CN105838718A - 一种水稻茎叶强表达启动子safes7及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种水稻茎叶强表达启动子SAFES7及其应用。本发明从水稻中发现、分离并鉴定了该启动子的序列。具体而言，本发明通过DNA重组技术，构建由该水稻茎叶强表达启动子SAFES7驱动GUS报告基因的转化载体，通过模式作物的转化实验，鉴定了该启动子的特点是，驱动目的基因在茎、叶、叶鞘等组织中表达，而在根、胚、胚乳细胞中不表达。对这类启动子的研究和应用，不仅有助于阐述相关基因的生物学功能，而且在作物基因工程中使用此类启动子为作物转基因安全性研究提供了材料基础和多种选择。

Description

一种水稻茎叶强表达启动子SAFES7及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻茎叶强表达启动子SAFES7及其应用。
背景技术
启动子是基因表达调控的重要顺式元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录，因此启动子是基因表达所必需的，在很大程度上决定了目的基因的表达模式。利用特异型启动子精确控制目的基因产物生成的时间、位置和数量，对提高目的基因表达的针对性和时效性非常重要，节约能量，减少代谢负担，减少其他性状的不利影响，也是提高转基因植物风险防控能力的重要方面。
茎在植物生长发育过程中起着传输养料和支撑等作用，叶片则是植物光合作用的器官，茎叶在固定和能量利用方面起到十分重要的作用。茎叶特异启动子可以用来分析茎叶的发生、分化过程，研究茎叶特异启动子的调控机理对于碳同化过程的理解和应用具有重要的价值，利用其调节植物代谢来满足农业生产的需要。茎叶都是植物病虫害的主要侵袭部位，利用茎叶特异启动子，驱动BT等抗病虫基因仅在病原菌繁殖或害虫取食的茎叶部位表达，不在根和种子等部位表达，不仅可提高目的基因表达产物的量，还可最大限度减轻对植物其他代谢途径的不利影响。
但是，目前所报道的针对茎叶特异性表达的启动子并不多见，因此，有必要发掘出更多、表达特异性更强的茎叶启动子，以应用在作物生产中。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻茎、叶、叶鞘表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻茎叶强表达启动子SAFES7，其特征在于，所述水稻茎叶强表达启动子SAFES7包含：
(a)序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或者
(b)序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或者
(c)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(d)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(e)与序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(f)与序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(g)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(h)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(i)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(j)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(k)与带有序列表SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；或者
(l)与带有序列表SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。
优选地，所述水稻茎叶强表达启动子为序列表中SEQ ID No:1或2所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为SAFES7或启动子SAFES7。
另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻茎叶强表达启动子的表达盒。
另一方面，本发明还提供用于扩增所述水稻茎叶强表达启动子SAFES7的引物序列，其特征在于，所述引物序列包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第二引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻茎叶强表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻茎叶强表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-SAFES7，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即SAFES7或启动子SAFES7构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-SAFES7。
或者待表达基因可以为任何对水稻的茎、叶、叶鞘生长特性具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在茎、叶、叶鞘特异性地集中表达，从而实现针对性改善作物茎叶相应性状的功能，而不会对植物体内其他组织或器官带来任何不利影响。
再一方面，本发明提供上述水稻茎叶强表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻茎叶强表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。
优选地，所述应用可以改良作物生长特性，所述作物为禾谷类作物：水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦等；优选为水稻。
优选地，所述应用采用下述步骤进行：
步骤(1)、根据序列表中SEQ ID NO：1所示的序列设计扩增引物；
步骤(2)、以水稻品种日本晴的DNA为模板，利用所述引物通过PCR扩增程序扩增水稻茎叶强表达启动子SAFES7；
步骤(3)、回收PCR扩增的目的片段，并将其连接到PGEM-T-Easy载体上；
步骤(4)、利用连接产物按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞；
步骤(5)、对转化产物进行PCR筛选，获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用相应限制性内切酶进行双酶切；
步骤(6)、将经过酶切后的阳性克隆进行测序，获取测序正确的核苷酸序列；
步骤(7)、准备包含待表达基因的载体并对其进行线性化处理，并且将步骤(6)中测序正确的核苷酸序列与所述载体进行连接获得相应作物表达载体，在所述连接产物中，所述水稻茎叶强表达启动子SAFES7与所述待表达基因直接相连；
步骤(8)、将所述作物表达载体转入根瘤农杆菌中；
步骤(9)、利用所获得的转入了所述作物表达载体的根瘤农杆菌对成熟水稻种子进行农杆菌介导的遗传转化，进而将所述作物表达载体转入所述成熟水稻种子中；
步骤(10)、将经处理后的种子培育成相应植株。
具体而言，本申请的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)分离克隆得到了序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列，发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得启动子SAFES7与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-SAFES7，利用该重组表达载体转化根瘤农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株仅在茎、叶、叶鞘等组织中具有较强活性的GUS表达，而在根、胚、胚乳细胞中不表达。从而证明该1994bp的序列具有驱动基因特异的在水稻茎、叶、叶鞘强表达的作用。
需要说明的是：本发明序列表SEQ ID NO：1序列开头的“ctgctggatctcccacacgc tc”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾的“cgagtagcca tggatgccct ct”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列，即序列表SEQ IDNO：2中所示序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指SEQ IDNO：1中的序列，也可以指SEQ ID NO：2中的序列。换言之，虽然本发明中采用序列表SEQ ID NO：3和4中的引物获得了该序列，但是即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了本发明的核心序列，其也落入本发明的保护范围之内。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子SAFES7能够调控基因在水稻茎叶部位集中表达，在实际应用中具有重要价值。本发明的茎叶特异启动子可以用来分析茎叶的发生、分化过程，研究茎叶特异启动子的调控机理对于碳同化过程的理解和应用具有重要的价值，利用其调节植物代谢来满足农业生产的需要。
本发明的水稻茎叶强表达启动子SAFES7仅驱动外源基因在转基因水稻的茎、叶、叶鞘中表达，不会在食用部位——种子中表达。在作物基因工程中，利用该启动子代替组成型启动子对农作物的茎叶进行基因改造，使目的基因只在茎叶表达，不在食用部位稻米中表达，有助于消除消费者对转基因水稻食用安全性的顾虑。
在作物基因工程中应用本发明的茎叶特异表达启动子，获得抗病、抗虫能力以及对环境耐受性提高的改良水稻，提高水稻的产量，具有重要的应用价值。茎叶都是植物病虫害的主要侵袭部位，利用茎叶特异启动子，驱动BT等抗病虫基因仅在病原菌繁殖或害虫取食的茎叶部位表达，不在根和种子等部位表达，不仅可提高目的基因表达产物的量，还可最大限度减轻对植物其他代谢途径的不利影响。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将SAFES7启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-SAFES7示意图，其中示出了利用SAFES7启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
图3为本发明实施例所获得植株的根(a)、茎(b)、叶鞘(c)、叶(d)、种子(e)的GUS染色结果，图中标尺＝2.5mm。图中可以看出，SAFES7启动子在茎、叶、叶鞘等组织中具有较强活性，而在根、胚、胚乳细胞中不表达。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。下述实施例中试剂、培养基配制，如无特殊说明，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)。
1植物材料
日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)成熟种子，由安徽省农科院水稻所生物技术室保存。
2菌株及质粒
本发明所用大肠杆菌菌株为XL-blue；根瘤农杆菌为EHA105，由安徽省农科院水稻所生物技术室保存。作物双元表达载体pCAMBIA1391购自澳大利亚CAMBIA公司。
实施例1启动子SAFES7的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴全基因组序列，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计扩增引物，并在引物两端分别添加限制性内切酶HindIII和EcoRI识别位点及保护碱基。
本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391为例，靶标基因为Gus基因，设计的引物如下(SEQ ID No:3-4)：
SAFES7HindIII FP：AAGCTTCTGCTGGATCTCCCACACGCTC
SAFES7EcoRI RP：GAATTCAGAGGGCATCCATGGCTACTCG
其中AAGCTT为限制性内切酶HindIII的识别位点及保护碱基；
GAATTC为限制性内切酶EcoRI的识别位点及保护碱基。
引物由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子SAFES7的获得
以水稻品种日本晴的基因组DNA为模板，利用扩增引物扩增启动子SAFES7，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证，目的片段长度1994bp，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES7，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
实施例2启动子SAFES7的功能验证
一、重组表达载体的构建和农杆菌的转化
从实施例1中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和EcoRI双酶切，回收启动子SAFES7片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的SAFES7片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子SAFES7与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-SAFES7(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。
二、农杆菌介导的水稻遗传转化
将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述“重组表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根瘤农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phosphomannose isomerase positive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
三、GUS组织化学染色
参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用无水乙醇处理，至叶绿素完全脱掉。结果见图3，根(a)、茎(b)、叶鞘(c)、叶(d)、种子(e)中GUS染色。蓝色为GUS组织化学染色，代表组织中有GUS表达。从图中可以看出，SAFES7启动子在茎、叶、叶鞘等组织中具有较强活性，而在根、胚、胚乳细胞中不表达。GUS组织化学染色结果表明启动子SAFES7是水稻茎叶强表达启动子。
实施例2
在本实施例中，为了验证序列表SEQ ID NO：2中的序列与序列表SEQID NO：1中的序列具有同样的功能，本申请的发明人采用与实施例1类似的方式，更换了引物，进行了类似的实验。
具体而言，发明人根据NCBI中提供的水稻品种日本晴全基因组序列，重新选用载体，并根据选用的载体及靶标基因的特点，重新设计引物，对SEQ ID NO：2中的序列进行扩增。然后，将扩增产物利用T4连接酶与新的载体相连，并且进行了表达量测试。
测试结果表明，SEQ ID NO：2中的序列与序列表SEQ ID NO：1中的序列具有同样的功能。由于方法与实施例1类似，具体过程这里不再累述。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种水稻茎叶强表达启动子SAFES7，其特征在于，所述水稻茎叶强表达启动子SAFES7包含：
(a)序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或者
(b)序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或者
(c)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(d)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(e)与序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(f)与序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(g)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(h)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(i)在序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(j)在序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(k)与带有序列表SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；或者
(l)与带有序列表SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻茎叶强表达启动子SAFES7，其特征在于，所述水稻茎叶强表达启动子SAFES7由序列表SEQ ID No:1或2所示的DNA序列构成。
3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的水稻茎叶强表达启动子SAFES7。
4.用于扩增权利要求1中所述的水稻茎叶强表达启动子SAFES7的引物序列，其特征在于，所述引物序列包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述第二引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的水稻茎叶强表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻茎叶强表达启动子SAFES7连接于载体中待表达的基因序列的上游。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-SAFES7，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达的基因是具有改善茎叶生长性能的基因。
7.一种根据权利要求1所述的水稻茎叶强表达启动子SAFES7在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的水稻茎叶强表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，进而获得相应转基因植株。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良作物生长特性，所述作物为禾谷类作物：水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦等。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述待表达的基因为改善植物生长性能的结构基因、调节基因或者结构基因的反义基因。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用采用下述步骤进行：
步骤(1)、根据序列表中SEQ ID NO：1所示的序列设计扩增引物；
步骤(2)、以水稻品种日本晴的DNA为模板，利用所述引物通过PCR扩增程序扩增水稻茎叶强表达启动子SAFES7；
步骤(3)、回收PCR扩增的目的片段，并将其连接到PGEM-T-Easy载体上；
步骤(4)、利用连接产物按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞；
步骤(5)、对转化产物进行PCR筛选，获得阳性克隆，从中挑取单克隆摇菌液提质粒，用相应限制性内切酶进行双酶切；
步骤(6)、将经过酶切后的阳性克隆进行测序，获取测序结果与SEQ IDNO：1所示的序列吻合的核苷酸序列；
步骤(7)、准备包含待表达基因的载体并对其进行线性化处理，并且将步骤(6)中测序正确的核苷酸序列与所述载体进行连接获得相应作物表达载体，在所述作物表达载体中，所述水稻茎叶强表达启动子SAFES7与所述待表达基因彼此相连；
步骤(8)、将所述作物表达载体转入根瘤农杆菌中；
步骤(9)、利用所获得的转入了所述作物表达载体的根瘤农杆菌对成熟水稻种子进行农杆菌介导的遗传转化，进而将所述作物表达载体转入所述成熟水稻种子中；
步骤(10)、将经处理后的种子培育成相应植株。
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