CN108588069B

CN108588069B - 桑树miR171a的前体基因及其在增强植物耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN108588069B
Application number: CN201810184919.9A
Authority: CN
Inventors: 孙志超; 李季生; 李娜; 杨贵明
Original assignee: Chengde Medical University
Current assignee: Chengde Medical University
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2038-03-07
Also published as: CN108588069A

Abstract

本发明公开了一种桑树miR171a的前体基因，所述前体基因的序列如下:(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或(b)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成桑树miR171a的核苷酸序列。应用桑树miR171a前体序列，有望人为地增强植物耐盐性，从而使得植物能够在含盐性高的土壤中生长繁育。

Description

桑树miR171a的前体基因及其在增强植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及桑树miR171a的前体基因及其在增强植物耐盐性中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中，其前体经过Dicer剪切之后的形成的非编码的小RNA分子。miRNA通过在转录水平或者转录后水平对基因组上的靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达，在基因表达中起负调控其靶基因的作用。

模式植物miR171a的相关功能研究很早就有报道。2002年David P.Bartel等从拟南芥幼苗和花中分别克隆了大量的小RNAs，Northern分析发现拟南芥ath-miR171a在花中表达量较高；2005年VincentL.Chiang等发现毛果杨miR171a在毛果杨茎杆中特异表达，可能参与了木质组织的形成，木质组织机械损伤胁迫导致ptr-miR171a下降；小麦miR171a在小麦的各种组织中都有表达，特别是根中相对较高；2009年薛红卫等对水稻miRNA做了表达谱分析，得出水稻osa-miR171ag/h在水稻根中选择性优先表达。可见miR171a在不同植物的各个组织中表达量及其功能是有差异的，然而，桑树miR171a的功能作用尚未知晓。

发明内容

本发明目的在于提供一种桑树miR171a的前体基因，该前体基因经过Dicer剪切后形成桑树miR171a，桑树miR171a能够沉默相关靶基因从而提高植物耐盐性。

本发明提供了一种桑树miR171a的前体基因，所述前体基因的序列如下:

(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有 98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成桑树miR171a的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述miR171a的序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供了含有上述前体基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

在一个实施方案中，所述重组菌为将上述前体基因插入表达载体得到的重组菌。

另一方面，本发明还提供了上述前体基因在增强植物耐盐性中的应用。

在一个实施方案中，所述植物为拟南芥或烟草。优选地，所述植物是拟南芥。

在一个实施方案中，由于桑树miR171a本身序列很短，只有21个bp，而前体序列相对较长，通过将其前体序列连接到载体上，有利于转化实现，因此上述应用还包括：将包含所述桑树miR171a的前体基因连接到载上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。

本发明提供了桑树miR171a前体在增强植物耐盐性中的应用。应用桑树miR171a前体序列，有望人为地增强植物耐盐性，从而使得植物能够在含盐性高的土壤中生长繁育。

附图说明

图1为桑树叶片的总RNA；

图2为桑树miR171a前体的表达载体菌液PCR检测；

图3为桑树miR171a转基因拟南芥植株的抗性筛选；

图4为桑树miR171a转基因拟南芥的PCR检测；

图5A为观察到的野生型、桑树miR171a突变体的拟南芥发芽；5B为不同浓度的盐胁迫下拟南芥发芽率统计(WT为野生型，MIR171为转基因植株)。

具体实施方式

以下本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.材料

1.1实验材料

桑树实生苗(冀桑3号)，盆栽于培养室内，使用霍格兰式培养液进行培养。选取长势一致的幼苗，进行NaCl的胁迫处理，每种组分分别设置3个梯度浓度：CK(control)，150mM(T1)，300mM(T2)，每个浓度处理设3组处理重复，每组6株幼苗的样品重复。培养条件为：温度22℃，相对湿度80％，光周期为16h光照/8h黑暗，光合有效辐射强度为100 μmol·m^–2·s^–1，处理24h后取样品存-80℃备用。

1.2实验试剂与仪器

DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。 PCR仪为美国PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。

1.3引物合成及测序

引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.方法

2.1桑树叶片总RNA的提取

RNA提取试剂为RNAiso Plus，具体步骤如下：

(1)植物材料用量为100mg，将其用液氮在研钵中研磨至光滑无颗粒状态，装入无Rnase 1.5 ml离心管中，加入1ml RNAiso Plus试剂，剧烈震荡混匀，室温静置5min。

(2)离心机离心，参数设置为12000g，4℃，离心5min。

(3)移液枪吸取上清移入另一无Rnase离心管中，加入1/5体积氯仿，充分震荡乳化，室温静置5min。

(4)离心机离心，参数设置为12000g，4℃，离心15min。

(5)移液枪吸取上清移入另一无Rnase离心管中，加入等体积异丙醇，轻柔混匀，室温静置10min。

(6)离心机离心，参数设置为12000g，4℃，离心10min，在底部可见RNA沉淀。

(7)弃掉上清液，加入1ml预先配置75％乙醇(DEPC水)，轻柔上下颠倒。

(8)离心机离心，参数设置为7500g，4℃，离心5min，弃掉上清液，室温干燥。

(9)在离心管中加入适量DEPC水，溶解RNA。

(10)ND.1000UV分光光度计检测提取RNA的质量和浓度。

2.2cDNA合成

使用TAKARA试剂盒Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内容如下：

(1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系:

(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却。(模板RNA变性)

(3)再次配置反应体系如下：

(4)缓慢摇匀

(5)42℃反应30-60min

(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。

2.3前体序列的引物设计

依据前体序列：AAAATGGTAGGATGTTGGTAGGGCTCAATCAAATCAAATCTCCT AAGAATTGGGTCCTTTTATTTGATTGAGCCGTGCCAATATCTCGTCTGGTT，通过与桑树基因组比对，在其上下游各加200bp碱基序列，形成序列如下：

GAGGACCCCCACCCCATTCAACACCATCTAATATAAATAACTTCTGTACTTTCAATGACT CCACCATGTTCTTCATTTTCTATGCTTCAAATTGCTAGCTTTCCTTGCATCACTGCCGACA GGAGTTCGACCGAGAGAGGTACCAAAGAGGTGAAATTGGTTGGTTCCCTAATTTTGATC CTTTTTTTTTTCTTTACTCAAAAAATGGTAGGATGTTGGTAGGGCTCAATCAAATCAAAT CTCCTAAGAATTGGGTCCTTTTATTTGATTGAGCCGTGCCAATATCTCGTCTGGTTTTCTT TCGTGAACTTTTTGTTTTGCTAGTTTATTATGAACGTGGAATACCCTGTTGTGTTATGTAT TGTTGTTTCTTTTTCTTTGGCACGCCTTTTACATGCAATTCTTTGCCAAGCGTGCATCTGA ATTGAACTTCACATTTAAAAAAAAAAAAAAAATGCTTGCATCAACCCTTTCCCAGGGAA AAAAAAAATAAAAAA，使用PrimerPrimer5.0设计引物，引物两端分别加上酶切位点KpnI 和XbaI，在该序列的基础上设计上游引物S1(正向引物)：

5-GGGGTACCCTTCATTTTCTATGCTTCAA-3，下游引物S2(反向引物)：

5-GCTCTAGAATAACACAACAGGGTATTCC-3。

2.4PCR扩增反应

以桑树cDNA为模板扩增，反应体系如下(总体积20μL)：

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min。30个循环后，72℃延伸10min。PCR反应完成后4℃暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进行调整。

2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收

将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA)，核酸燃料为EB。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的DNA胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：

(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过400mg，否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴露时间来降低对DNA的损伤。

(2)根据胶块的质量和浓度，每100mg琼脂糖加300～600μL的比例加入Buffer B2。

(3)置于55℃金属浴10min，期间混匀2～3次直至胶块完全溶化为止。

(4)当目的片段＜500bp时，可加入1/3体积的Buffer B2的异丙醇，混匀。若≥500bp，则此步骤可以省略。

(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，并将吸附柱放入同一个收集管中。

(6)加入500μL Wash Solution，9000xg离心30sec。再次倒掉收集管中的液体。

(7)重复一次步骤6。

(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，9000xg空离1min。扔掉收集管，并将吸附柱置于灭过菌的1.5mL EP管中。

(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min。为了去除残留的酒精，否则会严重影响回收得率和后续实验结果。

(10)在吸附膜中央加入15-30μL ddH2O。室温静置5min，9000xg离心1min。1.5mLEP 管底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20℃保存。

2.6DNA回收片段与PMD-19T载体连接

根据PMD19-T载体使用说明书，在灭过菌的PCR反应管中将Vector与回收DNA片段进行T-A克隆连接，反应体系如下：

轻轻混匀后16℃过夜连接10h以上，转化DH5α感受态。

2.7连接产物转化DH5α感受态

转化感受态具体操作步骤如下：取出适量DH5α感受态细胞并至于冰上冻融。在超净工作台内向冰冷的感受态细胞中加入上述连接混合液，并用移液器吸头轻轻吸打混匀。置于冰上20min。快速平稳放入42℃水浴中60s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入细胞)，并迅速放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭)。加入500μL无抗LB液体培养基，37℃恒温振荡培养1h。室温下4000rpm离心5min，弃掉上清(保留少许培养基，约50μL)。超净台内，用枪头轻轻吸打并重悬菌液，涂于氨苄抗性平板。倒置琼脂平板于37℃，平板通常在37℃温育14h。

2.8重组菌的筛选和鉴定

用10μL小号枪头挑取平板上至少5个单菌落(每个菌落均做好标记)，并置于含有800μL LB培养基(含相应抗生素)的1.5mL EP管中，37℃振荡培养4h左右至培养基浑浊，并对培养基浑浊的菌样进行菌检验证，菌检验证载体构建成功的菌液取1mL送上海生工测序。利用 BLAST、CLUSTAL、MEGA4.0等软件对序列进行分析。

2.9表达载体的构建

将测序获得完全正确的序列，提取质粒后用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切中间载体和表达载体 pCAMBIA13011(pC13011)，再用T4连接酶连接经过双酶切的pC13011载体和miRNA171a前体片段，然后转化到大肠杆菌中提取质粒酶切验证。

2.10转化农杆菌

2.10.1电击杯的处理

(1)用移液枪吸取ddH₂O反复冲洗电击杯3-5次。

(2)用75％的乙醇反复冲洗电击杯3-5次。

(3)将电击杯浸泡在无水乙醇中2h，然后倒掉乙醇，置于超净工作台中让残余酒精挥发。

(4)酒精挥发完全后，盖好电击杯盖子，室温保存备用。

2.10.2电转化

采用仪器为伯乐公司GenePμLser Xcell电穿孔仪进行感受态细胞的转化。主要参数为：电脉冲2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω。操作步骤如下：

(1)取出保藏的农杆菌GV3101感受态细胞放置冰上融化。

(2)取1μL质粒加入到解冻的感受态细胞中，轻轻混匀。

(3)将混合液加到电击杯中(-20℃预冷)，在电脉冲为2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω的参数条件下电击。

(4)取出电击杯，迅速加入800μL预热的无抗的YEP液体培养基，悬浮细胞后，转移到 1.5mL的离心管中。

(5)28℃，220rpm震荡培养2h左右。

(6)取30-40μL菌液，用无菌的涂布棒将菌液均匀的涂在含有相应抗生素YEP平板上，倒置放入28℃培养箱培养2-3天。

2.10.3电转化农杆菌及其检测

将酶切验证正确的pC13011-miRNA171a质粒转化到农杆菌GV3101中，再从农杆菌中提取质粒后，转化到大肠杆菌中提质粒，酶切验证。验证正确的含有pC1301-miRNA171a质粒的农杆菌，-70℃保存菌种。

2.11拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选

2.11.1拟南芥的种植

(1)将野生型拟南芥种子均匀撒在1/2MS固体培养基中。

(2)4℃冰箱避光春化处理3天。

(3)3天后，移至培养室培养，条件为温度23℃，光强7000-9000Lx，光照16小时，黑暗8小时。

(4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后，将其移植到含基质的盆中，继续培养。

2.12.2拟南芥的遗传转化

(1)农杆菌菌液的准备：配制含有卡那霉素和利福平的YEP固体培养基，倒平板，划线以活化保存的农杆菌，28℃倒置培养2天。挑单菌落至1mL含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天，再转移至100mL相同的培养基中扩大培养，直至培养液浑浊变为橙色，测其OD值达到1.2时停止培养。

(2)4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用浸染介质悬浮菌体。

(3)浸花法转化拟南芥

a.选取开花初期的拟南芥，将花序浸入含有目的基因农杆菌的转化介质中，约10-20秒。

b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养24小时。

c.第二天，放置正常条件下继续培养。

d.收获拟南芥种子，干燥。

2.11.3拟南芥转基因种子的筛选及种植

(1)将转基因种子均匀撒在1/2MS的固体培养基中(培养基中潮霉素的浓度为50mg/L)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照。

(2)4℃避光春化处理3天。

(3)3天后将撒有野生型拟南芥种子的培养皿打开，置于培养室中正常培养，而含有转基因种子的培养皿则避光培养。

(4)48小时后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株就会生长，反之不生长。

(5)待拟南芥长出2-4片真叶后，移植到含有泥炭的盆中，继续培养。

(6)使用盐胁迫对野生型拟南芥和桑树miR171a转基因拟南芥处理，观察拟南芥的生长情况。

3.实验结果

3.1桑树叶片总RNA提取分析

利用RNA提取试剂RNAiso Plus提取盐胁迫处理后的桑树总RNA，并通过紫外分光光度计测定每个RNA样品260nm及280nm的吸光度，并以此计算RNA的浓度及纯度，并在 1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。所提桑树RNA的光密度比值均在2.0-2.2之间，说明总RNA基本无糖类、酚及蛋白质的污染；电泳结果图1则显示RNA样品的18s和28s 两条带非常清晰，可推断RNA没有降解，符合下步实验的要求。

3.2miRNA171a转基因功能验证

依据桑树miR171a前体序列，进行表达载体的构建，将桑树miRNA171a前体序列连接到pC13011表达载体上，转化到DH5α感受态细胞中，同时对其进行菌液PCR检测(图2)，菌液PCR检测的条带单一；将连接成功的单克隆提取质粒，转化到土壤农杆菌GV3101中，进行拟南芥转基因。对桑树miRNA171a转基因拟南芥植株进行抗性筛选(如图3)，将筛选出的转基因拟南芥体取DNA，进行PCR检测(如图4，PCR扩增获得桑树miRNA171a前体基因)。将筛选出的转基因拟南芥进行盐胁迫处理，野生型拟南芥作对照。根据图5可以看出，随着处理盐浓度的增大，野生型与转基因植株发芽率出现了不同的抑制，而在同一浓度下，转基因植株抑制程度较野生型轻。综上可知，转入桑树miRNA171a前体基因使得植株的耐盐性增强。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 承德医学院

<120> 桑树miR171a的前体基因及其在增强植物耐盐性中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaatggtag gatgttggta gggctcaatc aaatcaaatc tcctaagaat tgggtccttt 60

tatttgattg agccgtgcca atatctcgtc tggtt 95

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgattgagcc gtgccaatat c 21

<210> 3

<211> 497

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggaccccc accccattca acaccatcta atataaataa cttctgtact ttcaatgact 60

ccaccatgtt cttcattttc tatgcttcaa attgctagct ttccttgcat cactgccgac 120

aggagttcga ccgagagagg taccaaagag gtgaaattgg ttggttccct aattttgatc 180

cttttttttt tctttactca aaaaatggta ggatgttggt agggctcaat caaatcaaat 240

ctcctaagaa ttgggtcctt ttatttgatt gagccgtgcc aatatctcgt ctggttttct 300

ttcgtgaact ttttgttttg ctagtttatt atgaacgtgg aataccctgt tgtgttatgt 360

attgttgttt ctttttcttt ggcacgcctt ttacatgcaa ttctttgcca agcgtgcatc 420

tgaattgaac ttcacattta aaaaaaaaaa aaaaatgctt gcatcaaccc tttcccaggg 480

aaaaaaaaaa taaaaaa 497

Claims

1.桑树miR171a的前体基因在增强植物耐盐性中的应用，其特征在于，所述前体基因的序列为SEQ ID NO：1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或烟草。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将包含所述桑树miR171a的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。