CN1360466A - 耐缺铁性稻类的构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了即使在缺铁地区仍可生长的耐缺铁性禾本科植物,更具体而言,耐缺铁性且即使在石灰性碱性土壤中仍能旺盛生长的禾本科植物,其是通过将禾本科植物中麦根酸生物合成途径中的酶的基因转移到禾本科植物中来构建的。本发明还公开了构建具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法,其包括将麦根酸生物合成途径中的酶(优选烟酰胺氨基转移酶;NAAT)的基因转移到禾本科植物中。本发明亦公开了由上述方法构建的禾本科植物;栽培上述具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法;通过所述栽培获得的作物。即,耐缺铁性的新禾本科植物的构建。

Description

耐缺铁性稻类的构建

技术领域

本发明涉及耐缺铁性禾本科植物的生产方法、经此法获得的禾本科植物、种植所述禾本科植物的方法以及经此法获得的作物。

更具体而言，本发明涉及通过引入基因来生产耐缺铁性禾本科植物，其中所述基因编码禾本科植物的麦根酸(mugineic acid)合成途径中的酶，更优选所述酶是烟酰胺氨基转移酶。

背景技术

地球上90％的土壤是存在某种问题的不良土壤。通常，不良土壤根本性地和在一定程度上缺乏植物生长所必需的元素，因此，植物生长受阻，或者因土壤含有大量重金属而发生生长紊乱。典型的不良土壤是旱地盐积土(salt accumulated soil)。在这种土壤中，因人为漫灌或长期干旱而积聚了NaCl和Na₂CO₃，或者在表土层中积聚了CaCO₃或CaSO₄。盐成土引起盐密度紊乱，石灰性土壤引起缺铁紊乱。

地球上约30％的耕作土壤据说是潜在的缺铁地区(Wallece等(1960))。半干旱地区的石灰性土壤具有因毛细管效应从地心物质中洗脱出的石灰质成分，其积聚到地表面上。在此土壤中，pH升高成碱性，因此，土壤中的铁以Fe(OH)₃的形式存在并具有极低的溶解度。

在这些土壤中生长的植物具有缺铁失绿症，其生长受阻或者死亡。

高等植物的获铁体系分为两类：策略I体系和策略II体系。策略I体系是除禾本科植物外的高等植物的获铁体系，其中，土壤中不可溶的三价铁被存在于根部细胞表面上的三价铁还原酶还原，然后被二价铁转运蛋白吸附。在具有该体系的那些植物中，有些具有如下体系，其释放质子到根围中，通过降低根围的pH来增加三价铁还原酶的活性；有些具有如下体系，其释放酚类化合物到根围中，并通过Fe(III)-酚化合物螯合物来向细胞表面上的三价铁还原酶提供Fe(III)。近期的研究分离了转运蛋白IRTl(Eibe等(1996))，其特异性地出现在arabidopsis thaliana的根部，并分离了arabidopsis thaliana的三价铁还原酶的基因(Robinson等(1997))。

策略II体系是仅在单子叶植物中的禾本科植物中观察到的获铁体系。禾本科植物释放出在缺铁环境中具有三价铁螯合活性的麦根酸，并从根吸收作为“Fe(III)-麦根酸”复合体的铁(Takagi等(1984))。已知有7种麦根酸类(MA)：麦根酸(MA)、2’-脱氧麦根酸(DMA)、3-羟基麦根酸(HMA)、3-表羟基麦根酸(epiHMA)、燕麦蛋白酸(avenin acid；AVA)、distichon acid和表羟基脱氧麦根酸(epiHDMA)。如图1所示，所有这些麦根酸(MA)都是用甲硫氨酸作为前体合成的(Shojima等(1999)，Ma等(1998))。

麦根酸的分泌具有昼夜节律(Takagi等，同上)，在日落后其分泌达到顶峰，而在夜间不分泌。此外，观察到在缺铁性大麦中在分泌前颗粒膨胀，在分泌后颗粒萎缩(Nishizawa等(1987))。因此相信，麦根酸是在所述颗粒中合成的。这些事实说明禾本科植物对缺铁作出的反应不仅是通过麦根酸的合成来形成的，而且还是通过一种复杂系统来形成的，所述复杂系统例如为缺铁信号的传递和根部形状的变化。

据报道，烟酰胺合成酶的基因已被分离且该基因是受缺铁诱导的，所述烟酰胺合成酶是一种与麦根酸合成途径相关的酶。(Higuchi等(1999))。此外，烟酰胺氨基转移酶(NAAT)基因已被分离且其是受缺铁诱导的(Takahashi等(1997))。

此外，通过使用从缺铁大麦根和对照大麦根中提取的mRNA进行示差筛选，分离了专一地在缺铁条件下被诱导出的基因Ids1、Ids2和Ids3。Ids1是编码金属硫蛋白的基因(Okumura等(1991))。Ids2是一个这样的基因，其中从其遗传序列推出的氨基酸序列与氢氧化酶是同源的(Okumura等(1994))。Ids3也是这样一个基因，其中从其遗传序列推出的氨基酸序列与氢氧化酶是同源的(Nakanishi等(1993))。在表羟基麦根酸合成途径中存在两种氢氧化物反应，相信催化该反应的酶是由此基因编码的。

此外，由大麦根缺铁所诱导的蛋白的例子是IDS3蛋白、腺嘌呤-核糖-磷酸转移酶(Itai等(1999))、甲酸脱氢酶(Suzuki等(1998))和36kDa蛋白(Irifune(1991))。禾本科植物在缺铁条件下生物合成麦根酸。此时，相信根部所含的甲硫氨酸减少，以便在甲硫氨酸循环中合成了甲硫氨酸，同时为了将产生的腺嘌呤转化成AMP，诱导出腺嘌呤-核糖-磷酸转移酶(Itai等，同上)。

甲酸脱氢酶分解在甲硫氨酸循环中产生的甲酸。据报道，缺铁性禾本科植物的根部中的线粒体变形，电子传输系统的能量降低(Mori等(1991))。相信甲酸脱氢酶是受缺铁产生的厌氧条件所诱导的，NADH是作为能量来源而被提供的。

随着人口的增加，食物增产是未来人类生存条件的一个重要的问题。从古代以来，禾本科植物就是最重要的食物之一，但是，事实上，禾本科植物很难在缺铁地区生长。如果有可能在缺铁地区种植禾本科植物，食物增产将是可能的，因此，其作为一种增加食物产量的办法已受到人们的关注。

发明公开

本发明的一个目的是提供可在缺铁地区生长的耐缺铁性禾本科植物。

更具体而言，本发明的一个目的是通过将禾本科植物的麦根酸生物合成途径中的一种酶的基因导入禾本科植物中来提供耐缺铁性禾本科植物，所述禾本科植物即使在石灰性碱性土壤中仍旺盛地生长。

本发明涉及通过将编码麦根酸生物合成途径中的酶的基因导入禾本科植物来生产具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法，更具体而言，涉及通过导入基因naat来生产具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法，其中所述酶是烟酰胺(nicotianamine)氨基转移酶(NAAT)。

此外，本发明还涉及所述具有改善的铁吸收性的禾本科植物的生长方法，以及经所述生长获得的作物。

附图简述

图1显示了缺铁大麦根的麦根酸生物合成途径及其根围环境。

图2显示了用于禾本科植物转化的双元载体pIG121Hm的遗传序列，其中插入了naat-A的cDNA。

图3是照片而非图片，其中显示了通过Southern杂交方法检测所导入的基因的结果。图3中的WT显示了野生型禾本科植物的情况，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2显示了具有35S启动子的转化子。

图4显示了测量在水培溶液中在含铁(+Fe)和缺铁(-Fe)条件下培育的根中的NAAT活性的结果。在图4中，透明部分显示了+Fe的情况，阴影部分显示了-Fe的情况。WT显示了野生型禾本科植物，1-5、1-6和1-7显示的是转化子的情形。

图5是照片而非图片，其中显示了移植至碱性土8周后的各禾本科植物的生长状态，图5中的对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是被转化的禾本科植物。

图6是显示移植至碱性土后的各禾本科植物的高度变化过程的图。黑点显示了转化子15-2，黑正方形显示了转化子8-1，白点显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物。

图7显示了包括分离的基因组naat的噬菌体DNA的限制性酶图谱。在图7中，E表示EcoRI，H表示HindIII，B表示BamHI，N表示NotI。在两个位置处的NotI位点是位于λFIXII臂上的NotI。

图8显示了用于禾本科植物转化的双元载体pBIGRZ1的遗传序列，其中插入了NAAT基因组的片段。在图8中，NPTII是卡那霉素抗性基因，HPT是潮霉素抗性基因，GUS是具有内含子的β葡糖醛酸糖苷酶基因，LacZ是β半乳糖苷酶基因，35P是35S启动子，NP是NOS启动子，NT是NOS终止子，MCS是多克隆位点，Riori是Ri质粒复制起点。

图9是显示所得基因组naat的碱基序列的图。

图10是显示通过比较naat cDNA序列和naat基因组序列而确定的naat碱基序列、naat-A和naat-B的5’上游、外显子、内含子和3’下游的碱基序列的图。在图10中，大写字母显示了在cDNA上转录的外显子部分，小写字母显示了其余的部分。

图11是所得基因组片段的示意图。在图11中，E是EcoRI，H是HindIII，B是BamHI。

图12显示了naat-A和naat-B的cDNA中的内含子的大小。

图13显示了以单字母密码表示的从cDNA推定的NAAT-A的氨基酸序列的氨基酸。

图14显示了以单字母密码表示的从cDNA推定的NAAT-B的氨基酸序列的氨基酸。

图15是照片而非图片，其显示了移植至碱性土后10周的各禾本科植物的生长状态，在图15中，对照是其中仅导入了载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。

图16是显示移植至碱性土后的其中导入了基因组naat的各禾本科植物的高度变化过程的图。在图16中，左边的禾本科植物是用naat转化的禾本科植物，右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。

发明的最佳实施方案

所述策略II是在单子叶植物中仅在禾本科植物中观察到获铁体系，其利用了生物合成并释放麦根酸的方法来获得铁。因此，研究了提高麦根酸生物合成途径(参见图1)中的酶的方法。

本发明人首先注意到了作为麦根酸合成途径中的一个酶的烟酰胺氨基转移酶(NAAT)，然后努力导入基因naat。奇迹般地发现导入了所述基因的禾本科植物即使在石灰性碱性土中仍能旺盛生长。

利用XbaI和SacI位点，将烟酰胺氨基转移酶(NAAT)naat-A的cDNA整合到pIG121Hm中，制备了图2中所示的双元载体。通过导入到农杆菌中，所得载体被用于转化。

禾本科植物的转化按照Hiei等的方法进行(Hiei等(1994))，并将“Tsukinohikari”用作所述材料。从胚盘中诱导出的愈伤组织沉浸入所述转入的农杆菌悬浮液中并在其中感染，获得再生体(T1植物)。最后，从种子获得34株经转化的禾本科植物。

通过Southern杂交方法检测所导入的基因。结果如图3所示。在图3中，WT显示了野生型禾本科植物的情况，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2显示了具有35S启动子的转化子。如图3所示，所有转化子具有过表达的naat-A。此外，发现在这些35S转化的禾本科植物中，8-1和15-2分别具有所导入naat的至少5个拷贝和2个拷贝。

与野生型和其中仅导入载体的禾本科植物相比，导入了基因naat的禾本科植物被认为存在烟酰胺氨基转移酶(NAAT)的过度释放，由此，麦根酸合成途径被激活，从而大量产生对于铁摄取所必需的麦根酸。

因此，首先研究了这些植物种中的NAAT活性。发芽后3周的幼苗(T2)在水培溶液中在含铁(+Fe)和缺铁(-Fe)条件下培育2周。NAAT活性的测量结果如图4所示。在图4中，透明部分显示了+Fe的情况，阴影部分显示了-Fe的情况。WT显示了野生型禾本科植物的情况，1-5、1-6和1-7显示了转化子的情况。

结果，对于+Fe和-Fe两种情况，经转化的禾本科植物比非转化的野生型禾本科植物(WT)具有较高的比活，此外，还发现在-Fe条件下所述比活进一步增加。这说明基因导入不仅导致了高NAAT活性，而且在缺铁条件或不可溶性铁的条件下转化子的NAAT活性得以显著促进。换言之，认为它已成为对缺铁环境或不可溶性铁的环境具有高耐受性的物种。

基于以上描述，发现基因naat的导入提高了NAAT的活性。尽管如此，仍调查了这些转化子是否能在实际缺铁土壤中生长。当将35S-naat-A转化的禾本科植物移植至碱性土后，其叶子在移植后至多2周内变黄，然而，在4-5周后，新叶子变成暗绿色并开始恢复。图5是显示移植至碱性土8周后的生长状态的照片。在图5中，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是经转化的禾本科植物。发现与对照相比，经转化的禾本科植物具有显著较好的生长。此外，在图6中显示了移植至碱性土后的各禾本科植物的高度变化过程。在图6中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。黑点显示转化子15-2，黑正方形显示转化子8-1，白点显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。

如上所述，35S转化的禾本科植物8-1具有所导入naat基因的至少5个拷贝，35S转化的禾本科植物15-2具有所导入naat基因的至少2个拷贝。从图6中的植物高度判断，基因的拷贝数是不相关的，表示只要导入了所述基因，禾本科植物就获得了耐缺铁性。

如上所述，所述基因的导入提高了禾本科植物的麦根酸合成途径中的酶的活性，此外还发现由此附加了耐缺铁性。

对于在本发明麦根酸合成途径中的酶，只要其是图1所示麦根酸生物合成途径中的酶且编码所述酶基因的导入增加其活性，就是可接受的。如上所述，在候选物中，烟酰胺氨基转移酶(NAAT)和烟酰胺合成酶是可取的。编码本发明禾本科植物的麦根酸合成途径中的酶的基因是cDNA或从基因组衍生的基因。如下文所述，基因组的应用是本发明的优选实例。

因此，对于本发明的禾本科植物，只要其是可经策略II体系吸收铁的植物就是可接受的，且不限于理论意义上的禾本科植物。本发明禾本科植物的优选实例是稻类植物、玉米、高粱、小麦、大麦和燕麦。这些禾本科植物可应用本发明的方法而不论其品种，并可生产出具有所导入的靶基因的禾本科植物。

本发明的启动子不受限制，只要其可产生靶酶。可使用35S启动子，更具体而言，可使用CaMV35S启动子。

本发明的载体不受具体的限制，只要其可在转化过程中被优选使用。本发明转化方法不限于所述使用农杆菌方法的方法，可使用多种(例如，使用粒子枪)的转化方法等。所形成的禾本科植物的细胞不限于来自所述愈伤组织的细胞，可使用各种细胞，但是，通常优选使用来自愈伤组织的细胞。

本发明所述及的缺铁性可以是其中缺乏铁的一种状态，但是优选其是这样一种状态，其中铁的存在形式很难被植物吸收，根据植物的类型，可确定其缺铁与否。因此，本发明中的耐缺铁性的定义是指受测植物对很难吸收土壤中的铁这一困难环境的抵抗力。

然后，本发明人努力将基因组naat代替naat的cDNA来进行导入。

对于基因组naat，使用利用从大麦(Horudeum vulgare L.var.Igri)中提取的基因组DNA来制备的文库(由Stratagen Corp.生产)。利用限制性酶Sau3AI部分切割所述文库，并将其导入λFIXII载体的XhoI位点。对于探针，使用提前分离的naat-A的完整cDNA。将大肠杆菌XL1-Blue(大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2))用作宿主。

作为筛选的结果，获得了5个噬菌体。从中分离了各噬菌体DNA，并进行限制性酶作图。发现在所有情况下相同的片段增加。即，发现所得的5个噬菌体来自基因组的相同部分。其被认为含有在探针中使用的naat。因此，测定其中之一的碱基序列，如图7所示。

图7所示的噬菌体DNA被插入到质粒载体pBIGRZ1的NotI位点，其中可插入10kb或更大的片段，可使用农杆菌进行禾本科植物的转化(参见图8)。

此外，将图7所示的至多11.0kb的片段分成4部分，即A-D，将它们导入质粒载体pBluescript SK(-)的EcoRI位点(B、C)或NotI和EcoRI位点(A、D)。

对于片段A-D，使用基于质粒上的序列的引物(M13正向引物，M13反向引物)从片段的两端确定了碱基序列。为了确定DNA碱基序列，使用Shimadzu，Ltd.的DNA测序仪DSQ-2000L。

序列测定详见实施例。

序列表中的SEQ ID NO：1显示了所确定的10966bp碱基序列。此外，完整序列如图9所示(无碱基编号)。

基于所得的碱基序列，该10966bp基因被发现是编码所获得的naat-A和naat-B的大麦基因组的片段。其位次为naat-B、naat-A。

图10中显示了通过cDNA比较确定的naat-A和naat-B的5’上游、内含子和3’下游。在图10中，大写字母显示了在cDNA上转录的外显子部分，小写字母显示了其余的部分。外显子部分的碱基编号见下。

图11是所得基因组片段的示意图。外显子部分以阴影部分表示。两个基因均包含6个内含子和7个外显子。此外，内含子的插入位置对于各基因是同源的。图12显示了内含子在cDNA中的位置和内含子的大小。

由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列分别如图13和14所示。

按照所述35S转化的禾本科植物的转化方法来进行禾本科植物的转化，其中将所得的大麦基因组naat导入。

然后，对导入所得基因组naat的禾本科植物的耐缺铁性进行检查。在所得的再生体(T1)中，使用了39个植株和15个其中仅导入载体的对照，以与35S转化的植物相似的方法进行检查。从移植后第5周起，每周或隔周测量植物的高度。每4-5周将它们两次移植至其中土壤尺寸渐增的罐中。

到移植至碱性土后第2周，经转化的具有基因组naat的禾本科植物的叶子变黄，但在第4-5周，新叶子变成暗绿色并开始恢复，然后他们开始旺盛生长。与此相比，其中仅导入载体的对照组在很长的时间内带有黄叶，从约第8周，新叶开始变绿。

图15是显示移植至碱性土10周后的禾本科植物的生长状态的照片。图15中的对照显示的是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。右边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。

图16显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程。在图16中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。在图16中，左边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物，右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。

基于以上描述，发现基因组naat的导入使得禾本科植物具有附加的耐缺铁性。实施例

使用以下实施例对本发明进行详细地描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例I：禾本科植物的转化方法，其中存在具有CaMV35S启动子的过表达的Naat。

图2所示的双元载体是通过使用XbaI和SacI位点将遗传naat的cDNA整合到pIGl21Hm中来制备的。将这些载体导入农杆菌中用于转化。

禾本科植物的转化按照Hiei等的方法进行(Hiei等(1994))，并将“Tsukmohikari”用作所述材料。首先，带壳种子灭菌，在包含N6无机盐、30g/L N6维生素、2mg/L蔗糖，2，4-D和2g/L脱乙酰吉兰糖胶的愈伤组织诱导性培养基(pH5.8)上的种子在25℃下在60μmol/m²s和16小时光照/8小时避光条件下培养3周，从胚盘中诱导出愈伤组织。

在愈伤组织移植到新的培养基中在25℃下在光亮处培养3天后，用农杆菌悬浮液培养基(pH5.8)(20g/L AA无机盐、氨基酸、B5维生素、2mg/L蔗糖、0.2mg/L 2，4-D、10mg/L细胞分裂素和乙酰丁香酮)使愈伤组织沉浸入农杆菌悬浮液中。然后，在用纸巾使其变干后，其在共存培养基(pH5.2)(30g/L N6无机盐和N6维生素、10g/L蔗糖、2mg/L葡萄糖、10mg/L 2，4-D和2g/L乙酰丁香酮脱乙酰吉兰糖胶)中在暗处于28℃感染3天。

然后，通过用含500mg/L Claforan的无菌洗涤溶液漂洗来去除农杆菌，将愈伤组织放置到含50mg/L潮霉素(pH5.8)的选择性培养基中(30g/L N6无机盐和N6维生素、2mg/L蔗糖、2g/L 2，4-D、500mg/L脱乙酰吉兰糖胶、50mg/L Claforan和潮霉素)，并在25℃下在光亮处培养3周。

培养后，将其转移到再分化培养基(pH5.8)中(30g/L MS无机盐和MS维生素、30g/L蔗糖、2g/L山梨糖醇、1mg/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L NAA、500mg/L BAP、50mg/L Claforan、4g/L潮霉素和脱乙酰吉兰糖胶)，将在3-5周内被再分化的再生体(T1植物)转移至检查培养基。检查培养基(pH5.8)包含30g/L MS无机盐和MS维生素、50mg/L蔗糖、8g/L潮霉素和琼脂。

将生长至充满培养皿的植物定植(establish)4-5天，转移至混有1∶1比例的合成培养土(BONSOL 1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)和蛭石的土壤中，获取种子。从而获得34株经转化的禾本科植物。实施例2：使用Southern杂交方法检测所导入的基因

研磨在实施例1中获得的T1植物的叶子，通过改进的C-TAB方法提取基因组。用Hind III处理所提取的基因组，通过使用0.8％琼脂糖凝胶电泳来进行分离。将这些印迹到尼龙膜上。使用在探针上的naat内部序列产生的引物，以及通过PCR用³²P标记的探针，进行杂交。然后使用BAS 2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)检测条带。

Southern杂交方法的结果如图3所示。在图3中，WT显示野生型禾本科植物，对照显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2是其中具有35S启动子的naat-A过表达的禾木科植物的情况。

基于图3所示的结果，发现在35S转化的禾本科植物中，至少5个naat拷贝和至少2个naat拷贝被分别引入到8-1和15-2中。实施例3：使用碱性土检查耐缺铁性

使用包括以下组合物的古壳层土(fossil shell soil)作为样品土。

水含量                             0.48％

总磷酸盐                           0.12％

总钾                               0.12％

总硅酸盐                           22.79％

总石灰                             37.82％

总镁                               0.91％

总锰                               0.018％

总硼                               0.003％

碱                                 38.80％

盐酸不溶性物质                     28.88％

氧化铁                             0.99％

氧化铝                             5.59％

锌                                 0.002％

所述土壤中的可溶性铁含量是22ppm，pH是8.78，电阻是0.03mΩ。

如下进行对35S转化的植物的检查，首先，从再生体(T1)获得的种子播种在含50mg/L的MS固体培养基上并进行筛选，在它们定植后，使用生长到20-25cm的幼苗植物(T2)。

对27个品种的34株植物中的16个进行耐缺铁性检查。检查方法如下：将纸巾和滤纸剪成圆形，并放置到塑料黑罐(0.5L)的底部，用碱性土添满。将植物转移到罐中，然后从罐底部放入位于罐底2-3cm处的水培溶液(Kasugai溶液：7×10^-4M K₂PO₄，1×10^-4M KCl，1×10^-4MKH₂PO₄，2×10^-3M Ca(NO₃)₂，5×10^-4M MgSO₄，1×10^-5M H₃BO₃，5×10^-7M MnSO₄，5×10^-7M ZnSO₄，2×10^-4M CuSO₄，1×10^-8M(NH₄)₃MoO₂₄，1.5×10^-4M Fe-EDTA)中，在温室中生长，白天30℃，夜晚25℃。将碱性土在3-4周后增加至1L，在8-9周后增加至2L并转移。从移植后第2周，每周或隔周测量植物高度。

对在+Fe(铁存在)或-Fe(缺铁)水培溶液中生长的经转化的禾本科植物(35S-naat禾本科植物)的NAAT比活的测量如下进行。发芽后3周的幼苗植物(T2)在+Fe和-Fe水培溶液中生长，测量各植物根部的NAAT活性。结果如图4所示。在图4中，透明部分显示了+Fe的情况，阴影部分显示了-Fe的情况。WT显示了野生型禾本科植物的情况，1-5、1-6和1-7显示了转化子的情况。

对于+Fe和-Fe两种情况，经转化的禾本科植物比非转化的野生型(WT)禾本科植物具有较高的比活，在-Fe条件下其比活甚至更高(参见图4)。实施例4：使用碱性土检查耐缺铁性

将35S-naat-A转化的禾本科植物转移至碱性土并观察其生长情况。

35S-naat-A转化的禾本科植物叶子变黄，直至移植后第二周，然而，在第4-5周，新叶子变成暗绿色并开始恢复。因此发现naat的导入使禾本科植物具有耐缺铁性。

图5是显示移植至所述土壤8周后的禾本科植物的生长状态的照片。在图5中，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是经转化的禾本科植物。

图6是显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程的图。在图6中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。黑点显示转化子15-2，黑正方形显示转化子8-1，白点显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。

发现通过导入基因naat，可给禾本科植物添加耐缺铁性(参见图5和6)。实施例5：分离naat-A和B基因组克隆

按照“Cloning and Sequence”(Nosonbunka)进行筛选。

将从Stratagnen Corp.购买的λFIXII文库用作文库。其是使用从大麦(Horudeum vulgare L.var.Igri)提取的基因组DNA制备的。基因组DNA用限制性酶部分切割并导入λFIXII载体的XhoI位点。文库的插入片段大小是9-23kb。

(1)大肠杆菌(XL1-BLUE MRA(P2))在NZCYM液体培养基(10gNZ胺、5g NaCl、1g水解酪蛋白氨基酸、5g细菌用酵母抽提物、2gMgSO₄ 7H₂O和约6mL 1N NaOH用1L蒸馏水(pH7.5)稀释并用高压灭菌)中培养过夜，然后离心，然后悬浮在20mL 10mM MgSO₄溶液中。

(2)100mL的该大肠杆菌悬浮液和100mL的噬菌体稀释液(其量在筛选平板(9cm×13cm)上产生25,000个噬斑进行混合，37℃放置20分钟，然后与8mL的50℃0.7％上层琼脂(每100mL加入0.7g琼脂糖)混合，并播种到筛选板上(9cm×13cm)。板放置在37℃，然后培养直至噬斑大小达到0.5mm。

(3)将尼龙膜HYBOND-N(Amersham Corp.)剪成板的大小，然后放置到上层琼脂糖的上部30秒。将其放到用变性液(0.5M NaOH、1.5MNaCl)浸过的滤纸上，并使表面与噬斑的上面接触。将另一膜放置到上层琼脂上，放置1分钟。类似地，将其放到用变性液浸过的滤纸上。在放置5分钟后，将第二个膜移至用中和液(0.5M Tris-HCl，pH8.0，1.5MNaCl)浸过的滤纸上。在放置5分钟后，用2xSSPE(0.02M NaH₂PO₄ pH7.4、0.3M NaCl、2mM EDTA)充分洗涤两次，然后干燥。

(4)为了使用提前分离的naat-A的全长cDNA，将位于质粒载体pYH23的HindIII位点和NotI位点上的那些切下并纯化。使用随机引物DNA标记试剂盒VER.2(Takara Shuzo CO.，Ltd))用[α-³²P]dATP对其进行标记。

用预热至65℃的30mL杂交缓冲液(6x SSPE、5x Denhart溶液、0.1％SDS、100mg/mL已变鲑精DNA)在65℃进行预杂交1小时，然后更换为杂交缓冲液(25mL)。

将上述探针加入该溶液中，在65℃杂交12小时。膜用预热至65℃的清洗液(5x SSPE)清洗两次，共10分钟，用65℃的高度严格清洗液(2 XSSPE、0.1％SDS)清洗一次。膜用莎伦包装膜包裹，过夜显影至成像板(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)，用影像分析仪(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)获得结果。

使用的试剂为20 X SSPE(0.2M NaH₂PO₄ pH7.4、3M NaCl和20mM EDTA)、50x denhart溶液、5g FICOLL 400、5g聚乙烯吡咯烷酮(MW 360,000)和5g小牛血清白蛋白，其溶解在500mL蒸馏水中，用0.45mm滤器过滤。

(5)将在两种膜上均出现噬斑的情况确定为阳性，将与所述位置相符的噬斑从培养皿中切下。将切下的噬斑放入SM溶液(50mM Tris-HClpH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO₄和0.01％明胶)，并在4℃下保存。然后，使用该噬菌体溶液以相似的方法进行第二和第三次筛选。最后，得到5个噬菌体。

分离上述获得的5个噬菌体中的每一个的DNA，并进行限制性酶作图。发现对于所有情况，相同的片段增加。即，发现所得的5个噬菌体来自基因组的相同部分。此外，其被认为含有用于探针的naat。因此，测定其中之一的碱基序列，如图7所示。在图7中，E表示EcoRI，H表示HindIII，B表示BamHI，N表示NotI。在两个位置处的NotI位点是位于λFIXII臂上的NotI。实施例6：亚克隆化和碱基序列的确定

(1)图7所示的噬菌体DNA被插入到质粒载体pBIGRZ1的NotI位点，其中可插入10kb或更大的片段，可使用农杆菌进行禾本科植物的转化。将第1个NotI位点至图7所示噬菌体DNA 11.0kb处的NotI位点的11.0kbp片段切下并插入质粒载体pBIGRZ1的NotI位点(参见图8)。在图8中，NPTII是卡那霉素抗性基因，HPT是潮霉素抗性基因，GUS是具有内含子的β葡糖醛酸糖苷酶基因，LacZ是β半乳糖苷酶基因，35P是35S启动子，NP是NOS启动子，NT是NOS终止子，MCS是多克隆位点，Riori是Ri质粒复制起点。

换言之，确定了该11.0kb片段的碱基序列。对于其余禾本科植物的转化，使用由此产生的构建体。

(2)pBIGRZ1稳定地维持在大肠杆菌(XL1-BLUE)中。对含有该构建体的大肠杆菌进行培养，使用质粒调节剂PI-50α(KurashikiBoseki Co.，Ltd.)从中提取质粒。

(3)将图7所示至多11.0kb的片段分成4部分，即A-D，将它们导入质粒载体pBluescript SK(-)的EcoRI位点(B、C)或NotI和EcoRI位点(A、D)。

(4)对于片段A-D，使用基于质粒上的序列的引物(M13正向引物，M13反向引物)从片段的两端确定碱基序列。使用Shimadzu，Ltd.的DNA测序仪DSQ-2000L来确定DNA碱基序列。

(5)对各片段确定对碱基序列的上述部分进行进一步读码的引物并制备该引物，制备用于证实已读序列的反向引物，依次确定碱基序列。最后，从5’和3’端双向确定所有片段的序列。用于确定各片段碱基序列的引物序列如下所示。

为应用于DSQ-2000L，用异硫氰酸荧光素FITC在5’端标记这些引物。片段A的引物

名称：序列F-A1F：FITC-5′-gct act agt agt att cct ggt gta g

名称：序列F-A1R：FITC-5′-gga gta cta cta gac tac acc agg a

名称：序列F-A2F：FITC-5′-aca tgc gca tgc atg aat tgc cg

名称：序列F-A2R：FITC-5′-caa ttc atg cat gcg cat gtg cc片段B的引物

名称：序列F-B1F：FITC-5′-ggt caa gta tgc agt atg ttg gaa c

名称：序列F-B1R：FITC-5′-gtt cca aca tac tgc ata ctt gac c

名称：序列F-B2F：FITC-5′-cta gaa gcc tat gga tgt ttc ttt tgg

名称：序列F-B2R：FITC-5′-cca aaa gaa aca tcc ata ggc ttc tag

名称：序列F-B3F：FITC-5′-agt tct tat caa ttt ccg aga tga c

名称：序列F-B3R：FITC-5′-ata gtc atc tcg gaa att gat aag a

名称：序列F-B4F：FITC-5′-agt ggt cac cat gcg gac caa cac c

名称：序列F-B4R：F1TC-5′-ggt gtt ggt ccg cat ggt gac cac t片段C的引物

名称：序列F-C1F：FITC-5′-cac cgg cca gtt caa ctg cta cgc

名称：序列F-C1R：FITC-5′-gcg tag cag ttg aac tgg ccg gtg

名称：序列F-C2F：FITC-5′-ttt gga gga gat cca tga cga cat a

名称：序列F-C2R：FITC-5′-tat gtc gtc atg gat ctc ctc caa a

名称：序列F-C3F：FITC-5′-tct tct cat atg cta ctg tgg gga t

名称：序列F-C3R：FITC-5′-tga cat gca aca cag gga cat gag c片段D的引物

名称：序列F-D1F：FITC-5′-cat gct gac gaa gag cga ggt cat a

名称：序列F-D1R：FITC-5′-ccc agg ata tga cct tag tgg ttg g

(6)对于不能完全确定的序列部分，使用ABI PRISMTM 310基因分析仪，新合成了以下引物，所述分析仪是PerkinElmer Japan，Inc.的自动DNA测序仪。片段B的引物

名称：序列B5F：5′-gaa tgg caa act ggg tcc gca tta c

名称：序列B5R：5′-gta atg cgg acc cag ttt gcc att c

名称：序列B6F：5′-ctg gtt gtt gtg gcc tgg acg aaa c

名称：序列B6R：5′-gtt tcg tcc agg cca caa caa cca 9

名称：序列B7F：5′-agc aca aac cct acc tat gtt agg c

名称：序列B7R：5′-gcc taa cat agg tag ggt ttg tgc t片段C的引物

名称：序列C4F：5′-tgg aat ttc gcc cgg ggc aag gac

名称：序列C4R：5′-ccc tgt gac aag tgc tct gct acg

名称：序列C5F：5′-tct ggg atc tca gtg cat cca aca

名称：序列C5R：5′-gaa gca tat atc agt caa aca taa cc

此外，为确定片段A和B间以及片段B和C间的连接区，制备了以下引物。使用PerkinElmer Japan，Inc.的自动DNA测序仪ABIPRISMTM 310基因分析仪确定了在(1)中所制备的构建体的碱基序列。对于片段A和B间的边界区

名称：序列A-eF：5′-cac atc ctt tgc ctt gct gaa tat gg

名称：序列B-tR：5′-cag tag tac taa tta atc acc tta gta gc对于片段B和C间的边界区

名称：序列B-eF：5′-caC gat caa cca aag aat gtc ctc c

名称：序列C-tR：5′-tac ttg tat atgcag ctc cag cac

(7)已确定的10,966bp碱基序列在序列表中SEQ ID NO：1已显示。完整的序列参见图9(无碱基编号)。

基于所得的碱基序列，发现这10,966bp基因是迄今获得的编码naat-A和naat-B的大麦基因组的片段。次序是naat-B和naat-A。

图10中显示了通过与所示cDNA比较得以确定的naat-A和naat-B的5’上游、外显子、内含子和3’下游。在图10中，大写字母表示在cDNA上转录的外显子，小写字母代表其余的部分。外显子部分的碱基编号如下。naat-B

第1外显子579-1299(起始密码子6518)

第2外显子1483-1825

第3外显子1922-2140

第4外显子2244-2303

第5外显子2761-2916

第6外显子3263-3356

第7外显子3735-4033(终止密码子3868)naat-A

第1外显子6457-6897(起始密码子6518)

第2外显子7029-7371

第3外显子7479-7697

第4外显子7784-7843

第5外显子8285-8440

第6外显子8738-8831

第7外显子9414-9732(终止密码子9547)

示意图如图11所示。阴影部分为外显子部分。两个基因均是由6个内含子和7个外显子形成的。此外，内含子的插入位置是同源的。图12显示了在cDNA中插入内含子的位置和插入内含子的大小。图13和14显示了由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列。实施例7：导入大麦基因组naat的禾本科植物的转化方法

除了以下(1)至(3)点之外，以与35S转化的禾本科植物相似的方式实施上述实施例6中获得的大麦基因组naat导入禾本科植物的转化方法。

(1)愈伤组织的诱导在28℃在暗处进行，愈伤组织诱导培养基包含0.3g/L N6无机盐和N6维生素、30g/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L蔗糖、2.8g/L 2，4-D、4g/L脯氨酸和脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)。

(2)其用农杆菌在25℃感染，共存培养基包含30g/L N6无机盐和N6维生素、10g/L蔗糖、1g/L葡萄糖、2mg/L水解酪蛋白氨基酸、20mg/L 2，4-D、2g/L乙酰丁香酮和脱乙酰吉兰糖胶(pH5.2)。该过程是通过滤纸敷在上面而进行。

(3)选择时，使用选择培养基，第1周含10mg/L潮霉素，第2周含30μg/L潮霉素，最后2周含50mg/L潮霉素，在28℃下在暗处培养。

使用包含1g/L N6无机盐和N6维生素、水解酪蛋白氨基酸、30g/L蔗糖、2mg/L 2，4-D、250mg/L Claforan、10-50mg/L潮霉素和2g/L脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)的选择培养基，使用包含30g/L MS无机盐和MS维生素、30g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、2g/L水解酪蛋白氨基酸、1.1g/LMES、2mg/L NAA、1mg/L细胞分裂素、250mg/L CLAFORAN、50mg/L潮霉素和4g/L脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)的再分化培养基，在28℃培养。实施例8：检查具有所导入的基因组Naat的禾本科植物的耐缺铁性

以与35S转化的植物相似的方式，对所得再生体(T1)中具有所导入的基因组Naat的禾本科植物的39个植株和15个仅导入载体的对照进行检查，检查它们的耐缺铁性。从移植后的第5周起，每周或隔周测量植物的高度。每4-5周将它们两次转移到土壤尺寸渐增的罐中。

到移植至碱性土后第2周，经转化具有基因组naat的禾本科植物的叶子变黄，但在第4-5周，新叶子变成暗绿色并开始恢复，然后他们开始旺盛生长。与此相比，其中仅导入载体的对照组在很长的时间内带有黄叶，从约第8周，新叶开始变绿。基于这一事实，发现naat的导入使禾本科植物具有耐缺铁性(参见图15和16)。

图15是显示移植至碱性土后的禾本科植物的生长状态的照片。

图15中的对照显示了其中仅导入了载体的对照禾本科植物。右边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。

图16显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程。在图16中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。在图16中，左边的禾本科植物是用基因组naat转化了的禾本科植物，右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。

基于这一事实，发现naat的导入使禾本科植物的耐缺铁性增强。

工业实用性

本发明提供了具有耐缺铁性的新禾本科植物，并提供了可在缺铁栽培区生长的新禾本科植物。

此外，本发明提供了可通过向禾本科植物中导入编码麦根酸合成途径中的酶的基因来获得的具有改善的铁吸收性的禾本科植物的新技术。

                                 序列表<110>科学技术振兴事业团(Japan Science and Technology Corporation)<120>在石灰性土壤中生产耐缺铁性转基因禾本科植物(Creation of the transgenic

 graminaceous plants tolerant to Fe-deficiency in calcareous soils)<130>JA903969<150>JP11-190318<151>1999-07-05<160>1<210>1<211>10966<212>DNA<213>大麦(Horudeum vulgare L.var.Igri)<400>1ctcgatccca ttgcaatggt atgattagct atcaaacgaa agaaagagat ggcatgtgcc      60ctgtgtgtca tccctcactg gcttggcgaa tggcgatacc gagttaggta gagtgttttt     120ttagcatgat gtctgccggc actgccaaga aaactgcgtg cagcggactg caggagagtt     180gagcgatgca tgctttgtga tgagcggagc tgagtgggtg tcactaactg aacccaatca     240gcattgggtg agtcgagtcg agaagcatca tgcttcctgc gtcccgatcc gcttatcttt     300ttctcccaaa ttattaaaga gggatagatg atggtgtgct gggttgggta gagtacgtgc     360atagaaccaa agcgaggcgc cgaaaatatg ccggggataa tggtggcagg ccgcaacggc     420cacgcccgtc agctggcagc ggcgtgccag agcgtgccag agcgtgcgcg cgtgcgtgct     480tcttgctgcc ggccccggtt cgtgtgcggt cagagcaacg gctatatagg accgtcaatc     540accgctactc aatccgtccc caactcgttt cctattaccg ctactagtag tattcctggt     600gtagtctagt agtactcctc ctcctccttc tcctcctacc cgtttcctca tggccaccgt     660acgccagagc gacggagtcg ccgcgaacgg ccttgccgtg gccgcagccg cgaacggcaa     720gagcaacggc catggcgtgg ctgccgccgt gaacggcaag agcaacggcc atggcgtgga     780tgccgacgcg aacggcaaga gcaacggcca tggcgtggct gccgacgcga acggcaagag     840caacggccat gccgaggcca ctgcgaacgg ccacggcgag gccactgcga acggcaagac     900caacggccac cgcgagagca acggccatgc tgaggccgcc gacgcgaacg gcgagagcaa     960cgagcatgcc gaggactccg cggcgaacgg cgagagcaac gggcatgcgg cggcggcggc    1020agaggaggag gaggcggtgg agtggaattt cgcgggtgcc aaggacggcg tgctggcggc    1080gacgggggcg aacatgagca tccgggcgat acggtacaag atcagcgcga gcgtgcagga    1140gaaggggccg cggcccgtgc tgccgctggc ccacggggac ccgtccgtgt tcccggcctt    1200ccgcacggcc gtcgaggccg aggacgccgt cgccgccgcg ctgcgcaccg gccagttcaa    1260ctgctacccc gccggcgtcg gcctccccgc cgcacgaagg taacaacaac aacaacacaa    1320gaacaatttc cttttcgcgt gtcgtgtcgc gcggcaatcc atgcatgcgc atgtgccgct    1380ttcacgtgtc cgtccgtccg tccaccgttc cttcctcctc cctacgccca tgagaaatct    1440gaccttctcc caccttatac caaacaaaac aaaaaaacac agcgccgtgg cagagcacct    1500gtcgcagggc gtgccgtaca tgctatcggc cgacgacgtc ttcctcaccg ccggcgggac    1560ccaggcgatc gaggtcataa tcccggtgct ggcccagacc gccggcgcca acattctgct    1620ccccaggcca ggctacccaa actacgaggc gcgcgccgcg ttcaacaggc tggaggtccg    1680gcatttcgac ctcatccccg acaaggggtg ggagatcgac atcgactcgc tggaatccat    1740cgccgacaag aacaccaccg ccatggtcat cataaacccc aacaacccgt gcggcagcgt    1800ttactcctac gaccatctgt ccaaggtttc acatcctttg ccttgctgaa tatggattca    1860gttcagtgca cctgctgaat tctttttgcc aatcgcatac tgactgatgt tgctcaatta    1920ggtcgcggag gtggcgaaaa ggctcggaat attggtgatt gctgacgagg tatacggcaa    1980gctggttctg ggcagcgccc cgttcatccc aatgggagtg tttgggcaca tcacccctgt    2040gctgtccata gggtctctgt ccaagtcatg gatagtgcct ggatggcggc ttggatgggt    2100agcggtgtac gaccccagaa agatcttaca ggaaactaag gtacttaaat ctctatatca    2160ttcttttcaa atgctactaa ggtgattaat tagtactact gtacaatata tttgctaaat    2220ttgtactgac atttttgtgg tagatctcta catcaattac gaattacctc aatgtctcga    2280cagacccagc aaccttcatt caggtcagtc tttggtattt acctcgtttc aagaaataaa    2340gtctttggta tttactcctc cttgtcctat tttgctccgg tccctatgtt gtaggcagcc    2400cacgtgcatg tcaagtgacc gttttttcac attaagtttg aaagtcaaag tcagacacat    2460acacttgtag ttattttacc tttgtttgct ttgatccgat aaaataaaaa aatacaaaaa    2520ctgaacctac tgttgaatat aaccactgtt cttacaagat atacatgatt gcactatggg    2580catgccatat tcttttgggt caagtatgca gtatgttgga acctctttta gaaaatagat    2640acattgtact atgagtatac cattttatta agaatttcat attttgatat ccttgatggt    2700attgttctct tgtgattcac acgatttact tgtggttttt tgtactatca aattgttcag    2760gcagctcttc ctcagattct tgagaacaca aaggaagatt tctttaaggc gattattggt    2820ctgctaaagg aatcatcaga gatatgctac aaacaaataa aggaaaacaa atacattaca    2880tgtcctcaca agccagaagg atcaatgttt gtcatggtaa gcctattttg tgaagtaaaa    2940aaatcttagg gagtgtcagt aatcataaac ttatttatat aggattaatc tgggaccgaa    3000atgcatccaa cataattact tcaaattcaa attcaaatta cattcttccg tacatatttt    3060tgaagatgca tgtattttaa gaataatgac gagagctaaa gttatgctac gactaatcat    3120ctggatatcc tttgtccatc tttttgttat actgtggaat gttaatggtc aaatcatatt    3180acacaaatat ccatgctagt ttctagaaag attgattatt tttctgtaac catgaactcc    3240gtattaactt ccatgtaaac aggtgaaact gaacttacat cttttggagg aaatagacga    3300tgacattgat ttttgctgca agctcgcaaa agaagaatca gtaatcttat gcccaggtag    3360gaatccattg ttgatttttg actgtatatg aagttcttat caatttccga gatgactata    3420catataaatg attaccatat tatggtcaga aattgtataa cagtgttaga atattctgtg    3480aagacttttt taacacaata ttctgtgaag actagatatc atgtacttct ccttgttttc    3540ttgacctgat gtccttcgtc acatgttgtg ctcctcacaa aaaaatagca agcacatgtt    3600tcaaataatt gttaataata taatttagcc tttaatttat atggttctat tttgagatat    3660ttttgtagtc caacttatat atttgtgact attctcaaaa acaaaactta tatatgtgtg    3720cctctcaaat gtagggagtg ttcttggaat ggcaaactgg gtccgcatta cttttgcttg    3780tgttccatct tctcttcaag atggtctcgg aaggatcaaa tcattctgtc aaaggaacaa    3840gaagagaaat tcgagcgatg attgctagtt gtatatctga ctgaagctgt aaatcattcc    3900cagtatcccc atctatatct ttcaataaaa tggaactttt agttctctat gaatagaagt    396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Claims (11)

1.生产禾本科植物的方法，包括导入编码麦根酸生物合成途径中的酶的基因的步骤。

2.权利要求1的方法，其中所述酶是烟酰胺氨基转移酶(NAAT)，其编码基因是naat。

3.权利要求1或2的方法，其中启动子是CaMV35S。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述基因是基因组基因。

5.权利要求4的方法，其中所述基因组是大麦基因组naat。

6.权利要求5的方法，其中所述基因的碱基序列是序列表中的SEQID NO：1所示的碱基序列，或可在严格条件下与所述碱基序列杂交并有可能产生具有烟酰胺氨基转移酶(NAAT)活性的蛋白的碱基序列或其互补碱基序列。

7.一种耐缺铁性禾本科植物，其是按照权利要求1-6中任一项的方法生产的。

8.一种种子，其是权利要求7的禾本科植物的种子。

9.一种细胞，其是权利要求7的禾本科植物的细胞。

10.一种在缺铁地区种植禾本科植物的方法，其中所述禾本科植物是如权利要求7所述的禾本科植物。

11.一种禾本科作物，其是经权利要求10的方法获得的。

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