CN105132423A - 一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调控AaPDR1基因在分泌型腺毛中表达的启动子及其应用，所述启动子的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；同时本发明还涉及前述AaPDR1基因启动子在利用植物分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。本发明提供的启动子能引导报告基因在植物分泌型腺毛中特异表达，本发明对利用植物分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种启动子及其应用，尤其涉及一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子及其在基因工程技术领域的用途。
背景技术
青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandulartrichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都大量存在分泌型腺毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。
ABC(ATPbindingcassette)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。AaPDR1是从青蒿中克隆得到的一个ABC转运蛋白中PDR(Pleiotropicdrugresistance)亚家族的转运蛋白。AaPDR1在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中分泌型腺毛特异性表达的基因ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在青蒿的分泌型腺毛中特异性表达。从而克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子。这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于分泌型腺毛特异表达的启动子只对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物造成代谢的浪费和生长发育造成危害。因此，克隆AaPDR1基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaPDR1基因启动子序列相关的报道。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种AaPDR1基因的启动子。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子及其应用，具体为一种AaPDR1基因的启动子，即青蒿中一个ABC(ATPbindingcassette)转运蛋白中PDR(Pleiotropicdrugresistance)亚家族的转运蛋白的启动子。
本发明所提供的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
进一步地，该启动子为诱导型启动子。
本发明所提供的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子，可用在在植物生产代谢产物的基因工程育种中。
本发明提供的启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型腺毛中特异表达。
本发明提供一种载体，所述载体连接有上述调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子。
本发明提供一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaPDR1基因启动子序列，克隆启动子序列；
步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；
步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
步骤七、PCR检测转基因植株；
步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增分泌型腺毛特异启动子序列。
进一步地，所述步骤三中调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件包括：TATA-box，ABRE，ACE，CAAT-box，CCAAT-box，HSE，G-box、TATA-box或CAAT-box，启动子序列中调控元件见表1和图1。
表1启动子序列中调控元件分析
进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下所示：
PstI-Pro-PDR1-FP：GACTGCAGAAGATCTTCGCCTACAACCA
Pro-PDR1-BamHI-RP：CGGGATCCGTTAACTCACAATCAAGAT
进一步地，所述步骤六具体包括：
1)外植体的预培养；
2)农杆菌与外植体的共培养；
3)抗性再生植株的筛选。
本发明具有如下有益效果：本发明提供的AaPDR1基因启动子，可特异性地在分泌型腺毛组织启动并高效表达外源基因，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
附图说明
图1为AaPDR1基因启动子区域的顺式作用元件结构图；
图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；
图3为利用AaPDR1基因启动子与GUS基因融合的载体1391Z-AaPDR1转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
实施例
本实施例涉及AaPDR1基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
步骤一，培养青蒿无菌苗
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
步骤二，根据青蒿全基因组中AaPDR1基因启动子序列，巢式PCR克隆启动子序列；
为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，使用的引物如表2所示，AaPDR1-FP1和AaPDR1-RP1是根据青蒿全基因组数据库中AaPDR1基因序列和其的启动子序列设计的特异引物，首轮PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，50℃40s，68℃3min，34个循环；68℃延伸10min。
表2巢式PCR引物
| 引物名称 | 引物序列(5’→3’) |
| AaPDR1-FP1 | TGACCACCACAACTCTAAATAATGC |
| AaPDR1-RP1 | TCTTCGTCATTTTCTTCACGGGATG |
| AaPDR1-FP2 | CTTCCCGACCCTTTTTGACATTTCC |
| AaPDR1-FP2 | GCTTTGTGTATATCACTTCCTTCCAT |
表3PCR的反应体系
| 青蒿DNA | 1μL |
| 10×KOD Plus Buffer | 5μL |
| dNTP | 5μL |
| MgSO4 | 2μL |
| AaPDR1-FP1 | 1μL |
| AaPDR1-RP1 | 1μL |
| KOD Plus | 1μL |
| ddH2O | 34μL |
| 总体积 | 50μL |
表4PCR的反应体系
| 1:50稀释的第一轮PCR产物 | 1μL |
| 10×KOD Plus Buffer | 5μL |
| dNTP | 5μL |
| MgSO4 | 2μL |
| AaPDR1-FP2 | 1μL |
| AaPDR1-RP2 | 1μL |
| KOD Plus | 1μL |
| ddH2O | 34μL |
| 总体积 | 50μL |
首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是AaPDR1-FP2和AaPDR1-RP2，反应体系如表4所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，55℃40s，68℃2min，34个循环；68℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pJET1.2载体用于测序，将该片段的序列与AaPDR1基因的序列进行拼接，结果获得了AaPDR1基因上游约2.1kb的序列；
步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaPDR1基因启动子的类型本发明中得到的AaPDR1基因启动子的序列长2166bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaPDR1基因的启动子进行分析。在AaPDR1基因启动子上发现有TATA-box，ABRE，ACE，CAAT-box，CCAAT-box，HSE，G-box等。预测的TATA-box、CAAT-box以及其它重要的顺式作用元件均用下划线标出，并在其下标出名字。G-box发现于很多植物基因的启动子中，它是很多刺激响应启动子行使功能所必需的元件；它在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到重要的作用。
步骤四，AaPDR1基因启动子与GUS报告基因的融合并连入1391Z载体
为了分析AaPDR1基因启动子上的顺式作用元件，将AaPDR1基因的启动子与GUS报告基因融合，研究该启动子驱动GUS基因在不同组织部位中的表达，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了PstI的酶切位点，反向引物中引入了BamHI的酶切位点，引物如表5所示；
表5AaPDR1-1391Z载体构建的PCR引物
| 引物名称 | 引物序列(5’→3’) |
| PstI-Pro-PDR1-FP | GACTGCAGAAGATCTTCGCCTACAACCA |
| Pro-PDR1-BamHI-RP | CGGGATCCGTTAACTCACAATCAAGAT |
步骤五，将构建好的载体1391Z-AaPDR1载体转化根癌农杆菌
将含AaPDR1基因启动子片段和GUS基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌，并进行PCR验证，结果表明，含AaPDR1基因启动子片段的植物双元表达载体成功构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含AaPDR1基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体1391Z-AaPDR1的根癌农杆菌工程菌；
步骤六，将带有1391Z-AaPDR1载体的根癌农杆菌转化青蒿
①外植体的预培养
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化；
②农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/LAS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；
③抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L6-BA、0.05mg/LNAA、50mg/LKan和500mg/LCb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/LCb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株；
步骤七，PCR检测转基因植株
根据目的基因所在表达盒pAaPDR1promoter-GUS序列AaPDR1promoter和GUS分别设计正向引物(proAaPDR1F：TTATGGTGGTTTCATCTTGATTGTG)和反向引物(GUSR:GATTTCACGTTCTACAGGACGG)对GUS基因进行检测，转基因青蒿植株的PCR阳性检测如图2所示，结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段；
步骤八，启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定
对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图3所示，结果表明，染色部位在青蒿的分泌型腺毛中特异性表达，说明AaPDR1基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在分泌型腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的AaPDR1基因启动子可用于利用植物分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为诱导型启动子。
3.一种如权利要求1所述的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
4.一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的用途，其特征在于，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型腺毛中特异表达。
5.一种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子。
6.一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaPDR1基因启动子序列，克隆启动子序列；
步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；
步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
步骤七、PCR检测转基因植株；
步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
7.如权利要求5所述的一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增分泌型腺毛特异启动子序列。
8.如权利要求5所述的一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤三中调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件包括：TATA-box，ABRE，ACE，CAAT-box，CCAAT-box，HSE，G-box、TATA-box或CAAT-box。
9.如权利要求5所述的一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下所示：
PstI-Pro-PDR1-FP：GACTGCAGAAGATCTTCGCCTACAACCA
Pro-PDR1-BamHI-RP：CGGGATCCGTTAACTCACAATCAAGAT。
10.如权利要求5所述的一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤六具体包括：
1)外植体的预培养；
2)农杆菌与外植体的共培养；
3)抗性再生植株的筛选。
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