CN114214325B - 光皮桦miR156a前体基因及在促进植物分枝形成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种光皮桦的miR156a前体基因在调控植物分枝数量中的应用。本发明提供的光皮桦miR156a前体基因，该前体基因序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了光皮桦miR156a前体基因在促进植物分枝形成中的应用。通过光皮桦miR156a前体基因的过量表达，有望人为地促进植物分枝的形成，增加侧枝的数量，在调控植物株形及产量等方面有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，涉及一种光皮桦miR156a前体基因及在促进植物分枝形成中的应用。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长度约为20-24nt内源非编码单链RNA分子，具有调控基因表达的功能，在植物的生长发育、信号转导和胁迫响应等过程中起着关键作用。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区。在植物中，细胞核内编码miRNA的基因在转录后经过一系列加工成为成熟的双链miRNA分子，该双链miRNA与沉默复合体RISC结合，通过剪切靶mRNA或抑制靶mRNA翻译来负调控基因表达。
MicroRNA156s(miR156s)是植物microRNAs中最为保守成员之一，在种子萌发、发育阶段转变、分蘖、花青素合成和赤霉素信号转导等方面有重要的调控作用。研究也显示，不同的miR156基因通过靶向不同的基因，在植物中发挥不同的功能。miR156在树木中调控分枝形成的作用尚未见有报道，因此，利用基因工程技术，将从光皮桦中克隆获得miR156a前体基因转入其它植物中，对于研究其功能具有重要意义，同时极具应用前景。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种光皮桦miR156a前体基因及其促进在植物分枝形成中的应用。
本发明提供一种光皮桦miR156a成熟miRNA，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种编码所述光皮桦miR156a成熟miRNA的前体基因。
在一个实施方案中，该光皮桦miR156a前体基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供了含有上述基因的重组载体、宿主细胞、转基因细胞系或重组菌。
在一个实施方案中，该重组菌为将上述基因插入表达载体得到的重组菌。
另一方面，本发明提供了一种光皮桦miR156a前体基因在促进植物分枝形成中的应用，该基因的序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，该光皮桦miR156a前体基因经剪切后的成熟序列为SEQ IDNO：1。
在一个实施方案汇总，将所述前体基因转入寄主植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，促进植物分枝形成。
在一个实施方案中，该植物为烟草或拟南芥。
在一个实施方案中，该植物为烟草。
在一个实施方案中，包括：将包含上述光皮桦miR156a前体基因连接到过表达载体上，利用农杆菌介导转化到烟草，通过筛选和培养获得转基因株系。
本发明还提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述前体基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株，所述的转基因植株与野生型相比，转基因植株分化生长出更多的分枝。
本发明提供了光皮桦miR156a前体基因在促进植物分枝形成中的应用。通过光皮桦miR156a前体基因的过量表达，有望人为地促进植物分枝的形成，增加侧枝的数量，在调控植物株形及产量等方面有重要的应用前景。
附图说明
图1为本发明的光皮桦叶片的基因组DNA。
图2为光皮桦miR156a前体的表达载体菌液PCR检测。
图3为光皮桦miR156a前体转基因烟草植株的抗性筛选。
图4为转基因烟草miR156a前体表达水平检测。
图5为过量表达miR156a烟草与野生型烟草分枝数量的比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实验材料取自浙江农林大学林木遗传育种实验室的组培苗，品种光皮桦优3，叶片样品采下后立即液氮速冻并放置在-80℃冰箱保存待用。烟草野生型采用本生烟(Nicotiana benthamiana)。
DNA聚合酶、DNA Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、β-疏基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、NaCl、Tris-HCl等DNA提取试剂购自上海生工生物工程股份有限公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司，无缝克隆试剂盒购置海南你行生物技术有限公司。PCR仪为美国伯乐PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
引物合成及测序均由北京擎科生物技术有限公司杭州分公司完成。
实施例1光皮桦miR156a前体基因克隆
利用改良CTAB法提取光皮桦叶片基因组DNA(图1)，通过Nanodrop分光光度计测定每个DNA样品的OD260、OD280，并以此计算DNA的浓度及纯度，并在1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。所提DNA的OD260/OD280比值均在1.80-1.90之间，浓度均在200ng/μL以上，说明DNA无多糖、酚及蛋白质的污染；琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA样品条带清晰，大小在10kb以上，可推断DNA没有降解，符合后续实验的要求。
将光皮桦的基因组DNA用适量ddH2O稀释至50ng/μL后，进行PCR扩增。基因克隆PCR体系如下(25μL)：
反应程序为：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，20sec，72℃，20sec，循环35次；72℃，5min。
基因克隆所用引物为Primer1:5’-AGGCATCATGTTGACAGAAGAG-3’，Primer2:5’-ATGGAAGTGATGGTGACAGAAG-3’。
通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测(图2)，然后利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(爱思进)进行目的片段回收。将目的片段连接到pEASY-T1 Cloning Vector后，转化Trans-T1感受态细胞，挑取阳性克隆鉴定和测序，序列如SEQ ID NO：2所示，该光皮桦miR156a前体基因经剪切后的成熟序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2表达载体构建
根据无缝克隆Nimble Cloning试剂盒(海南你行生物科技有限公司)说明书构建入门载体。
(1)提取测序正确的阳性克隆质粒，利用高保真taq酶PCR扩增光皮桦miR156a前体基因片段，配制如下PCR体系(25μL)：
(2)PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，20sec，72℃，20sec，循环35次；72℃，5min。基因克隆所用引物为NC_Primer1:5’-AGTGGTCTCTGTCCAGTCCTAGGCATCATGTTGACAGAAGAG-3’，NC_Primer2:5’-GGTCTCAGCAGACCACAAGTATGGAAGTGATGGTGACAGAAG-3’。
(3)回收PCR产物，利用无缝克隆方法将miR156a前体基因构建至表达载体pNC-Cam1304-35S，配制反应体系(10μL)如下：
(4)将上述混合液充分混匀，在PCR仪上按50℃反应30min。
(5)取2-5μL步骤4中的反应液，加入50μL DH5α感受态中，轻柔混匀，冰浴25-30min。
(6)置于42℃水浴锅中热激60s，加250μL LB液体培养基，200rpm 37℃孵育45min。
(7)4000rpm离心3min去部分上清液，余下100μL菌液涂于LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素)上，37℃培养过夜。
(8)用基因特异引物NC_Primer1和NC_Primer2进行菌液PCR检测，并测序确认。
(9)提取测序结果正确的菌株质粒，待用。
实施例3化学转化农杆菌及其检测
(1)取-80℃保存的农杆菌感受态GV3101于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰浴中。
(2)取1.0μL质粒DNA加入50μL感受态中，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
(3)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。
(4)6000rpm离心1min，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于LB(含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
(5)挑取单克隆，通过PCR鉴定阳性农杆菌，-80℃保存菌种。
实施例4叶圆盘法转化烟草
(1)取保存于-80℃的菌种，划线于LB平板，倒置放于28℃培养箱培养3天，从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3-5ml YEB液体培养基中(含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)于恒温摇床上28℃，180rpm摇培过夜至OD 600为0.6-0.8。
(2)培养过夜的菌液按1％-2％的比例，转入新配置的无抗生素的YEB培养基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，待OD600为0.2-0.5时即可用于转化。
(3)取烟草无菌小苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，在无菌条件下用打孔器将其打成5mm直径的叶圆盘，放入固体诱导培养基MS1(MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)中预培养48h。
(4)将叶圆盘在稀释的农杆菌中浸泡30-60s，用无菌滤纸吸干。
(5)将侵染后的叶圆盘放入固体诱导培养基MS1(MS+1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA)中，黑暗28℃共培养7天，至有微菌落产生。
(6)取出叶圆盘，用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水漂洗5次左右，无菌滤纸吸干。
(7)将叶圆盘置于诱导出芽的固体选择培养基MS2(MS1+30mg/L潮霉素+400mg/L羧苄青霉素)中，在25-28℃，16h/8h光暗条件下选择培养。
(8)20天后转入MS3(MS1+30mg/L潮霉素+300mg/L羧苄青霉素)固体选择培养基中，培养2周后转入MS4(MS1+30mg/L潮霉素+200mg/L羧苄青霉素)固体选择培养基中培养(图3)。
(9)待不定芽长到1cm左右，将不定芽移至1/2MS固体培养基中(含200mg/L羧苄青霉素)生根培养，约5-10天长出不定根。
(10)将生根的小苗移入基质中，在培养室中培养40-50天，开花结种按单株收集种子。
实施例5转基因烟草纯合株系获取
(1)取适量的转基因烟草种子，加入75％乙醇，充分振荡10min。弃去75％乙醇后，加入无水乙醇振荡1min，重复操作3次。加入无菌水振荡1min，重复3次，将无菌水吸去。
(2)将灭菌后的烟草种子，均匀的播种于固体培养基(MS+30mg/L潮霉素)上，封好培养皿，置于光照培养箱萌发。
(3)烟草萌发后长至有4-5张叶片时，选择生长良好的幼苗，移栽至基质中培养。
(4)待烟草长至8-10张叶片时，提取叶片DNA，进行PCR检测。
(5)按上述方法培养3代，得到miR156a前体基因的转基因烟草的纯合株系。
实施例6转基因烟草miR156a表达水平检测及分枝性状观察
(1)取野生型和转基因烟草纯化株系种子，用无菌水浸泡2小时。
(2)将浸泡后的种子播种于基质上，培养箱内25℃，16h/8h光暗条件下萌发。
(3)萌发一周后，将小苗移栽至育苗盆内，每个株系至少移栽10株，培养室内25-28℃，16h/8h光暗条件下培养40-50天。
(4)取烟草叶片提取RNA，通过定量PCR对miR156a前体基因的表达进行检测(图4)。定量PCR结果显示不同，转基因株系miR156a前体基因表达水平存在差异。
(5)观察野生型和转基因烟草植株的形态，统计各个植株的分枝数量，比较野生型和转基因植株间分枝数量的差异。观察野生型和转基因植株在生长40天后的植株形态和分枝数量，发现野生型植株的平均分枝数量为4.4个；而转基因植株分枝数量随着miR156a表达水平的提高而明显增加，其中表达水平最低的株系植株平均分枝数为6.8个，表达水平最高的株系植株平均分枝数为12.8个，表明miR156a过量表达植株可以分化生长出更多的分枝(图5)。
综上所述，转入光皮桦miR156a前体基因使得植物的生长发育受到影响，促进分枝的形成，植株可产生更多的分枝。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> 光皮桦miR156a前体基因及在促进植物分枝形成中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 光皮桦(Betula luminifera)
<400> 1
ttgacagaag agagagagca c 21
<210> 2
<211> 107
<212> DNA
<213> 光皮桦(Betula luminifera)
<400> 2
aggcatcatg ttgacagaag agagagagca caacccgcca ttggctaaag agagtctttg 60
tctttgttgg gagtgtgctt tctcttcttc tgtcaccatc actccat 107
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggcatcatg ttgacagaag ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggaagtga tggtgacaga ag 22
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agtggtctct gtccagtcct aggcatcatg ttgacagaag ag 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtctcagca gaccacaagt atggaagtga tggtgacaga ag 42
Claims (4)
1.编码光皮桦miR156a成熟miRNA的前体基因在促进植物分枝形成中的应用，其特征在于，所述前体基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述前体基因转入寄主植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，促进植物分枝形成。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草或拟南芥。
4.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将含有编码光皮桦miR156a成熟miRNA的前体基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株，所述的转基因植株与野生型相比，转基因植株分化生长出更多的分枝，其中，所述前体基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
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