CN108441495A - 一种AaWBC1基因启动子及其功能验证方法和应用 - Google Patents

一种AaWBC1基因启动子及其功能验证方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种AaWBC1基因启动子，该启动子能调控AaWBC1基因在青蒿分泌型腺毛中特异表达，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时本发明公开了一种AaWBC1基因启动子及其功能验证方法和应用。本发明提供的启动子能引导报告基因在植物分泌型腺毛中特异表达，对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

一种AaWBC1基因启动子及其功能验证方法和应用
技术领域
本发明涉及一种启动子(proWBC1)及其应用，尤其涉及一种在青蒿分泌型腺毛中特异表达的转运蛋白基因启动子及其在基因工程技术领域的用途。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，是我国传统的中草药，青蒿素是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。另外，青蒿素及其衍生物还具有抗红斑狼疮、抗炎、抗肿瘤以及免疫调节的功能，是一种极具潜力的天然广谱性药物。植物青蒿叶片、花蕾、茎秆等组织表面有两种表皮细胞特化的结构：分泌型腺毛(glandularsecretory trichome，GST)和非分泌型腺毛(T shape trichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用，与青蒿素含量的高低也密切相关。而分泌型腺毛是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。
ABC(ATPbinding cassette)转运蛋白是一大类非常多样化的超级家族，大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。角质层单体在表皮细胞内合成并沉积在表皮外，ABC转运蛋白中WBC(white–brown complex)亚家族的部分转运蛋白参与角质层合成单体的运输。植物WBC转运蛋白与人类ABCG转运蛋白(例如ABCG2,5和8)显示出高度相似性，而人类ABCG亚家族成员被认为是重要的脂质转运蛋白。AaWBC1是从青蒿中克隆得到的一个WBC亚家族的转运蛋白。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子，这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于分泌型腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，克隆AaWBC1基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaWBC1基因启动子序列相关的报道。因此，本领域的技术人员致力于开发一种青蒿分泌型腺毛中特异表达基因(AaWBC1)启动子。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种调控基因在青蒿分泌型腺毛中特异表达的启动子，能特异性地在分泌型腺毛组织启动并表达外源基因。具体为一种AaWBC1基因的启动子，即青蒿中一个ABC(ATPbinding cassette)转运蛋白中WBC(white–brown complex)亚家族的转运蛋白的启动子。
为实现上述目的，本发明提供了一种AaWBC1基因启动子，其特征在于，所述AaWBC1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述AaWBC1启动子能调控AaWBC1基因在青蒿分泌型腺毛中特异性表达。
进一步地，所述启动子为特异性启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物青蒿分泌型腺毛中特异表达。
进一步地，所述AaWBC1基因启动子为诱导型启动子。
进一步地，所述AaWBC1基因启动子上面的顺式作用元件包括：TATA box、CAATbox、G-box、I-box、ARE、ABRE、GA-motif、ATCT-motif和MBS等
本发明还提供了一种包括AaWBC1基因启动子的载体，该载体中的AaWBC1基因启动子能调控外源基因在植物腺毛组织中的表达。优选的，该载体为pCAMBIA1391z。
本发明还提供了一种AaWBC1基因启动子的功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaWBC1基因启动子序列，克隆启动子序列；
步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；
步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
步骤七、PCR检测转基因植株；
步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌型腺毛特异性AaWBC1启动子序列。
进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点。引物序列如下所示：
BamHI-Pro-WBC1-FP：
CAGGTCGACGGATCCATGTGGGTGTTTTTGAAAGAC
Pro-WBC1-NcoI-RP：
TCAGATCTACCATGGTTTTACTTATCAATGAAAACCTAG
进一步地，所述步骤六具体包括：
1)外植体的预培养；
2)农杆菌与外植体的共培养；
3)抗性再生植株的筛选。
本发明提供了一种利用AaWBC1基因启动子在调控外源基因在青蒿分泌型腺毛组织中特异性表达及其在青蒿基因工程育种中的应用。
进一步地，本发明还提供了一种利用AaWBC1基因启动子在青蒿分泌型腺毛组织中特异性表达外源基因及其在青蒿基因工程育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的AaWBC1基因启动子，可在青蒿分泌型腺毛组织启动并特异表达外源基因，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
附图说明
图1是为利用AaWBC1基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z–proWBC1通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图；
图2是转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
实施例
本实施例涉及AaWBC1基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaWBC1基因启动子序列，克隆启动子序列；
1、基因组DNA的提取
在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm2左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μL TPS buffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒。再加入300μL TPS buffer(通风橱)。65℃水浴1h(每隔20min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h。冷却至室温，4℃10000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)。混合后在-20℃冰箱中放置10-15min(可延长至1h)。取出4℃离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75％乙醇500-600μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入50μL ddH2O回溶，4℃保存。
2、PCR扩增
以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增分泌型腺毛特异启动子序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据本实验室基因组测序得到的AaWBC1基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表1所示，首轮PCR反应体系如表2所示。PCR条件为：94℃预变性10min；94℃40s，50℃40s，68℃3min，34个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。
表1巢式PCR引物设计
表2第一轮PCR反应体系
首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是FP2和RP2，反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，55℃40s，68℃2min，34个循环；68℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pJET1.2载体用于测序，将该片段的序列与AaWBC1基因的序列进行拼接，结果获得了AaWBC1基因上游约2kb的序列；
表3第二轮PCR反应体系
步骤三、分析得到的AaWBC1基因启动子的顺式作用元件，确定AaWBC1基因启动子的类型
本发明中得到的AaWBC1基因启动子序列长度为1574bp。为了寻找启动子上面的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/)对AaWBC1基因的启动子进行分析。分析发现克隆到的启动子上面具有除了TATA box和CAAT box，还具有很多顺式作用元件：G-box、I-box、ARE、ABRE、GA-motif、ATCT-motif和MBS等；G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动子行使功能所必须的元件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到很重要的作用；此外，GA-motif受光调控，ATCT-motif和I-box涉及光响应，ABRE在植物中能够响应脱落酸；MBS是MYB转录因子结合位点；以上结果分析表明，AaWBC1基因启动子是一个诱导型的启动子，能受多种因素诱导。
步骤四、AaWBC1基因启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因。
为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaWBC1基因的启动子AaWBC1连接pCAMBIA-1391z载体融合GUS报告基因，为了实现对表达载体的构建，正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下表4所示：
表4pCAMBIA1391z-proAaWBC1载体构建PCR引物
步骤五、将构建好的pCAMBIA1391z-proAaWBC1载体转化根癌农杆菌并检测。
将含有构建完成的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(EHA105)，并进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proAaWBC1的根癌农杆菌菌株中。
步骤六、将带有pCAMBIA1391z-proAaWBC1载体的根癌农杆菌转化青蒿
1)外植体的预培养
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化；
2)农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含proAaWBC1基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；
3)抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、100mg/L Hyg和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Hyg抗性再生青蒿植株；
步骤七，PCR检测转基因植株
根据目的基因所在表达盒promoter-GUS序列promoter和GUS分别设计正向引物(proWBC1:CAAACCGCAAAAAGTTGAAAATGA)和反向引物(GUSR:GACATCGGCTTCAAATGGCGTA)对GUS基因进行检测；结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图1所示；
步骤八，启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定
对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图2所示，结果表明，染色部位在青蒿的分泌型腺毛中特异性表达，说明AaWBC1基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的proWBC1基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> AaWBC1基因启动子及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1574
<212> DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua L.)
<400> 1
atgtgggtgt ttttgaaaga caaactttat gaatttgaaa aagattaggt cattaggtga 60
ctagctgact aagtatttac tcaaagcgca atctattaaa tcaaattata gctttatact 120
tatgtatata ggtttgctat gaaatatggt gcaatcagct taaccagttt gcacaataac 180
taaaaatttg atgtggattt gtagctaata ctcgtatcat ttattgcccg cttaacgtcc 240
agaattagaa aggaacaaat taaaccgatc acacatatta cgtaggactt ccgttatata 300
tatcttattt gacagcttaa agttcctttg atctatacat gcatgagttg cactgtaccg 360
ccagttgtgt gcgtcacact atattgtgca tgtctctttt atttctggct ttattaatgt 420
atgcatcaca ctccatatat gtttggatta gatcgctctt ggttatatat atgcatcata 480
tacacttata atttggatta gctattttat gttttaaacg attaggttat tggtccaagc 540
ctgatttttg gttcattagg tttaaaattt gaattatgtt ggttataatt aaagctatca 600
gatatgtatt tactataagt acaaatgcta tctcacatat taatcaagaa ctattttgtt 660
agtttacaat ttccaacatt ctcatactta ctttatgcta aaccaaaatc tagacactag 720
ctaactcatg gaaaagttat actaataatg tttagtggct aattgacata tcattatttt 780
agtaagtaaa gatgaatgta aaagttctaa tcacccagac gaatttaagt aaccagatgt 840
gaaaatcgag tggatgttac taacagtacg tgatccagga gttacttttg acattattaa 900
acatgctata tatatcaagc aaacaaccct ccactttaaa tggtggattt attgtagcaa 960
ttcagctaga aagacatcat aacctttaca ataagtgtat atggtggcaa aataaaagcc 1020
attcaaaacc ttgaatggaa tatctagcta ctttcaaacc gcaaaaagtt gaaaatgata 1080
ttattatata ttgtgtatca acaaaatatc atcttgacgt ttttatggca ttttaatgac 1140
attttaattt gttgagatga tgtgaaaatg aaacaaaggt tgatatttaa tttaagacga 1200
atcgagtata tactttgaac tctagggttc ttatcttaac agtgctaccg tcatttgact 1260
tcatatttca aaaacctaac cgtgacaaat atattaaaaa ttcagaaatt aaaatattgt 1320
atgatgaata ttcatttact tttgtatcta tatcaatctc tctctatata tatagaagct 1380
catctatact actatctaca aacacataac tcattcggta cacaataata tctccttgag 1440
ccttaacaac aacgtttcac aagtcacaaa tctacaacaa aagagtcagc aaaggcgcat 1500
gactgtctat atctcattac acacattcaa ctaaccacca caaccaaaac taggttttca 1560
ttgataagta aaac 1574
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttggatgtg attcaacggg agta 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacaagaca aaaggtaacg actg 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgaatgtgg gtgtttttga aagaca 26
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgacccgtt gttacgattt ccat 24
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggtcgacg gatccatgtg ggtgtttttg aaagac 36
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcagatctac catggtttta cttatcaatg aaaacctag 39
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaaccgcaa aaagttgaaa atga 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacatcggct tcaaatggcg ta 22

Claims (10)

1.一种AaWBC1基因启动子，其特征在于，所述AaWBC1基因启动子的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的AaWBC1基因启动子，其特征在于，所述AaWBC1基因启动子能调控AaWBC1基因在青蒿分泌型腺毛中特异性表达。
3.如权利要求1所述的AaWBC1基因启动子，其特征在于，其特征在于，所述启动子为特异性启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物青蒿分泌型腺毛中特异表达。
4.如权利要求1所述的AaWBC1基因启动子，其特征在于，所述AaWBC1基因启动子为诱导型启动子。
5.一种包括如权利要求1所述的AaWBC1基因启动子的载体，其特征在于，所述载体中的AaWBC1基因启动子能调控外源基因在植物腺毛组织中的表达。
6.一种如权利要求1所述的AaWBC1基因启动子的功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaWBC1基因启动子序列，克隆启动子序列；
步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；
步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
步骤七、PCR检测转基因植株；
步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
7.如权利要求6所述的AaWBC1基因启动子的功能验证方法，其特征在于，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌型腺毛特异性AaWBC1启动子序列。
8.如权利要求6所述的AaWBC1基因启动子的功能验证方法，其特征在于，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点。引物序列如下所示：
BamHI-Pro-WBC1-FP：
CAGGTCGACGGATCCATGTGGGTGTTTTTGAAAGAC
Pro-WBC1-NcoI-RP：
TCAGATCTACCATGGTTTTACTTATCAATGAAAACCTAG。
9.如权利要求6所述的AaWBC1基因启动子的功能验证方法，其特征在于，所述步骤六具体包括：
1)外植体的预培养；
2)农杆菌与外植体的共培养；
3)抗性再生植株的筛选。
10.一种利用如权利要求1所述的AaWBC1基因启动子在调控外源基因在青蒿分泌型腺毛组织中特异性表达及其在青蒿基因工程育种中的应用。
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