CN102925441A - AaORA基因启动子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种AaORA基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时本发明还涉及前述AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。本发明提供的启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，由于腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种基因工程技术领域的基因启动子及其用途，具体是一种AaORA基因启动子及其用途。
背景技术
青蒿（Artemisia annua L.）是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法（ACTs）。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低（0.01%-1%），使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。
AaORA是从青蒿中分离得到的一个AP2-ERF类的转录因子。在青蒿植株中抑制AaORA可以有效降低青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸的含量，表明该基因在青蒿素生物合成途径中具有重要的调节作用。AaORA在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中腺毛特异性表达的基因ADS、CYP71AV1和DBR2均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在腺毛中特异性表达。由于青蒿素是在青蒿的油性腺毛中合成，因此，克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子，例如烟草花叶病毒35S启动子（CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害。因此，克隆AaORA基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。克隆其启动子将为研究AaORA基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaORA基因启动子序列相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种AaORA基因启动子及其用途。本发明提供的基因启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种过程中，本发明提供的启动子能够特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，而且不会对植物的生长发育造成危害。
本发明是通过以下技术方案实现的，
第一方面，本发明涉及一种AaORA基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
第二方面，本发明还涉及前述AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。
优选的，所述代谢产物为青蒿素。
本发明涉及的AaORA基因启动子的获得步骤具体如下：
步骤一，培养青蒿无菌苗；
步骤二，基因组DNA步移(Genomic DNA Walking)法克隆启动子基因组序列；
步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaORA基因启动子的类型；
步骤四，AaORA基因启动子连入1391Z载体；
步骤五，将构建好的载体1391Z-AaORA载体转化根癌农杆菌；
步骤六，将带有1391Z-AaORA载体的根癌农杆菌转化青蒿；
步骤七，PCR检测转基因植株；
步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定。
本发明具有如下有益效果：本发明提供的AaORA基因启动子，可特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为AaORA基因启动子区域的顺式作用元件结构图；
图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；
图3为利用AaORA基因启动子与gus基因融合的载体1391Z-AaORA转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28（3）：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105,质粒pCAMBIA1391Z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
实施例
本实施例涉及AaORA基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
步骤一，培养青蒿无菌苗
青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡1min，再用20%（w/v）的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h（light/dark）光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
步骤二，基因组DNA步移(Genomic DNA Walking)法克隆启动子基因组序列
本实施例采用基因组DNA步移分离AaORA基因5’侧翼序列，基因组DNA步移的方法参照基因组WalkerTM Universal Kit(Clontech,638904)的说明书，具体步骤如下：
①基因组因组酶切
采用3种平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV和StuI分别对青蒿基因组DNA进行酶切，反应体系如表1所示，将反应体系轻轻地混匀，于37℃水浴中反应过夜；
表1限制性内切酶体系
| 基因组DNA（0.1μg/μL） | 25μL |
| 限制性内切酶（10units/μL） | 8μL |
| 限制性内切酶buffer | 10μL |
| ddH2O | 57μL |
| 总体积 | 100μL |
②加接头
三种酶切产物分别进行纯化，用20μL水溶解；取4μL酶切并纯化的DNA于新的EP管中，分别加入如下反应物：25μM的基因组Walker Adaptor 1.9μL，1.6μL 10×Ligation Buffer，6units/μL的T4DNA连接酶0.5μL，混匀后于16℃PCR仪中反应过夜；70℃水浴5min终止反应；加入72μL水后可用于PCR扩增；
③PCR扩增
为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，基因组DNA步移(Genomic DNAWalking)中使用的引物如表2所示，其中AP1和AP2是试剂盒中附带的引物，AaORAPR1和AaORAPR2是根据AaORA基因的序列设计的特异引物，首轮PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃25s，72℃3min，7个循环；94℃25s，67℃3min，32个循环；67℃延伸7min；
表2基因组DNA步移引物
| 引物名称 | 引物序列（5’→3’） |
| AP1 | GTAATACGACTCACTATAGGGC |
| AP2 | ACTATAGGGCACGCGTGGT |
| AaORAPR1 | GCAAATGATGACCTACGCTAGTGGAG |
| AaORAPR2 | ATTCTCCTTTCTGAGTAGCAGTGATG |
表3基因组DNA步移的反应体系
| 已加接头的DNA | 0.5μL |
| 10×LA PCR Buffer II | 2.5μL |
| dNTP(2.5mM each) | 1.5μL |
| MgCl2 | 1.5μL |
| AP1 | 0.5μL |
| CYPPR1 | 0.5μL |
| LA Taq DNA聚合酶 | 0.2μL |
| ddH2O | 17.8μL |
| 总体积 | 25μL |
首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的反应体系如表4所示，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃25s，72℃3min，5个循环94℃25s，67℃3min，20个循环；67℃延伸7min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pMD18-T载体用于测序，将该片段的序列与AaORA基因的序列进行拼接，结果获得了AaORA基因上游约1.2kb的序列；
表4基因组DNA步移的第二轮反应体系
| 1:50稀释的第一轮PCR产物 | 3μL |
| 10×exTaq Buffer | 5μL |
| dNTP(2.5mM each) | 3μL |
| AP2 | 1μL |
| AaORAPR2 | 1μL |
| exTaq DNA聚合酶 | 0.5μL |
| ddH2O | 36.5μL |
步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaORA基因启动子的类型
本发明中得到的AaORA基因启动子的序列长1006bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaORA基因的启动子进行分析。在-18到-25nt的位置（转录起始位点定为+1）发现了一个可能的TATA box（ATATAA），如图1所示，符合真核生物启动子的特征。图1中，数字代表每行第一个碱基相对于转录起始位点的位置；转录起始位点用阴影表示；翻译起始密码子用粗体表示；预测的TATA box、CAAT box以及其它重要的顺式作用元件均用下划线标出，并在其下标出名字。在TATA box上游88个碱基的地方，即-113到-120nt的位置发现了一个可能的CAAT box。分析结果进一步证明转录起始位点位于起始密码子AGT上游186bp的地方。除了TATA box和CAAT box，还发现了一些其它重要的顺式作用元件：G-box(-380 to-385:TACGTT；-616 to-621:TACGTA),W box(-228 to-232:TTGACC)和ABRE box(-185 to-190:CACGT；-326 to-330:CACGT)等；G-box发现于很多植物基因的启动子中，它是很多刺激响应启动子行使功能所必需的元件；它在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到重要的作用；另外，AaORA基因启动子上的其它元件也可以对一些刺激做出响应，例如ABRE在ABA应答中起作用，W box在植物抗胁迫应答中起作用；以上的分析结果表明，AaORA基因的启动子是一个诱导型的启动子，能受几种刺激物的诱导；
步骤四，AaORA基因启动子与gus报告基因的融合并连入1391Z载体
为了分析AaORA基因启动子上的顺式作用元件，将AaORA基因的启动子启动子与gus报告基因融合，研究该启动子驱动gus基因在不同组织部位中的表达，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了PstI的酶切位点，反向引物中引入了EcoRI的酶切位点，引物如表5所示；
表5AaORA-1391Z载体构建的PCR引物
| 引物名称 | 引物序列（5’→3’） |
| AaORAF | CCCTGCAGCTGAGTGAACAGTTGCTCAA |
| AaORAR | CCGAATTCATATATTGAAGCTAGCTTTATAGA |
步骤五，将构建好的载体1391ZAaORA载体转化根癌农杆菌
将含AaORA基因启动子片段和gus基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌，并进行PCR验证，结果表明，含AaORA基因启动子片段的植物双元表达载体成功构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含AaORA基因启动子和gus基因融合的植物表达载体1391Z-AaORA的根癌农杆菌工程菌；
步骤六，将带有1391Z-AaORA载体的根癌农杆菌转化青蒿
①外植体的预培养
青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡1min；再用20%（w/v）的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化；
②农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；
③抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光（light）和8小时的黑暗（dark）中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株；
步骤七，PCR检测转基因植株
根据目的基因所在表达盒pAaORA promoter-GUS序列AaORA promoter和GUS分别设计正向引物（AaORAF:CCCTGCACTGAGTGAACAGTTGCTCAA）和反向引物(GUSR:GACATCGGCTTCAAATGGCGTA)对gus基因进行检测，转基因青蒿植株的PCR阳性检测如图2所示，结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段；
步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定
对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图3所示，结果表明，染色部位在青蒿的油性腺毛和非油性腺毛中特异性表达，说明AaORA基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的AaORA基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (3)
1.一种AaORA基因启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。
3.如权利要求2所述的AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途，其特征在于，所述代谢产物为青蒿素。
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