CN111549026B - 一种水稻增强子及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻增强子及鉴定方法。该水稻增强子为622bp的DNA分子，序列如SEQ ID NO.1。构建OsENHANCER1 reporter载体、正对照载体CaMV35S‑GFP reporter(SEQ ID NO.2)和负对照载体Enhancerless reporter(SEQ ID NO.3)，通过水稻原生质体转化进行鉴定。本发明增强子在基因转录过程中发挥重要作用，鉴定方法快速，便捷。

Description

一种水稻增强子及鉴定方法

技术领域

本发明涉及增强子及鉴定方法，特别涉及一种水稻增强子及鉴定方法。

背景技术

增强子作为顺式调控元件，主要促进远距离的目标基因的转录。增强子无论位于基因的上游、下游或是基因内部，都可以发挥增强转录的作用。研究表明增强子具有细胞或组织特异性，这取决于细胞或组织中反式作用因子。增强子可以与一些特定反式作用因子而起作用。且与其自身序列方向无关。真核生物基因的转录是一个复杂的过程，增强子与多种调控因子共同参与转录调控，在细胞分化及个体发育中发挥着重要作用。近年来关于增强子的研究取得了很大进展。据报道，增强子可以作为转录因子的平台，其中一研究认为增强子区域会与启动子区域相互作用，形成环状结构，使作用于该增强子区域的转录因子可以促进目的基因转录。因此增强子是基因工程中重要的研究对象。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种水稻增强子。

本发明的另一目的是提供所述水稻增强子的鉴定方法。

技术方案：本发明提供一种水稻增强子，基因序列如SEQ ID NO.1。

进一步地，所述水稻增强子来源于禾本科稻属粳稻日本晴(Oryza sativaL.spp.Japonica var.Nipponbare)，具体用引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到662bp的扩增产物。

进一步地，所述引物序列如下：

正向：5’-gtacaagtgactcgagctacggtttcgaggaaaaggggtt-3’

反向R：5’-atcttcatcttcatatatccgaacagcggatctgacgacg-3’。

所述的水稻增强子的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)通过生物信息学分析，结合本实验室水稻DNaseI数据对日本晴基因组进行预测，获得增强子OsENHANCER1(SEQ ID NO.1)；

(2)将OsENHANCER1(SEQ ID NO.1)扩增后插入mini35s-GFP reporter(SEQ IDNO.4)，构建OsENHANCER1 reporter载体；

(3)构建正对照载体CaMV35S-GFP reporter(SEQ ID NO.2)和负对照载体Enhancerless reporter(SEQ ID NO.3)；

(4)水稻原生质体的制备与转化；

(5)转化后对OsENHANCER1的活性进行验证。

进一步地，所述步骤(3)中正对照载体构建方法为：以P1300LV载体为模板，扩增CaMV35S启动子；使用限制性内切酶AscI和XbaI将mini35s-GFP reporter载体线性化，用无缝连接试剂盒将上述2个片段快速连接，转化至大肠杆菌DH5 α中，筛选阳性转化子，得到正对照载体CaMV35S-GFP reporter(SEQ ID NO.2)。

进一步地，所述步骤(3)中负对照载体构建方法为：使用限制性内切酶BsaI将mini35s-GFP reporter载体线性化，将一段无功能序列插入线性化载体，连接后转化至大肠杆菌DH5 α中，筛选阳性转化子，得到负对照载体Enhancerless reporter(SEQ IDNO.3)。

鉴定原理：负对照载体利用mini35s启动子不能启动的荧光蛋白GFP表达，由于增强子可远距离促进转录，所以负对照载体中GFP序列后插入增强子序列，当增强子有功能时荧光蛋白则可发光。若以相同策略插入非增强子序列时，荧光蛋白不能发光。

有益效果：本发明提供了一种水稻增强子序列，本质是DNA分子，622bp，对转录具有较好的增强效果，同时，提供了快速便捷的鉴定方法。

附图说明

图1是正负载体结构示意图，CaMV35S-GFP reporter载体是正对照载体，载体结构为CaMV35S启动GFP表达；mini35s-GFP reporter和Enhancerless reporter是负对照，mini35s reporter载体结构为mini35s启动GFP表达；Enhancerless reporter载体是将一段非增强子序列的连入mini35s-GFP reporter报告载体；

图2是原生质体中增强子OsENHANCER1的载体示意图和活性检测结果图。

具体实施方式

本实施例的增强字获取及鉴定方法如下：

1.OsENHANCER1介绍

水稻基因组开放染色质数据(DNase-seq)在植物开放染色质数据库PlantDHS(http://plantdhs.org/)中获得，结合水稻组蛋白修饰数据(ChIP-seq)，预测基因组中增强子位点。增强子通常位于无核小体保护的开放染色质区域，可以与调控蛋白共同作用于远端基因上游的启动子区域，共同促进下游基因的转录，与基因的H3K27ac组蛋白修饰高度相关。经分析获得OsENHANCER1(SEQ ID NO.1)。

设计序列特异性引物，制备如下引物：

正向：5’-gtacaagtgactcgagctacggtttcgaggaaaaggggtt-3’

反向R：5’-atcttcatcttcatatatccgaacagcggatctgacgacg-3’。

用以上引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到662bp的扩增产物。

经测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的自5’端第一位-662位所示。

2.检测

将SEQ ID NO.1所示的片段插入载体mini35s-GFP reporter(由电子科技大学张勇课题组提供，SEQ ID NO.4)中的BsaI酶切位点中，构建OsENHANCER1 reporter载体(如图2所示)。

同时构建正对照载体：以P1300LV载体为模板，扩增CaMV35S启动子；使用限制性内切酶AscI和XbaI将mini35s-GFP reporter载体线性化，用无缝连接试剂盒将上述2个片段快速连接，转化至大肠杆菌DH5 α中，筛选阳性转化子，得到正对照载体CaMV35S-GFPreporter(如图1所示)。

负对照载体：使用限制性内切酶BsaI将mini35s-GFP reporter载体线性化，将一段无功能序列插入线性化载体，连接后转化至大肠杆菌DH5 α中，筛选阳性转化子，得到负对照载体Enhancerless reporter(如图1所示)。

5.水稻原生质体制备与转化

5.1水稻原生质体制备：

(1)叶片准备。取无菌培养14天左右生长良好的新鲜水稻植株40-60株，去掉根部，备用。

(2)酶解。将水稻叶片和茎段用锋利刀片切成宽度为0.5mm的条状，速度要快，防止叶片脱水，将切好的叶片放入盛有10mL酶解液的培养皿中，置于密闭容器中用真空泵抽真空30min，用封口膜封口，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下过夜酶解。

(3)过滤。将过夜酶解的粗酶液通过预先用2mL W5 washing Buffer润洗过的孔径40μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。

(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15mL离心管中，每管6mL细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16mL0.55M蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8mL 0.55M蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。

(5)清洗。取50mL离心管一个，加入10mL Washing buffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8mL Washing buffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10mL Washing buffer的50mL离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。

(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10mL Washing buffer，轻弹混匀，100g离心2min。

(7)重悬。去掉上清，加入5mL Washing buffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。

(8)计数。吸取100μL细胞用于计数，取6-7pL细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用MGG稀释后再进行计数。

(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用MGG Buffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×10⁶个/mL，用于原生质体转化。

5.2水稻原生质体的转化：

(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat#DP-106)提取以下质粒：mini35s-GFP reporter，OsENHANCER1 reporter，Enhancerless reporter和CaMV35S-GFPreporter。确保其浓度尽量在500ng/μL以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用MGG Buffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。

(2)PEG介导的转化。将上述准备好的质粒(mini35s-GFP reporter，OsENHANCER1reporter，Enhancerless reporter和CaMV35S-GFP reporter)中加入200μL按照2.2.6制备过程制备的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μL 40％PEG(PEG加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于PEG当中，从第一管加入PEG开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。

(3)清洗。加入PEG反应20min后，每管加入1mL W5 Washing Buffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。

(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μL Washing Buffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。

(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2mL W5 Buffer，再取培养皿中的W5Buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养，两天后在显微镜下观察荧光。

6.激光共聚焦显微镜观察

使用Zeiss 700激光共聚集显微镜进行观察。GFP使用的激发波长为488nm，吸收波长为490-540nm。所有的荧光实验至少重复三次。mini35s-GFP reporter，OsENHANCER1reporter，Enhancerless reporter和CaMV35S-GFP reporter质粒分别转化原生质体后，在转化子中观察，结果如图1所示，正对照CaMV35S-GFP reporter有较强荧光；负对照mini35s-GFP reporter和Enhancerless reporter均没有荧光信号；图2所示，连有OsENHANCER1的OsENHANCER1 reporter质粒中能观察到明显的GFP荧光信号。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种水稻增强子及鉴定方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 662

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

ggtttcgagg aaaaggggtt atacacgtgg tgatactcac ttgacggtgc tgttattttc 60

ggatggattt gagttttatg aaactcaaca ggcattagcc aaaggtcctt gtcactgagt 120

aagtgggtat actttgagga acagtgtatg ctaaacaaat gtgttttgat ttggacttgt 180

gtagttgtgt tgagtgaaat cttccatgta ttttcatctg tttgttcgac acggttgagt 240

gcacgactac acgagtgacg tgagtctgat agctccagtg accaagcgcg taaacgtgac 300

ataaaatgca caaatgggaa gtctttgctt gtactttctt ccatctaaga gcatctccaa 360

cagtctcctt atccccttct ctaagttaaa ttttggcaat tttgattcaa tttcaccctc 420

caacagactg gctatcgggc tggccaagcc atccggctgg ccaaagtcct ccttccacta 480

gccaaatttg gccaaccaaa atagcctagc caatcgtggg ccccacgccg acagcatccc 540

tcttcccttt ctctctccgc caaccatcgt cgtcgagatg ccatcgctgg tgctgtcgag 600

gctgtcgttg ccggaagccg ccgtcgccag ccgtcgtcgc accgtcgtca gatccgctgt 660

tc 662

<210> 2

<211> 10427

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

ctagaatggc tcctaagaag aagagaaagg ttataacaat ggtgagcaag ggcgaggagc 60

tgttcaccgg ggtggttccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt 120

tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca 180

tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ttcggctacg 240

gcctgcagtg cttcgcccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg 300

ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca 360

agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg 420

gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca 480

gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga 540

tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc 600

ccatcggcga tggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagctac cagtccgccc 660

tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg 720

ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtgact cgagctacgg agaccttata 780

ttccccagaa catcaggtta atggcgtttt tgatgtcatt ttcgcggtgg ctgagatcag 840

ccacttcttc cccgataacg gaaaccggca cactggccat atcggtggtc atcatgcgcc 900

agctttcatc cccgatatgc accaccgggt aaagttcacg ggagacttta tctgacagca 960

gacgtgcact ggccaggggg atcaccatcc gtcgcccggg cgtgtcaata atatcactct 1020

gtacatccac aaacagacga taacggctct ctcttttata ggtgtaaacc ttaaactgca 1080

tttcaccagc ccctgttctc gtcagcaaaa gagccgttca tttcaataaa ccgggcgacc 1140

tcagccatcc cttcctgatt ttccgctttc cagcgttcgg cacgcagacg acgggcttca 1200

ttctgcatgg ttgtgcttac cagaccggag atattgacat catatatgcc ttgagcaact 1260

gatagctgtc gctgtcaact gtcactgtaa tacgctgctt catagcatac ctctttttga 1320

catacttcgg gtatacatat cagtatatat tcttataccg caaaaatcag cgcgcaaata 1380

cgcatactgt tatctggctt ggtctcagga tatatgaaga tgaagatgaa atatttggtg 1440

tgtcaaataa aaagcttgtg tgcttaagtt tgtgtttttt tcttggcttg ttgtgttatg 1500

aatttgtggc tttttctaat attaaatgaa tgtaagatca cattataatg aataaacaaa 1560

tgtttctata atccattgtg aatgttttgt tggatctctt ctgcagcata taactactgt 1620

atgtgctatg gtatggacta tggaatatga ttaaagataa ggagctcaaa ctatcagtgt 1680

ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag cgtttattag aataacggat 1740

atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca 1800

gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg 1860

cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac 1920

gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat 1980

aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc 2040

tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag gacttgacca accaacgggc 2100

cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg 2160

cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt 2220

gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat 2280

ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc 2340

ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat 2400

catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc 2460

ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg 2520

ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc 2580

acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga 2640

ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca 2700

agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag 2760

gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg cgcacggctc aaccgtgcgg 2820

ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg 2880

gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc 2940

ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg 3000

aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg 3060

caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg 3120

atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg 3180

tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg 3240

tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg 3300

acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat atgggccacc gccgacctgg 3360

tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg 3420

tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt 3480

acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg 3540

ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg 3600

cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag 3660

caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac 3720

gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga 3780

ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct 3840

atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa 3900

ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg 3960

aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc 4020

ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc ggcgtgacgg tcgcaaacca 4080

tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc 4140

gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa 4200

gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg 4260

attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat gctctatgac 4320

gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt 4380

gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc 4440

gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc 4500

catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg 4560

ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag 4620

aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt 4680

acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc cttgattagc 4740

cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat cgagctagct 4800

gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc 4860

gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc 4920

gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc 4980

ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg 5040

gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc 5100

aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa 5160

attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa ggcctctttc ctgtggatag cacgtacatt 5220

gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac 5280

attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc 5340

gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg 5400

tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc 5460

ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc 5520

ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg 5580

cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 5640

catgcagctc ccggaaacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 5700

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 5760

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 5820

gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 5880

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 5940

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 6000

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 6060

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 6120

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 6180

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 6240

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 6300

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 6360

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 6420

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 6480

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 6540

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 6600

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 6660

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 6720

ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc 6780

tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg 6840

atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg 6900

cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct 6960

cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca 7020

tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg 7080

gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta 7140

tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg 7200

ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc 7260

tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca 7320

ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc 7380

cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta 7440

tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt 7500

tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac 7560

agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc 7620

ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg 7680

cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc 7740

tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg 7800

cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac 7860

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gtggcttttt ctaatattaa atgaatgtaa gatcacatta taatgaataa acaaatgttt 1620

ctataatcca ttgtgaatgt tttgttggat ctcttctgca gcatataact actgtatgtg 1680

ctatggtatg gactatggaa tatgattaaa gataaggagc tcaaactatc agtgtttgac 1740

aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa cggatattta 1800

aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt 1860

cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca gtcggcttct 1920

gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa gttacgcgac 1980

aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt cgcataaagt 2040

agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc gccgctggcc 2100

tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa cgggccgaac 2160

tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc aggcgcgacc 2220

gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg acagtgacca 2280

ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga cattgccgag cgcatccagg 2340

aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc acgccggccg 2400

gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg 2460

accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt ggcccccgcc 2520

ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca 2580

ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac cgcgcacttg 2640

agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg 2700

cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat 2760

gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga tcgaggcgga 2820

gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac ggctcaaccg tgcggctgca 2880

tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc tggccggcca gcttggccgc 2940

tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa acagcttgcg 3000

tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca aggggaacgc 3060

atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc 3120

catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga ttccgatccc 3180

cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc 3240

atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga cttcgtagtg 3300

atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc agccgacttc 3360

gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg ccaccgccga cctggtggag 3420

ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg 3480

cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag 3540

ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc 3600

ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg 3660

gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa 3720

gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct gcaacgttgg 3780

ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg gcggaggatc 3840

acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag ctgctatctg 3900

aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta 3960

gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc 4020

cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc 4080

tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt gacggtcgca aaccatccgg 4140

cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga aggccgcgca 4200

ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt ggcaagcggc 4260

cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca gccggtgcgc cgtcgattag 4320

gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg 4380

cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg 4440

acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg cacgtagagg tttccgcagg 4500

gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg tttcccatct 4560

aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc gcgtgttccg 4620

tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga 4680

cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc agcgtacgaa 4740

gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga ttagccgcta 4800

caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc tagctgattg 4860

gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc accccgatta 4920

ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc gcgccgcagg 4980

caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca gcgccggaga 5040

gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc tgccggagta 5100

cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct 5160

gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc 5220

cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggcct ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa 5280

cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg 5340

gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta 5400

aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat aactgtctgg 5460

ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg 5520

ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg 5580

gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgccc 5640

acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc 5700

agctcccgga aacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc 5760

agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg 5820

atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca 5880

ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc 5940

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 6000

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 6060

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 6120

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 6180

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 6240

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 6300

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 6360

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 6420

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 6480

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 6540

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 6600

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 6660

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 6720

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 6780

catgcattct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata taatatttta ttttctccca 6840

atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc 6900

ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct 6960

cccaagatca ataaagccac ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag 7020

gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag 7080

ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag 7140

atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg tctaagctat tcgtataggg 7200

acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca gctcgataat 7260

cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact 7320

catgagcaga ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag 7380

ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt 7440

ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt tctcccacca gcttatatac 7500

cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt 7560

caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc cttcctcttt tctacagtat 7620

ttaaagatac cccaagaagc taattataac aagacgaact ccaattcact gttccttgca 7680

ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat 7740

aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt 7800

catcgttaca atcaacatgc taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct 7860

tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg 7920

ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc 7980

cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca 8040

aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattaacg 8100

ccgaattaat tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg aattagaaat 8160

tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt atatgctcaa 8220

cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac tcacacatta 8280

ttatggagaa aatagagctt gtcgatcgtt aattaatcac ctccaagatc ccggacgagt 8340

gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc 8400

cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc 8460

gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata 8520

gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc ctgcaagctc 8580

cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca 8640

gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat 8700

gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac 8760

gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc 8820

gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc 8880

aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg 8940

gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac 9000

cggctgcaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc 9060

acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc gctgaattcc ccaatgtcaa gcacttccgg 9120

aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc 9180

ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg 9240

agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag gtcggacacg ctgtcgaact tttcgatcag 9300

aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc atcctaggag agatagattt 9360

gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 9420

gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 9480

cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 9540

tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct 9600

ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact gtccttttga 9660

tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt 9720

gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga 9780

cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg 9840

gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt 9900

cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc 9960

caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga 10020

ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga 10080

ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg 10130

Claims (6)

1.一种水稻增强子，其特征在于：基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 根据权利要求1所述的水稻增强子，其特征在于：所述水稻增强子来源于禾本科稻属粳稻日本晴Oryza sativa L. spp. Japonica var. Nipponbare，具体用引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到662bp的扩增产物。

3.根据权利要求2所述的水稻增强子，其特征在于：所述引物序列如下：

正向: 5’-gtacaagtgactcgagctacggtttcgaggaaaaggggtt-3’

反向R: 5’-atcttcatcttcatatatccgaacagcggatctgacgacg-3’ 。

4.权利要求1所述的水稻增强子的鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）通过生物信息学分析，结合本实验室水稻DNaseI数据对日本晴基因组进行预测，获得增强子OsENHANCER1，其序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）将OsENHANCER1，其序列如SEQ ID NO.1所示，扩增后插入mini35s-GFP reporter，其序列如SEQ ID NO.4所示，构建OsENHANCER1 reporter载体；

（3）构建正对照载体CaMV35S-GFP reporter，其序列如SEQ ID NO.2所示，和负对照载体Enhancerless reporter，其序列如SEQ ID NO.3所示；

（4）水稻原生质体的制备与转化；

（5）转化后对OsENHANCER1的活性进行验证。

5.根据权利要求4所述的水稻增强子的鉴定方法，其特征在于：所述步骤（3）中正对照载体构建方法为：以P1300LV载体为模板，扩增CaMV35S启动子；使用限制性内切酶AscI和XbaI将mini35s-GFP reporter载体线性化，用无缝连接试剂盒将上述2个片段快速连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，得到正对照载体CaMV35S-GFP reporter，其序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求4所述的水稻增强子的鉴定方法，其特征在于：所述步骤（3）中负对照载体构建方法为：使用限制性内切酶BsaI将mini35s-GFP reporter载体线性化，将一段无功能序列插入线性化载体，连接后转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，得到负对照载体Enhancerless reporter ，其序列如SEQ ID NO.3所示。

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