CN105505935B - AaALDH1基因启动子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种启动子，该启动子是能调控基因在分泌型腺毛中特异表达，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明还提供了该启动子在利用植物分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。另外，本发明还公开了包含该启动子的载体和表达盒。本发明为研究AaALDH1基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础，也对利用植物分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

AaALDH1基因启动子及其用途
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种启动子及其应用，尤其涉及一种在植物分泌型腺毛中特异表达的转运蛋白基因启动子(proAaALDH1)及其在转基因植物中的应用。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物，从青蒿中可以提取一种倍半萜内酯类过氧化物——青蒿素，青蒿素对治疗疟疾效果显著，被世界卫生组织称做是“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)。植物青蒿是目前世界上唯一获取青蒿素的天然资源，但其青蒿素合成量极低，仅为干重的0.1-0.8％，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。
在目前的青蒿基因工程研究中，多采用组成型的启动子，例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端，因此，克隆得到青蒿分泌型腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。
AaALDH1(青蒿醛还原酶基因)编码青蒿素合成途径下游的一个关键酶，可以催化青蒿素前体青蒿醛和二氢青蒿醛的氧化反应。AaALDH1在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中分泌型腺毛特异性表达的基因ADS、CYP71AV1和DBR2均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在分泌型腺毛中特异性表达。
因此，本发明致力于开发一种植物腺毛组织特异表达的启动子，尤其是一种AaALDH1启动子。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种使基因在植物分泌型腺毛中特异性表达的启动子，尤其是使AaALDH1基因在植物分泌型腺毛中特异高效表达的启动子，从而为研究AaALDH1基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础，也对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种启动子，该启动子是能调控基因在分泌型腺毛中特异表达，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。该启动子为特异型启动子。
进一步地，该启动子是青蒿AaALDH1基因上游的启动子。
进一步地，该启动子上的顺式作用元件包括：TATA box、CAAT box、GARE-motif、AE-box、GA-motif、ARE、HSE和TCCC-motif。
本发明的另一方面提供上述启动子的应用，是在利用植物分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
进一步地，其中代谢产物为青蒿素。
本发明的又一方面提供一种载体，该载体连接有如上所述的启动子。该载体可以是pCAMBIA1391z载体。
本发明的再一方面，提供一种制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，包括以下步骤：
步骤一、根据青蒿基因组中AaALDH1基因启动子序列，利用巢式PCR克隆如上所述的启动子的序列；
步骤二、将步骤一中获得的AaALDH1基因的启动子的序列连入pCAMBIA1391z载体，获得pCAMBIA1391Z-proAaALDH1载体；
步骤三、将步骤二中获得的pCAMBIA1391Z-proAaALDH1载体转化根癌农杆菌；
步骤四、将步骤三中获得的带有pCAMBIA1391Z-proAaALDH1载体的根癌农杆菌转化青蒿，并进行检测；
步骤五、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位。
优选地，其中启动子与青蒿素合成途径中的关键酶基因融合，从而加强青蒿合成途径，最终提高青蒿素的合成。该青蒿素合成途径中的关键酶基因可以是AaALDH1基因等。
优选地，其中巢式PCR的引物序列为：
第一轮PCR：proALDH1-FP1：5’–TGGCTTGCTGTTCAAAGAAGGCTAA-3’；
proALDH1-RP1：5’–GCCTTAACGGCCAAATCAATGTCTT-3’；
第二轮PCT：proALDH1-FP2：5’–TTGGGCTATTTCCTTCTTAGGGCTCGC-3’；
proALDH1-RP2：5’–GTTGCTAACACTTCTTCTGTCGCTGGAT-3’；
优选地，为构建pCAMBIA1391z-proAaALDH1载体，在proAaALDH1两端分别引入了HindIII的酶切位点和Bam HI的酶切位点，使用的引物序为：
1391Z-proAaALDH1-FP：5’–CCCAAGCTTATGAACCATTAGAAG-3’
1391Z-proAaALDH1-RP：5’–CGCGGATCCCTTTGTTTTTTATGA-3’。
本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括如前所述的启动子。优选地，该表达盒为proAaALDH1-GUS表达盒，在该表达盒中，可以插入青蒿素合成途径中的关键酶基因，也可以插入想要在分泌型腺毛中表达的基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用有效的青蒿表皮毛组织特异性启动子代替组成型启动子，可以通过分子生物学的方法构建在青蒿分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作以获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。另外，克隆proAaALDH1启动子将为研究AaALDH1基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。
以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的转基因青蒿植株的PCR检测结果图。其中，M：分子量标记；泳道1：阳性对照；泳道2：阴性对照；泳道3和4、5和6、7和8、9和10以及11和12：分别是5株转基因青蒿植株基因组为模版，进行的两次单独的PCR得到的产物。
图2是本发明的一个较佳实施例利用AaALDH1基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-proAaALDH1转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图。
具体实施方式
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105和质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
实施例1 AaALDH1基因启动子的获得
1、培养青蒿无菌苗
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(日光/黑夜)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗。
2、基因组DNA的提取
在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm2左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μL TPS buffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90s。再加入300μL TPS buffer(通风橱)。65℃水浴1h(每隔20min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h。冷却至室温，4℃10000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)。混合后在-20℃冰箱中放置10-15min(可延长至1h)。取出4℃离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75％乙醇500-600μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入50μLddH2O回溶，即获得基因组DNA，4℃保存。
3、PCR扩增
以上述获得的基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增AaALDH1基因启动子proAaALDH1序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据基因组测序得到的AaALDH1基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表1所示，第一轮PCR反应体系如表2所示。PCR条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。
表1巢式PCR引物
表2第一轮PCR反应体系
将第一轮PCR的产物稀释100倍，作为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR反应体系见表3。PCR条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，切胶回收目的片段，纯化DNA。然后连接到pMD18-T(购自TaKaRa公司)载体用于测序，将该片段的序列与基因序列进行拼接，获得AaALDH1基因上游约1.6kbp的片段。获得的AaALDH1基因启动子proAaALDH1的序列如SEQID No：1所示。
表3第二轮PCR反应体系
实施例2分析启动子proAaALDH1的顺式作用元件
实施例1中获得的启动子proAaALDH1序列长度为1620bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对启动子proAaALDH1进行分析。分析发现该启动子上的顺式作用元件包括：TATAbox、CAAT box、AE-box、ARE、GA-motif、GARE-motif和TCCC-motif，具体情况如表4所示。
表4启动子proAaALDH1序列中调控元件分析
实施例3将AaALDH1基因启动子proAaALDH1连入pCAMBIA-1391z载体并转化农杆菌
将AaALDH1基因的启动子proAaALDH1与GUS报告基因融合，研究该启动子驱动GUS基因在不同组织部位中的表达。为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了HindIII的酶切位点，反向引物中引入了BamHI的酶切位点，引物如表5所示。将加入了上述两个酶切位点的proAaALDH1序列连入pCAMBIA-1391z载体中，获得pCAMBIA1391z-proAaALDH1载体。
随后，将pCAMBIA1391z-proAaALDH1植物表达载体转入根癌农杆菌(EHA105)。
表5 pCAMBIA1391z-proAaALDH1载体构建使用的PCR引物
实施例4将带有pCAMBIA1391z-proAaALDH1植物表达载体的根癌农杆菌转化青蒿并进行检测
1)外植体的预培养
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
其中，MS培养基为Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得。
2)农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS(乙酰丁香酮)组成的共培养培养基中，滴加活化好的含有pCAMBIA1391z-proAaALDH1植物表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3天。以滴加不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
3)抗性再生植株的筛选及检测
将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、0.05mg/L NAA(萘乙酸)、50mg/L Kan(卡那霉素)和500mg/L Cb(羧苄青霉素)组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光和8小时的黑暗中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0(无激素的MS培养基)和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。
根据表达盒proAaALDH1-GUS序列中的proAaALDH1和GUS序列分别设计正向引物1391Z-proAaALDH1-FP(5’-CCCAAGCTTATGAACCATTAGAAG-3’)和反向引物GUS-RP(5’-GACATCGGCTTCAAATGGCGTA-3’)进行检测。利用所设计的PCR特异引物，对挑取的5株转基因植株分别进行两次独立的PCR检测，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图1所示。
实施例5 GUS报告基因在植株中的表达部位的确定
对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图2所示，其中，染色部位为青蒿的分泌性腺毛。这说明proAaALDH1在转基因青蒿中能够引导外源基因在分泌性腺毛中特异表达。由此可见，本发明所克隆的proAaALDH1启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种启动子的应用，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其特征在于，在利用植物分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用；所述植物为青蒿；所述启动子是能调控基因在青蒿分泌型腺毛中特异表达。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述代谢产物为青蒿素。
3.一种制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、根据青蒿基因组中AaALDH1基因启动子序列，利用巢式PCR克隆如SEQ ID No：1所示的启动子的序列；
步骤二、将步骤一中获得的AaALDH1基因的所述启动子的序列连入pCAMBIA1391z载体，获得pCAMBIA1391Z-proAaALDH1载体；
步骤三、将步骤二中获得的pCAMBIA1391Z-proAaALDH1载体转化根癌农杆菌；
步骤四、将步骤三中获得的带有pCAMBIA1391Z-proAaALDH1载体的根癌农杆菌转化青蒿，并进行检测；
步骤五、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位；
所述启动子与青蒿素合成途径中的关键酶基因融合。
4.根据权利要求3所述的制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，所述巢式PCR的引物序列为：
第一轮PCR：proALDH1-FP1：5’–TGGCTTGCTGTTCAAAGAAGGCTAA-3’；
proALDH1-RP1：5’–GCCTTAACGGCCAAATCAATGTCTT-3’；
第二轮PCT：proALDH1-FP2：5’–TTGGGCTATTTCCTTCTTAGGGCTCGC-3’；
proALDH1-RP2：5’–GTTGCTAACACTTCTTCTGTCGCTGGAT-3’；
为构建pCAMBIA1391z-proAaALDH1载体，在proAaALDH1两端分别引入了HindIII的酶切位点和Bam HI的酶切位点，使用的引物序为：
1391Z-proAaALDH1-FP：5’–CCCAAGCTTATGAACCATTAGAAG-3’
1391Z-proAaALDH1-RP：5’–CGCGGATCCCTTTGTTTTTTATGA-3’。
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