CN108220291B

CN108220291B - 水稻小分子RNA osa-miR171b以及在水稻抗倒伏中的应用

Info

Publication number: CN108220291B
Application number: CN201611151144.2A
Authority: CN
Inventors: 燕飞; 袁泉; 佟爱仔; 彭杰军; 鲁宇文; 赵晋平; 郑红英; 林林; 程晔; 陈剑平
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2036-12-14
Also published as: CN108220291A

Abstract

本发明公开了水稻小分子RNA osa‑miR171b在调控水稻茎长及增强水稻抗倒伏中的应用。本发明从水稻日本晴中高通量测序得到microRNA osa‑miR171b序列，用该microRNA构建到前体基因pre‑miR528序列中。该microRNA前体在水稻中过量表达osa‑miR171b后，转基因株系和野生型对照相比，超表达株系茎直径变粗，茎壁变厚，抗折断力矩增大。因此，在水稻中超表达osa‑miR171b对于增强水稻抗倒伏作用具有重要意义，这为培育抗倒伏水稻提供新的资源和研究方法。

Description

水稻小分子RNA osa-miR171b以及在水稻抗倒伏中的应用

技术领域：

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种水稻小分子RNA osa-miR171b在水稻中的应用。

背景技术

小分子RNA(microRNA)普遍存在于动植物体内，对其靶基因起着转录后调控的重要作用，从而调控生物体的性状.

水稻(Oryza sativa L.)是一种重要的粮食作物。一些水稻在成熟期存在倒伏的危险，增加了收割成本，降低了产量，给农业生产造成重大损失。因此培育抗倒伏水稻显得尤为重要。

发明内容

本发明小组发现，本申请通过超表达水稻miR171b来增加水稻茎直径和茎壁厚度，从而增强水稻抗倒伏作用更显著。

一方面，本发明通过高通量测序得到长度为21nt水稻成熟microRNA，命名为osa-miR171b序列，其序列为：5’UGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC 3’,(SEQ ID NO：1)。用该microRNA，osa-miR171b序列替换已知的osa-MIR528前体序列中的osa-miR528序列，得到人工miR171b序列osa-miR171b(SEQ ID NO：2)。经化学合成该序列DNA后，将该DNA片段连接至双元表达载体pCAMBIA1300UR(图1)。将该载体转化至EHA105农杆菌,利用农杆菌介导遗传转化在水稻中超表达osa-miR171b，该microRNA超表达株系与野生型相比，超表达株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强。因此，在水稻中超表达osa-miR171b能增加水稻茎直径、茎壁厚度和抗折力，为抗倒伏水稻分子育种提供新的方法。

另一方面，本发明提供一段水稻小分子RNA osa-miR171b序列，该microRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，其特征在，该小分子RNA通过转基因水方法能够制备株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强的水稻。

另一方面，本发明提供一种制备株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强的水稻的方法，其中，让microRNA核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的基因序列转入到水稻中。

另一方面，本发明提供一段水稻小分子RNA osa-miR171b序列在制备株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强水稻中的用途，其中，所述的RNA osa-miR171b为SEQ ID NO:1所示的序列。

另一方面，本发明提供水稻人工小分子RNA osa-miR171b序列，该microRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示，其特征在于，该小分子RNA能够通过转基因方法制备株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强的水稻。

另一方面，本发明提供一种制备株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强的水稻的方法，其中，让核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的基因序列转入到水稻中。

另一方面，本发明提供水稻人工小分子R株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强的水稻中的用途，其中，所述的基因序列为SEQ ID NO:2所示的序列。

本领域的一般技术人员有理由相信，任何转基因的方法都适用本发明所揭示的基因序列的转移，任何水稻品种都可以适用本发明的基因。本发明小组发现，不同水稻品种或者不同的转基因方法，虽然可能存在其他不同性状的表型，但是，对于成功转入本发明揭示的目的基因，都能够表现出株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强。

有益效果

利用本发明提供的序列进行转基因获得水稻阳性植株，显著让株系茎直径变粗,茎壁变厚,抗折力增强。

附图说明

图1为本发明的pCAMBIA1300UR-osa-miR171b表达载体结构示意图。

图2为Northern blot检测osa-miR171b超表达转基因水稻阳性植株osa-miR171b表达水平图。

图3为Real-Time PCR检测osa-miR171b超表达转基因水稻阳性植株osa-miR171b相对表达水平。

图4为osa-miR171b超表达转基因水稻阳性植株茎和横切面图。

图5为osa-miR171b超表达转基因水稻阳性植株茎直径统计图。

图6为osa-miR171b超表达转基因水稻阳性植株茎壁厚度统计图。

图7为osa-miR171b超表达转基因水稻阳性植株茎折断力矩统计图。

具体实施方式

需要特别指明，本发明的具体实施方式仅仅是为了说明本发明如何实现进行举例说明，这样的说明并不能对本发明形成任何的限制。本发明的范围在权利要求得到体现。为了实现本发明的目的，采用举例的方式进行如下说明。

根据高通量测序获得的osa-miR171b的序列，具体序列信息如所示:5’UGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC 3’,(SEQ ID NO：1),用该microRNA，osa-miR171b序列替换已知的osa-MIR528前体序列中的osa-miR528序列，得到人工miR171b序列osa-miR171b(SEQ IDNO：2)，其中，序列2中划线部分为序列1替换而形成的对应的序列，这里的替换不是简单的取代，而是RNA序列1对应的DNA序列TGAT TGAGCCGTGC CAATATC替换原始osa-MIR528前体序列中的osa-miR528序列，斜体部分为序列1对应的DNA序列的互补序列:

然后采用人工合成的方式合成新的序列2：

1 GAGCTCTTTG GCTGTAGCAG CAGCAGTGAT TGAGCCGTGC CAATATCCAG

51 GAGATTCAGT TTGAAGCTGG ACTTCACTTT TGCCTCTCTG ATATTGGGGC

101 GGTTCAATCA TTCCTGCTGC TAGGCTGTTC GGATCC(SEQ ID NO：2)。

该序列经化学合成人工microRNA osa-miR171b前体DNA序列。该DNA经SacⅠ、BamHⅠ酶切后连至pCAMBIA1300UR载体，命名为pCAMBIA1300UR-osa-miR171b(图1)。

转化农杆菌

取-70℃保存的农杆菌EHA105感受态置冰上融化，吸取1μl pCAMBIA1300UR-osa-miR171b质粒至100μl感受态中，混匀，加至预冷1mm电击杯；设置电压2.3kv,电容25μF,电阻200Ω电击转化；加入900μl LB液体培养基，28℃200rpm摇床培养2h,菌液涂布至含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L LB平板上，28℃培养至形成单菌落。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化将其导入水稻中，水稻种子诱导愈伤、继代培养、共培养、筛选和分化得到转基因水稻苗。

具体步骤如下：

1.水稻愈伤组织的诱导

取成熟日本晴水稻种子，人工去壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，种子放入25ml无菌管中，加入75％酒精浸泡1min，无菌水洗3遍；加入30％次氯酸钠溶液，浸泡30min；倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水清洗种子5次，无菌水浸泡30min；种子置无菌滤纸上吸干，转入诱导培养基上，每皿6-7粒；医用胶带封好培养皿，光照培养箱温度27℃，湿度50％，培养约27天；于超净台用镊子挑取诱导的愈伤组织，转入继代培养基上，光照培养箱27℃，湿度50％培养7天。

2.愈伤组织与农杆菌的共培养

挑取农杆菌单菌落至5ml LB液体培养基(含Kan 50mg/L，Rif 50mg/L)中，28℃，180rpm摇床培养至橙黄色；吸取2ml菌液至2ml EP管中，5,000rpm，离心5min，弃上清；用适量AAM培养基悬浮，转入到100ml无菌三角瓶中，将50ml AAM液体培养基。挑选状态较好，色泽微黄的继代培养的愈伤组织转入无菌三角瓶中，摇匀，室温放置30min。倒掉培养基，将愈伤组织转到无菌滤纸上吸去多余菌液，转移至共培养基上，27℃黑暗培养2.5天。

3.水稻愈伤组织的筛选与分化

将共培养后的愈伤组织转移至选择培养基上，27℃，湿度50％光照培养。以10天为一个周期，共培养3个周期。挑取颜色鲜黄的愈伤，转移至装有约60ml分化培养基的塑料瓶中，每瓶放5颗。培养箱中27℃，湿度50％，光照培养直至分化出幼苗。

4.生根炼苗和移栽

当愈伤组织分化出的幼苗长至约10cm时，拔出幼苗，去掉培养基，将根剪去，插入生根培养基中，培养5天。待根长出，洗去培养基，27℃光照水培养5天，移栽至水田。

5.水稻遗传转化所用培养基：

诱导培养基：N6大量，MS-Fe盐，B5微量，B5有机，2,4-D 2.5mg/L，脯氨酸2800mg/L，L-谷氨酰胺500mg/L，水解酪蛋白300mg/L，肌醇2g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0g/L，pH＝5.8

7.继代培养基：N6大量，MS-Fe盐，B5微量，B5有机，2,4-D 2.0mg/L，脯氨酸2800mg/L，L-谷氨酰胺500mg/L，水解酪蛋白300mg/L，肌醇2g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0g/L，pH＝5.8

8.AAM培养基：AA大量，MS-Fe盐，B5微量，B5有机，2-吗啉乙磺酸3.9g/L，酪蛋白氨基酸500mg/L，肌醇2g/L，麦牙糖30g/L PH＝5.5，乙酰丁香酮200μM

9.共培养培养基：N6大量，MS-Fe盐，B5微量，B5有机，水解酪蛋白500mg/L，肌醇2g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0g/L，2-吗啉乙磺酸3.9g/L pH＝5.5，乙酰丁香酮100μM

10.选择培养基：N6大量，MS-Fe盐，B5微量，B5有机，2,4-D 2.0mg/L，脯氨酸500mg/L，谷氨酰胺500mg/L，水解酪蛋白300mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3.0g/L pH＝5.8，羧苄青霉素250mg/L，潮霉素50mg/L

11.分化培养基：N6大量，MS-Fe盐，B5微量，B5有机，萘乙酸0.5mg/L，脯氨酸500mg/L，谷氨酰胺500mg/L，水解酪蛋白300mg/L，6-苄氨基嘌呤3mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30g/L，山梨糖醇20g/L，植物凝胶3.0g/L pH＝5.8，羧苄青霉素250mg/L，潮霉素50mg/L

12.生根培养基：1/2N6大量，MS-Fe盐，B5微量，蔗糖30g/L，肌醇100mg/L，琼脂0.8％pH＝5.8

水稻转基因所用培养基的具体配比：

N6大量元素(20X)

MS铁盐(200X)

Na₂.EDTA 7460 mg

FeSO₄·7H₂O 5560 mg

加水定容至1000mL

B5微量元素(100X)

B5有机(100X)

AA大量元素(10X)

转基因水稻的分子生物学检测

1)Northern blot分析

为确认转入的人工microRNA发生超表达，Trizol Reagent试剂分别提取3个转基因阳性株系(OE-#1、OE-#2、OE-#3)总RNA，使用探针(序列为5’GATATTGGCACGGCTCAATCA 3’SEQ ID NO：3)进行Northern blot分析。具体操作流程参照Roche公司的DIG High PrimeDNA Lebeling and Detection Starter Kit II说明书。检测结果表明检测的超表达转基因osa-miR171b表达均上调(图2)。

2)Real-Time PCR分析

为确认转入的人工microRNA的表达水平，将移栽至水田的转基因水稻苗繁殖两代后，Trizol Reagent试剂分别提取3个转基因阳性株系(OE-#1、OE-#2、OE-#3)总RNA，逆转录引物5’GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACGATATT 3’(SEQ ID NO：4)逆转录获得cDNA。以上游引物5’GCATCGGTGATTGAGCCGTGCC 3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’GTGCAGGGTCCGAGGT 3’(SEQ ID NO：6)进行real-time PCR，分析osa-miR171b在转基因水稻体内的表达水平。结果表明osa-miR171b在转基因水稻体内的表达水平分别高于对照野生型水稻植株30倍、19倍和39倍(图3)

转基因水稻茎

将繁殖两代后的osa-miR171b超表达转基因水稻苗，移栽至水田中。通过观察和测量转基因水稻茎，结果表明osa-miR171b超表达转基因水稻茎直径平均为3.9mm，显著粗于对照野生型水稻植株2.7mm(p<0.01)(图4,5)；茎壁厚度平均为0.79mm,显著厚于野生型水稻植株0.52mm(p<0.01)(图4,6)；茎折断力矩为0.06Nm,显著大于野生型水稻植株0.03mm(p<0.01)(图7)。说明osa-miR171b超表达能显著增强水稻的抗倒伏作用。

Organization Applicant

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<110> OrganizationName : 浙江省农业科学院

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<120> Title : 水稻小分子RNA os-miR171b以及在水稻抗倒伏中的应用

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Sequence

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<213> OrganismName : 水稻（Oryza sativa）

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ugauugagcc gugccaauau c 21

<212> Type : RNA

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SequenceName : 水稻小分子RNA os-miR171b序列

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<213> OrganismName : 人工合成

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gagctctttg gctgtagcag cagcagtgat tgagccgtgc caatatccag gagattcagt 60

ttgaagctgg acttcacttt tgcctctctg atattggggc ggttcaatca ttcctgctgc 120

taggctgttc ggatcc 136

<212> Type : DNA

<211> Length : 136

SequenceName : 水稻人工小分子RNA osa-miR171b的前体序列

SequenceDescription :

Sequence

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<213> OrganismName : 人工合成

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gatattggca cggctcaatc a 21

<212> Type : DNA

<211> Length : 21

SequenceName : 探针

SequenceDescription :

Sequence

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<213> OrganismName : 人工合成

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gttggctctg gtgcagggtc cgaggtattc gcaccagagc caacgatatt 50

<212> Type : DNA

<211> Length : 50

SequenceName : 逆转录引物

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName : 人工合成

<400> PreSequenceString :

gcatcggtga ttgagccgtg cc 22

<212> Type : DNA

<211> Length : 22

SequenceName : 上游引物

SequenceDescription :

Sequence

--------

<213> OrganismName : 人工合成

<400> PreSequenceString :

gtgcagggtc cgaggt 16

<212> Type : DNA

<211> Length : 16

SequenceName : 下游引物

SequenceDescription :

Claims

1. 一种制备株系茎直径变粗、茎壁变厚的水稻的方法，其中，让microRNA核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的基因序列转入到水稻中。

2.一段水稻小分子RNA osa-miR171b序列在制备株系茎直径变粗、茎壁变厚的水稻中的用途，其中，所述的RNA osa-miR171b为SEQ ID NO:1所示的序列。

3.水稻人工小分子RNA osa-miR171b，该microRNA的前体DNA序列为SEQ ID NO:2所示，其特征在于，该小分子RNA能够通过转基因方法制备株系茎直径变粗、茎壁变厚的水稻。

4.一种制备株系茎直径变粗、茎壁变厚的水稻的方法，其中，让核苷酸的前体DNA序列为SEQ ID NO:2所示的基因序列转入到水稻中。

5.水稻人工小分子R株系茎直径变粗、茎壁变厚的水稻中的用途，其中，所述的基因的前体DNA序列为SEQ ID NO:2所示的序列。