6 102号(pCE2MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

7 46号(pCE2MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

8 106号(pCE2MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

9 72号(pC35MG/LBA4404转化植株，PCR⁺、RT-PCR⁺)

10 阴性对照植株 M Sigma低分子量标准蛋白

图20HRP标记的弓形虫tSAG1单克隆抗体Y₃A₈(HRP-Y₃A₈)

对部分弓形虫tSAG1转基因番茄植株叶片蛋白的Western-blot识别结果图

1 阴性对照植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

2 p8pC35E1tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+阴性鼠血清

3 p8pC35E1tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

4 p7pC35E1tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

5 p6pC35E1tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

6 p5pC35tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

7 p4pC35tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

8 p3pC35tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

9 p2pC35tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

10 p1pC35E1tSAG1/LBA4404转化植株叶片蛋白+HRP-Y₃A₈

M 低分子量标准蛋白

图21 弓形虫tSAG1转基因番茄蛋白的SDS-PAGE分析

1 阴性对照植株2tSAG1转基因植株3标准分子量蛋白

图22 弓形虫tSAG1转基因番茄蛋白的Western-blot分析

1 阴性对照植株2tSAG1转基因植株3标准分子量蛋白

图23 E.coli及转基因番茄表达的弓形虫tSAG1重组蛋白及其纯化产物的SDS-PAGE分析

1，5，8 低分子量标准蛋白

2 E.coli表达的弓形虫tSAG1融合型重组蛋白纯化产物

3 E.coli表达的弓形虫tSAG1融合型重组蛋白酶切去担体蛋白的纯化产物

4 E.coli表达的弓形虫tSAG1融合型重组蛋白酶切后的担体蛋白纯化产物

6 番茄表达的弓形虫tSAG1重组蛋白纯化产物

7 弓形虫tSAG1转基因番茄植株可溶性总蛋白

图24 HRP标记的弓形虫tSAG1单克隆抗体Y3A8(HRP-Y3A8)

对E.coli及转基因番茄表达的弓形虫tSAG1重组蛋白及其纯化产物的Western-blot识别图

1 Ecoli表达的弓形虫tSAG1融合型重组蛋白酶切去担体蛋白的纯化产物

2 E.coli表达的弓形虫tSAG1融合型重组蛋白酶切后的担体蛋白纯化产物

3 番茄表达的弓形虫tSAG1重组蛋白纯化产物

4 弓形虫tSAG1转基因番茄植株可溶性总蛋白

图25 弓形虫MAG转基因番茄T1株基因组DNA的提取

1，2 阴性对照植株

3，4 pC35MG转化番茄T1株

5，6，7 pCE2M转化番茄植株

M DNA标准分子量

图26 弓形虫MAG转基因番茄T1代植株的PCR分析

1，2，3 pC35MG转化番茄T1代植株

4，5，6 pCE2MG转化番茄T1代植株

7 阴性对照植株 8 阳性质粒对照 M DNA标准分子量

具体实施方式

实施例一E81.1-pGEM-T和E82.2-pGEM-T的构建

1 引物的设计

P1、P3为5’端引物，P2为3’端引物。P1、P2用于扩增Zhongshu No.5番茄的E81.1序列；P3、P2用于扩增E81.1及其上游1.1kb序列即果实特异性E8启动子全长2.2kb片段E82.2。P1：5’CCG AAG CTT TCT AGA AG G AAT TTC ACGAAA TCG3’；引入HindIII和Xba I酶切位点。P2：5’GCC TCT AGA GGA TCC TCTTTT GCA CTG TGA ATG3’；引入BamH I和Xba I酶切位。P3：5’GGC AAG CTT CCCTAA TGA TAT TGT TCA C3’引入HindIII酶切位点。

2 PCR循环条件

95℃，5min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃，8min。

3 PGR产物的鉴定与纯化

用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用冻融法从琼脂糖凝胶中切胶纯化回收目的DNA片段，见图1，图2。

4 重组载体的构建与筛选、鉴定

按Promega公司pGEM-T载体操作手册，将番茄果实特异性E81.1和E82.2启动子PCR纯化产物克隆进pGEM-T载体；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种到含有Amp⁺LB平板上，挑取单菌落于Amp⁺LB液体培养基中37℃250rpm摇过夜，收菌提取质粒；用Xba I单酶切鉴定E81.1-pGEM-T重组质粒，用HindIII/BamHI双酶切鉴定E81.1-pGEM-T和E82.2-pGEM-T重组质粒；含有正确插入子的重组质粒送公司进行序列测定，见图3，图4。

实施例二 植物表达操纵子单元及其中间载体与表达载体的构建

(一) 以E35S+MAG+NOS构成植物表达操纵子的中间载体pB35MG及植物表达载体pC35MG的构建(参见构建流程图5)

将pCR II-Topo-MAG质粒中的MAG用BamH I单酶切连接方式亚克隆进pBAC55载体，构建中间载体pB35MG，其以E35S驱动MAG，3’端为终止子NOS3’序列，组成E35S/MAG/NOS3’结构单元。用酶切和测序进行克隆鉴定：用BamH I酶切鉴定插入子，Xho I鉴定插入子正反向，HindIII鉴定E35S/MAG/NOS3’结构单元；由上海基康生物有限公司完成pB35MG载体中E35S/MAG/NOS3’结构单元的测序鉴定。再将鉴定后的pB35MG中E35S/MAG/NOS3’结构单元通过HindIII单酶切连接方式亚克隆进pCAMBIA2300质粒中，构建用E35S启动子驱动MAG的植物表达载体pC35MG。重组质粒用酶切进行鉴定：用HindIII鉴定插入子，Sac I鉴定插入子的正反向。使用单酶切插入克隆法，对载体片段和插入目的基因片段的准备要求较高，目的片段行酶切、切胶纯化后基本能满足克隆的要求，载体片段则需要在酶切、切胶纯化后用CIP酶进行去磷酸化处理，以尽可能减少在连接过程中载体出现的自身环化现象，方法如下：

CIP酶去磷酸化体系(总体积20μl)：

酶切切胶纯化后的线性化载体10μl

10×CIP buffer2μl(NEB buffer3)

CIP酶1μl

DDW7μl

37℃水浴15min后，在加入CIP酶1μl，55℃水浴45min；灭活CIP酶，可在体系中加入1/10体积的0.5M EDTA(2μl)，65℃灭活1h℃或75℃灭活10min；再加入200μlpH8.0TE，混匀后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提纯化；取上清加入1/10体积3MNaAc(pH7.0)和2.5倍体积的无水乙醇，置—20℃沉淀至少30min；4℃离心12000rpm15min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤1-2次，干燥DNA，溶解DNA于10μl TE(pH8.0)，-20℃保存备用。

(二)以E35S-E81.1双启动子+MAG+NOS组成植物表达操纵子单元的中间载体pB35E1MG及植物表达载体pC35E1MG的构建(参见构建流程图6)

用Xba I单酶切连接法将E81.1-pGEM-T载体中的E81.1启动子亚克隆进pB35MG载体中，构建含E35S和E81.1双启动子驱动下的MAG中间载体pB35E1MG。用酶切法进行重组质粒的鉴定：Xba I鉴定插入子的大小，BamH I鉴定插入子的正反向。再将证实后的pB35E1MG质粒中E35SE81.1/MAG/NOS3’结构单元通过HindIII单酶切连接方式亚克隆进pCAMBIA2300质粒中，构建用E35S和E81.1双启动子驱动MAG的植物表达载体pC35E1MG。重组质粒用酶切进行鉴定：用HindIII鉴定插入子，Kpn I鉴定插入子的正反向。

(三)以E82.2启动子+MAG+NOS组成的植物表达操纵子单元的中间载体pBE2MG及植物表达载体pCE2MG的构建(参见构建流程图7)

采用平粘端定向克隆法用E82.2-pGEM-T载体中的番茄果实特异性启动子E82.2置换下pB35MG载体中的E35S启动子，构建以E82.2启动子驱动下的MAG基因中间载体pBE2MG。

1 E82.2插入子片段的准备：E82.2-pGEM-T，先用Apa I酶切后，1％琼脂糖电泳切胶纯化；用T4DNA聚合酶补平粘端后，酚、氯仿抽提纯化；再用Spe I酶切后，切胶纯化E82.2插入小片段。

2 pB35MG载体片段的准备：用Apa I酶切后，1％琼脂糖电泳切胶纯化；用T4DNA聚合酶补平粘端后，酚、氯仿抽提纯化；再用Spe I酶切后，切胶纯化pB35MG载体片段。

3 T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂于LB Amp+平板，倒置培养12-18hs；挑取单菌落至2ml LB Amp+液体培养基中250rpm、37℃摇6-10hs。

4 提取质粒，电泳鉴定，滞后者疑为重组质粒，用Nco I/Spe I双酶切进一步进行酶切鉴定。

5 将鉴定后的pBE2MG重组质粒中E82.2/TGMG/NOS3’结构单元通过HindIII单酶切连接方式亚克隆进pCAMBIA2300质粒中，构建用E82.2启动子驱动TGMG基因的植物双元载体pCE82MG。重组质粒用酶切进行鉴定：用HindIII鉴定插入子，KpnI鉴定插入子的正反向。

实施例三番茄高频再生体系的建立

(一) 番茄外植体的选择

上述萌发8-12天的番茄幼苗，取其子叶和下胚轴(不带顶芽)，子叶和叶盘下表面朝下，切割处伤口紧贴于再生培养基。

(二)激素的选择

细胞分裂素选择：ZT、6-BA；生长素选择：IAA。

基础培养基均为MS1，激素选择不同，以下三种激素配方均可获得高频再生：

再生培养基1：ZT0.2-0.5mg/L，IAA0.1mg/L

再生培养基2：ZT0.2-0.5mg/L

再生培养基3：ZT0.2-0.5mg/L，6-BA0.5mg/L，IAA0.1mg/L

(三)培养条件

置人工气候箱中，光照条件同无菌苗的培养，温度条件23℃-25℃，2周继代培养一次。

实施例四 番茄转化、筛选、再生、培育体系的建立

(一) 农杆菌浸染悬浮液的准备

分别挑取携带有三种启动子驱动下的弓形虫MAG和tSAG1的工程菌株pC35MG/LBA4404、pC35E1MG/LBA4404、pCE2MG/LBA4404、pC35tSAG1/LBA4404、pC35E1tSAG1/LBA4404、pCE2tSAG1/LBA4404单菌落，接种于3-5ml YEB(Str⁺50mg/L kana⁺50mg/L)液体培养基中，于28℃200rpm振摇过夜，次日按1∶20转接至新鲜YEB(Str+Kana+)液体培养基中，28℃200rpm振摇约5hs至菌液OD600为0.6-0.8。将培养物于4000rpm离心10min，弃上清，菌体用液体MSO稀释10-20倍，可根据情况在此时加入AS至终浓度100μM，再置于28℃200rpm振摇2h，所获菌液即为工程菌浸染悬浮液，可作为番茄外植体的浸染转化。

(二) 外植体的预培养、浸染和共培养

1 预培养

切取8-10天苗龄的番茄子叶和下胚轴，分别置于再生培养基1或2或3中，23℃-25℃人工气候箱中光照培养2天。

2 浸染与共培养

取经过2天预培养的番茄子叶和下胚轴，分别置于上述制备好的含pC35M、pC35E1M、pCE2M、pC35tSAG1、pC35E1tSAG1、pCE2tSAG1的农杆菌浸染悬浮液中，浸染20-30min，其间摇动几次；再用无菌滤纸吸去多余的农杆菌液；取一张无菌滤纸铺于培养基(同预培养)上，将浸染好的番茄子叶与下胚轴置于其上，于23℃-25℃暗培养2天。

(三) 筛选培养与植株再生

1 番茄转化体芽诱导与芽伸长时期的筛选培养

芽诱导选择培养基：

MS，ZT0.2-0.5mg/L，6-BA0.5mg/L，IAA0.1mg/L，Cef400mg/L，Kana100mg/L芽伸长筛选培养基：MS，ZT0.2mg/L，Cef100mg/L，Kana100mg/L。

将浸染农杆菌后共培养2天的番茄子叶与下胚轴，用灭菌DDW清洗3次以去除外植体表面的农杆菌，在灭菌滤纸上吸干外植体上的水份，转移至芽诱导筛选培养基中，23℃±1℃人工气候箱中光照培养，2周继代一次，观察芽诱导生长情况，出芽的外植体转移至芽伸长选择培养基中，长愈伤的外植体继续用原培养基继代持续转化体的芽诱导。同时设立番茄外植体正常再生的正对照，以及未转化的外植体在抗性筛选培养基上生长的负对照。

2 番茄转化体的生根筛选培养与转基因植株的再生

生根选择培养基：

MS(备注其中大量元素减半)，IAA0.2mg/l，Cef100mg/L，Kana50-100mg/L。

切取在番茄芽伸长选择培养基上生长至3cm以上的小苗，插入生根选择培养基中，于25-28℃人工气候箱中光照培养，观察根的再生与苗的生长状况。待转基因苗生根后长至近培养瓶高时，可开盖，继续在光照人工气候箱中练苗2-3天，移栽至营养土盆中，进行根的进一步发育，最后移栽至土壤中，自然生长开花结果。

实施例五、PCR对转基因番茄植株DNA水平的检测

(一) 转基因番茄植株基因组DNA的提取

1 采集大田栽种的转基因番茄植株叶片或果实；

2 取3％CTAB提取液，加3％2-ME，置60-65℃水浴中预热；

3 用液氮研磨新鲜的果实或去掉叶柄的幼嫩叶片，然后迅速加入预热的3％CTAB提取液600μl/管，摇匀，置60-65℃水浴45-60min，期间，每10min摇动一次；加入等体积冷的氯仿∶异戊醇(24∶1)，完全混匀后，4℃15000rpm离心10min；

4 取上清，重复4一次；

5 取上清，加入1倍体积冷的异丙醇，室温沉淀DNA，可用tip头将DNA挑出，或用10000rpm离心30sec，DNA沉淀再用70％乙醇洗涤2次，干燥DNA后，加入0.5mlTE重悬DNA，加入1μl/管10mg/ml的RNAase，混匀后于37℃消化30min-1h；

6 用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次；

7 加入等体积冷的异丙醇，室温沉淀DNA，10000rpm离心30sec；

8 干燥DNA，重悬于0.4mlTE，加入1/103MNaAc(pH5.0)和2-2.5倍体积的无水乙醇，于-20℃沉淀20min，4℃14000rpm离心15min；

9 DNA沉淀用70％乙醇洗涤2次，干燥DNA后，加入适量TE重悬DNA，-20℃保存备用。

(二) PCR扩增转基因番茄植株中的目的基因

以三种启动子驱动下的弓形虫MAG转基因植株叶片或果实提取的DNA为检测模板，正常再生未转基因番茄植株叶片或果实提取的DNA为阴性对照模板，弓形虫MAG植物表达质粒为阳性对照模板。

引物扩增MAG编码区360bp DNA片段：

P1：5’CTC TCG AGG CAA TGG GAA ACA AC3’；

P2：5’ATG GAT CCT CAC TCC AGG TGG G3’；

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃充分延伸8min。

(三) 琼脂糖凝胶电泳鉴定

用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的基因组DNA的质量，用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。

实施例六、RT-PCR对转基因番茄植株转录水平RNA的鉴定

(一) 转基因番茄植株总RNA的提取

1 取适量(200mg-500mg)新鲜植物叶片或果实，在液氮下充分研磨后，加入600μl/管Trizol试剂，充分混匀；

2 室温放置5min；

3 加入200μl/管氯仿，用力振荡1min，冰浴20min；

4 4℃12000rpm离心20min；

5 取上清至新的1.5mlEp管中，加入等体积预冷的异丙醇混匀后，置-80℃沉淀过夜；

6 4℃12000rpm离心20min，去上清；

7 RNA沉淀用70％乙醇洗涤2次，在超净台中风干；

8 加入灭菌无RNAase DDW131.5μl/管，待RNA完全溶解，加入无RNAase的DNAase I于37℃水浴消化30min-1h，其酶切体系如下：

10×DNAase I buffer      15μl

DNAase I                  3μl

Ribonuclease inhibitor  0.5μl

加原溶解RNA的灭菌无RNAase水131.5μl，总体积150μl/管

9 加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，上清移至新的1.5mlEp管中，加入等体积的预冷异丙醇，混匀后，置-80℃沉淀1h；

10 4℃12000rpm离心20min，去上清；

11 RNA沉淀用70％乙醇洗涤2次，在超净台中风干；

加入适量灭菌无RNAase DDW(20-50μl)，Ribonuclease inhibitor0.5μl/管，溶解后，取少量用Bio-Rad Smart Spec^TM3000型核酸蛋白定量分析仪进行RNA含量的测定；

12 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的转基因番茄植株RNA的质量，注意用0.1％DEPC水配制电泳缓冲液(TBE)及用其配制琼脂糖凝胶，所用电泳槽、试剂瓶等均用0.1％DEPC水清洗处理。

(二)RT-PCR对转基因番茄植株目的基因RNA水平的检测

1 取提取的植株果实或叶片RNA2g，加入Oligo(dT)引物50pmol，DEPC H₂O补平体积至13.5μl，置70℃水浴5min，冰浴5min；

2 再加入AMV逆转录反应体系(终体积25μl)：

AMV5×buffer             5μl

dNTP(10mM)             2.5μl

Ribonuclease inhibitor 0.5μl

焦磷酸钠(40mM)          2.5μl

AMV                        1μl

置于42℃反应1h。

3 以逆转录获得的植株果实和叶片cDNA为模板，PCR扩增目的基因，PCR反应体系：

DDW                       19.5μl

10×PCR buffer             2.5μl

dNTP(10mM)                 0.5μl

5’primer(20μM)            0.5μl

3’primer(20μM)            0.5μl

Tag酶                      0.5μl

cDNA模板                      1μl

PCR反应程序基本同前。

4 2％琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物。

实施例七、转基因番茄植株中目的基因的表达蛋白的鉴定与分析

(一) 植物总蛋白的提取

采用蛋白提取液：P buffer。

1 采集三种启动子驱动弓形虫MAG和tSAG1的转基因番茄植株的果实和叶片，同时将正常再生的未转基因植株的果实和叶片作为阴性植株对照，加入液氮在研钵中迅速研磨成粉；

3 加入蛋白提取液P buffer，充分混匀，置4℃冷浸过夜；

4 4℃15000-18000rpm离心20min，取上清，用Bio-Rad Smart Spec^TM3000型核酸蛋白定量分析仪进行蛋白含量的测定，分装后置-20℃保存备用。

(二) Western-bIot分析

1 SDS-PAGE分析

提取的转基因番茄果实或叶片总蛋白，根据蛋白含量可选用加入5×或2×蛋白上样buffer，采用使用Tris-Tricine、Urea-Tricine电泳缓冲系统，恒定电流30mA电泳7小时，Bio-rad电泳槽，银染，黑马凝胶成像分析系统进行分析鉴定。

银染基本流程：取下SDS-PAGE胶，用DDW稍冲洗，置银染固定液中固定2h，转移至浸泡液中40-45min，DDW洗5min×3次，银染液中避光染色40min，置显色液中显色，观察蛋白条带染色情况，及时用DDW终止显色。

2 蛋白的半干转移

取下刚电泳结束的SDS-PAGE胶，用蛋白转移缓冲液浸泡10-15min；同时裁切同样大小的PVDF膜，先用甲醇浸透后，置蛋白转移缓冲液浸泡5-10min；从负极至正极方向按“厚滤纸—胶—膜—厚滤纸”的顺序依次叠放，注意排尽气泡，10V转印20-25min；转印后的PVDF膜，用丽春红S染色以证实目的条带的转印效果，然后用甲醇将膜浸透后，置干净滤纸上自然干透(室温30min-1h)，于-20℃保存备用。

3 Western-blot鉴定

(1) 直接检测法

取出转印的PVDF膜，裁切成条，用甲醇浸透DDW漂洗后，用0.3％Tween-2037℃恒温孵育箱封闭1-2h；弃去封闭液，直接加入HRP标记的rtSAG1单抗或弓形虫速殖子免疫兔血清纯化IgG，37℃孵育1h；用洗液洗涤5min×4次；DAB显色液避光显色5-20min，观察反应条带情况，及时用DDW冲洗终止显色。

(2) 间接检测法

操作流程基本同直接检测法，仅直接法中直接使用标记的特异性抗体，而间接法中一抗未标记，再加入标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗。间接法中一抗37℃孵育1.5-2.5h，洗涤5min×4次；二抗37℃孵育40min-1h，洗涤5min×4次。

番茄高~1

序列表

<110>(周晓红，陈晓光)

<120>(一种转基因番茄高效稳定表达体系)

<140>(专利申请号)

<141>(2006-03-9)

<160>3

<210>1

<211>2191

<212>DNA

<213>中国中蔬5号番茄(Lycopersicon esculentum，Zhongshu No.5)

<220>

<221>Promoter

<222>(1)......(2191)

<210>2

<211>1198

<212>DNA

<213>中国中蔬5号番茄(Lycopersicon esculentum，Zhongshu No.5)

<220>

<221>Promoter

<222>(1)......(1198)

番茄高~1

<210>3

<211>1734

<212>DNA

<213>中国中蔬5号番茄(Lycopersicon esculentum，Zhongshu No.5)

<220>

<221>Promoter

<222>(1)......(1734)

Claims (5)

1.一种我国优良纯种番茄Zhongshu No.5番茄果实特异性启动子E81.1基因与植物组成型启动子E35S基因构成的E35S-E81.1复合式启动子，其序列如SEQID NO：3所示。

2.一种操纵子单元，所述操纵子单元用于在植物中表达外源疫苗分子，该操纵子单元以权利要求1所述的复合式启动子驱动目的疫苗分子表达，以NOS为终止子；所述操纵子单元构成如下：

权利要求1所述的E35S-E81.1复合式启动子+疫苗分子MAG+NOS终止子；

或权利要求1所述的E35S-E81.1复合式启动子+疫苗分子tSAG1+NOS终止子。

3.一种如权利要求2所述的操纵子单元构建的植物中间载体pB35E1MG、pB35E1tSAG1。

4.一种如权利要求2所述的操纵子单元构建的植物表达载体pC35E1MG、pC35E1tSAG1。

5.一种如权利要求4所限定的植物表达载体转化的农杆菌菌株，即工程菌pC35E1MG/LBA4404、pC35E1tSAG1/LBA4404。

Images