CN107056907A - Nac062d转录因子蛋白及其编码基因在抑制种子发芽中的应用 - Google Patents

Abstract

一种NAC062D转录因子蛋白，是膜结合转录因子NAC062去掉跨膜域后的活性形式，其氨基酸序列为序列表中的序列1，其核苷酸序列为序列表中的序列2。所述的NAC062D转录因子蛋白的编码基因导入目的植物的转基因植物培育方法，将NAC062D蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；转基因植株特征：1)正常情况下与非转基因没有区别；2)加入10uM诱导剂beta‑estrodial(beta‑E)后，转基因植物的发芽率远低于非转基因。所述转基因植物抑制种子发芽体现在所述转基因植株的发芽率均低于所述目的植物。本发明提供了将一个调控植物种子发芽的转录因子NAC062D及其编码基因导入拟南芥哥伦比亚生态型中，得到转基因植物，发现转录因子可以用于调控种子发芽。

Description

NAC062D转录因子蛋白及其编码基因在抑制种子发芽中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种膜结合转录因子NAC062的活性形式NAC062D蛋白及其编码基因在抑制种子发芽中的应用。

背景技术

孟山都公司研究人员从矮牵牛中克隆获得了抗性基因(EPsPs基因)，并应用粒介导转移脱氧核糖核酸(DNA)技术，将矮牵牛质粒(caMv)中35s启动子控制的EPsPs基因导人大豆基因组中，进而培育出抗草甘膦大豆品种。这种转基因大豆于1994年被美国食品与药品管理局(FDA)批准，较早成为商业化大规模推广的生产转基因作物之一。由于RR豆具有耐除草剂草甘膦基因，这种大豆对非选择性除草剂农达(Rwndup)有高度耐受性。在大田中施用草甘膦除草剂，不会影响大豆产量。此外，转基因大豆还有其他类型，如高蛋氨酸大豆品种等，但转基因大豆的毒性和安全隐患问题一直备受争议，如下：

1.说转基因不能留种，而只能买新鲜转基因种，转基因种子也只有研究转基因的人专营，这就不免让人联想到利益的趋势，一旦利益驱使，就难免派生不良的理念；

2.例如黄豆需要转化成豆芽的时候，转基因就不能办到，必须购买能转化成豆芽的非转基因。

随着环境污染日益加剧，温室效应加剧，地表气温上升，四季气温变化异常，雾霾天气也不断发生，严重影响了农作物的生长发育，继而影响粮食产量。因此，在未来很长一段时间内，农业研究可能将重点关注如何提高植物在各种恶性环境条件下的抗逆性。研究表明，拟南芥膜结合转录因子在调控植物生长发育、逆境胁迫应答等中起着重要的作用。NAC膜结合转录因子是拟南芥重要的转录因子家族之一，是近年来发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子。

发明内容

本发明公开了一种膜结合转录因子NAC062的活性形式NAC062D蛋白及其编码基因在抑制种子发芽中的应用。

本发明的目的及解决的主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种NAC062D转录因子蛋白，其特征在于，NAC062全长蛋白是一个具有跨膜域(TM)的膜结合转录因子，而NAC062D是其去掉跨膜域后的截短形式，其氨基酸序列为序列表中的序列1，其核苷酸序列为序列表中的序列2，是膜结合转录因子NAC062的活性形式。

本发明提供的转基因植物培育方法，为将NAC062D蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植株特征：1)正常情况下与非转基因没有区别；2)加入10uM诱导剂beta-estrodial(beta-E)后，转基因植物的发芽率远低于非转基因。

在上述方法中，所述目的植物为双子叶植物和单子叶植物。

在上述方法中，所述双子叶植物为拟南芥，油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草；所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱或草坪草。

所述目的植物为拟南芥或油菜。

所述方法，NAC062D蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物，所述重组载体为1)或2)：

1)转录激活活性鉴定：将所述NAC062D蛋白的编码基因插入PGBK-T7中得到的载体；

2)转基因载体构建：将所述NAC062D蛋白的编码基因插入PER10得到的载体。

上述的NAC062D转录因子蛋白的编码基因在抑制种子发芽中的应用，转基因能够抑制种子发芽，所述转基因植物抑制种子发芽体现在所述转基因植株的发芽率均低于所述目的植物。

所述NAC062D是NAC062去掉跨膜域后的截短形式，通过构建到PGBK-T7载体中转入到酵母中，实验证明该形式是具有转录激活活性。

本发明的另一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供了一种重组载体为如下1)或2)

1)转录激活活性鉴定：将所述NAC062D蛋白的编码基因插入PGBK-T7的BamH I和EcoRI中得到的载体；

2)转基因载体构建：将所述NAC062D蛋白的编码基因插入PER10的ASCI和Spe I位点间得到的载体。

本发明将一个调控植物种子发芽的转录因子NAC062D及其编码基因导入拟南芥哥伦比亚生态型(Columbia)中，得到转基因植物，发现转录因子可以用于调控种子发芽。本发明具有以下特点：

1、本发明采用了诱导型启动子，不加诱导剂的时候，植物生长和非转基因一致，可以繁殖下一代；

2、如果想要吃种子，例如黄豆，就添加诱导剂，让基因表达抑制种子发芽，就能得到种子。

附图说明

图1是NAC062和NAC062D的基因结构框架图。其中黑色方框表示外显子，灰色方框表示5’和3’非编码区，直线表示内含子。ATG和TGA分别表示基因的起始密码子和终止密码子。

图2是NAC062和NAC062D蛋白结构示意图。“NAC”代表NAC结构域，NAC062全长在N端具有NAC结构域，C端具有跨膜域。NAC062D在N端也具有NAC结构域，但是去掉了C端跨膜域。

图3是NAC062D转录激活活性分析。

图4是PER10-NAC062D转基因植株表达量鉴定；PER10是只含有空载体的转基因材料，作为对照；NAC062#14，NAC062#16号分别代表PER10-NAC062D的T2代转基因材料14号、16号。

图5其中：图5A.植物编号图，PER10-NAC062D转基因植株表达量鉴定；wt是野生型，作为对照；PER10-NAC062D#6/14/8/25/16号，是转基因T2代材料；

图5B.不加beta-E植物全部发芽，转基因和对照野生型一致；

图5C.加beta-E后6天对照生长不受影响，而PER10-NAC062D种子不发芽；

图5D.加beta-E后12天后，WT生长一致，但是PER10-NAC062D种子仍然不发芽。

图6是统计分析种子发芽率，NAC062D转基因抑制种子发芽差异极显著。

具体实施方式

以下结合附图、序列表及较佳实施例，对依据本发明提出的NAC062D转录因子蛋白及其编码基因在抑制种子发芽中的应用具体实施方式、特征及其功效，详细说明如下。

实施中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

一、转NAC062D酵母菌株的获得：

(1)调控基因的克隆：

转录激活活性的设计引物序列如下：

P1上游:CCGAATTCATGAATCAGAATCTTCATGT

P2下游：AGAGATCTTGCTACAACATCAAAACCAC

用植物中RNA提取试剂盒(天根)，并参照说明书提取野生型拟南芥(Columbia生态型，购自美国拟南芥生物资源中心，ABRC)10天幼苗的总RNA,然后用invitrogen反转录试剂盒合成cDNA,在引物P1,P2的引导下PCR扩增；凝胶电泳，回收片段约987bp。

(2)含NAC062D的酵母转化载体的构建：

用限制性内切酶ECORI和BAMHI双酶切载体PGBK-T7(购于clonetech公司)和实验1获得的基因NAC062D，对双酶切产物进行1％跑胶电泳检测，并纯化连接，得到连接产物。将连接载体用热激法转化大肠杆菌(E.COLI)DH5α感受态细胞，克隆PCR鉴定，筛选阳性克隆，将其接种于50mg/L卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃培养16小时，提质粒，标记为PGBK-NAC062D，对其进行测序，测序结果表明PCR产物的基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，由987个碱基构成，其编码序列为自5’端的1-987位碱基，其编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。其中序列表中序列2自5’端第37-492位碱基编码NAC结构域和蛋白-蛋白相互作用结构域。

(3)转NAC062D酵母的获得

挑取一些平板上生长的新鲜酵母菌落，接种到5mL的YPAD液体培养基中，30℃过夜培养；第二天将过夜培养的菌液取3mL接种到含50mL YPAD的三角瓶中，30℃培养3～4小时，直至OD600到0.6为最佳；700g室温离心5min，收集菌液，用无菌水重悬菌液，700g室温离心5min，去掉上清，加入1.5mL 1.1×TE/LiAc(10mL＝1.1mL 10×TE+1.1mL10×LiAc+7.8mLH2O)重悬，转移到1.5mL离心管中，12000g室温离心30s，去上清，加入600μL1.1×TE/LiAc重悬，每50μL分装到离心管中，酵母感受态制备完成接下来进行酵母转化。首先取适量的鲑鱼精95℃加热5min后，迅速插入冰上，使鲑鱼精DNA变成单链，帮助质粒DNA进入酵母体内。依次将500μL PEG/LiAc(10mL PEG/LiAc＝8mL50％PEG3350+1mL 10×TE+1mL10×LiAc)，1～5μg质粒和已变性的鲑鱼精5μL(10mg/mL)加入到已制备好的100μL酵母感受态细胞中，混匀，放入30℃恒温箱中孵育30min，每10min混匀一次；再放入42℃水浴锅中热击15～20min，每5min混匀一次；12000g室温离心15s，去掉上清，无菌水重悬酵母，涂布于相应的营养缺陷型平板上。30℃培养箱培养2-3天待酵母菌落生长。

(4)转NAC062D酵母转录激活活性鉴定：

为了鉴定该截短形式是否具有功能，发明人初步在酵母中完成了转录激活活性的检测。EMPTY代表是PGBK-T7空载体作为对照，NAC062D代表PGBK-T7载体上连接有NAC062D基因，作为实验组。挑取步骤3的单克隆接种到YPDA液体培养基上，30℃过夜摇菌，第二日，测酵母菌液OD600，并用无菌水稀释酵母菌液，调整OD600值在相近范围内。吸取5μL菌液在营养缺陷型平板培养基上打点，3天后观察酵母生长情况。从土中可以看出在缺TRP色氨酸的时候，NAC062D和对照empty(空载体PGBK-T7)生长一致，当培养基中缺TRP色氨酸和筛选标记HIS组氨酸的时候，对照就不能生长，而含有NAC062D就能生长，同时当用另外一个筛选标记X-gal染色，含有NAC062D的酵母出现蓝色，进一步说明NAC062D这种截短形式在酵母中是具有转录激活活性的。如图3。

二、转NAC062D拟南芥植株的获得：

(1)设计引物序列如下：

P1上游:ttggcgcgccATGAATCAGAATCTTCATGT

P2下游：ggactagtTGCTACAACATCAAAACCACTT

用植物中RNA提取试剂盒(天根)，并参照说明书提取野生型拟南芥(Columbia生态型，购自美国拟南芥生物资源中心，ABRC)10天幼苗的总RNA,然后用invitrogen反转录试剂盒合成CDNA,在引物P1,P2的引导下PCR扩增；凝胶电泳，回收片段约987bp。

(2)含NAC062D的植物诱导表达载体的构建：

用限制性内切酶ASCI和Spe I双酶切载体PER10和实验1获得的基因NAC062D，对双酶切产物进行1％跑胶电泳检测，并纯化连接，得到连接产物。PER10是一个由雌二醇诱导的植物表达载体，具体参照中科院遗传与发育生物学文章，Zuo J，Hare P D，Chua NH.Applications of Chemical-Inducible Expression Systems in FunctionalGenomics and Biotechnology[M]//Arabidopsis，Protocols.Humana Press，2006:329-42.将连接载体用热激发转化大肠杆菌(E.COLI)DH5α感受态细胞，克隆PCR鉴定，筛选阳性克隆，将其接种于50mg/L spec壮观霉素抗性LB液体培养基中，37度培养16小时，提质粒，对重组质粒用限制性内切酶ASCI和Spe I双酶切鉴定，与预期结果相符，命名为PER10-NAC062D，对其进行测序，测序结果表明PCR产物的基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，由987个碱基构成，其编码序列为自5’端的1-987位碱基，其编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。其中序列表中序列2自5’端第37-492位碱基编码NAC结构域和蛋白-蛋白相互作用区域。

上述基因NAC062D对应的基因组序列具有序列表中序列3的核苷酸序列，由1639个碱基组成，自5’端第197-374位碱基位该基因组基因的第一个外显子，自5’端第375-644位碱基位该基因组基因的第一个内含子，自5’端第197-374位碱基位该基因组基因的第一个内含子自5’端,645-925位碱基位该基因组基因的第二个外显子，自5’端第926-1019位碱基位该基因组基因的第二个内含子，自5’端第1020-1259位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第1260-1351位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第1352-1639位碱基为该基因组基因的第四个外显子。该基因框架结构见图1，将该基因命名为NAC062D,将其编码的蛋白命名为NAC062D。

图2是NAC062和NAC062D蛋白结构示意图。“NAC”代表NAC结构域，NAC062全长在N端具有NAC结构域，C端具有跨膜域。NAC062D在N端也具有NAC结构域，但是去掉了C端跨膜域。

(3)转NAC062D拟南芥的获得：

将步骤2构建的植物表达载体PER10-NAC062D用电击法转化农杆菌GV3101感受态细胞，将其涂布于含50mg/L壮观霉素和50mg/L的利福平的LB抗性平板上，在28度、150rpm下培养16小时，挑取长出的农杆菌单菌落经过引物P1和P2的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到987bp的DNA片段，说明为阳性重组农杆菌，命名为GV3101/PER10-NAC062D.将GV3101/PER10-NAC062D接种于含50mg/L壮观霉素和50mg/L的利福平的LB抗性培养液体中，在28度、150rpm下培养20小时，取1mL菌液接种于含50mg/LL壮观霉素和50mg/L的利福平的300mL LB抗性培养液体中，在28度、150rpm下培养达到OD＝0.6.培养结束后，5000rpm离心15分钟收集菌体，再将液体溶于500mL含有5％蔗糖的MS侵染液中，慢慢摇匀，将已经去掉花和果荚的野生型拟南芥倒置于烧杯中10分钟，得到T0代PER10-NAC062D植物。将上述阳性T0代转NAC062D植物进行培养，收获种子，所得种子经50mg/L卡那霉素筛选后得到40株T1代转NAC062D植物。经过自交，获取T2代NAC062D植物，并挑选#6/#14/#8/#25/#16号进行RT-PCR检测NAC062D表达量,都是高于野生型中的表达，说明是阳性植株。

三、转NAC062D拟南芥的表型鉴定：

(1)转PER10-NAC062D植物的鉴定

首先将步骤二获得的编号为#14和#16号代的T2代转NAC062D拟南芥(PER10-NAC062D)的T2代种子播在MS培养基上，培养10天后的幼苗含有雌激素MS培养液处理10小时。(+beta-E)代表用10um雌激素(17-β-ESTRODIOL,SIGMA,产品货号E8875)处理的实验组，(-beta-E)代表不用试剂处理作为对照。处理完成后提取全苗的RNA,以野生型拟南芥作为对照，反转录获得Cdna,用

P3(上游引物)：5’-GGGGAAGAAGATTCGAAGTCAG-3’

P4(下游引物)5’-GCTCTGCGGTTGTAGCCTCATC-3’进行qRT-PCR,检测了NAC062D基因在T2代转基因中植物中的表达水平，以野生型拟南芥为对照，以ACTIN为内参，内参的引物为ACTIN-F:5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’,ACTIN-R:5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’结果如图4所示，为qRT-PCR技术检测NAC062D基因的表达水平，从图4中可以看出，与野生型拟南芥相比，编号为#14和#16的T2代转PER10-NAC062D拟南芥中NAC062基因的表达水平具有不同程度的升高，说明编号为#14和#16的T2代转PER10-NAC062D拟南芥为阳性的过表达拟南芥。

(2)转PER10-NAC062D植物的表型分析：

将上述鉴定为阳性的编号的挑选#6/#14/#8/#25/#16号进行RT-PCR检测NAC062D表达量的T2代转PER10-NAC062D拟南芥的种子播在含有10uM雌激素(17-β-ESTRODIOL，SIGMA，产品货号E8875)的MS培养基上，置于光照培养箱，22℃，16小时光照，以野生型拟南芥为对照。6天和12天天后观察T2代转NAC062D拟南芥和野生型植株的生长情况，结果如图5所示，图5A是模式图，图5B是不加诱导剂雌激素(-beta E)的时候，通过与对照野生型比较，植物和正常一致；图和图5C是加入10uM雌激素诱导剂(+beta E)，诱导NAC062D基因表达6天后，野生型已经全部发芽，而NAC062D转基因种子不发芽，图5D是加入10uM雌激素诱导剂(+beta E)，12天后NAC062D种子不发芽，而对照植物种子野生型生长正常。

(3)统计分析差异。根据图5的结果分别在6天和12天统计种子发芽率，结果显示极显著。如图6。

四、NAC062D调控种子发芽的分子机制研究：

将步骤二获得的编号为#14的T2代转NAC062D拟南芥(PER10-NAC062D)的种子在含有10uM雌激素(17-β-ESTRODIOL，SIGMA，产品货号E8875)MS培养液中处理12小时，24小时，不处理作为对照，提取种子RNA，送公司进行转录组测序。ABA脱落酸是一种具有倍半萜结构的植物激素,具有能引起芽休眠、叶子脱落和抑制细胞生长等生理作用。研究发现种子发芽与ABA信号通路有着密切联系。转录组测序结果显示结果发现许多与ABA相关的基因在转基因中发生了变化，说明NAC062可能是通过调控ABA途径来调控基因表达从而抑制种子发芽，如下PER10-NAC062D#14号通过转录组分析与ABA信号通路相关基因列表。

转基因材料中与ABA信号通路相关的差异显著基因。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

序列1：NAC062D蛋白序列 329aa 拟南芥（arabidopsis thaliana）

1 MNQNLHVLSM DSLPVGLRFR PTDEELIRYY LRRKINGHDD DVKAIREIDI

50 CKWEPWDLPD FSVIKTKDSE WLYFCPLDRK YPSGSRQNRA TVAGYWKATG

100 KDRKIKSGKT NIIGVKRTLV FHAGRAPRGT RTNWIIHEYR ATEDDLSGTN

151 PGQSPFVICK LFKKEELVLG EEDSKSDEVE EPAVSSPTVE VTKSEVSEVI

201 KTEDVKRHDI AESSLVISGD SHSDACDEAT TAELVDFKWY PELESLDFTL

251 FSPLHSQVQS ELGSSYNTFQ PGSSNFSGNN NNSFQIQTQY GTNEVDTYIS

301 LDSILKSP DEDPEKHKYV LQSGFDVVA

序列2：NAC062D CDS序列 987bp 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

1 ATGAATCAGA ATCTTCATGT ATTATCAATG GATTCGTTAC CAGTTGGATT

51 AAGATTCCGT CCAACAGACG AGGAGCTAAT CCGTTACTAT CTCCGTAGGA

101 AAATCAACGG TCACGATGAC GACGTCAAAG CTATCCGTGA GATCGATATT

151 TGCAAATGGG AACCTTGGGA TTTACCTGAT TTTTCTGTGA TCAAAACTAA

201 AGACTCAGAG TGGCTCTACT TCTGTCCATT GGATCGGAAG TATCCGAGTG

251 GAAGTAGACA GAACCGGGCA ACAGTTGCAG GGTACTGGAA AGCCACAGGA

301 AAAGACCGGA AGATAAAATC CGGTAAGACT AACATTATTG GTGTGAAGAG

351 AACTCTAGTT TTCCACGCGG GTAGAGCTCC TAGGGGGACA CGAACCAATT

401 GGATTATTCA TGAGTATCGT GCCACGGAGG ATGATCTTAG TGGTACCAAT

451 CCTGGCCAGA GTCCGTTTGT TATATGCAAA TTGTTCAAGA AAGAAGAACT

501 GGTTTTAGGG GAAGAAGATT CGAAGTCAGA TGAAGTTGAA GAACCTGCTG

551 TCTCGTCTCC AACTGTCGAA GTGACTAAGT CAGAAGTATC TGAGGTAATT

601 AAAACAGAAG ACGTGAAGCG TCATGACATA GCAGAATCTT CTCTTGTAAT

651 CTCTGGAGAT TCTCATAGTG ATGCTTGTGA TGAGGCTACA ACCGCAGAGC

701 TTGTAGATTT TAAATGGTAT CCGGAATTGG AGTCCTTAGA TTTCACGCTG

751 TTCTCTCCAT TACACTCTCA AGTCCAATCT GAGCTTGGAT CCTCTTACAA

801 CACATTCCAG CCTGGCTCGA GTAATTTTTC AGGGAACAAC AACAACAGCT

851 TCCAAATCCA GACTCAGTAT GGTACAAATG AAGTAGATAC GTATATATCT

901 GATTTTCTTG ATTCGATTCT CAAGAGCCCA GACGAGGATC CAGAGAAGCA

951 CAAGTATGTT TTGCAAAGTG GTTTTGATGT TGTAGCA

序列3 :NAC062D 基因组序列 1639bp 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

1 ACATCTGCCT TCTTCTTCAC TTTACCAAAA TCATCGAATC CATTTTTAGG

51 GTTTTTGTTT TCTCTCTAAA TTTTTATTGT TATCTTCTTC GCGATACCTT

101 GGAATCGCAT CTCTGAGATA GATAAATAAT TCTGATTCGT ATCTTTAAAT

151 CTTGGGTTCT TCTTCTTCTC GCGATTCGTT TAAAAGAGCA GCATCAATGA

201 ATCAGAATCT TCATGTATTA TCAATGGATT CGTTACCAGT TGGATTAAGA

251 TTCCGTCCAA CAGACGAGGA GCTAATCCGT TACTATCTCC GTAGGAAAAT

301 CAACGGTCAC GATGACGACG TCAAAGCTAT CCGTGAGATC GATATTTGCA

351 AATGGGAACC TTGGGATTTA CCTGGTACTT ACTTACTTAC TTCTTCATCT

401 CTTTATTCAT AAATTTACAC TTTTTCTATA GATCCTCTTT GATTTCTCTG

451 GCATTATGTT GAATTGAGAA ATGGTAGAAC TTAAAATTTG TAGCTTTAGT

501 TTCTATGGTG AAGAAAGTTA ATAACTTTAA ACCGATCATA TGTGTTTGAT

551 ATAGTTTAGT TTTGGGTATG TGGTTATATC TCTGTTAAGG TGTAGTGTAA

601 GTGACTGAAA TTTGATTAAA AGATGTGATT TTTTTTTGTT GTAGATTTTT

651 CTGTGATCAA AACTAAAGAC TCAGAGTGGC TCTACTTCTG TCCATTGGAT

701 CGGAAGTATC CGAGTGGAAG TAGACAGAAC CGGGCAACAG TTGCAGGGTA

751 CTGGAAAGCC ACAGGAAAAG ACCGGAAGAT AAAATCCGGT AAGACTAACA

801 TTATTGGTGT GAAGAGAACT CTAGTTTTCC ACGCGGGTAG AGCTCCTAGG

851 GGGACACGAA CCAATTGGAT TATTCATGAG TATCGTGCCA CGGAGGATGA

901 TCTTAGTGGT ACCAATCCTG GCCAGGTAAA TAATGCATAC TTTTAGATGT

951 GTAACCATTG GAAAACTAAA TTTGGCTCTG TAGCTTATTG TGTGCTTGTG

1001 TTGATATATA TATATGCAGA GTCCGTTTGT TATATGCAAA TTGTTCAAGA

1051 AAGAAGAACT GGTTTTAGGG GAAGAAGATT CGAAGTCAGA TGAAGTTGAA

1101 GAACCTGCTG TCTCGTCTCC AACTGTCGAA GTGACTAAGT CAGAAGTATC

1151 TGAGGTAATT AAAACAGAAG ACGTGAAGCG TCATGACATA GCAGAATCTT

1201 CTCTTGTAAT CTCTGGAGAT TCTCATAGTG ATGCTTGTGA TGAGGCTACA

1251 ACCGCAGAGG TGAGGACATT GAAAAATTCT CTTAGACAGT TTTTAGATGA

1301 TTGTCTCTAG TGTCTGTTTG AATACTAATG ATGTTTATTT TCGGCATGCA

1351 GCTTGTAGAT TTTAAATGGT ATCCGGAATT GGAGTCCTTA GATTTCACGC

1401 TGTTCTCTCC ATTACACTCT CAAGTCCAAT CTGAGCTTGG ATCCTCTTAC

1451 AACACATTCC AGCCTGGCTC GAGTAATTTT TCAGGGAACA ACAACAACAG

1501 CTTCCAAATC CAGACTCAGT ATGGTACAAA TGAAGTAGAT ACGTATATAT

1551 CTGATTTTCT TGATTCGATT CTCAAGAGCC CAGACGAGGA TCCAGAGAAG

1601 CACAAGTATG TTTTGCAAAG TGGTTTTGAT GTTGTAGCA

Claims (7)

1.一种NAC062D转录因子蛋白，其特征在于：NAC062全长蛋白是一个具有跨膜域TM的膜结合转录因子，而NAC062D是膜结合转录因子NAC062去掉跨膜域后的活性形式，其氨基酸序列为序列表中的序列1，其核苷酸序列为序列表中的序列2。

2.如权利要求1所述的NAC062D转录因子蛋白的编码基因导入目的植物的转基因植物培育方法，其特征在于：将NAC062D蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植株特征：1)正常情况下与非转基因没有区别；2)加入10uM诱导剂beta-estrodial后，转基因植物的发芽率远低于非转基因。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物和单子叶植物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥，油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草；所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱或草坪草。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目的植物为拟南芥或油菜。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：NAC062D蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物，所述重组载体为1)或2)：

1)转录激活活性鉴定：将所述NAC062D蛋白的编码基因插入PGBK-T7中得到的载体；

2)转基因载体构建：将所述NAC062D蛋白的编码基因插入PER10得到的载体。

7.如权利要求1所述的NAC062D转录因子蛋白的编码基因在抑制种子发芽中的应用，其特征在于：转基因能够抑制种子发芽，所述转基因植物抑制种子发芽体现在所述转基因植株的发芽率均低于所述目的植物。