CN101040049B - 胁迫抗性植物 - Google Patents

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Abstract

通过使用编码参与NAD补救合成途径和/或NAD从头合成途径的酶的核苷酸序列(如在植物中过表达)使植物和植物细胞获得胁迫耐受性。

Description

胁迫抗性植物
技术领域
(本发明)通过在植物中表达参与NAD补救合成途径或NAD从头合成途径中的酶,提供了增加植物或植物细胞胁迫抗性的方法。
技术背景
考虑到对最终增加作物植物的实际产率的永无止境的需求,对不利生长条件的耐受性是这些作物非常理想的特性,所述不利生长条件包括干旱、高光照强度、高温、营养限制、盐生长条件等等。
达到提高通常称为植物胁迫抗性或胁迫耐受性目的的多种方法已有描述。由于不同的非生物胁迫条件经常导致产生有害的活性氧(ROS)),如超氧化物或过氧化氢,因此,提高植物耐受性的初期尝试集中在阻止产生ROS或将其除去。这些方法的实施例是过表达ROS清除酶,如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等,或者甚至增加ROS清除分子,如抗坏血酸、谷胱甘肽等的量。产生胁迫耐受性植物的这些方法和其它尝试综述于,如wang等人,2003,Planta 218:1-14。
如WO00/04173和PCT/EP2004/003995中分别描述的,植物细胞和植物的胁迫耐受性也可以通过减少内源聚ADP核糖聚合酶(ParP)或聚(ADP-核糖)糖苷水解酶(ParG)的活性或水平而实现。一般认为,在这种方法中,遭受胁迫条件的植物细胞中,导致创伤性细胞死亡的致死的NAD和ATP衰竭可以被避免或充分地推迟,以使受胁迫的细胞存活并适应胁迫条件。
Uchimiya等人(2002)描述了命名为YK1的稻基因的分离,以及嵌合YK1基因增加含有这种基因的转基因稻类植物对稻瘟病和几种非生物胁迫(如NaCl、UV-C、浸没和过氧化氢)耐受性的用途(Uchimiya等人.,2002,molecular breeding 9:25-31)。
Uchimiya等人还发表一篇会议摘要,描述的是在稻细胞中过表达NAD依赖性还原酶基因(YK1)还通过上调NAD合成酶的活性提高NAD(P)(H)的水平,并且推断这种改变能依次产生ROS胁迫抗性所需要的氧化还原物质库(Uchimiya等人.2003Keystone symposium on Plantbiology:Functions and control of cell death,Snowbird Utah April 10-15,2003).
酵母中的NAD合成酶已经得到很好的表征,而且它是NAD从头合成途径以及NAD补救途径中最后的一个酶(见图1)。在从头合成途径中,喹啉(quinolate)是合成NAD的前体,并且是作为色氨酸降解产物产生。在补救途径中,烟酰胺是前体分子,其为通过多种酶(如PARP、NAD依赖的脱乙酰酶或其它NAD糖苷水解酶)作用产生的NAD的降解产物。在第一步中,烟酰胺由烟酰胺酶脱去酰胺基变成烟酸。烟酸在烟酸酯磷酸核糖基转移酶的作用下转移到5-磷酸核糖基-1-焦磷酸上产生烟酸单核苷酸。这一化合物是NAD从头合成途径和补救合成途径共同拥有的。因此,在从头合成途径中通过NAD+焦磷酸化酶和NAD合成酶完成这一化合物的进一步转化。
在酵母中,已经将过表达PNC1(编码烟酰胺酶)通过卡路里限制和低强度胁迫与生命期延长相关联(Anderson等人,2003 Nature 423:p181-185;Gallo等人,2004,Molecular and Cellular Biology 24:1301-1312).
对植物中NAD生物合成途径中的各个酶所知甚少。Hunt等人2004年描述了使用可获得的拟南芥基因组信息鉴定这些酶的植物同源物(Hunt等人,2004,New Phytologist 163(1):31-44)。已经识别的DNA序列有以下的登录号:烟酰胺酶:At5g23220、At5g23230和At3g16190;烟酸酯磷酸核糖基转移酶:At4g36940、At2g23420;烟酸单核苷酸腺苷转移酶:At5g55810以及NAD合成酶:At1g55090(所有的核苷酸序列在此引用作为参考)。
依然需要能增加植物胁迫抗性的备选方法,下面描述的实施方案,包括权利要求,提供了这样的方法和手段。
发明概述
在本发明的一个实施方案中,提供了获得具有增加的胁迫抗性植物的方法,所述方法包括将嵌合基因引入植物细胞中获得转基因细胞,所述嵌合基因包括以下有效连接的DNA片段:
i.可在植物中表达的启动子;
ii.编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中植物功能酶的DNA区,所述酶选自烟酰胺酶、烟酸酯磷酸核糖基转移酶,烟酸单核苷酸腺苷转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶;
iii.参与转录终止和多聚腺苷化作用的3’末端区。
随后,由转基因植物细胞再生获得转基因植物群;并从转基因植物群选择比类似的非转基因植物表现出增加的胁迫抗性的植物,或在胁迫条件下表现出降低水平活性氧的植物或维持高水平NADH的植物。DNA区可以编码含有选自SEQ ID No.:2、SEQ ID No.:4、SEQ ID No.:6、SEQ IDNo.:8、SEQ ID No.:10、SEQ ID No.:12、SEQ ID No.:14、SEQ ID No.:16、SEQ ID No.:18、SEQ ID No.:20、SEQ ID No.:22、SEQ ID No.:24氨基酸序列的蛋白质;或编码具有约60%序列同一性并且具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的酶活性的蛋白质,如核苷酸序列SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:3、SEQ ID No.:5、SEQ ID No.:7、SEQ ID No.:9、SEQ IDNo.:11、SEQ ID No.:13、SEQ ID No.:15、SEQ ID No.:17、SEQ ID No.:19、SEQ ID No.:21、或SEQ ID No.:23。
在另一实施方案中,本发明涉及这里所述的嵌合基因、包含这些嵌合基因的植物细胞、基本上由含有这些嵌合基因的植物细胞组成的植物以及这样的植物的种子。这些植物和植物细胞的特征在于其在胁迫条件下比类似的不包含这样的嵌合基因的植物拥有更低水平的活性氧。
而在另一个实施方案中,本发明涉及使用所述的嵌合基因以增加植物的胁迫抗性,或减少在胁迫条件下植物或植物细胞中活性氧的水平。
本发明还提供编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶的DNA序列的用途(所述酶选自烟酰胺酶、烟酸酯磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶),例如编码含有选自SEQ ID No.:2、SEQ ID No.:4、SEQ ID No.:6、SEQ ID No.:8、SEQID No.:10、SEQ ID No.:12、SEQ ID No.:14、SEQ ID No.:16、SEQ IDNo.:18、SEQ ID No.:20、SEQ ID No.:22、SEQ ID No.:24氨基酸序列的蛋白质的DNA序列,或编码具有约60%序列同一性并且具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中酶活性的蛋白质的DNA序列,包括含有选自SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:3、SEQ ID No.:5、SEQ ID No.:7、SEQ ID No.:9、SEQ ID No.:11、SEQ ID No.:13、SEQ ID No.:15、SEQ ID No.:17、SEQ IDNo.:19、SEQ ID No.:21、或SEQ ID No.:23核苷酸序列的DNA序列,所述用途为在胁迫条件下增加植物胁迫抗性,或减少活性氧水平,或维持植物或植物细胞中的NADH水平。
附图简述
图1是面包酵母(酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))中公知的NAD补救合成途径和NAD从头合成途径的图示。
图2-11是多种T-DNA载体的图示,这些T-DNA载体包含可在植物中表达的控制元件的控制下编码NAD补救合成途径或NAD从头合成途径中的酶的DNA区。使用的缩写为:RB:T-DNA右边界;3’35S:来自花椰菜花叶病毒35S转录物的转录终止和多聚腺苷酸化作用信号;Cab22L:Cab22L转录物的非翻译前导序列;P35S2:花椰菜花叶病毒35S启动子;3’g7:来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA基因7的转录终止和聚腺甘酸信号;bar:膦丝菌素乙酰转移酶编码区;pSSUAra:来自拟南芥的核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基转录物的启动子;LB:T-DNA左边界;Sm/Sp:壮观霉素和链霉素抗性基因;pVS1ori:适合在农杆菌中复制的VS1起始点;ColE1:复制起点;NLS:核定位信号;PNC1:编码酿酒酵母烟酰胺酶的DNA区;npt1:酿酒酵母烟酸酯磷酸核糖基转移酶;nma1:酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶1;nma2:酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶2;qns1:酿酒酵母NAD合成酶(QNS1)。
发明详述
本发明是基于这样的发现,即可以使用编码酵母NAD补救途径中的植物功能酶的DNA序列获得转基因植物,所述转基因植物比不包含这些DNA序列的植物对胁迫特别是对非生物胁迫的抗性更强。与对照植物相比,转基因植物在胁迫条件下也表现出活性氧(ROS)水平显著降低和维持高水平的NADH。
因此在本发明的一个实施方案中,提供了获得具有增加的胁迫抗性的植物的方法,所述方法包括步骤:
-将如这里描述的胁迫抗性嵌合基因引入植物细胞中以获得含有这种胁迫抗性嵌合基因的细胞;
-再生这些含有胁迫抗性嵌合基因的细胞以获得含有胁迫抗性嵌合基因的植物群,和
-从这些植物群中选择植物,所述植物与类似的非转基因植物相比在胁迫条件下表现出增加的胁迫抗性和/或减少的ROS水平和/或维持高水平的NADH。
因此所述胁迫抗性嵌合基因包含有效连接到DNA区的可在植物中表达的启动子和参与转录终止和聚腺甘酸化的3’区,所述DNA区编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶,所述酶选自烟酰胺酶、烟酸酯磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
在这里使用“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的植物功能酶”是指当连接到适当的控制元件(如可在植物中表达的启动子和终止子区)并将其引入到植物中时,能被转录和翻译产生在植物细胞中有功能的NAD补救合成途径中的酶。所包括的NAD补救合成途径中的酶(和编码基因)不仅从植物来源中获得,还从酵母(酿酒酵母)或其他酵母或真菌中获得。认为后一种来源的蛋白质甚至更适用于本发明的方法,因为这些蛋白质较少可能受到酶反馈调节等,而相似的植物来源的酶则容易受酶的反馈调节。
参与NAD补救合成途径的酶包括如下:
-烟酰胺酶(EC 3.5.1.19)催化烟酰胺上的酰胺基团水解,从而释放出烟酸和NH3。该酶又称为烟酰胺脱氨酶、烟酰胺酰胺酶、YNDase或烟酰胺酰胺水解酶。
-烟酸酯磷酸核糖基转移酶(EC 2.4.2.11)又称为烟酸核苷酸酶、烟酸单核苷酸糖苷水解酶、烟酸单核苷酸焦磷酸化酶、烟酸磷酸核糖基转移酶,其催化下面的反应:
烟酸酯-D-核苷酸+二磷酸=烟酸酯+5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸。
-烟酸酯-核苷酸腺苷转移酶(EC 2.7.7.18)又称为脱酰胺NAD+焦磷酸化酶、烟酸酯单核苷酸腺苷转移酶、脱酰胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸化酶、NaMT-ATase、烟酸单核苷酸腺苷转移酶,其催化下面的反应:
ATP+烟酸酯核苷酸=二磷酸+脱酰胺NAD+
NAD合酶(EC 6.3.1.5)又称为NAD合成酶、NAD+合酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶、二磷酸吡啶核苷酸合成酶,其催化下面的反应:
脱酰胺NAD++ATP+NH3=AMP+二磷酸+NAD+
在本发明的一个实施方案中,编码NAD补救合成途径中不同的酶的编码区包含一段核苷酸序列,例如,SEQ ID No 1、SEQ ID No 3、SEQ IDNo 5、SEQ ID No 7或SEQ ID No 9的核苷酸序列,所述核苷酸序列编码蛋白质具有的氨基酸序列如SEQ ID No 2、SEQ ID No 4、SEQ ID No 6、SEQ ID No 8或SEQ ID No 10所列。
但是,应该明确的是,也可以使用这些核苷酸序列的变体,包括其插入、缺失和取代,达到同样的效果。同样地,可以使用来自除了酿酒酵母外其他物种的所提到的核苷酸序列的同源物。这些核苷酸序列包括但不限于植物来源的核苷酸序列,编码具有相同氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列,以及这些核苷酸序列的变体。后者的实例是编码带有SEQ ID No 12、14、16、18、20、22或24中列出的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列,例如SEQ ID No 11、13、15、17、19、21或23的核苷酸序列。
所述核苷酸序列的变体与鉴定的编码NAD补救合成途径中酶的核苷酸序列(如序列表中鉴定的那些)具有序列同一性,其优选至少为约80%,或85%、或90%或95%。优选地,这些变体能编码与NAD补救途径中的酶具有相同酶活性的有功能的蛋白质。为了本发明的目的,用百分比表示的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”指两个最佳比对序列中相同残基位置的数目(x100)除以所有比较残基位置的数目。空位即比对中残基在一个序列中存在而在另一个序列中没有的位置,被认为是没有相同残基的位置。两个序列的比对用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)执行。上述计算机辅助的序列比对可以用标准软件程序如GAP方便地执行,所述GAP为Wisconsin Package Version 10.1(GeneticsComputer Group,Madision,Wisconsin,USA)的部分,使用带有空位产生罚分为50和空位延伸罚分为3的缺省得分矩阵。
如Hunt等人所述(见上),可以通过基因组数据芯片(in silico)分析鉴定编码来自酵母NAD补救途径的酶的核苷酸序列或编码来自酵母之外生物体的酶的核苷酸序列的同源核苷酸序列。
同源核苷酸序列也可以使用编码NAD补救合成途径中酶的鉴定的核苷酸序列(如在序列表中鉴定的核苷酸序列)作为探针,在严格条件下通过杂交得以鉴定和分离。
如这里所用“严格杂交条件”意指杂交通常发生在探针和目标序列之间的同一性至少为95%,并优选至少97%时。严格杂交条件的实例是在含有50%甲醛、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt杂交溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的载体DNA(如鲑鱼精子DNA)的溶液中孵育过夜,然后用0.1×SSC在大约65℃洗涤杂交支持物,优选洗两次每次约10分钟。其他的杂交和洗涤条件是众所周知的,并且示例于Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,NY(1989),特别是第11章。
这些变体序列也可以通过DNA扩增技术获得,其中使用对于编码NAD补救途径中的酶的基因具有特异性的寡核苷酸作为引物,例如但不限于包含约20至约50个连续核苷酸的寡核苷酸,所述连续核苷酸选自SEQID No 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸序列或它们的互补序列。
可以使用本发明的方法获得耐受不同种类胁迫诱导条件特别是非生物胁迫条件的植物,所述非生物胁迫条件包括浸没、高光照条件、高UV辐射水平、增加的过氧化氢水平、干旱条件、高温或低温、增加的盐度条件。本发明的方法也可以用来降低生长在不利条件下特别是非生物胁迫条件下的植物细胞中ROS的水平,所述非生物胁迫条件包括浸没、高光照条件、高UV辐射水平、增加的过氧化氢水平、干旱条件、高温或低温、增加的盐度条件等。可以用在本领域内公知的方法(包括在实施例3中所述的方法)测定ROS水平或NADH水平。
使用这里所述方法可以获得植物,其中在非胁迫条件下(例如但不限于低光照条件下)其ROS的水平等于或低于对照植物。在非胁迫条件下,这些植物中的ROS水平可以是在低光照条件下对照植物水平的50%至100%,尤其在约60%至约85%之间。在胁迫条件下,这些植物中的ROS水平是胁迫条件下对照植物的ROS水平的大约50%-80%,相当于非胁迫条件下对照植物中的ROS水平的大约60%-80%。同样地,在非胁迫条件下,例如但不限于低光照条件下,这些植物的NADH水平等于或高于对照植物中的水平。在非胁迫条件下,这些植物中的NADH水平是在低光照条件下的对照植物中NADH水平的100%-160%之间,尤其在大约120%至大约140%之间。在胁迫条件下这些植物中的NADH水平是胁迫条件下对照植物中NADH水平的大约200%-300%,相当于非胁迫条件下对照植物中ROS水平的大约100%-160%。
获得转基因植物的方法不是本发明的关键,任何转化方法和适合具体植物物种的再生方法都可以使用。这些方法是本领域内众所周知的,其包括农杆菌介导的转化、基因枪递送、显微注射、完整细胞的电穿孔、聚乙二醇介导的原生质体转化、原生质体电穿孔、脂质体介导的转化、硅须介导的转化(silicon-whiskers mediated transformation)等。然后,用这种方式得到的转化细胞可以再生为成熟的有繁殖能力的植物。
获得的转化植物可以用于传统的育种方案以产生更多的具有相同特征的转化植物,或将本发明的嵌合基因引入相同或相关植物物种的其它品种或杂交植物中。从转化植物中得到的种子含有作为稳定的基因组插入片段的本发明的嵌合基因,并且也被包含在本发明中。
很清楚,这里描述的不同胁迫抗性嵌合基因含有编码NAD补救途径中不同酶的DNA区域,这些嵌合基因可以在一个植物细胞或植物中组合以进一步提高含有所述嵌合基因的植物的胁迫耐受性。因此,在本发明的一个实施方案中,提供的植物细胞和植物含有至少两个胁迫抗性嵌合基因,每一嵌合基因含有不同的编码区。
根据本发明的转基因植物细胞和植物系还可以含有能减少如WO00/04173和PCT/EP2004/003995所述的内源PARP和/或PARG基因表达的嵌合基因。可以例如通过将本发明的转基因植物系与含有使PARP和/或PARG基因表达减少的嵌合基因的转基因植物杂交引入更多的嵌合基因。也可以通过将本发明的嵌合基因引入或转化到含有使PARP或PARG基因表达减少的嵌合基因的转基因植物细胞获得转基因植物细胞或植物系,反之亦然。
为了本发明的目的,启动子是可在植物中表达的启动子。这里所用术语“可在植物中表达的启动子”意指能在植物细胞中控制(起始)转录的DNA序列。这包括植物起源的任何启动子,也包括非植物起源的但能在植物细胞中指导转录的任何启动子,即病毒或细菌起源的某些启动子,如CaMV35S(Harpster等人,1988 Mol.Gen.Genet.212,182-190)、地下三叶草病毒启动子No 4或No 7(WO9606932)、或T-DNA基因启动子,还包括组织特异性或器官特异性启动子,其包括但不限于种子特异性启动子(例如WO89/03887)、器官原基特异性启动子(An等人,1996,The Plant Cell 8,15-30)、茎特异性启动子(Keller等人,1988,EMBO J.7,3625-3633)、叶特异性启动子(Hudspeth等人,1989,Plant Mol Biol 12,579-589)、叶肉特异性启动子(如光诱导的核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶启动子)、根特异性启动子(Keller等人,1989,Genes Devel.3,1639-1646)、块茎特异性启动子(Keil等人,1989,EMBO J.8,1323-1330)、维管组织特异性启动子(Peleman等人,1989,Gene 84,359-369)、雄蕊选择性启动子(WO 89/10396、WO 92/13956)、裂开区特异性启动子(WO 97/13865)等等。
本发明的嵌合基因也可以装备在植物中有功能的核定位信号(“NLS”),如SV40NLS,所述NLS有效地连接到编码NAD补救途径中的酶的DNA区。
读到这篇文献,本领域的技术人员将会立即认识到,只要获得其中编码NAD补救途径中的酶的内源基因更加活跃或以更高水平表达的植物的天然变体可以获得增加胁迫抗性的类似效果。这样的变体植物可以这样得到:对植物群进行诱变,例如但不限于EMS诱变,然后再筛选NAD补救途径中任何一个酶或其组合的活性增加的植物。
同样立即显而易见的是,可以筛选对前面提到的一般性胁迫条件(特别是非生物胁迫条件)增加耐受性的很多不同的品种或栽培种,然后将对胁迫条件增加的耐受性与存在编码NAD补救途径中酶的任何内源基因的特定等位基因相关联。如果这些物种是性亲和的,可以通过杂交将这样的等位基因引入目的植物中;或者使用这里描述的常规方法(包括杂交技术或PCR扩增技术)对其鉴定并用重组DNA技术引入植物中。用育种技术引入特别期望的等位基因后可以接着用目的等位基因特异性的分子标记检测。
认为这里描述的方法和手段适合所有植物细胞和植物,同时包括双子叶和单子叶植物细胞,并且植物包括但不限于棉花、芸苔属植物、油料种子油菜、小麦、谷物或玉米、大麦、向日葵、稻、燕麦、甘蔗、大豆、蔬菜(包括菊苣、莴苣、番茄)、烟草、马铃薯、甜菜、木瓜、菠萝、芒果、拟南芥,也包括在园艺、花卉或林业中使用的植物。
在这里使用的“包含”应阐释为说明陈述特征、整体、步骤或成分的存在,但是并不排除存在或增加一种或多种特征、整体、步骤或成分,或它们组成的组。因此,例如,包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以比实际引述的核酸或蛋白质包含更多的核苷酸或氨基酸,即所述实际引述的核酸或蛋白质包含在更大的核酸和蛋白质中。含有确定结构或功能的DNA区的嵌合基因可以包含额外的DNA区等。
具体实施方式
以下非限制性实施例描述了能增加植物细胞和植物胁迫抗性的嵌合基因的构建和这些基因的使用。
除非在实施例中另有说明,所有重组DNA技术都是根据在Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY和Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA第1、2卷中描述的标准方案实施。植物分子工作的标准材料和方法于R.D.D.Croy编著的由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications,UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中得到描述。标准分子生物学技术的其它参考书包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,Brown所著卷I和II(1998)Molecular BiologyLabFax,第二版,Academic Press(UK)。聚合酶链式反应的标准材料和方法见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,以及McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第一版,Springer Verlag,Germany。
在所有的描述和实施例中,参考下面的序列:
SEQ ID No.1:酿酒酵母烟酰胺酶(PNC1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.2:酿酒酵母烟酰胺酶(PNC1)的氨基酸序列。
SEQ ID No.3:酿酒酵母烟酸酯磷酸核糖基转移酶(NPT1)的核苷酸序列(互补)。
SEQ ID No.4:酿酒酵母烟酸酯磷酸核糖基转移酶(NPT1)的氨基酸序列。
SEQ ID No.5:酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶1(NMA1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.6:酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶1(NMA1)的氨基酸序列。
SEQ ID No.7:酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶2(NMA2)的核苷酸序列。
SEQ ID No.8:酿酒酵母的烟酸单核苷酸腺苷转移酶2(NMA2)的氨基酸序列。
SEQ ID No.9:酿酒酵母NAD合成酶(QNS1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.10:酿酒酵母NAD合成酶(QNS1)的氨基酸序列。
SEQ ID No.11:拟南芥烟酰胺酶(同工型1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.12:拟南芥烟酰胺酶(同工型1)的氨基酸序列。
SEQ ID No.13:拟南芥烟酰胺酶(同工型2)的核苷酸序列。
SEQ ID No.14:拟南芥烟酰胺酶(同工型2)的氨基酸序列。
SEQ ID No.15:拟南芥烟酰胺酶(同工型3)的核苷酸序列。
SEQ ID No.16:拟南芥烟酰胺酶(同工型3)的氨基酸序列。
SEQ ID No.17:拟南芥烟酸酯磷酸核糖基转移酶(同工型1)的核苷酸序列。
SEQ ID No.18:拟南芥烟酸酯磷酸核糖基转移酶(同工型1)的氨基酸序列。
SEQ ID No.19:拟南芥烟酸酯磷酸核糖基转移酶(同工型2)的核苷酸序列。
SEQ ID No.20:拟南芥烟酸酯磷酸核糖基转移酶(同工型2)的氨基酸序列。
SEQ ID No.21:拟南芥烟酸单核苷酸腺苷转移酶的核苷酸序列。
SEQ ID No.22:拟南芥烟酸单核苷酸腺苷转移酶的氨基酸序列。
SEQ ID No.23:拟南芥NAD合成酶的核苷酸序列。
SEQ ID No.24:拟南芥NAD合成酶的氨基酸序列。
SEQ ID No.25:T-DNA载体pTVE467的核苷酸序列。
SEQ ID No.26:T-DNA载体pTVE468的核苷酸序列。
SEQ ID No.27:T-DNA载体pTVE469的核苷酸序列。
SEQ ID No.28:T-DNA载体pTVE470的核苷酸序列。
SEQ ID No.29:T-DNA载体pTVE496的核苷酸序列。
SEQ ID No.30:T-DNA载体pTVE497的核苷酸序列。
SEQ ID No.31:T-DNA载体pTVE500的核苷酸序列。
SEQ ID No.32:T-DNA载体pTVE501的核苷酸序列。
SEQ ID No.33:T-DNA载体pTVE502的核苷酸序列。
SEQ ID No.34:T-DNA载体pTVE503的核苷酸序列。
实施例
实施例1:胁迫抗性基因的组装和引入到植物中。
pTVE467
为了增加植物的胁迫抗性,用常规技术构建的嵌合基因依次含有以下DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个碱基对的DNA片段;
-编码酿酒酵母烟酰胺酶的DNA片段(SEQ ID NO 1);
-来自花椰菜花叶病毒35S转录物的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
可以将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE467(SEQID 25)。T-DNA载体pTVE467如图2所示。
T-DNA载体pTVE467含有下列分子特征:
(C)表示互补链。
起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  1181   534(C) PNC1编码区
  1250   1191(C) cab22前导序列
  1781   1251(C) P35S2启动子
  2293   2082(C) 3′g7转录终止信号
  2866   2315(C) bar编码区
  4592   2867(C) PSSuAra启动子
  4760   4784 T-DNA左边界
  6352   5352(C) Sm/Sp抗性基因
  6875   10645 pVS1复制起点
  10646   11709 ColE1复制起点
pTVE468
构建与pTVE467中所示类似的嵌合基因,其中烟酰胺酶装备了标准核定位信号。因此,该嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个核苷酸的DNA片段;
-编码含有核定位信号的肽的约20个核苷酸的DNA片段;
-编码酿酒酵母烟酰胺酶的DNA片段(SEQ ID NO 1),由此将核定位信号融合在阅读框内;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
这一嵌合基因和能提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起被引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE468(SEQ ID26)。T-DNA载体pTVE468如图3所示。
T-DNA载体pTVE468包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
  起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  1169   534(C) PNC1编码区
  1187   1167(C) 核定位信号
  1268   1209(C) cab22前导序列
  1799   1269(C) P35S2启动子
  2311   2100(C) 3′g7转录终止信号
  2884   2333(C) bar编码区
  4610   2885(C) PSSuAra启动子
  4778   4802 T-DNA左边界
  6370   5370(C) Sm/Sp抗性基因
 6893   10663   pVS1复制起点
 10664   11727   ColE1复制起点
pTVE469
为了增加植物的胁迫抗性,用常规技术构建的嵌合基因依次含有以下DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个碱基对的DNA片段;
-编码酿酒酵母烟酸酯磷酸核糖基转移酶(NPT1;SEQ ID NO 3)的DNA片段;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
将这一嵌合基因和能提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE469(SEQ ID27)。T-DNA载体pTVE469如图4所示。
T-DNA载体pTVE469包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
  起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  1765   534(C) NPT1编码区
  1832   1773(C) cab22前导序列
  2363   1833(C) P35S2启动子
  2875   2664(C) 3′g7转录终止信号
  3448   2897(C) bar编码区
  5175   3449(C) PSSuAra启动子
  5342   5366 T-DNA左边界
  6934   5934(C) Sm/Sp抗性基因
 7457   11227   pVS1复制起点
 11228   12291   ColE1复制起点
pTVE470
构建与pTVE469所示类似的嵌合基因,其中酵母烟酸酯磷酸核糖基转移酶装备了标准核定位信号。因此,这个嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个核苷酸的DNA片段;
-编码含有核定位信号的肽的约20个核苷酸的DNA片段;
-编码酿酒酵母烟酸酯磷酸核糖基转移酶(NPT1;SEQ ID NO 3)的DNA片段,由此将核定位信号融合在阅读框内;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE470(SEQ ID28)。T-DNA载体pTVE470如图5所示。
T-DNA载体pTVE470包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
  起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  1787   534(C) NPT1编码区
  1775   1755(C) SV40核定位信号
  1853   1794(C) cab22前导序列
  2384   1854(C) P35S2启动子
  2896   2685(C) 3′g7转录终止信号
  3469   2918(C) bar编码区
 5195   3470(C)   PSSuAra启动子
 5363   5387   T-DNA左边界
 6955   5955(C)   Sm/Sp抗性基因
 7478   11248   pVS1复制起点
 11249   12312   ColE1复制起点
pTVE496
为了增加植物的胁迫抗性,用常规技术构建成的嵌合基因依次含有以下DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个碱基对的DNA片段;
-编码酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶(NMA1;SEQ ID NO 5)的DNA片段;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE496(SEQ ID29)。T-DNA载体pTVE496如图6所示。
T-DNA载体pTVE496包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
  起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  1739   534(C) NMA1编码区
  1805   1746(C) cab22前导序列
  2336   1806(C) P35S2启动子
  2848   2637(C) 3′g7转录终止信号
  3421   2870(C) bar编码区
 5147   3422(C)   PSSuAra启动子
 5315   5339   T-DNA左边界
 6907   5907(C)   Sm/Sp抗性基因
 7430   11200   pVS1复制起点
 11201   12264   ColE1复制起点
pTVE497
构建与pTVE496所示类似的嵌合基因,其中酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶装备了标准核定位信号。因此,这个嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个核苷酸的DNA片段;
-编码含有核定位信号的肽的约20个核苷酸的DNA片段;
-编码酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶(NMA1;SEQ ID NO 5)的DNA片段,由此将核定位信号融合在阅读框内;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE497(SEQ ID30)。T-DNA载体pTVE497如图7所示。
T-DNA载体pTVE497包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  1757   534(C) NMA1编码区
  1748   1731(C) SV40核定位信号
 1823   1764(C)  cab22前导序列
 2354   1824(C)  P35S2启动子
 2866   2655(C)  3′g7转录终止信号
 3439   2888(C)  bar编码区
 5165   3440(C)  PSSuAra启动子
 5333   5357  T-DNA左边界
 6925   5925(C)  Sm/Sp抗性基因
 7448   11218  pVS1复制起点
 11219   12282  ColE1复制起点
pTVE500
为了增加植物的胁迫抗性,用常规技术构建成的嵌合基因依次含有以下DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个碱基对的DNA片段;
-编码酿酒酵母中的烟酸单核苷酸腺苷转移酶2(NMA2;SEQ ID NO7)的DNA片段;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE500(SEQ ID31)。T-DNA载体pTVE500如图8所示。
T-DNA载体pTVE500包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
  起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  1721   534(C) NMA2编码区
 1787   1728(C)  cab22前导序列
 2318   1788(C)  P35S2启动子
 2830   2619(C)  3′g7转录终止信号
 3403   2852(C)  bar编码区
 5129   3404(C)  PSSuAra启动子
 5297   5321  T-DNA左边界
 6889   5889(C)  Sm/Sp抗性基因
 7412   11182  pVS1复制起点
 11183   12246  ColE1复制起点
pTVE501
构建与pTVE500所示类似的嵌合基因,其中酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶2装备了标准核定位信号。因此,这个嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个核苷酸的DNA片段;
-编码含有核定位信号的肽的约20个核苷酸的DNA片段;
-编码酿酒酵母烟酸单核苷酸腺苷转移酶2(NMA2;SEQ ID NO 7)的DNA片段,由此将核定位信号融合在阅读框内;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE501(SEQ ID32)。T-DNA载体pTVE501如图9所示。
T-DNA载体pTVE501包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
起始(nt)   终止(nt)
  198   222   RB:T-DNA右边界
 521   300(C) 3′35S:转录终止信号
 1739   534(C) NMA2编码区
 1733   1713(C) SV40核定位信号
 1805   1746(C) cab22前导序列
 2336   1806(C) P35S2启动子
 2848   2637(C) 3′g7转录终止信号
 3421   2870(C) bar编码区
 5165   3440(C) PSSuAra启动子
 5315   5339 T-DNA左边界
 6907   5907(C) Sm/Sp抗性基因
 7430   11200 pVS1复制起点
 11201   12264 ColE1复制起点
pTVE502
为了增加植物的胁迫抗性,用常规技术构建的嵌合基因依次含有以下DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个碱基对的DNA片段;
-编码酿酒酵母中的NAD合酶(QNS1;SEQ ID NO 9)的DNA片段;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE502(SEQ ID33)。T-DNA载体pTVE502如图10所示。
T-DNA载体pTVE502包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
  起始(nt)   终止(nt)
  198   222   RB:T-DNA右边界
 521   300(C) 3′35S:转录终止信号
 2678   534(C) QNS1编码区
 2744   2685(C) cab22前导序列
 3275   2745(C) P35S2启动子
 3787   3576(C) 3′g7转录终止信号
 4360   3809(C) bar编码区
 6086   4361(C) PSSuAra启动子
 6254   6278 T-DNA左边界
 7846   6846(C) Sm/Sp抗性基因
 8369   12139 pVS1复制起点
 12140   13203 ColE1复制起点
pTVE503
构建与pTVE502所示类似的嵌合基因,其中酿酒酵母中NAD合酶装备了标准核定位信号。因此,这个嵌合基因包含以下有效连接的DNA片段:
-来自花椰菜花叶病毒的启动子区域(CaMV35S);
-对应Cab22L非翻译前导序列的约60个核苷酸的DNA片段;
-编码含有核定位信号的肽的约20个核苷酸的DNA片段;
-编码酿酒酵母NAD合酶(QNS1;SEQ ID NO 9)的DNA片段,由此将核定位信号融合在阅读框内;
-来自花椰菜花叶病毒35S转录子的3’端非翻译末端的片段(3’35S)。
将这一嵌合基因和提供对除草剂膦丝菌素抗性的选择性标记基因一起引入到T-DNA载体的左边界和右边界序列之间,产生pTVE503(SEQ ID34)。T-DNA载体pTVE503如图11所示。
T-DNA载体pTVE503包含下列分子特征:
(C)表示互补链。
  起始(nt)   终止(nt)
  198   222 RB:T-DNA右边界
  521   300(C) 3′35S:转录终止信号
  2699   534(C) QNS1编码区
  2690   2670(C) SV40核定位信号
  2765   2706(C) cab22前导序列
  3296   2766(C) P35S2启动子
  3808   3597(C) 3′g7转录终止信号
  4381   3830(C) bar编码区
  6107   4382(C) PSSuAra启动子
  6275   6299 T-DNA左边界
  7867   6867(C) Sm/Sp抗性基因
  8390   12610 pVS1复制起点
  12161   13224 ColE1复制起点
用常规方法将T-DNA载体引入到含有辅助Ti质粒的农杆菌菌株中。用如本领域所述农杆菌介导的转化方法将嵌合基因引入到拟南芥植物中。
实施例2:对含有实施例1所述嵌合基因的转基因拟南芥系的分析
如在实施例1所述获得的表达酵母NAD补救途径基因的转基因拟南芥系(T1代)的种子在含有15mg/L膦丝菌素(PPT)的培养基上萌发并生长。拟南芥cv Col-0作为对照。
所有的植物都用高光照胁迫处理。将在每秒30μEinstein/m2生长的两周龄的植物转移到每秒250μEinstein/m2(高光照)中处理6小时;接着在黑暗中8小时后;再用高光照8小时。
这种处理后,检测所有植物系中的NADH含量和超氧化物自由基的含量,并与在低光照条件下转基因和对照植物系中相同化合物的测量相比较。结果概括于表1。
在高光照条件下转基因植物比对照植物表现出更高水平的NADH含量,并且在高光照条件下转基因植物比对照植物产生更少的活性氧。其中在装备或未装备核定位信号的编码NAD补救途径酶的构建体之间没有观察到差异。
还对转基因植物系对高光照胁迫条件的耐受性进行了表型计分。为此,将植物在体外低光照条件下(每秒30μEinstein/m2)生长两周而后转到高光照条件(每秒250μEinstein/m2;16小时光照-8小时黑暗)3天。在高光照处理后,将植物转回到低光照条件下,并在表型计分前再生长3天。
对照植物矮小,并且已经开始开花(胁迫诱导);而含有如实施例1中所述嵌合基因的转基因植物系则比对照植物高大并且仅开始抽薹(bolt)。
表1.过表达如实施例1所述嵌合酵母基因的转基因拟南芥系的高光照耐受性。
Figure G05832357720070328D000241
平均值的标准误差<10%
实施例3:NADH含量和超氧化物含量的检测方案
用水溶性四氮唑盐定量细胞内NAD(P)H
参考文献
Jun Nakamura,Shoji Asakura,Susan D.Hester,Gilbert de Murcia,Keith W.Caldecott和James A.Swenberg(2003)Quantitation ofintracellular NAD(P)H can monitor an imbalance of DNA single strandbreak repair in base excision repair deficient cells in real time.NucleicAcids Research 31(17),e104.
植物材料
最常用的植物材料
-体外生长14-18天但未开花的拟南芥芽
-油料种子油菜的下胚轴外植体
细胞计数试剂盒-8(CCK-8)
Sopachem n.v./比利时
72A,Avenue du Laarbeeklaan-1090Brussels
比利时
内含物:
5mL瓶中含有5mMol/L的WST-8(四氮唑盐)、0.2mMol/L的1-甲氧基PMS、150mMol/L NaCl
反应溶液:
-10ml 25mM磷酸钾缓冲液pH7.4
-0.5ml  CCK-8
-0.1mM 1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐(=1-甲氧基吩嗪硫酸二甲酯):1μL/mL的100mM储液(分子量=336.4;2.973ml水中溶100mg)
-1滴吐温20/25ml
操作
-收集植物材料并置于25mM的磷酸钾缓冲液(pH7.4)中。
如150个油料种子油菜的下胚轴外植体
1克拟南芥的芽(不带根)
-用反应溶液替换缓冲液
1克拟南芥苗加15ml
150个油料种子油菜下胚轴外植体加15ml
-在黑暗中于26℃孵育0.5小时(接着反应)
-在450nm测量反应溶液的吸光度
通过定量XTT的减少来测量超氧化物的产生
参考文献
De Block,M.,De Brouwer,D.(2002)A simple and robust in vitro assayto quantify the vigour of oilseed rape lines and hybrids.Plant Physiol.Biochem.40,845-852
A.欧洲油菜(BRASSICA NAPUS)
培养基和反应缓冲液
播种培养基(培养基201):
半浓缩的Murashige和Skoog盐
2%的蔗糖
pH 5.8
0.6%琼脂(Difco Bacto琼脂)
250mg/l triacillin
愈伤组织诱导培养基A2S3:
MS培养基、0.5g/l Mes(pH5.8)、3%蔗糖、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5%琼脂糖、1mg/l 2,4-D、0.25mg/l NAA、1mg/l BAP、250mg/ltriacillin。
反应缓冲液:
25mM磷酸钾缓冲液pH8,
1mM 3’-{1-[苯基氨-羰基]-3,4-四氮唑}-双(4-甲氧基-6-硝基)钠=XTT(BioVectra,Canada)(分子量674.53)
通过小心温热溶液(±37℃)溶解XTT(用前冷却到室温)
每25ml缓冲液中加1滴吐温20
种子消毒-种子预萌发-幼苗生长
种子在70%的乙醇中浸泡2分钟,然后用含有0.1%吐温20的次氯酸钠溶液(含有约6%的活性氯)表面消毒15分钟。最后,用1升无菌自来水冲洗种子。将种子在无菌自来水中孵育至少1小时(让可能抑制萌发的成分从种子扩散)。
将种子放在含有50毫升无菌自来水(+250mg/l triacillin)的250ml锥形瓶(erlenmeyer flask)中。摇动约20小时。
将长出根的种子从含有约125ml播种培养基的Duchefa(每个容器10粒种子,不要太多以减少由于污染带来的种子损失)放到实验室通风容器中。这些种子在±24℃和每天16小时光照(每秒10-
Figure G05832357720070328D000271
μEinstein/m2)条件下萌发。
附:为了计算,必须播种的种子数目:每个幼苗5个下胚轴片段下胚轴外植体的预培养和胁迫的诱导
-播种12-14天后,将下胚轴切为约7-10mm片段。
-下胚轴外植体(25个下胚轴/Optilux培养皿,Falcon S1005,丹麦)在A2S2培养基中在25℃(于每秒10-30μEinstein/m2)条件下培养5天。附:每个条件使用150个下胚轴外植体。
-胁迫诱导:
将下胚轴外植体转移到分别含有0、25和50mg/l乙酰水杨酸的A2S3培养基中。
在25℃和每天16小时光照(每秒10-30μEinstein/m2)的条件下孵育约24小时。
XTT测定
-将150个下胚轴外植体转移到50ml Falcon管中。
-用反应缓冲液(无XTT)洗涤。
-加20ml反应缓冲液+XTT
(必须浸没外植体,而不要真空渗入)
-在黑暗中于26℃孵育。
-反应后,在470nm测量反应培养基的吸光度。
B.拟南芥
培养基和反应缓冲液
植物培养基:
半浓缩的Murashige和Skoog盐
B5维生素
1.5%蔗糖
pH 5.8
0.7%Difco琼脂
孵育培养基:
半浓缩的MS盐
1%蔗糖
0.5g/l MES pH5.8
每25ml培养基中加1滴吐温20
反应缓冲液:
25mM磷酸钾缓冲液pH8.0,
1mM 3’-{1-[苯基氨-羰基]-3,4-四氮唑}-二(4-甲氧基-6-硝基)钠=XTT(BioVectra,Canada)(分子量674.53)
通过小心温热溶液(±37℃)溶解XTT(用前冷却到室温)
每25ml缓冲液中加1滴吐温20
拟南芥植物
-拟南芥株系:用于测试的对照株系(用来获得测试株系的母株系)
-拟南芥种子的消毒:
用70%乙醇处理2分钟
用每20ml溶液(含有6%活性氯)中加入1滴吐温20的溶液漂白10分钟
用无菌自来水冲洗5次
附:消毒是在2ml的Eppendorf管中进行。拟南芥种子沉到管底,使能够用1ml的自动移液器(pipetman)移去液体。
-种子的预萌发:
在直径为9cm的Optilux培养皿(Falcon)中含有12ml无菌自来水。低光照过夜到24小时。
-拟南芥植物的生长:
将种子播种在含有±125ml植物培养基的Falcon的内格(intergrid)组织培养皿(nr.3025)中:每格放1粒种子。植物抽薹前在24℃和16小时光照(每秒30μEinstein/m2)-8小时黑暗的条件下生长约18天。
附:实施测定需要1克的植物材料(不带根的芽)/株系/条件。1克芽对应于40-60株植物。
胁迫诱导
百草枯
-收获拟南芥芽(无根)
-将1克芽放在分别含有0、5和10μM百草枯的孵育培养基中(必须浸没芽,而不要真空渗透)。
孵育培养基:在Falcon的内格组织培养皿(nr.3025)中±150ml-在24℃黑暗中孵育±24小时以及每天16小时光照(每秒30-50μEinstein/m2)。
高光照
-将半数平皿转移到高光照(每秒250μEinstein/m2)并孵育4-20小时。
XTT测定
-从琼脂平皿中(高光照胁迫)或从液体孵育培养基中(百草枯胁迫)收获芽(无根),并将其放在含反应缓冲液(无XTT)的50ml的Falcon管中。
-用含有XTT(15ml/g)的缓冲液替换反应缓冲液;
-必须浸没芽,而不要真空渗透;
-在黑暗中于26℃孵育;
-反应后,在470nm处检测反应培养基的吸光度(约1小时)。
实施例4:过表达酵母烟酰胺酶(Pnc1)基因增加拟南芥植物对臭氧的耐受
将嵌合载体pTVE467(实施例1)用于哥伦比亚生态型拟南芥的转化。用Southern-DNA和Northern-RNA印迹分析初始转化体。鉴定到一个转基因系带有单个拷贝的Pnc1转基因构建体并且具有高稳态水平的转基因全长Pnc1-mRNA(20pg/5μg总RNA)。
萌发6周之后,将含有单个拷贝转基因系的植物和作为对照的哥伦比亚野生型各100株植物在烟熏室内暴露于臭氧。在连续两天中分别用250、350、500ppb的臭氧浓度处理植物,每天5小时。处理之后,对全部植物肉眼筛选表现为坏死斑的臭氧损伤植物。结果概括于表2。在500ppb臭氧暴露处理中,几乎所有的植物表现为坏死斑,但在2个较低臭氧浓度的暴露处理中,转基因植物受伤的百分比显著减少。
另外,在增加的臭氧浓度下,确定所有转基因株系和野生型植物的生存力表现指数(PI)的演化。PI可以通过公式计算:PI=(ABS/CS)×(TR/CS)×(ET/CS)(ABS=由天线色素Chi吸收的光子流量;CS=横断面;TR=由反应中心捕获的并转化为氧化还原能的能量;ET=进一步流向下游引起CO2固定的电子流量)。转基因株系的生存力表现指数PI随着臭氧浓度的增加显著地增加,而野生型植物的生存力表现指数随着臭氧浓度的增加保持恒定。这可以解释为在转基因株系中为对抗臭氧伤害产生的补偿性生理应答。
表2:过表达酵母烟酰胺酶(Pnc1)基因的拟南芥植物对臭氧的耐受性增加
  250ppb O3   350ppb O3   500ppb O3
  野生型   45%   50%   100%
  Pnc1   20%   25%   100%
呈现坏死斑的植物的百分比
此外,还将对照植物,含有嵌合基因Pnc1的纯合子转基因植物种群以及杂合子转基因种群用臭氧烟熏处理,并计录了肉眼可见的伤害以及与未烟熏植物相比的多种生理应答。所述评估包括非调节荧光、调节荧光、叶绿素的测量以及新增重量的确定。
根据肉眼可见的伤害和生理应答,对每个种群定级表明臭氧影响的程度。评估越是负值,种群对臭氧的应答越敏感。
对照非转基因种群和杂合子转基因种群的累计得分为-13,而两个纯合子转基因种群的得分分别是-6和-2。因此,很明显,纯合子转基因种群在统计学上的表现显著优于对照植物。
序列表
<110>拜尔生物科学公司
<120>胁迫抗性植物
<130>BCS04-2005WO1
<150>EP 04077624.7
<151>2004-09-24
<150>US 60/628826
<151>2004-11-17
<160>34
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>651
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>1
atgaagactt taattgttgt tgatatgcaa aatgatttta tttcaccttt aggttccttg   60
actgttccaa aaggtgagga attaatcaat cctatctcgg atttgatgca agatgctgat  120
agagactggc acaggattgt ggtcaccaga gattggcacc cttccagaca tatttcgttc  180
gcaaagaacc ataaagataa agaaccctat tcaacataca cctaccactc tccaaggcca  240
ggcgatgatt ccacgcaaga gggtattttg tggcccgtac actgtgtgaa aaacacctgg  300
ggtagtcaat tggttgacca aataatggac caagtggtca ctaagcatat taagattgtc  360
gacaagggtt tcttgactga ccgtgaatac tactccgcct tccacgacat ctggaacttc  420
cataagaccg acatgaacaa gtacttagaa aagcatcata cagacgaggt ttacattgtc  480
ggtgtagctt tggagtattg tgtcaaagcc accgccattt ccgctgcaga actaggttat  540
aagaccactg tcctgctgga ttacacaaga cccatcagcg atgatcccga agtcatcaat  600
aaggttaagg aagagttgaa ggcccacaac atcaatgtcg tggataaata a           651
<210>2
<211>216
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>2
Met Lys Thr Leu Ile Val Val Asp Met Gln Asn Asp Phe Ile Ser Pro
1               5                   10                  15
Leu Gly Ser Leu Thr Val Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ile Asn Pro Ile
            20                  25                  30
Ser Asp Leu Met Gln Asp Ala Asp Arg Asp Trp His Arg Ile Val Val
        35                  40                  45
Thr Arg Asp Trp His Pro Ser Arg His Ile Ser Phe Ala Lys Asn His
    50                  55                  60
Lys Asp Lys Glu Pro Tyr Ser Thr Tyr Thr Tyr His Ser Pro Arg Pro
65                  70                  75                  80
Gly Asp Asp Ser Thr Gln Glu Gly Ile Leu Trp Pro Val His Cys Val
                85                  90                  95
Lys Asn Thr Trp Gly Ser Gln Leu Val Asp Gln Ile Met Asp Gln Val
            100                 105                 110
Val Thr Lys His Ile Lys Ile Val Asp Lys Gly Phe Leu Thr Asp Arg
        115                 120                 125
Glu Tyr Tyr Ser Ala Phe His Asp Ile Trp Asn Phe His Lys Thr Asp
    130                 135                 140
Met Asn Lys Tyr Leu Glu Lys His His Thr Asp Glu Val Tyr Ile Val
145                 150                 155                 160
Gly Val Ala Leu Glu Tyr Cys Val Lys Ala Thr Ala Ile Ser Ala Ala
                165                 170                 175
Glu Leu Gly Tyr Lys Thr Thr Val Leu Leu Asp Tyr Thr Arg Pro Ile
            180                 185                 190
Ser Asp Asp Pro Glu Val Ile Asn Lys Val Lys Glu Glu Leu Lys Ala
        195                 200                 205
His Asn Ile Asn Val Val Asp Lys
    210                 215
<210>3
<211>1290
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>3
ttaggtccat ctgtgcgctt cgttatcacc actccaactt cgttcagtat atcccaattc   60
ctctttcact ctcttcacag tggcaggatc tcccatattt ttacctaagt tatcagaaat  120
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taatagcgat ttgtttctgt ctgggttacc gttcacagct ttcatgattc cttgcataat  720
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attatcaaac aaagtttccg ccttcttctc agcttgttct aattggtttt cgtagtccca  840
gtcgatgtca acaaatttaa aatacgcttc tgatattagg gacagtaagg ggatctcata  900
aaggatagta tccttccaac taccactgac taaaattttc aatttgtagt gggtgggctt  960
gccctcgatt tcttctgaag tgaaggaaat ctgctcttca gggtgtagtt tgtaattaga 1020
actgctaata tacttaatat atgccgatgg caaatatggg atttcctgtt ttaagtattc 1080
aatttcctct tctgtgaacc tcaaatttcc caaatacgaa aattgctctt tcaaccaatt 1140
aatggcttcc ttattgaagg tcaattggga cgacctgttg gtatatttat aagtaactgt 1200
aacatctgga aaattagtga agacagcagc atgcatcgta atcttgtaca tgtctgtgtc 1260
caaaagagac tttatcactg gttctgacat                                  1290
<210>4
<211>429
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>4
Met Ser Glu Pro Val Ile Lys Ser Leu Leu Asp Thr Asp Met Tyr Lys
1               5                   10                  15
Ile Thr Met His Ala Ala Val Phe Thr Asn Phe Pro Asp Val Thr Val
            20                  25                  30
Thr Tyr Lys Tyr Thr Asn Arg Ser Ser Gln Leu Thr Phe Asn Lys Glu
        35                  40                  45
Ala Ile Asn Trp Leu Lys Glu Gln Phe Ser Tyr Leu Gly Asn Leu Arg
    50                  55                  60
Phe Thr Glu Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Lys Gln Glu Ile Pro Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ser Ala Tyr Ile Lys Tyr Ile Ser Ser Ser Asn Tyr Lys Leu His
                85                  90                  95
Pro Glu Glu Gln Ile Ser Phe Thr Ser Glu Glu Ile Glu Gly Lys Pro
            100                 105                 110
Thr His Tyr Lys Leu Lys Ile Leu Val Ser Gly Ser Trp Lys Asp Thr
        115                 120                 125
Ile Leu Tyr Glu Ile Pro Leu Leu Ser Leu Ile Ser Glu Ala Tyr Phe
    130                 135                 140
Lys Phe Val Asp Ile Asp Trp Asp Tyr Glu Asn Gln Leu Glu Gln Ala
145                 150                 155                 160
Glu Lys Lys Ala Glu Thr Leu Phe Asp Asn Gly Ile Arg Phe Ser Glu
                165                 170                 175
Phe Gly Thr Arg Arg Arg Arg Ser Leu Lys Ala Gln Asp Leu Ile Met
            180                 185                 190
Gln Gly Ile Met Lys Ala Val Asn Gly Asn Pro Asp Arg Asn Lys Ser
        195                 200                 205
Leu Leu Leu Gly Thr Ser Asn Ile Leu Phe Ala Lys Lys Tyr Gly Val
    210                 215                 220
Lys Pro Ile Gly Thr Val Ala His Glu Trp Val Met Gly Val Ala Ser
225                 230                 235                 240
Ile Ser Glu Asp Tyr Leu His Ala Asn Lys Asn Ala Met Asp Cys Trp
                245                 250                 255
Ile Asn Thr Phe Gly Ala Lys Asn Ala Gly Leu Ala Leu Thr Asp Thr
            260                 265                 270
Phe Gly Thr Asp Asp Phe Leu Lys Ser Phe Arg Pro Pro Tyr Ser Asp
        275                 280                 285
Ala Tyr Val Gly Val Arg Gln Asp Ser Gly Asp Pro Val Glu Tyr Thr
    290                 295                 300
Lys Lys Ile Ser His His Tyr His Asp Val Leu Lys Leu Pro Lys Phe
305                 310                 315                 320
Ser Lys Ile Ile Cys Tyr Ser Asp Ser Leu Asn Val Glu Lys Ala Ile
                325                 330                 335
Thr Tyr Ser His Ala Ala Lys Glu Asn Gly Met Leu Ala Thr Phe Gly
            340                 345                 350
Ile Gly Thr Asn Phe Thr Asn Asp Phe Arg Lys Lys Ser Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Lys Ser Glu Pro Leu Asn Ile Val Ile Lys Leu Leu Glu Val Asn
    370                 375                 380
Gly Asn His Ala Ile Lys Ile Ser Asp Asn Leu Gly Lys Asn Met Gly
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            420                 425
<210>5
<211>1206
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<400>5
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ccaaataaac tgccgttagt aatagtagca tgtgggtctt tttcaccaat cacctacttg  540
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<211>401
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>6
Met Asp Pro Thr Arg Ala Pro Asp Phe Lys Pro Pro Ser Ala Asp Glu
1               5                   10                  15
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Pro Ile Ile Pro Tyr Val Leu Ala Asp Ala Asn Ser Ser Ile Asp Ala
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Pro Phe Asn Ile Lys Arg Lys Lys Lys His Pro Lys His His His His
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Ser Glu Gln Thr Arg Phe Glu Val Ile Gly Gly Tyr Tyr Ser Pro Val
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<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>8
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<213>酿酒酵母
<400>10
Met Ser His Leu Ile Thr Leu Ala Thr Cys Asn Leu Asn Gln Trp Ala
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        195                 200                 205
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Lys Val Lys Arg Phe Phe Phe Phe Tyr Ala Ile Asn Arg His Lys Gln
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Thr Val Leu Thr Pro Ser Tyr His Ala Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asp
            660                 665                 670
Asn Arg Phe Asp Leu Arg Pro Phe Leu Ile Asn Pro Arg Phe Pro Trp
        675                 680                 685
Ala Ser Arg Lys Ile Asp Glu Val Val Glu Gln Cys Glu Ala His Lys
    690                 695                 700
Gly Ser Thr Leu Asp Ile Met Ser Ile Asp
705                 710
<210>11
<211>597
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>11
atggcttcct catcaacgag aaagtacgag acacgaaagc gagatccaaa ctctaaaatc   60
gcagctcttc tcgttatcga catgcagaat cacttctcct ccatggccaa acccatcctc  120
aacaacgttc tcaccaccat cgacatctgc cgacgcgcct cagtccccgt attctttacg  180
cgtcacaacc acaaatcccc gaccgaccac ggcatgctcg gcgagtggtg taacggcgat  240
gtaatccttg acggaaccac cgattctgaa atcatccagg agatacaagg ccaagtaacc  300
ggaccagacg agatggtgga gaagaacacg tacagtgcgt ttaacaaaac ccgcctccag  360
gaaaacctgg aaaagatcgg agtaaaggag gtgatcgtga tcggagtgat gacgaacttg  420
tgctgtgaga caacggcgcg tgaagcgttt attaagggtt ttagggtttt tttctcgacg  480
gacgcgactg cgacgtttaa tgaggagctt cacgaggcta cgctaatgaa tctcgctttt  540
ggcttcgctt atctcgtcga ttgcgataaa ctccggcgaa gtctactcgg taactaa     597
<210>12
<211>198
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>12
Met Ala Ser Ser Ser Thr Arg Lys Tyr Glu Thr Arg Lys Arg Asp Pro
1               5                   10                  15
Asn Ser Lys Ile Ala Ala Leu Leu Val Ile Asp Met Gln Asn His Phe
            20                  25                  30
Ser Ser Met Ala Lys Pro Ile Leu Asn Asn Val Leu Thr Thr Ile Asp
        35                  40                  45
Ile Cys Arg Arg Ala Ser Val Pro Val Phe Phe Thr Arg His Asn His
    50                  55                  60
Lys Ser Pro Thr Asp His Gly Met Leu Gly Glu Trp Cys Asn Gly Asp
65                  70                  75                  80
Val Ile Leu Asp Gly Thr Thr Asp Ser Glu Ile Ile Gln Glu Ile Gln
                85                  90                  95
G1y Gln Val Thr Gly Pro Asp Glu Met Val Glu Lys Asn Thr Tyr Ser
            100                 105                 110
Ala Phe Asn Lys Thr Arg Leu Gln Glu Asn Leu Glu Lys Ile Gly Val
        115                 120                 125
Lys Glu Val Ile Val Ile Gly Val Met Thr Asn Leu Cys Cys Glu Thr
    130                 135                 140
Thr Ala Arg Glu Ala Phe Ile Lys Gly Phe Arg Val Phe Phe Ser Thr
145                 150                 155                 160
Asp Ala Thr Ala Thr Phe Asn Glu Glu Leu His Glu Ala Thr Leu Met
                165                 170                 175
Asn Leu Ala Phe Gly Phe Ala Tyr Leu Val Asp Cys Asp Lys Leu Arg
            180                 185                 190
Arg Ser Leu Leu Gly Asn
        195
<210>13
<211>597
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>13
atggcttctt catcatcgag aacgtacgag acacgaaagc gagagccaaa tcctaaaatc     60
gcagctcttc tcgtcatcga tatgcagaat cacttctact ctatggctga accaatcctc    120
caaaacgctc tcaccaccat cgacatctgc cgacgcgctt caatccccgt attcttcacg    180
cgccacaacc acaaatcccc aaccgaccac ggcatgctcg gagagtggtg gaacggcgat    240
ctaatcctcg acggaaccac tgattccgaa atcatcccgg aaatcaatcg ccaggtcacc    300
ggaccagacg aaatcgtgga gaagagcacg tacagtgcgt ttaacaacac gcaccttcag    360
gagaagctgg acaagatcgg agtgaaggag gtgatcgtta tcggagtgat gacgaaccta    420
tgctgtgaga cgacggcgcg tgaagcgttt gtaaaggggt ttagggtttt tttctcgacg    480
gacgcgactg cgacggttaa tgaagagctt cacgaggcta ctctaatgaa tctcgcgtat    540
ggctttgctt atctcgtcga ttgcgataga ctccggcgag gtctactcag tagttaa       597
<210>14
<211>198
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>14
Met Ala Ser Ser Ser Ser Arg Thr Tyr Glu Thr Arg Lys Arg Glu Pro
1               5                   10                  15
Asn Pro Lys Ile Ala Ala Leu Leu Val Ile Asp Met Gln Asn His Phe
            20                  25                  30
Tyr Ser Met Ala Glu Pro Ile Leu Gln Asn Ala Leu Thr Thr Ile Asp
        35                  40                  45
Ile Cys Arg Arg Ala Ser Ile Pro Val Phe Phe Thr Arg His Asn His
    50                  55                  60
Lys Ser Pro Thr Asp His Gly Met Leu Gly Glu Trp Trp Asn Gly Asp
65                  70                  75                  80
Leu Ile Leu Asp Gly Thr Thr Asp Ser Glu Ile Ile Pro Glu Ile Asn
                85                  90                  95
Arg Gln Val Thr Gly Pro Asp Glu Ile Val Glu Lys Ser Thr Tyr Ser
            100                 105                 110
Ala Phe Asn Asn Thr His Leu Gln Glu Lys Leu Asp Lys Ile Gly Val
        115                 120                 125
Lys Glu Val Ile Val Ile Gly Val Met Thr Asn Leu Cys Cys Glu Thr
    130                 135                 140
Thr Ala Arg Glu Ala Phe Val Lys Gly Phe Arg Val Phe Phe Ser Thr
145                 150                 155                 160
Asp Ala Thr Ala Thr Val Asn Glu Glu Leu His Glu Ala Thr Leu Met
                165                 170                 175
Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Tyr Leu Val Asp Cys Asp Arg Leu Arg
            180                 185                 190
Arg Gly Leu Leu Ser Ser
        195
<210>15
<211>591
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>15
atggccgaga gatggaggaa cacggctcta ctcgtcatcg acatgcagaa cgatttcata   60
gaggaaggtg ctgtgacgca agtgaaagga ggaaaatcta tagttcctaa tgttatcaga  120
gtcgtcgaac tcgcgaggca gcgtggtatt ctcgtaattt gggttgttcg agaacatgat  180
cgtcaaggaa gagatgttga attattcagg cgccataact acagttctga gaaagtcggg  240
ccagttatta aaggcaccgt aggagcagaa ttggttgatg gattgatgat caacgaagaa  300
gatgactata agattgtgaa aactcgtttc agtgctttct ttagtaccaa tcttcattcc  360
ttcttgcaaa cttcaggggt taccaagtta gtgattgctg gtgtgcaaac gccgaactgt  420
atccggcaaa cggtgtttga tgcagtggcg ctggattatc ccaatgtgac tgttattaca  480
gatgccacag ctgctgcaac accagagatc catactgcga atattcttga catgaagaat  540
attggagtca agactcctac attacacgag tggtccgaag aacttgcttg a           591
<210>16
<211>196
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>16
Met Ala Glu Arg Trp Arg Asn Thr Ala Leu Leu Val Ile Asp Met Gln
1               5                   10                  15
Asn Asp Phe Ile Glu Glu Gly Ala Val Thr Gln Val Lys Gly Gly Lys
            20                  25                  30
Ser Ile Val Pro Asn Val Ile Arg Val Val Glu Leu Ala Arg Gln Arg
        35                  40                  45
Gly Ile Leu Val Ile Trp Val Val Arg Glu His Asp Arg Gln Gly Arg
    50                  55                  60
Asp Val Glu Leu Phe Arg Arg His Asn Tyr Ser Ser Glu Lys Val Gly
65                  70                  75                  80
Pro Val Ile Lys Gly Thr Val Gly Ala Glu Leu Val Asp Gly Leu Met
                85                  90                  95
Ile Asn Glu Glu Asp Asp Tyr Lys Ile Val Lys Thr Arg Phe Ser Ala
            100                 105                 110
Phe Phe Ser Thr Asn Leu His Ser Phe Leu Gln Thr Ser Gly Val Thr
        115                 120                 125
Lys Leu Val Ile Ala Gly Val Gln Thr Pro Asn Cys Ile Arg Gln Thr
    130                 135                 140
Val Phe Asp Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Asn Val Thr Val Ile Thr
145                 150                 155                 160
Asp Ala Thr Ala Ala Ala Thr Pro Glu Ile His Thr Ala Asn Ile Leu
                165                 170                 175
Asp Met Lys Asn Ile Gly Val Lys Thr Pro Thr Leu His Glu Trp Ser
            180                 185                 190
Glu Glu Leu Ala
        195
<210>17
<211>1680
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>17
atggagaaga aagaaaatgg tctcgatgga aagcaatcgg gtcgggtcat taacggaccc   60
actaacccga tggtcacacc tctgctcaac gatctttacc aattcaccat ggcttatgct  120
tattggaaag ctggcaaaca atctgagcga tctgtgtttg atctgtattt tcgtaagaat  180
ccttttggtg gagaatacac tatctttgct ggtttagaag aatgcatcaa atttctcgct  240
aatttcaatt tgactgatga agagatcgat ttcgttcgtg attcgttacc tggatgtgag  300
gaagctttct gtgattatct tcgagggctt gattgttctg acattgaagt gtatgccatt  360
tcggaaggat cagttgtttt tcctaaagtt cctttactca gaatcgaagg tcctgttgct  420
gtggtgcaat tgttggaaac tccattcctc aatctcatca attacgcatc tttggttgct  480
acaaatgcag caagacatcg gtttgttgca ggaaaatcta agcttctgct tgagtttggt  540
gctagaagag ctcagggacc cgatggtgca ataagcgcat caaagtattg ctaccttgga  600
ggttttgatg caacaagtaa tgttgcagcg ggaaaactgt ttgggatacc cctccgtggt  660
actcattccc atgcttttgt tagctcattc atgagccttg atgaaattgt tgacaaagtg  720
cttcgaagtt ctgatgggaa aagcacttgt aaggatttta tatgtttggt ccaaacttgc  780
ctaacaaaga ttcagaattc atcttcatta caaggaattt tttccgagac aaatcaaagc  840
gagcttgcag cgttcatttc atatgcactg gcattcccaa actcctttct cgctcttgta  900
gacacttatg atgtgatgaa gagtggtatt ccaaacttct gtgctgttgc tctagcactt  960
aatgaattgg gatacaaagc agtaggcatt agactggatt caggtgactt agcctatctt 1020
tctactgagg tcaggaaatt cttttgtgcc atagagagag acctcaaagt tcctgatttc 1080
gggaagatga tcgtcactgc tagtaacgat ctaaacgaag agacagtcga tgctctaaat 1140
aaacagggtc atgaagtaga tgcatttgga attggaacca acttagtgac ttgctatgcg 1200
caagctgcgt taggttgtgt tttcaaactt gtggaaataa acaatcagcc tcggatcaaa 1260
ctttctgaag atgttactaa ggtatcgatt ccatgtaaaa agcgtactta cagattgttc 1320
ggaaaagagg gttaccctct tgttgatata atgactggag agaacgaacc acctccaaag 1380
gtcggtgaaa ggttactttg ccgtcatcca ttcaatgaat caaaaagggc ttatgtggtt 1440
ccacaacgcg ttgaagagct tctgaaatgt tattggcgtg gcaatgcaga tgaagctagg 1500
gaagagctag agccattgaa agagctaaga aatcgttgca tcaaacagct cgaaaatatg 1560
cgacccgatc atatgagaag attaaaccct actccttata aggttagtgt cagcgccaag 1620
ttgtatgact tcatccactt cctctggctc aacgaagctc ctgtcggtga actgcattga 1680
<210>18
<211>559
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>18
Met Glu Lys Lys Glu Asn Gly Leu Asp Gly Lys Gln Ser Gly Arg Val
1               5                   10                  15
Ile Asn Gly Pro Thr Asn Pro Met Val Thr Pro Leu Leu Asn Asp Leu
            20                  25                  30
Tyr Gln Phe Thr Met Ala Tyr Ala Tyr Trp Lys Ala Gly Lys Gln Ser
        35                  40                  45
Glu Arg Ser Val Phe Asp Leu Tyr Phe Arg Lys Asn Pro Phe Gly Gly
    50                  55                  60
Glu Tyr Thr Ile Phe Ala Gly Leu Glu Glu Cys Ile Lys Phe Leu Ala
65                  70                  75                  80
Asn Phe Asn Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Phe Val Arg Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Pro Gly Cys Glu Glu Ala Phe Cys Asp Tyr Leu Arg Gly Leu Asp Cys
            100                 105                 110
Ser Asp Ile Glu Val Tyr Ala Ile Ser Glu Gly Ser Val Val Phe Pro
        115                 120                 125
Lys Val Pro Leu Leu Arg Ile Glu Gly Pro Val Ala Val Val Gln Leu
    130                 135                 140
Leu Glu Thr Pro Phe Leu Asn Leu Ile Asn Tyr Ala Ser Leu Val Ala
145                 150                 155                 160
Thr Asn Ala Ala Arg His Arg Phe Val Ala Gly Lys Ser Lys Leu Leu
                165                 170                 175
Leu Glu Phe Gly Ala Arg Arg Ala Gln Gly Pro Asp Gly Ala Ile Ser
            180                 185                 190
Ala Ser Lys Tyr Cys Tyr Leu Gly Gly Phe Asp Ala Thr Ser Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ala Gly Lys Leu Phe Gly Ile Pro Leu Arg Gly Thr His Ser His
    210                 215                 220
Ala Phe Val Ser Ser Phe Met Ser Leu Asp Glu Ile Val Asp Lys Val
225                 230                 235                 240
Leu Arg Ser Ser Asp Gly Lys Ser Thr Cys Lys Asp Phe Ile Cys Leu
                245                 250                 255
Val Gln Thr Cys Leu Thr Lys Ile Gln Asn Ser Ser Ser Leu Gln Gly
            260                 265                 270
Ile Phe Ser Glu Thr Asn Gln Ser Glu Leu Ala Ala Phe Ile Ser Tyr
        275                 280                 285
Ala Leu Ala Phe Pro Asn Ser Phe Leu Ala Leu Val Asp Thr Tyr Asp
    290                 295                 300
Val Met Lys Ser Gly Ile Pro Asn Phe Cys Ala Val Ala Leu Ala Leu
305                 310                 315                 320
Asn Glu Leu Gly Tyr Lys Ala Val Gly Ile Arg Leu Asp Ser Gly Asp
                325                 330                 335
Leu Ala Tyr Leu Ser Thr Glu Val Arg Lys Phe Phe Cys Ala Ile Glu
            340                 345                 350
Arg Asp Leu Lys Val Pro Asp Phe Gly Lys Met Ile Val Thr Ala Ser
        355                 360                 365
Asn Asp Leu Asn Glu Glu Thr Val Asp Ala Leu Asn Lys Gln Gly His
    370                 375                 380
Glu Val Asp Ala Phe Gly Ile Gly Thr Asn Leu Val Thr Cys Tyr Ala
385                 390                 395                 400
Gln Ala Ala Leu Gly Cys Val Phe Lys Leu Val Glu Ile Asn Asn Gln
                405                 410                 415
Pro Arg Ile Lys Leu Ser Glu Asp Val Thr Lys Val Ser Ile Pro Cys
            420                 425                 430
Lys Lys Arg Thr Tyr Arg Leu Phe Gly Lys Glu Gly Tyr Pro Leu Val
        435                 440                 445
Asp Ile Met Thr Gly Glu Asn Glu Pro Pro Pro Lys Val Gly Glu Arg
    450                 455                 460
Leu Leu Cys Arg His Pro Phe Asn Glu Ser Lys Arg Ala Tyr Val Val
465                 470                 475                 480
Pro Gln Arg Val Glu Glu Leu Leu Lys Cys Tyr Trp Arg Gly Asn Ala
                485                 490                 495
Asp Glu Ala Arg Glu Glu Leu Glu Pro Leu Lys Glu Leu Arg Asn Arg
            500                 505                 510
Cys Ile Lys Gln Leu Glu Asn Met Arg Pro Asp His Met Arg Arg Leu
        515                 520                 525
Asn Pro Thr Pro Tyr Lys Val Ser Val Ser Ala Lys Leu Tyr Asp Phe
    530                 535                 540
Ile His Phe Leu Trp Leu Asn Glu Ala Pro Val Gly Glu Leu His
545                 550                 555
<210>19
<211>1674
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>19
atggagccga aagagaacgg ctcagaattg ggtcagaaga tcattgacgg accaacgaat   60
ccaatggtca cacctttact caatgatctt tatcaattca ccatggctta tgcttattgg  120
aaagctggca aacacaacga acgatccgtt ttcgatctgt attttcgtaa gaacccattt  180
ggtggtgagt acactgtgtt tgctggatta gaagagtgtg ttaagttctt agccaatttc  240
aaattgactg atgaagaaat cgatttcgtt caagagtgtt tgcctggatc tgaggaagct  300
ttttgtgatt atcttagagg gcttgattgt tctgatgttg aagtttatgc aattccggaa  360
ggatcagttg tttttcctaa agtacctctc atgagagttg aaggacctgt tggtgttgtt  420
caattgttgg aaactccatt cctcaatctt gtcaattttg catctttggt agctactaac  480
gcagctaggc atcgctttgt tgccggaaaa tctaagagtc tactcgagtt tggtgctcga  540
agggctcagg gtccggatgg tgcaataagc gcatcaaaat attgctacct tggaggtttt  600
gatgcaacaa gtaatgtagc agctggaaaa ctttttggga ttcctcttcg tggaacacac  660
tctcatgctt atgttagctc attcatgagt actgatgaga ttgttgacaa agtacttcgt  720
agtgctgatg ggaaaaccac gtgcgaggat tttgttagtc atgttcagac atggttaaaa  780
aagattcagt attcaccatc tctaagtggc attttctctg agacaaatca aagcgagcta  840
gcagctttca cctcatatgc actggcattc cccaaaactt ttcttgccct cgtagataca  900
tacgatgtga tgaagagtgg aatccctaac ttctgtgcag ttgctttagc actcaatgac  960
tttggatata aagcattagg tattagactg gattcaggtg atttagctta tctatctaga 1020
gaggccagaa atttcttctg cacggtagag agagaactaa aagtgcctgg ttttgggaag 1080
atggtcgtca ctgctagtaa tgatctaaat gaagagacga ttgacgcttt aaataaacag  1140
ggacatgagg tggatgcttt tggcatcggg acctacttgg tcacttgcta ttcacaagcg  1200
gccttaggtt gcgttttcaa acttgtggag ataaacaatc agcctcggat taaactttct  1260
gaagatgtta caaaggtatc aataccgtgt aaaaagcgaa gttacagatt atacggcaaa  1320
gaaggttacc ctctggtaga tataatgact ggagagaacg aaccacctcc aaaggttggt  1380
gagcgtttac tttgtcgtca cccattcaac gaatccaaaa gagcatatgt agtgccacaa  1440
cgtgtcgaag agctcctcaa atgttattgg cgtggaagtg cagatgaagc aagagaagta  1500
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gatcatatga ggagattaaa cccaactcct tataaggtta gtgtaagcgc aaagctgtac  1620
gatttcatcc acttcttatg gctaaacgaa gcacctgttg gtgaattgca gtga        1674
<210>20
<211>557
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>20
Met Glu Pro Lys Glu Asn Gly Ser Glu Leu Gly Gln Lys Ile Ile Asp
1               5                   10                  15
Gly Pro Thr Asn Pro Met Val Thr Pro Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Gln
            20                  25                  30
Phe Thr Met Ala Tyr Ala Tyr Trp Lys Ala Gly Lys His Asn Glu Arg
        35                  40                  45
Ser Val Phe Asp Leu Tyr Phe Arg Lys Asn Pro Phe Gly Gly Glu Tyr
    50                  55                  60
Thr Val Phe Ala Gly Leu Glu Glu Cys Val Lys Phe Leu Ala Asn Phe
65                  70                  75                  80
Lys Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Phe Val Gln Glu Cys Leu Pro Gly
                85                  90                  95
Ser Glu Glu Ala Phe Cys Asp Tyr Leu Arg Gly Leu Asp Cys Ser Asp
            100                 105                 110
Val Glu Val Tyr Ala Ile Pro Glu Gly Ser Val Val Phe Pro Lys Val
        115                 120                 125
Pro Leu Met Arg Val Glu Gly Pro Val Gly Val Val Gln Leu Leu Glu
    130                 135                 140
Thr Pro Phe Leu Asn Leu Val Asn Phe Ala Ser Leu Val Ala Thr Asn
145                 150                 155                 160
Ala Ala Arg His Arg Phe Val Ala Gly Lys Ser Lys Ser Leu Leu Glu
                165                 170                 175
Phe Gly Ala Arg Arg Ala Gln Gly Pro Asp Gly Ala Ile Ser Ala Ser
            180                 185                 190
Lys Tyr Cys Tyr Leu Gly Gly Phe Asp Ala Thr Ser Asn Val Ala Ala
        195                 200                 205
Gly Lys Leu Phe Gly Ile Pro Leu Arg Gly Thr His Ser His Ala Tyr
    210                 215                 220
Val Ser Ser Phe Met Ser Thr Asp Glu Ile Val Asp Lys Val Leu Arg
225                 230                 235                 240
Ser Ala Asp Gly Lys Thr Thr Cys Glu Asp Phe Val Ser His Val Gln
                245                 250                 255
Thr Trp Leu Lys Lys Ile Gln Tyr Ser Pro Ser Leu Ser Gly Ile Phe
            260                 265                 270
Ser Glu Thr Asn Gln Ser Glu Leu Ala Ala Phe Thr Ser Tyr Ala Leu
        275                 280                 285
Ala Phe Pro Lys Thr Phe Leu Ala Leu Val Asp Thr Tyr Asp Val Met
    290                 295                 300
Lys Ser Gly Ile Pro Asn Phe Cys Ala Val Ala Leu Ala Leu Asn Asp
305                 310                 315                 320
Phe Gly Tyr Lys Ala Leu Gly Ile Arg Leu Asp Ser Gly Asp Leu Ala
                325                 330                 335
Tyr Leu Ser Arg Glu Ala Arg Asn Phe Phe Cys Thr Val Glu Arg Glu
            340                 345                 350
Leu Lys Val Pro Gly Phe Gly Lys Met Val Val Thr Ala Ser Asn Asp
        355                 360                 365
Leu Asn Glu Glu Thr Ile Asp Ala Leu Asn Lys Gln Gly His Glu Val
    370                 375                 380
Asp Ala Phe Gly Ile Gly Thr Tyr Leu Val Thr Cys Tyr Ser Gln Ala
385                 390                 395                 400
Ala Leu Gly Cys Val Phe Lys Leu Val Glu Ile Asn Asn Gln Pro Arg
                405                 410                 415
Ile Lys Leu Ser Glu Asp Val Thr Lys Val Ser Ile Pro Cys Lys Lys
            420                 425                 430
Arg Ser Tyr Arg Leu Tyr Gly Lys Glu Gly Tyr Pro Leu Val Asp Ile
        435                 440                 445
Met Thr Gly Glu Asn Glu Pro Pro Pro Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu
    450                 455                 460
Cys Arg His Pro Phe Asn Glu Ser Lys Arg Ala Tyr Val Val Pro Gln
465                 470                 475                 480
Arg Val Glu Glu Leu Leu Lys Cys Tyr Trp Arg Gly Ser Ala Asp Glu
                485                 490                 495
Ala Arg Glu Val Leu Pro Pro Leu Lys Glu Ile Arg Asp Arg Cys Ile
            500                 505                 510
Lys Gln Leu Glu Asn Met Arg Pro Asp His Met Arg Arg Leu Asn Pro
        515                 520                 525
Thr Pro Tyr Lys Val Ser Val Ser Ala Lys Leu Tyr Asp Phe Ile His
    530                 535                 540
Phe Leu Trp Leu Asn Glu Ala Pro Val Gly Glu Leu Gln
545                 550                 555
<210>21
<211>717
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>21
atggatgtcc cgttaccagt cgagaaatta tcttatggat caaacactga ggacaaaact   60
tgtgtagtgc ttgtggcaac tgggagtttc aatcctccta ctttcatgca tttacgcatg  120
tttgagctgg cgagagatga attacgctca aaaggatttc atgttcttgg aggatatatg  180
tctcctgtta atgatgcata taagaagaag ggccttttat ctgcagaaca tcgtttagag  240
atgtgtaatg tatcatgtca aagctctgac tttgtaatgg ttgatccgtg ggaggcatct  300
caaagcaact accaacgaac tttgacggtt ttatcaaggg tcaagacttt cttaacaaca  360
aatcgacatg tacccgagga atctctcaaa gtcatgctac tatgtggctc ggatttactg  420
ctatctttct gcactcccgg tgtttggatc cctgaacagt taagaactat ttgcaaagat  480
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gaagatggag taatagatta tatcagacaa catcaactat acactgagct cacatga     717
<210>22
<211>238
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>22
Met Asp Val Pro Leu Pro Val Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Ser Asn Thr
1               5                   10                  15
Glu Asp Lys Thr Cys Val Val Leu Val Ala Thr Gly Ser Phe Asn Pro
            20                  25                  30
Pro Thr Phe Met His Leu Arg Met Phe Glu Leu Ala Arg Asp Glu Leu
        35                  40                  45
Arg Ser Lys Gly Phe His Val Leu Gly Gly Tyr Met Ser Pro Val Asn
    50                  55                  60
Asp Ala Tyr Lys Lys Lys Gly Leu Leu Ser Ala Glu His Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Met Cys Asn Val Ser Cys Gln Ser Ser Asp Phe Val Met Val Asp Pro
                85                  90                  95
Trp Glu Ala Ser Gln Ser Asn Tyr Gln Arg Thr Leu Thr Val Leu Ser
            100                 105                 110
Arg Val Lys Thr Phe Leu Thr Thr Asn Arg His Val Pro Glu Glu Ser
        115                 120                 125
Leu Lys Val Met Leu Leu Cys Gly Ser Asp Leu Leu Leu Ser Phe Cys
    130                 135                 140
Thr Pro Gly Val Trp Ile Pro Glu Gln Leu Arg Thr Ile Cys Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Gly Ile Val Cys Ile Arg Arg Glu Gly Gln Asp Val Glu Asn Met
                165                 170                 175
Ile Ser Gly Asp Glu Ile Leu Asn Glu Asn Cys Ala Asn Val Lys Ile
            180                 185                 190
Val Asp Asn Thr Val Pro Asn Gln Ile Ser Ser Ser Arg Leu Arg Gln
        195                 200                 205
Cys Ile Ser Arg Gly Leu Ser Val Lys Tyr Leu Thr Glu Asp Gly Val
    210                 215                 220
Ile Asp Tyr Ile Arg Gln His Gln Leu Tyr Thr Glu Leu Thr
225                 230                 235
<210>23
<211>2178
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>23
atgaggctgt tgaaggttgc tacgtgtaac ttgaaccaat gggccatgga tttcgagagc     60
aacatgaaga acatcaaggc ttcgatcgct gaggcaaagg ctgctggtgc tgttatcagg    120
cttggacccg agctcgaggt cactggctat ggttgcgagg atcacttctt ggaactcgac    180
actgtcactc atgcgtggga gtgtttgaag gaattgctgc ttggtgattg gacggatgat    240
attttgtgca gcataggaat gcctgtgatt aaaggagcag agcgttataa ctgccaggtt    300
ctctgtatga acagaagaat catcatgatt cgaccgaaaa tgtggctcgc aaacgatgga    360
aactataggg agctacggtg gttcacagct tggaagcaga gagaagagct agaggaattt    420
cagctcccca ttgaaatttc agaggctttg gagcagaaat cagtcccttt tggttatggt    480
tacatccagt ttatcgacac ggctgttgca gctgaagtct gtgaggaact gtttagtcca    540
cttcctcctc atgccgagct cgcattgaat ggtgttgaag tatttatgaa tgcaagtggg    600
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gctcgtggtg gggtgtatat gtacagtaat caacaaggat gcgatggtag ccgcttatac    720
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gaaaacagtt ctgaggagac aaaaaggcgt tcaaagcagc tggcagacga gattggtgct   1320
tggcatcttg atgtttgcat agatggtgtt gtctctgcag ttttatcatt atttcaaaca   1380
gttacaggca agcgaccaag gtataaggtt gatggaggat caaatgctga gaaccttggg   1440
ttgcagaaca ttcaagcccg gatgagaatg gtgttagcat ttatgttagc gtctctcttg   1500
ccttgggttc atagcaaacc aggcttttac cttgttctag gcagctccaa cgttgatgaa   1560
ggacttcgtg gttacctgac aaagtatgat tgcagctcag cagacataaa tcctatagga   1620
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ccatccttgg cagagataga agctgctcca ccaacagctg agcttgagcc cattcgttct   1740
gactattctc agctcgatga agtcgacatg ggaatgacat atgaagagct ttcagtctat   1800
ggaaggatga ggaagatatt ccgttgtgga ccagtatcta tgttcaagaa tctatgttac   1860
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ccaagtgcgg gtctctga                                                 2178
<210>24
<211>725
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>24
Met Arg Leu Leu Lys Val Ala Thr Cys Asn Leu Asn Gln Trp Ala Met
1               5                   10                  15
Asp Phe Glu Ser Asn Met Lys Asn Ile Lys Ala Ser Ile Ala Glu Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Ala Gly Ala Val Ile Arg Leu Gly Pro Glu Leu Glu Val Thr
        35                  40                  45
Gly Tyr Gly Cys Glu Asp His Phe Leu Glu Leu Asp Thr Val Thr His
    50                  55                  60
Ala Trp Glu Cys Leu Lys Glu Leu Leu Leu Gly Asp Trp Thr Asp Asp
65                  70                  75                  80
Ile Leu Cys Ser Ile Gly Met Pro Val Ile Lys Gly Ala Glu Arg Tyr
                85                  90                  95
Asn Cys Gln Val Leu Cys Met Asn Arg Arg Ile Ile Met Ile Arg Pro
            100                 105                 110
Lys Met Trp Leu Ala Asn Asp Gly Asn Tyr Arg Glu Leu Arg Trp Phe
        115                 120                 125
Thr Ala Trp Lys Gln Arg Glu Glu Leu Glu Glu Phe Gln Leu Pro Ile
    130                 135                 140
Glu Ile Ser Glu Ala Leu Glu Gln Lys Ser Val Pro Phe Gly Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Gln Phe Ile Asp Thr Ala Val Ala Ala Glu Val Cys Glu Glu
                165                 170                 175
Leu Phe Ser Pro Leu Pro Pro His Ala Glu Leu Ala Leu Asn Gly Val
            180                 185                 190
Glu Val Phe Met Asn Ala Ser Gly Ser His His Gln Leu Arg Lys Leu
        195                 200                 205
Asp Ile Arg Leu Asn Ala Phe Met Gly Ala Thr His Ala Arg Gly Gly
    210                 215                 220
Val Tyr Met Tyr Ser Asn Gln Gln Gly Cys Asp Gly Ser Arg Leu Tyr
225                 230                 235                 240
Tyr Asp Gly Cys Ala Cys Ile Val Val Asn Gly Asn Val Val Ala Gln
                245                 250                 255
Gly Ser Gln Phe Ser Leu Arg Asp Val Glu Val Ile Ile Ser Gln Val
            260                 265                 270
Asp Leu Asp Ala Val Ala Ser Leu Arg Gly Ser Ile Ser Ser Phe Gln
        275                 280                 285
Glu Gln Ala Ser Cys Lys Val Lys Val Ser Ser Val Ala Val Pro Cys
    290                 295                 300
Arg Leu Thr Gln Ser Phe Asn Leu Lys Met Thr Leu Ser Ser Pro Lys
305                 310                 315                 320
Lys Ile Ile Tyr His Ser Pro Gln Glu Glu Ile Ala Phe Gly Pro Ala
                325                 330                 335
Cys Trp Met Trp Asp Tyr Leu Arg Arg Ser Gly Ala Ser Gly Phe Leu
            340                 345                 350
Leu Pro Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ser Ser Ser Val Ala Ala Ile Val
        355                 360                 365
Gly Cys Met Cys Gln Leu Val Val Lys Glu Ile Ala Lys Gly Asp Glu
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Gln Val Lys Ala Asp Ala Asn Arg Ile Gly Asn Tyr Ala Asn Gly Gln
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Phe Pro Thr Asp Ser Lys Glu Phe Ala Lys Arg Ile Phe Tyr Thr Val
                405                 410                 415
Phe Met Gly Ser Glu Asn Ser Ser Glu Glu Thr Lys Arg Arg Ser Lys
            420                 425                 430
Gln Leu Ala Asp Glu Ile Gly Ala Trp His Leu Asp Val Cys Ile Asp
        435                 440                 445
Gly Val Val Ser Ala Val Leu Ser Leu Phe Gln Thr Val Thr Gly Lys
    450                 455                 460
Arg Pro Arg Tyr Lys Val Asp Gly Gly Ser Asn Ala Glu Asn Leu Gly
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Leu Gln Asn Ile Gln Ala Arg Met Arg Met Val Leu Ala Phe Met Leu
                485                 490                 495
Ala Ser Leu Leu Pro Trp Val His Ser Lys Pro Gly Phe Tyr Leu Val
            500                 505                 510
Leu Gly Ser Ser Asn Val Asp Glu Gly Leu Arg Gly Tyr Leu Thr Lys
        515                 520                 525
Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Asp Ile Asn Pro Ile Gly Ser Ile Ser Lys
    530                 535                 540
Met Asp Leu Arg Leu Phe Leu Lys Trp Ala Ala Thr Asn Leu Gly Tyr
545                 550                 555                 560
Pro Ser Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ala Pro Pro Thr Ala Glu Leu Glu
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Pro Ile Arg Ser Asp Tyr Ser Gln Leu Asp Glu Val Asp Met Gly Met
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His Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Arg Phe Asp Leu Arg Gln
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        675                 680                 685
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Pro Ser Ala Gly Leu
                725
<210>25
<211>11811
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>pTVE467
<400>25
agattcgaag ctcggtcccg tgggtgttct gtcgtctcgt tgtacaacga aatccattcc     60
cattccgcgc tcaagatggc ttcccctcgg cagttcatca gggctaaatc aatctagccg    120
acttgtccgg tgaaatgggc tgcactccaa cagaaacaat caaacaaaca tacacagcga    180
cttattcaca cgcgacaaat tacaacggta tatatcctgc cagtactcgg ccgtcgaccg    240
cggtaccccg gaattaagct tgcatgcctg caggcaattg gccgctgtac catgcatgat    300
ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat agaagtattt    360
tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc gaaaccctat    420
aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga aaatagagag    480
agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc caagcttgct agcttattta    540
tccacgacat tgatgttgtg ggccttcaac tcttccttaa ccttattgat gacttcggga     600
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tccgattgaa cgtaatcttt agtcataggt tctaattctg cagttggtgt agcgtttaaa     960
aagtcattca agattggcat gttatattgt tttgatgcgt aggcaatgaa tcttttcaag    1020
tcagtttttg aaataccccc aatagggttg atatctgcgg aggagcagtc atattttgtt    1080
agatacccac gtaagcactc atcaacattt gcgctaccaa gtactaacaa tccacccgag    1140
tttgggatac cacgaaccca cggcaacagt tgcgcaaaaa gataagaaag aaccattctt    1200
agacgcgcct ggatgttttg taaagccaag ttctcgattt gagatccccc aaatattttg    1260
tatattggtt ttttgccagt ggctacttcg aataaggaca ccacactgga taccaatgag    1320
tccatcttta aatccacgtg gtaagatcca attgcattgg aaaggtcctt tgctctgttt    1380
cttgtctcct tggatgaatt ttccgtaccc atgaaacagg agtgaaatat ttttgaggct    1440
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tcaggagagt gatagaaagg ctcgcggact tttgttggac acactgtagg atcaaatctg    1740
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gaggcttgta ggccacgaga catgacagct gcacgataac tcctcacctc ttctaggtcc    1860
acagtagcag taactacttc cacatcatct agcgaaaatt gtgaaccttg ggctacaatt    1920
gtaccattga tggcaattag tgcacagcca tcataatata atctgtcacc atcacaacct    1980
ctttgatttg catacaagta aacaccacca caacgtttag tggcatttaa aattaggtct    2040
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ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat    3120
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cgataagaaa aggcaatttg tagatgttaa ttcccatctt gaaagaaata tagtttaaat    3600
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tgcaagttta aattcagaaa tatttcaata actgattata tcagctggta cattgccgta    3720
gatgaaagac tgagtgcgat attatgtgta atacataaat tgatgatata gctagcttag    3780
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tccggaaaac gcaagcgcaa agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata  13260
gctagactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa ttgcc                  13305
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gaggcttgta ggccacgaga catgacagct gcacgataac tcctcacctc ttctaggtcc    1860
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gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg  12180
atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag  12240
cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg  12300
gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc  12360
atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt  12420
aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc  12480
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac  12540
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa  12600
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca  12660
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc  12720
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata  12780
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta  12840
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca  12900
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga  12960
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg  13020
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg  13080
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg  13140
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag  13200
aaaaaaagga tctcaagaag atccggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg  13260
cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga  13320
attgcc                                                             13326

Claims (11)

1.获得具有增加的胁迫抗性的植物的方法,其包括
a.向植物细胞中引入嵌合基因获得转基因细胞,所述嵌合基因含有以下有效连接的DNA片段:
i.可在植物中表达的启动子;
ii.编码来自酵母或真菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径中的酶的DNA区,其中所述DNA区编码含有选自SEQ ID No.:2或SEQ ID No.:4的氨基酸序列的酶;
iii.参与转录终止和多聚腺苷酸化作用的3’末端区;
b.再生所述的转基因细胞以获得转基因植物群;和
c.从所述转基因植物群中选择表现为增加的胁迫抗性的植物或选择在胁迫条件下与类似的非转基因植物相比表现为降低的活性氧水平或维持高水平NADH的植物。
2.根据权利要求1的方法,其中所述DNA区含有SEQ IDNo.:1或SEQ ID No.:3的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2的方法,所述方法还包括将所述植物与其他植物杂交的步骤。
4.权利要求1或2任一项中描述的嵌合基因。
5.含有权利要求4所述嵌合基因的植物细胞。
6.权利要求5的植物细胞,其为芸苔属植物的植物细胞。
7.权利要求5的植物细胞,其选自棉花、油料种子油菜、小麦、玉米、大麦、向日葵、稻、燕麦、甘蔗、大豆、菊苣、莴苣、番茄、烟草、马铃薯、甜菜、木瓜、菠萝、芒果或拟南芥植物细胞。
8.权利要求5的植物细胞,其为蔬菜植物细胞。
9.根据权利要求5或6或7或8所述的植物细胞,其特征还在于在胁迫条件下与不含这类嵌合基因的类似植物细胞相比,其活性氧水平更低。
10.根据权利要求4的嵌合基因用于增加植物胁迫抗性的用途。
11.根据权利要求4的嵌合基因的用途,所述用途为在胁迫条件下降低植物或植物细胞中活性氧水平或在胁迫条件下维持植物或植物细胞中NAD水平。
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