CN102757962A - 在植物腺毛特异表达的dbr2基因启动子 - Google Patents
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Abstract
一种基因工程技术领域的DBR2基因启动子，该启动子序列具有序列表中SEQ ID NO.1的1520bp的核苷酸序列；该启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，能在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中应用。本发明得到的DBR2基因启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因工程技术领域的基因启动子，具体是一种在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。
目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，为0.01％-1％，低含量使得青蒿素的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大、产量低、成本高，因此人工生产缺乏可行性。也有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中的含量低于干重的0.1％，在芽中含量最高也只有干重的0.16％，大多数研究没有检测到青蒿素。因此，利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的也不具备可行性。Dahua Chen等在《Plant Science》(植物科学)2000年155期179-185页发表了题为“Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L.transgenicplants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation”(通过农杆菌介导转化在青蒿植株中表达法尼基焦磷酸合酶基因)的论文，文中评述，通过过量表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphate synthase，FPS)可在原有基础上提高青蒿素含量2倍-3倍，达到1％左右。
DBR2是从青蒿腺毛特异cDNA文库中分离出的一个编码DBR2酶的基因。随着青蒿素生物合成途径的逐渐清晰，采用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潜力，例如过量表达代谢途径中的青蒿素合成途径关键酶编码基因被证实是一种提高青蒿素含量的有效方法。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子，例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于腺毛不是植物生长所必需的，利用腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作不会对植物的生长发育造成危害。先前的研究表明DBR2基因在青蒿腺毛中大量表达，而在其它组织中表达量很低，这暗示DBR2的启动子很可能是腺毛特异表达的启动子。因此，克隆DBR2基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。克隆其启动子将为研究DBR2基因的表达调控、分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子。本发明的基因启动子能引导基因在转基因植物腺毛中特异表达。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，该启动子具有序列表中SEQ ID NO.1的1520bp的核苷酸序列。
所述DBR2基因启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达。
所述DBR2基因启动子能在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中应用。
所述的在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，其制备方法如下：
步骤一，培养青蒿无菌苗；
步骤二，采用CTAB法提取青蒿总DNA；
步骤三，Genomic DNA Walking法克隆启动子基因组序列；
步骤四，分析启动子上的顺式作用元件；
步骤五，DBR2基因启动子的载体构建；
步骤六，根癌农杆菌介导DBR2基因启动子转化青蒿；
步骤七，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定。
本发明的有益效果：
本发明克隆得到的DBR2基因启动子，可以特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，能应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
附图说明
图1为Genomic DNA Walking法克隆启动子基因组序列时的凝胶电泳结果。
图2为5’端启动子与gus基因融合的植物双元表达载体示意图。
图3为启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定；
图中：A为没有进行GUS组织染色得青蒿叶片；B为非转基因的青蒿植株的对照组，取其叶片进行GUS组织染色；C为利用DBR2基因启动子同gus基因融合的载体转化青蒿后，PCR检测为阳性的青蒿植株，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色。A、B、C图中黑色箭头所指示的为腺毛。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
步骤一，培养青蒿无菌苗
青蒿种子用75％(v/v)乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养(14天)，即可获得青蒿无菌苗。
步骤二，CTAB法小量抽提青蒿叶片总DNA
取约100mg叶片于1.5mLEP管中，加入预热的CTAB buffer 600μL，buffer中含2％(v/v)的β-巯基乙醇，用研磨棒将叶片研磨至无明显颗粒；将EP管置于65℃水浴45min，使细胞充分裂解。待溶液冷却后，加入等体积(600μL)24∶1(v/v)的氯仿∶异戊醇，混匀，静置5min，25℃、13000rpm离心10min；吸取上清液约500μL于新的干净的离心管中，加入等体积24∶1(v/v)的氯仿异戊醇，混匀，静置5min，25℃、13000rpm离心10min；吸取上清液约400μL于新的干净的离心管中，加入一滴3M醋酸钠溶液，然后加入等体积预冷的异丙醇混匀，-20℃静置约30min后，25℃、13000rpm离心10min；弃上清液，用75％(v/v)乙醇冲洗沉淀所得DNA一次，离心后，吸干上清，通风橱中晾干。将DNA溶解在40μL水中，-20℃保存。
步骤三，Genomic DNA Walking法克隆启动子基因组序列
由于TAIL-PCR只扩增出较小片段，本研究采用Genomic DNA Walking进一步分离DBR2基因5’侧翼序列。Genomic DNA Walking的方法参照基因组WalkerTM Universal Kit(Clontech，638904)的说明书。具体步骤如下：
①基因组酶切
采用3种平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV和StuI分别对青蒿基因组DNA进行酶切。反应体系如表1：
表1限制性内切酶体系
| Genomic DNA(0.1μg/μL) | 25μL |
| 限制性内切酶(10units/μL) | 8μL |
| 限制性内切酶buffer | 10μL |
| ddH2O | 57μL |
| 总体积 | 100μL |
将反应体系轻轻地混匀，于37℃水浴中反应过夜。
②加接头
三种酶切产物分别进行纯化，用20μL水溶解；取4μL酶切并纯化的DNA于新的EP管中，分别加入如下反应物：25μM的基因组Walker Adaptor 1.9μL，1.6μL 10×Ligation Buffer，6units/μL的T4DNALigase 0.5μL。混匀后于16℃PCR仪中反应过夜；70℃水浴5min终止反应；加入72μL水后可用于PCR扩增。
③PCR扩增
为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，Genomic DNAWalking中使用的引物列于表2。其中AP1和AP2是试剂盒中附带的引物，DBR2PR1和DBR2PR2是根据DBR2基因一段启动子的序列设计的特异引物。首轮PCR反应体系见表3，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃25s，72℃3min，7个循环；94℃25s，67℃3min，32个循环；67℃延伸7min。凝胶电泳结果见图1。
表2Genomic DNA Walking引物
| 引物名称 | 引物序列(5’→3’) |
| AP1 | GTAATACGACTCACTATAGGGC |
| AP2 | ACTATAGGGCACGCGTGGT |
| DBR2基因特异引物DBR2PR1 | AAAATATCACAGCCCCTTCTTTGTGAGC |
| DBR2基因特异引物DBR2PR2 | AAACCCGGCAGAAGAAGGAGAGATCAT |
表3Genomic DNA Walking的反应体系
| 已加接头的DNA | 0.5μL |
| 10×LA PCR Buffer II | 2.5μL |
| dNTP(2.5mM each) | 1.5μL |
| MgCl2 | 1.5μL |
| AP1 | 0.5μL |
| CYPPR1 | 0.5μL |
| LATaq DNA聚合酶 | 0.2μL |
| ddH2O | 17.8μL |
| 总体积 | 25μL |
首轮PCR的产物稀释50用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的反应体系(见表4)，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃25s，72℃3min，5个循环；94℃25s，67℃3min，20个循环；67℃延伸7min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pMD18-T载体用于测序。结果获得了DBR2基因上游约1.5kb的序列。
表4Genomic DNA Walking的第二轮反应体系
| 1∶50稀释的第一轮PCR产物 | 3μL |
| 10×exTaq Buffer | 5μL |
| dNTP(2.5mM each) | 3μL |
| AP2 | 1μL |
| CYPPR2 | 1μL |
| exTaq DNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 36.5μL |
步骤四，分析启动子上的顺式作用元件
本发明中得到的DBR2基因启动子序列长1520bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对DBR2基因的启动子进行分析。发现除了TATA box和CAAT box，还发现了一些其它重要的顺式作用元件：G-box，MYB-binding site，W-BOX，ABRE，Ethylene-Responsive Element。G-box发现于很多植物基因的启动子中，它是很多刺激响应启动子行使功能所必需的元件。它在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到重要的作用。另外，DBR2基因启动子上的其它元件也可以对一些刺激做出响应，例如ABRE在ABA应答中起作用，MYB-binding site这类转录因子特异结合的位点，W-BOX是和WRKY家族的转录因子特异结合的瞬时元件，Ethylene-Responsive Element是和乙烯信号途径结合的顺时元件。以上的分析结果表明，DBR2基因的启动子是一个诱导型的启动子，能受几种刺激物的诱导。
步骤五，DBR2基因启动子的载体构建
①DBR2启动子与gus报告基因的融合
为了分析DBR2基因启动子的组织特异性，将DBR2启动子与gus报告基因融合。根据DBR2基因启动子的序列设计了一个正向引物和一个反向引物。为了方便表达载体的构建，正向引物中都引入了EcoRI的酶切位点，反向引物中引入了NcoI的酶切位点。启动子片段回收后，用EcoRI和NcoI双酶切，替换pCAMBIA1301载体上的CaMV 35S启动子，构建成DBR2启动子与gus基因融合的植物双元表达载体，DBR2启动子-gus基因-nos，载体的示意图如图2所示。
②含DBR2基因启动子和gus基因融合的植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得。将含DBR2基因启动子和gus基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌，并进行PCR验证。结果表明，含DBR2启动子的植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
步骤六，根癌农杆菌介导DBR2基因启动子转化青蒿
①外植体的预培养
青蒿种子用75％(v/v)乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
②农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/LAS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
③抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/LKan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光和8小时的黑暗中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。
④转基因青蒿植株的PCR检测
待转基因苗及其对照长至20厘米高时，进行PCR阳性检测。根据目的基因所在表达盒，DBR2启动子-gus基因-nos上的DBR2启动子片段和gus基因片段分别设计正向引物设计和反向引物对gus基因进行检测。根据目的基因所在表达盒，DBR2启动子-gus基因-nos上的35s启动子和抗性基因NPTII片段分别设计正向引物设计和反向引物对NPTH基因进行检测。两次独立PCR检测，互相印证，确保DBR2启动子-gus基因-nos植物双元表达载体插入青蒿植株中。在PCR反应体系见表5。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，并在UVP凝胶成像系统(Transilluminator White/UV，UVP，inc.，USA)紫外光下拍照。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
表5转基因青蒿植物PCR检测反应体系
| 青蒿基因组总DNA | 1.5μL |
| 10×PCR Buffer(Mg2+Free) | 2.5μL |
| MgCl2(25mM) | 1.5μL |
| dNTP(2.5mM each) | 1.5μL |
| 上游引物(10μM) | 0.5μL |
| 下游引物(10μM) | 0.5μL |
| rTaq DNA聚合酶 | 0.3μL |
| ddH2O | Up to 25μL |
步骤七，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定
没有进行GUS组织染色得青蒿叶片，结果如图(见图3A，黑色箭头所指的部位为腺毛)。非转基因的青蒿植株的对照组，取其叶片进行GUS组织染色，结果表明(见图3B，色箭头所指的部位为腺毛)，青蒿的腺毛中没有被GUS染料染成蓝色或者深色。对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果表明(见图3C，色箭头所指的部位为腺毛)，染色部位在青蒿的腺毛中，说明DBR2基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达。由此可见，所克隆的DBR2基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
Claims (4)
1.一种在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，其特征在于，该启动子如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的在植物腺毛特异表达的DBR2基因启动子，其特征是，该启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达。
3.一种根据权利要求1所述DBR2基因启动子的应用，其特征在于，该启动子基因工程育种中应用。
4.根据权利要求3所述的DBR2基因启动子的应用，其特征是，所述的基因工程育种中应用是指：利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物。
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Granted publication date: 20130501 Termination date: 20180428 |