CN101597610A - 直立密穗基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种直立密穗基因及其应用。特别地，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1和5－8中的任何一个所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1和5－8中的任何一个所示的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。本发明还涉及包含该基因的载体、宿主细胞和植物及生产植物的方法。该基因可用于提高作物植物产量或者改良作物植物。
Description
技术领域
本发明涉及直立密穗基因及其应用。本发明还涉及包含该基因的载体、宿主细胞和植物及生产植物的方法。该基因可用于提高作物植物产量或者改良作物植物的性状。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界一半以上的人口以水稻为主要食物。在当前人口急剧增长，耕地面积逐年减少的情况下，如何有效地提高水稻产量成为农业生产上的一项非常重要的任务。
20世纪60年代利用矮秆基因“sd1”进行矮化育种，该基因编码赤霉素合成中的一个关键酶，导致水稻产量的第一次突破，史称第一次“绿色革命”[1]。事实上，这次革命是一种植物株型的革命，即矮化育种，深刻地影响了水稻育种的进程。国际水稻研究所(IRRI)于1989年启动了针对以大幅度提高产量潜力为目标的“新株型育种”项目，设计出了新株型的具体形态指标及其实现的方式和方法[2]。新株型的共同特点是株高增加，分蘖数减少，成穗率提高，大穗，生物产量与经济系数并重。
20世纪80年以后，中国北方提出了直立穗型理想株型结构。
直立或半直立穗型较弯曲穗型相比，具有很多方面的优势。比如能够很好的利用光能，群体的光照，温度、湿度和气体扩散等生态条件优越，结实期群体生长率和干物质生产量高，因而最终能够增加产量。直立密穗型一般株高较低，有利于株型改良，有利于协调产量构成因素之间的矛盾，尤其是穗数和穗粒数可在较高水平统一起来，降低株高的同时，提高了收获指数。穗对茎秆的作用力明显低于弯曲穗型，加之基部节间短粗、叶鞘支持力强以及抽穗后物质生产量多而向籽粒转移量少等原因，抗倒伏显著优于弯曲穗型[3，4]。
直立穗型水稻品种从20世纪30年代出现，60年代兴起到80年代的大面积推广，到如今已经历了较长的发展过程。近年来仍有进一步发展的趋势，特别是东北地区，直立穗型品种已占据主导地位，成为稻作生产和科研的一大特色。先后出现了辽粳5号、千重浪、沈农265和沈农606等。目前，从扬子江畔到松辽平原，种植的粳稻主要都是高产的直立密穗品种。中国大面积种植的直立穗品种均是来自意大利的主栽品种“巴利拉”，到目前为止，其衍生出的品种近60种，在西班牙、法国等欧洲国家，巴利拉也有种植[5]。
目前对控制直立穗基因的研究还较少，朱立宏(1979)认为直立穗基因是受单一的隐性核基因控制的[6]。而徐正进和张文忠等(1995，2001)认为直立穗基因是受一对核基因或一对加性基因控制[3，4]。孔繁娜等(2007)将直立穗基因定位在第9染色体上，距SSR标记RM5833-11，RM5686-23分别是1.5和0.9cM[7]。顾铭洪等(2007)报道了第9染色体上一个控制直立穗基因的主效QTL，qEP9-1，在STS标记H90和SSR标记RM5652之间[8]。到目前为止，对直立穗基因的克隆却没有报道。
我们利用F2分离群体，采用图位克隆的方法首次克隆了巴利拉型直立密穗基因Dep1(dense and erect panicle)。通过遗传互补和过量表达该基因的研究，证明了该基因的功能。我们分离了该基因的启动子区域，并且在小麦、大麦和玉米的cDNA中分别克隆到了同源的cDNA序列。并对Dep1基因的组织表达进行了研究。
我们的研究填补了国内外对控制水稻直立密穗基因克隆的空白，为水稻的高产育种、理想株型理论打下很好的基础。
发明内容
本发明涉及分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列或由该序列组成：
(1)SEQ ID NO：1和5-8中的任何一个所示的核苷酸序列；
(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；
(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；
(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；
(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；
(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明还提供分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1和5-8中的任何一个所示的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。
本发明还涉及构建体，其包含本发明的多核苷酸。
本发明还涉及载体，其包含本发明的多核苷酸。所述载体可以是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。
本发明还涉及细胞，其包含本发明的多核苷酸或本发明的构建体或本发明的载体。所述细胞可以是动物细胞、植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞，优选植物细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。
本发明还涉及植物或者植物部分，其包含本发明的细胞。所述植物优选是农作物例如水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。还涉及来自所述植物的转基因种子。
本发明还涉及分离的多肽(也称蛋白质)，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列或由该序列组成：
(1)SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列，
(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，
(3)与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的氨基酸序列，
(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段，和
(5)本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
本发明还提供分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
本发明的多核苷酸和多肽(也称蛋白质)能够赋予包含它的转基因植物以直立密穗性状。优选地，本发明的多核苷酸和多肽具有改良作物植物性状的能力。所述性状包括但不限于：产量、抗倒伏能力、穗数和穗粒数、半矮杆、光合效率、结实期群体生长率或干物质生产量。
本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括：从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交；其中所述植物优选是直立密穗植物，其中所述植物优选是农作物例如水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。
本发明还涉及本发明的方法生产的植物。
本发明还涉及本发明的多核苷酸或本发明的构建体或本发明的载体在改良作物植物性状中的用途。本发明还涉及改良作物植物性状的方法，该方法包括制备含有本发明的多核苷酸或本发明的构建体或本发明的载体的作物植物，例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。所述性状包括但不限于：产量、抗倒伏能力、穗数和穗粒数、光合效率、结实期群体生长率或干物质生产量。
本发明还涉及提高作物植物产量、降低株高提高收获指数、提高作物植物抗倒伏能力、提高作物植物穗数和穗粒数、提高作物植物光合效率、或提高作物植物结实期群体生长率或干物质生产量的方法，该方法包括制备含有本发明的多核苷酸或本发明的构建体或本发明的载体的作物植物，例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。
本发明还涉及本发明的多核苷酸或本发明的构建体或本发明的载体在提高作物植物产量、提高作物植物抗倒伏能力、提高作物植物穗数和穗粒数、提高作物植物光合效率、或提高作物植物结实期群体生长率或干物质生产量中的用途。
本发明还涉及分离的具有启动子功能的多核苷酸序列(启动子序列)，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列或由该序列组成：
(1)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；
(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的核苷酸序列；
(4)(1)-(3)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
(5)与(1)-(4)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明还涉及包含本发明启动子序列的构建体或载体、或包含该构建体或载体的细胞。
附图简述
图1显示等基因系313(直立密穗，图1右)和314(弯曲和散穗，图1左)典型整株的照片。
图2显示光合作用的典型测定结果。
图3显示叶绿素含量的典型测定结果。
图4显示茎杆维管束数的典型结果。
图5显示中脉维管束的典型结果。
图6显示互补转基因验证研究的典型结果。左为未转基因的314，右为Dep1转基因314。
图7显示过量表达研究的典型结果。从左至右：第1穗为未转基因的日本晴对照，第2-4穗为Dep1基因转基因日本晴。
图8显示Dep1基因的组织表达的典型结果。
图9显示313和314枝梗数目穗长和穗粒数统计图。显示了313和314一次枝梗数目(A)、二次枝梗数目(B)、穗长(C)和每穗粒数(D)的统计。
图10显示采用RT-PCR分析获得的Dep1基因在不同的转基因植株中的表达。NP：日本晴；1-7是pAct::Dep1过量表达的不同转基因日本晴植株。
序列
SEQ ID NO：1：Dep1 cDNA序列(分离自313)
atgggggaggaggcggtggtgatggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtacccgga
cctgtgcggccggcggcggatgcagctggaggtgcagatcctgagccgcgagatcacgttcc
tcaaggatgagcttcacttccttgaaggagctcagcccgtttctcgttctggatgcattaaa
gagataaatgagtttgttggtacaaaacatgacccactaataccaacaaagagaaggaggca
cagatcttgccgtctttttcggtggatcggatcaaaattgtgtatctgcatttcatgtcttt
gctactgttgcaagtgctcacccaagtgcaaaagaccaaggtgcctcaattgttcttgcagc
tcatgctgcgacgagccatgctgtaagccaaactgcagtgcgtgctgcgctgggtcatgctg
tagtccagactgctgctcatgctgtaaacctaactgcagttgctgcaagaccccttcttgct
gcaaaccgaactgctcgtgctcctgtccaagctgcagctcatgctgcgatacatcgtgctgc
aaaccgagctgcacctgcttcaacatctag
SEQ ID NO：2：DEP1 cDNA序列(分离自314)
atgggggaggaggcggtggtgatggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtacccgga
cctgtgcggccggcggcggatgcagctggaggtgcagatcctgagccgcgagatcacgttcc
tcaaggatgagcttcacttccttgaaggagctcagcccgtttctcgttctggatgcattaaa
gagataaatgagtttgttggtacaaaacatgacccactaataccaacaaagagaaggaggca
cagatcttgccgtctttttcggtggatcggatcaaaattgtgtatctgcatttcatgtcttt
gctactgttgcaagtgctcacccaagtgcaaaagaccaaggtgcctcaattgttcttgcagc
tcatgctgcgacgagccatgctgtaagccaaactgcagtgcgtgctgcgctgggtcatgctg
tagtccagactgctgctcatgctgtaaacctaactgcagttgctgcaagaccccttcttgct
gcaaaccgaactgctcgtgctcctgtccaagctgcagctcatgctgcgatacatcgtgctgc
aaaccgagctgcacctgcttcaacatcttttcatgcttcaaatccctgtacagctgcttcaa
gatcccttcatgcttcaagtcccagtgcaactgctctagccccaattgctgcacttgcaccc
ttccaagctgtagctgcaagggctgtgcctgtccaagctgtggatgcaacggctgtggctgt
ccaagctgcggatgcaacggttgtggctgtccaagctgcggttgcaacggctgtggccttcc
aagctgcggttgcaacggctgcggctcgtgctcttgcgcccaatgcaaacccgattgtggct
cgtgctctaccaattgctgtagctgcaagccaagctgcaacggctgctgcggcgagcagtgc
tgccgctgcgcggactgcttctcctgctcgtgccctcgttgctccagctgcttcaacatctt
caaatgctcctgcgctggctgctgctcgagcctgtgcaagtgcccctgcacgacgcagtgct
tcagctgccagtcgtcatgctgcaagcggcagccttcgtgctgcaagtgccagtcgtcttgc
tgcgaggggcagccttcctgctgcgagggacactgctgcagcctcccgaaaccgtcgtgccc
tgaatgttcctgtgggtgtgtctggtcttgcaagaattgtacagagggttgtcgatgcccac
ggtgtcgtaacccatgctgtctcagtggttgcttatgttga
SEQ ID NO：3：DEP1 gDNA序列(分离自314)
aatgcccatgagtgaaggcggcgaggggtggttctgagttggccgttggcgtgctgcgtgtg
gagatgggggaggaggcggtggtgatggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtaccc
ggacctgtgcggccggcggcggatgcagctggaggtgcagatcctgagccgcgagatcacgt
tcctcaaggtgagcgccccgcggcggcggcggctgcgtttttctctataggtttctctttca
cactcgctcgctcgaaattctcggggcccgagctctacttgcttcgtcttcctttgacttta
ccgattaattttaaaaaaaaggagatccgattcgccgcgcatttttcaaaacccaagcggcc
gagtacggagctacccgctactgcaagtaggatgctgtgaagtgtacagtaatggcgttgtt
aattgcggtagctagtgctattctagtacttgtagtactgtttctaggcggaggtgaatcac
ggcgccatcaatccgaggctggcgagacaagcttggccctctttgggcgtggcgccatggct
gtactacctttgtcgttgtttggttgggctcctcgttggagaaaagaagagcgtgggcatgg
acaactgacctgagtggccttgtcagggagagccatagcagtggacgtgtctatctccgcca
ttgcttcgtcgacactggacgtgcagacggcatggccatgagggctttgcacgatgggtggt
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catctttttatcgtttcttgcaaggtcagtccctgctttggtacccgatctcgcttttgtgc
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aaagaaaaaggaaaccagcattgaagtcttgtttgaaatgcatatgtacttgtaccattaca
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tgaaaaaaattatattgaactaaatatattgaacagtagtatgacgtcctctttgcttgagt
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atctgcatttcatgtctttgctactgttgcaagtgctcacccaagtgcaaaagaccaaggtg
cctcaattgttcttgcagctcatgctgcgacgagccatgctgtaagccaaactgcagtgcgt
gctgcgctgggtcatgctgtagtccagactgctgctcatgctgtaaacctaactgcagttgc
tgcaagaccccttcttgctgcaaaccgaactgctcgtgctcctgtccaagctgcagctcatg
ctgcgatacatcgtgctgcaaaccgagctgcacctgcttcaacatctt
ttcatgcttcaaatccctgtacagctgcttcaagatcccttcatgcttcaagtcccagtgca
actgctctagccccaattgctgcacttgcacccttccaagctgtagctgcaagggctgtgcc
tgtccaagctgtggatgcaacggctgtggctgtccaagctgcggatgcaacggttgtggctg
tccaagctgcggttgcaacggctgtggccttccaagctgcggttgcaacggctgcggctcgt
gctcttgcgcccaatgcaaacccgattgtggctcgtgctctaccaattgctgtagctgcaag
ccaagctgcaacggctgctgcggcgagcagtgctgccgctgcgcggactgcttctcctgctc
gtgccctcgttgctccagctgcttcaacatcttcaaatgctcctgcgctggctgctgctcga
gcctgtgcaagtgcccctgcacgacgcagtgcttcagctgccagtcgtcatgctgcaagcgg
cagccttcgtgctgcaagtgccagtcgtcttgctgcgaggggcagccttcctgctgcgaggg
acactgctgcagcctcccgaaaccgtcgtgccctgaatgttcctgtgggtgtgtctggtctt
gcaagaattgtacagagggttgtcgatgcccacggtgtcgtaacccatgctgtctcagtggt
tgcttatgttgatctagatccttttttggttgttgtttttcttgtattttttagttgttagg
cctttgattaagttcgaactttcataaatatatggtgtttatcctgtaaagaaatgatgatt
tcaaggatttttcatagctatgagacgaggttgaacc
SEQ ID NO：4：Dep1启动子序列(分离自313)
gtctctcagtgagccgttcccggtcggtggcgtcgtcgtcgcgcgcgagacgggcccatttg
cacgctcctgtgaccagtccacgtcggcgagggcccagcgaacagacggctccatcctcgca
tgggcccgggaaagctccagttgggcccagattccccgatgagcgctcaggtgacgttccgg
cctgtcgcaggcccacggtacagtcgaacgttggcgccccccgtcctcgactctctcctgcc
gttcctcccgtcacacagctaaaatgaatcgcatatgcagtgaatgagactctgagagccca
gtttaaggtaggagtagcatcaaattcactagtcctatacaccggcacgtcgtcgcagtgca
attttatacgatcttcatgtgtgcatcagtgcatgctgtttgcagaagggaagttggccgcc
tgcccgtgctgagctcaactgaacgctggctgcctgcatggccagttcgtgactacagttac
tacgcatactacccggggtagcagcggcgcgctatcagctctacccggagtaggcagtagca
gcagtggtggtagtagtagaaagcgcggcagtggaagggatagaggagtgcccacattaata
actcgtttcaaatcggacggcgtggctactctagtacacccatttcaacgggacgttccact
ccactccaccgtaactgcgcgcgtggggcgaccccatcacgtgccacggtacgggggcgtcg
ctgaccgtctctggcccaccgcaaccctgctcccccaatccaaaccccgcgctgcacgtctc
gctggcactgggcatttcgatccatcgcggtcgcggccgcggtatcacgactgacgcgcggg
gccggcccggcacgcgagaccgatgtagacgtgtcaccggggaagcttgtccgctcgcggtt
gccgctgcgcgggggggaggggagggcgtcgagccgtacgtcgtcgtcgcatacctcggtcg
cgtccctgtcaaagccggccatcgctgccggctgctcaatttattcccttgctgtttcattt
cgtacgtactccgcgctcgggatgcggccatagccatatcgccatatatctcgtgcaggcac
cgtcacgctcgctcggcaactgtacgtgccgtctcaggacgcggcagtcaatgcggagttgg
tacaaacttgcgatgaaaggagtggtactgtggtaccaccactgccctgtctttgcacacat
cagtcttcccggagtttagctcaaggaacgtgggtgggggtgctgtttgtgtttgtgtgtag
tttttgccaatccaaacaaattggcaaagggggctggaagagtccatggtatttcccctatt
tgatttgcaatttgaactgtgcaaaaaataacgcgtgatttcatccctgtaccacgggacga
aggatcggctttgcatggtctggggaatcatggccccataccggagaagtaccgggcccacg
cagccatgatccatccctcgagacggcccggcgacagcgtatccaacgtaggctcgggccca
cgtcgcagtggaacaaagcccacagacacaaaaccccaccccccgctcgctgttgaactctc
tcttccctctctctctttctctctccaaaccccacgcacgccgcgtcgccgcctcctcctct
ccatctccgctgctattattgcccgcgcagacgcaggccaccatccttcctctcgctcacgc
tcgctgctatatgggggtcctcct
catcgcatcgcatcgcatcacctcgcacgggcgcgcgcgccgtgccgtgccgctagctcgat
ccgcctcgtacgccagctcgctcgctcgctcccccaccccgctgctgcacggctgcgcccgc
gctgtcccctgtccccccgctcgccgcggcgatttatacccaccacgccccctgctgctgct
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SEQ ID NO：5：小麦cDNA序列
atgggggagggcgcggtggtggtgctggaggcgcccaagcccaggtcgccgccgaggtaccc
ggacatgtgcggccgccggcgcctgcagctggaggtgcagatccttgaccgcgagctcacgt
tcctcaaggacgagctacatttacttgaaggggctcaaccagtctcacgttctggttgcttg
aaagaggtaaacgagtttgtcggtacaaaacaagacccgctaataccaattaacaaaaggaa
gcaccggtcctgccgtctttattggtggatcagatcgaaactgtgcatatgtgcttcatggc
tgtgctgctcctgccaatgcctaccaacctgcaaaagaccaaggtgcttcgactgttcatgc
tgcgagccaaactgctcgtgctgcagcctgaactgctgcagctgcttcagtatcccttcgtg
ctgcaaaccaagctgtggctgctttgagtgctgcagctgcagcaaaccacagtgctgcagca
gcggctgtaacccttgcggcgagtgcaagccggagtgcggctcgtgttccggcggcggctgc
tgcggcgacagcaggccaagctgcagctgctgcggcgagcagtgctgctcctgccctcgatg
cacaggctgcttcagctgcttcaaggtccccaaatgctcgtgcgcgcagtgcttcaactgcc
agtcgtcgtgctgcaaggggcagccgtcgtgcttcaggtgccagtcgtcgtgctgcgacaag
ggaggctgctgcagcggcgggtcgtgcctgagctgcccgaagccgtcgtgcccggagtgctc
ctgcgggtgcgtgtggtcgtgcaaaaactgtacagacggatgccgatgcgcccggtgctgtg
ctggcgggtgcctgtgttaa
SEQ ID NO：6：大麦cDNA序列
Atgggggagggcgcggtggtggtgctggagccgcccaagcccaggtcgccgccgaggtaccc
ggacatgtgcggccgccggcgcctgcagctggaggtgcagatccttgaccgcgagctcacgt
tcctcaaggacgagctacatttacttgaaggggctcaaccagtctcacgttctgcttgcttg
aaagaggtaaatgagtttgttggtacaaaacaagatccactgataccaattaacaaaaggaa
gcatcggtcctgccgtctttattggtggatcagatcaaaactgtgcgtatgtgcttcatggc
tgtgctgctcctgccaatgcctaccaacctgcaaaagaccaagctgcttggactgttcatgc
tgcgagccaaactgctcgtgctgcagcccgaactgctgcagctgcttcaagatcccttcgtg
ctgcaaaccgagctgcggctgcttcgggtgctgcagctgcagcaaaccacagtgctgcagcg
gcggctgtaacccttgcggcgagtgcaagccggagtgtggctcttgttccgccggtggctgc
tgcggcgactgcaagccaagctgcagctgctgcggcgagcagtgccagtgctgctcctgccc
tcgatgcacggggggctgcttcaagctcccgaaatgctcgtgcgcgcagtgcttcaactgcc
agtcgtcgtgctgcaaggggcagccgtcgtgcttcaggtgccagtcgtcgtgctgcgacaag
ggcggctgctgcagcagcgggtcgtgcctgagctgcccgaagccgtcgtgcccggagtgctc
ctgcgggtgcgtgtggtcgtgcaaaaactgtacagacggatgccgatgcgcccggtgctgtg
ctagcgggtgcctgtgttga
SEQ ID NO：7：玉米cDNA序列-1
atggcggcaccgggaagcccgacgccgcgccggctcccacgcccgcgccaacgccgctgccg
ccagaaaagcctctcccgggagagtgctgcggcagcgggtgcgttcgctgcgtcggggacat
atatttcgacgagctcgacgcgtacgacaaggccctcgccgcgcgcgcggcctcctcaggct
ccggcggcaaggacgactctgctgataccaagcccaaagaaggtgccaaatcctgaagtgcg
cctctcatgtgacgagctacaattacttgaaggagttccaccagtttctagaagttgtaaag
aggtaaatgactttgttggtactaaacaagacccactaataccgataacgaaraagacacac
agatcatgccgtcttttttggtggatcagatcaaaactgtgcatatgcgtgccatggttctg
ctgttcctgccattgcrtgcccaastgcaaaaggccatgcttcttggattgctcctgctgct
catgcccagatctgtcatgctgctatcccagctgcaaatcatgcaacaaaccatgctttggg
cccaacagctgctcatgttgcgacatatcatgccgcaagccagattgcccatcctgtacctc
gagctgcagctcgtgctgcaatcggccatgtggcaacccagactgcagctcgtgctgcacct
gcaatccatcatgctgtaaaccaagctgcaactcgtgctgcagaccaaactgtagctcgtgc
tgcaatctgtcatgctgcaaacccagctgcagctcatgcttctcatgctgtaaagcgaactc
cagctcatgctgtaaacccaaatgcagctgcttcaaggccctctcgtgctgcaaattacagt
gcagcccaaactgctgcacttgcagtctcccgagctgctcaggctgcaacccctgcggcagt
tgcaagcaatgctgctcatgccccagcgactgctttgattgcaagccaaactgcggctgttt
cggcgcgcaatgctgcagctgcgtgggatgctgctcgtgctcctgccctcggtgctcaagct
gcttcggttgcttcaagtacttcaagtgctccaacctgttcgggtgctgctcctgcaagcag
tgct
tcaagtgccagtcctcgtgctgcaagggggcgccgtcctgctgcaaatgccagtcgtcgtgc
tgtgagggtgaagacggcagcagcagctgctggaggtcatgctgcagcgttccgaagccgga
ttgccctgggtgttcgtgcgggtgcgtttggtcctgcaggaagtgtacagaagggtgccgat
gttctgggtgccgcaaaccatgctgtgccaccggatgcttgtgctga
SEQ ID NO：8：玉米cDNA序列-2
Atgggggaagcgccgcagcccaggtcgccgccgaggtacccggacctgtgcggccgccgccg
cctgcagctcgaggtgcagatcctcaaccgggaggtcggcttcctcgagcgtcacgagtttg
tcagtgcaaagaccgacccaatgataccagtaagcaaaaggagacatggatcttgcagcttc
tcgcggtggatcagatcaaaattgcgcacatgcttttcatgcctgtgctgctggtgccactg
cttgccgaagcccaatgcgccaagctgcttcagctgttcttgttgcacctgccgcgacacgc
agtgctgtactccgatctgccgctgttcaaagaccccttcgtgcagccccggctgctgcacc
tgcagccttcccagctgcagctgcaagacgccaccaggctgcggccattgccgaccccagtg
cagcagctgctgctctagtggttgcagctgcgcggactgcccgtgctcctgctcctgccccc
cgtgctgcagctgccccggcttcttctcctgtgaggggtgctcggctggctgcctcggcgct
ctcaaccggtgtctcggcggcctgtcgtcgtgctgcagtgagatgcgaccttcctgctgcaa
gtgccagtcgtcgtgctgcgaggggggttcgtcctgccgcggcaccggcacgggagcgtgct
gccgcggttcgtgcctcggtgccccggcgtcgtcgtgcccggagtgctcctgcggctgcgtg
tgctcctgctccaggtgcaaaggaggatgccgctgcccgtcctgtggtagtaatccctgctg
tcccggtggatgcttgtgctag
SEQ ID NO：9：313的Dep1蛋白序列
MGEEAVVMEAPRPKSPPRYPDLCGRRRMQLEVQILSREITFLKDELHFLEGAQPVSRSGCIK
EINEFVGTKHDPLIPTKRRRHRSCRLFRWIGSKLCICISCLCYCCKCSPKCKRPRCLNCSCS
SCCDEPCCKPNCSACCAGSCCSPDCCSCCKPNCSCCKTPSCCKPNCSCSCPSCSSCCDTSCC
KPSCTCFNI
SEQ ID NO：10：314的DEP1蛋白序列
MGEEAVVMEAPRPKSPPRYPDLCGRRRMQLEVQILSREITFLKDELHFLEGAQPVSRSGCIK
EINEFVGTKHDPLIPTKRRRHRSCRLFRWIGSKLCICISCLCYCCKCSPKCKRPRCLNCSCS
SCCDEPCCKPNCSACCAGSCCSPDCCSCCKPNCSCCKTPSCCKPNCSCSCPSCSSCCDTSCC
KPSCTCFNIFSCFKSLYSCFKIPSCFKSQCNCSSPNCCTCTLPSCSCKGCACPSCGCNGCGC
PSCGCNGCGCPSCGCNGCGLPSCGCNGCGSCSCAQCKPDCGSCSTNCCSCKPSCNGCCGEQC
CRCADCFSCSCPRCSSCFNIFKCSCAGCCSSLCKCPCTTQCFSCQSSCCKRQPSCCKCQSSC
CEGQPSCCEGHCCSLPKPSCPECSCGCVWSCKNCTEGCRCPRCRNPCCLSGCLC
SEQ ID NO：11：小麦蛋白序列
MGEGAVVVLEAPKPRSPPRYPDMCGRRRLQLEVQILDRELTFLKDELHLLEGAQPVSRSGCL
KEVNEFVGTKQDPLIPINKRKHRSCRLYWWIRSKLCICASWLCCSCQCLPTCKRPRCFDCSC
CEPNCSCCSLNCCSCFSIPSCCKPSCGCFECCSCSKPQCCSSGCNPCGECKPECGSCSGGGC
CGDSRPSCSCCGEQCCSCPRCTGCFSCFKVPKCSCAQCFNCQSSCCKGQPSCFRCQSSCCDK
GGCCSGGSCLSCPKPSCPECSCGCVWSCKNCTDGCRCARCCAGGCLC
SEQ ID NO：12：大麦蛋白序列
MGEGAVVVLEPPKPRSPPRYPDMCGRRRLQLEVQILDRELTFLKDELHLLEGAQPVSRSACL
KEVNEFVGTKQDPLIPINKRKHRSCRLYWWIRSKLCVCASWLCCSCQCLPTCKRPSCLDCSC
CEPNCSCCSPNCCSCFKIPSCCKPSCGCFGCCSCSKPQCCSGGCNPCGECKPECGSCSAGGC
CGDCKPSCSCCGEQCQCCSCPRCTGGCFKLPKCSCAQCFNCQSSCCKGQPSCFRCQSSCCDK
GGCCSSGSCLSCPKPSCPECSCGCVWSCKNCTDGCRCARCCASGCLC
SEQ ID NO：13：玉米蛋白序列-1
MAAPGSPTPRRLPRPRQRRCRQKSLSRESAAAAGAFAASGTYISTSSTRTTRPSPRARPPQA
PAARTTLLIPSPKKVPNPEVRLSCDELQLLEGVPPVSRSCKEVNDFVGTKQDPLIPITKKTH
RSCRLFWWIRSKLCICVPWFCCSCHCXPXCKRPCFLDCSCCSCPDLSCCYPSCKSCNKPCFG
PNSCSCCDISCRKPDCPSCTSSCSSCCNRPCGNPDCSSCCTCNPSCCKPSCNSCCRPNCSSC
CNLSCCKPSCSSCFSCCKANSSSCCKPKCSCFKALSCCKLQCSPNCCTCSLPSCSGCNPCGS
CKQCCSCPSDCFDCKPNCGCFGAQCCSCVGCCSCSCPRCSSCFGCFKYFKCSNLFGCCSCKQ
CFKCQSSCCKGAPSCCKCQSSCCEGEDGSSSCWRSCCSVPKPDCPGCSCGCVWSCRKCTEGC
RCSGCRKPCCATGCLC
SEQ ID NO：14：玉米蛋白序列-2
MGEAPQPRSPPRYPDLCGRRRLQLEVQILNREVGFLERHEFVSAKTDPMIPVSKRRHGSCSF
SRWIRSKLRTCFSCLCCWCHCLPKPNAPSCFSCSCCTCRDTQCCTPICRCSKTPSCSPGCCT
CSLPSCSCKTPPGCGHCRPQCSSCCSSGCSCADCPCSCSCPPCCSCPGFFSCEGCSAGCLGA
LNRCLGGLSSCCSEMRPSCCKCQSSCCEGGSSCRGTGTGACCRGSCLGAPASSCPECSCGCV
CSCSRCKGGCRCPSCGSNPCCPGGCLC
SEQ ID NO：15：内参引物Actin1-F
agcaactgggatgatatgga
SEQ ID NO：16：内参引物Actin-R
cagggcgatgtaggaaagc
SEQ ID NO：17：Dep1基因特异引物1
gcgagatcacgttcctcaag
SEQ ID NO：18：Dep1基因特异引物2
tgcagtttggcttacagcat
生物材料的保藏
313和314的种子样品已经于2008年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center，CGMCC)(地址：中国北京市中国科学院微生物研究所，P.O.Box 2714，邮政编码100080)，保藏号分别为CGMCCNo.2485和CGMCC No.2486，分类命名为水稻(Oryza sativa)。并于2008年5月13日将上述保藏转换为按照《布达佩斯条约》的保藏。
具体实施方式
“相关”/“可操作地连接”指两个物理或功能相关的核酸序列。例如，如果启动子或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，那么称启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”。
“嵌合基因”是重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列可操作地连接编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列，或与编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列相关，使得调节核酸序列能调节相关核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中所发现的正常可操作地连接相关核酸序列。
“编码序列”是转录为RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，随后在生物体中翻译RNA以产生蛋白质。
对应于：在本发明上下文中“对应于”意指当不同Dep1基因或蛋白质的核酸编码序列或氨基酸序列互相比对时，“对应于”一些计数位置的核酸或氨基酸是与这些位置比对，但不必是在相对于特定Dep1各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。同样，当特定Dep1的编码或氨基酸序列与参照Dep1的编码或氨基酸序列比对时，“对应于”参照Dep1序列一些计数位置的该特定Dep1序列中核酸或氨基酸是与参照Dep1序列的这些位置比对，但不必是在该特定Dep1蛋白质各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。
这里所用的“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。通常，它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可以是天然存在的，但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而，通常，表达盒相对于宿主是异源的，即，表达盒的特定核酸序列不天然出现在宿主细胞中，必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时，所述诱导型启动子才起始转录。如果是多细胞生物体的情况，如植物，启动子也可以是对特定组织，或器官或发育阶段特异的。
“基因”是位于基因组内的限定区域，除了前述编码核酸序列外，包含其它主要是调节性的核酸序列，所述调节性核酸序列负责编码部分的表达，即转录和翻译控制。基因也可以包含其它5’和3’非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是，例如内含子。
“异源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞不天然相关的核酸序列，包含非天然存在的天然存在核酸序列的多拷贝。
“同源重组”是同源核酸分子间核酸片段的相互交换。
当核酸序列编码与参照核酸序列编码的多肽有相同氨基酸序列的多肽时，该核酸序列与参照核酸序列是“同类编码”。
“分离的”核酸分子或分离的蛋白质是人工地与其天然环境分离而存在，因此不是天然产物的核酸分子或蛋白质。分离的核酸分子或蛋白质可以以纯化形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如重组宿主细胞或转基因植物中。
天然：指在未转化细胞的基因组中存在的基因。
天然存在：术语“天然存在”用于描述可以在自然界中发现的客体，其与人工产生的客体不同。例如，可以从自然来源分离，并没有在实验室有意进行人工修饰的、生物体(包括病毒)中存在的蛋白质或核苷酸序列是“天然存在”的。
“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明上下文中，优选地，核酸分子是DNA片段。“核酸分子”也称多核苷酸分子。
“植物”是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官或整个植物的一部分。
“植物细胞培养物”意指各种发育阶段的植物单位如，例如原生质体，细胞培养细胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培养物。
“植物材料”指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。
“植物器官”是植物清楚的和明显结构化和分化的部分，如根，茎，叶，花蕾或胚。
这里所用的“植物组织”意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物，植物器官，植物种子，组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组织。
“启动子”是编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶的结合位点，并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。
“原生质体”是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。
“调节元件”指参与控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。
“改组的”核酸是通过改组方法，如这里所述的任何改组方法产生的核酸。通过人工的和可选地循环的方式(物理地或实际上)重组两个或多个核酸(或字符串)产生改组核酸。一般地，在改组方法中利用一步或多步筛选步骤以鉴定目的核酸；可以在任何重组步骤前或后进行该筛选步骤。在一些(但不是所有)改组实施方式中，期望在筛选前进行多轮重组以增加待筛选库的多样性。可选地，可以循环重复重组和筛选的全部过程。根据上下文，改组可以指重组和筛选的全部过程，或可替代地，可以仅指全部过程的重组部分。
基本相同：在两个核酸或蛋白质序列上下文中的短语“基本相同”指当比较和比对以获得最大对应时，如利用下面序列比较算法之一或目测所测定的，具有至少60％，优选80％，更优选85％，更优选90％，甚至更优选95％和最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列或亚序列。优选地，基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域，更优选至少约100个残基的区域上，最优选地，在至少约150残基中的序列基本相同。在特别优选的实施方式中，在编码区整个长度中序列基本相同。而且，基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同的功能。
为了进行序列比较，通常，一个序列作为参照序列而与检测序列比较。当利用序列比较算法时，将检测和参照序列输入到计算机中，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定序列算法程序的参数。然后，根据选定的程序参数，序列比较算法将计算出检测序列相对于参照序列的百分序列同一性。
例如，通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通过目测(通常参见，Ausubel等，下文)可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个算法例子是BLAST算法，在Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述了该算法。通过国家生物技术信息中心(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/)公众可得到进行BLAST分析的软件。该算法包括：通过鉴定出查寻序列中长度为W的短字而首先鉴定出高分值序列对(HSPs)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分T。T称为相邻字记分阈值(Altschul等，1990)。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的线索去发现包含它们的更长的HSPs。然后，这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可能远的延伸，直到积累比对分值不再增加。对于核苷酸序列，用参数M(成对匹配残基的奖励分值；总是大于零)和N(错配残基的罚分值；总是小于零)计算积累分值。对于氨基酸序列，用记分矩阵计算积累分值。当积累比对分值从获得的最大值回落数量X，由于一个或更多负分值残基比对积累，积累分值达到或低于零，或两个序列的任一个到达终点时，每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法的参数W，T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长值(W)11，期望值(E)10，截断值100，M＝5，N＝-4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长值(W)3，期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵(参见，Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))为缺省值。
除了计算百分序列同一性外，BLAST算法也进行两个序列间相似性的统计学分析(参见，例如Karlin&Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性测定是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率的指示。例如，如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小和概率少于约0.1，更优选少于约0.01，最优选少于约0.001，那么认为检测核酸序列与参照序列相似。
两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语“特异性杂交”指当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，在严格条件下，分子仅与特定核苷酸序列结合，形成双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核酸和靶核酸间互补杂交，并且包含较少的错配，通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配，以实现靶核酸序列的期望检测。
在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交漂洗条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分第2章″Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays″Elsevier，New York中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地，对于在限定离子强度和pH下的特定序列，高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点(Tm)约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。
Tm是(在限定离子强度和pH条件下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。对于特定的探针，非常严格的条件选择为等于Tm。在Southern或Northern印迹中在滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42℃，具有1mg肝素的50％甲酰胺，过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72℃，0.15MNaCl约15分钟。严格漂洗条件的例子是在65℃，0.2xSSC漂洗15分钟(参见，Sambrook，下文，SSC缓冲液的描述)。通常，在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，中严格性漂洗的例子是45℃，1xSSC漂洗15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，低严格性漂洗的例子是40℃，4-6xSSC漂洗15分钟。对于短探针(例如，约10到50个核苷酸)，严格条件通常包括在pH7.0到8.3的少于约1.0M Na离子的盐浓度，通常约0.01到1.0Na离子浓度(或其它盐)，通常温度至少是约30℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地，在特定杂交测定中，信噪音比就无关探针所观察到的值高2×(或更高)表明特异杂交的检测。在严格条件下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么它们仍是基本相同的。例如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时，就会出现这种情况。
下面是杂交/漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列：参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃，2XSSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃，1XSSC，0.1％SDS中漂洗，更期望在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.5XSSC，0.1％SDS中漂洗，优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在50℃，0.1XSSC，0.1％SDS中漂洗，更优选地，在50℃，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA中杂交，在65℃，0.1XSSC，0.1％SDS中漂洗。
两个核酸序列或蛋白质基本相同的另一个指标是第一核酸编码的蛋白质与第二核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或特异结合。因此，蛋白质通常与第二蛋白质基本相同，例如，其中两个蛋白质仅仅由于保守性置换而不同。
“合成的”指包含天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。例如，称更密切地类似双子叶和/或单子叶植物基因G+C含量和正常密码子分布的人工序列是合成的。
“转化”是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程，特别地，“转化”意指DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞，组织，或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。“非转化的”，“非转基因的”，或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。
本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学当前技术，Greene Publishing Associates&Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手 册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，Academic Press，Inc.，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。
植物转化
在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的直立密穗蛋白。可将本发明核苷酸序列插入到表达盒中，然后优选地，表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。在另一个优选实施方式中，核苷酸序列包含在农杆菌中。按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝，芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。
一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
优选地，在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相应直立密穗蛋白的生物合成。以这种方式，可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有特定的密码子使用偏爱性，这是本领域已知的，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35％，优选多于约45％，更优选多于50％，最优选多于约60％GC含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。尽管可以在单子叶植物和双子叶植物物种中充分地表达优选的基因序列，但可以修饰序列以适应单子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏好和GC含量偏好，因为这些偏好已被证明是不同的(Murray等，Nucl.Acids Res.17：477-498(1989))。此外，可筛选核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常规剪接位点的存在。利用公开专利申请EP 0 385962(Monsanto)，EP 0 359 472(Lubrizol)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)中所述的方法，用本领域熟知的位点定向诱变技术，PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需要进行的所有改变，如上述那些改变。
在本发明一个实施方式中，根据这里并入作为参考文献的美国专利5,625,136中公开的方法可制备合成基因。在该方法中，利用了玉米优选的密码子，即最常常编码玉米中那个氨基酸的单密码子。特定氨基酸的玉米优选密码子可以来源于，例如玉米的已知基因序列。在Murray等，Nucleic Acids Research 17：477-498(1989)中教导了玉米植物28个基因的玉米密码子使用，这里并入这篇文献的公开内容为参考文献。
以这种方式可以优化核苷酸序列以便在任何植物中的表达。公认基因序列的所有或任何部分都可以优化或合成。即，也可以利用合成或部分优化的序列。
为了翻译的有效起始，可能需要修饰邻近起始甲硫氨酸的序列。例如，通过包含已知在植物中有效的序列可以修饰它们。Joshi提出了植物适合的共有序列(NAR 15：6643-6653(1987))，Clonetech提出了进一步的翻译起始子共有序列(1993/1994目录，210页)。这些共有序列适合与本发明核苷酸序列一起使用。向包含所述核苷酸序列，直到和包含ATG(同时保持第二个氨基酸没有被修饰)或可替代地直到和包含ATG后的GTC(具有修饰转基因第二个氨基酸的可能性)的构建物中引入该序列。
可将作为其天然序列或作为如上所述优化合成序列的本发明新的Dep1直立密穗基因可操作地与在植物中表达的各种启动子，包括组成型，诱导型，时序调节，发育调节，化学调节，组织优选和组织特异性启动子相融合以制备重组DNA分子，即嵌合基因。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。因此，优选在叶，主茎或茎杆，穗，花序(例如，穗状花序，圆锥花序，穗轴等)，根，和/或幼苗中表达本发明核苷酸序列。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。然而，没有限制所选启动子的起源，只要启动子起作用驱动期望细胞中核苷酸序列的表达就足够了。
优选的组成型启动子包括CaMV 35S和19S启动子(Fraley等，1994年10月4日公布的美国专利号5,352,605)。另外优选的启动子来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因的任何一种。可以容易地修饰McElroy等(Mol.Gen.Genet.231：150-160(1991))所述的启动子表达盒以用于新直立密穗基因的表达，该基因表达盒特别适合在单子叶植物宿主中使用。
另一个优选的组成型启动子来源于泛素，它是已知在许多细胞类型中积累的另一种基因产物。从几种物种，例如向日葵(Binet等，1991.Plant Science 79：87-94)，玉米(Christensen等，1989.Plant Molec.Biol.12：619-632)和拟南芥(Norris等1993.Plant Molec.Biol.21：895-906)克隆了泛素启动子，可用于转基因植物中。已发展了转基因单子叶植物系统中的玉米泛素启动子，并且在专利公布EP 0 342926中公开了其序列和用于单子叶植物转化的载体。泛素启动子适合在转基因植物，特别是单子叶植物中新直立密穗基因的表达。
可用于在植物，特别是玉米中表达本发明新直立密穗基因的组织特异性或组织偏爱启动子是在根，木髓，叶或花粉中引导表达的启动子。在WO 93/07278中公开了这种启动子，这里整体并入其为参考文献。其它可用在本发明中的组织特异性启动子包括美国专利6,040,504中公开的棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子；美国专利5,604,121中公开的水稻蔗糖合酶启动子；和WO 01/73087中公开的夜香树黄化叶卷曲病毒启动子，并入所有这些文献为参考文献。在美国专利5,614,395中公开了可用于指导植物中新直立密穗基因表达的化学诱导型启动子，这里整体并入这篇文献为参考文献。
除了适合启动子的选择外，植物中直立密穗蛋白表达的构建需要连接在异源核苷酸序列下游的适合的转录终止子。可得到几种这种终止子，并且它们是本领域已知的(例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9)。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以用在本发明中。
也可以向本发明所述表达盒中引入大量其它的序列。这些序列包括已经证明增强表达的序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
有可能优选将本发明核苷酸序列的表达靶向到植物中不同细胞定位。在一些情况下，可能期望定位在细胞溶质中，而在其它情况下，可能优选定位在一些亚细胞细胞器中。转基因所编码的酶的亚细胞定位采用了本领域熟知的技术。通常，操作编码来源于已知靶向细胞器的基因产物的靶肽的DNA，使之融合到核苷酸序列的上游。已知用于叶绿体的许多这种靶序列，并且已知证明了它们在异源构建中的功能。本发明核苷酸序列的表达也可靶向到宿主细胞的内质网或液泡中。实现上述这些目的的技术是本领域熟知的。
可用于植物转化的大量转化载体是植物转化领域技术人员已知的，并且本发明的核酸分子可以与任何这种载体联合使用。载体的选择将依赖于用于转化的优选转化技术和靶植物物种。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing&Vierra.，1982.Gene 19：259-268；和Bevan等，1983.Nature304：184-187)，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，(White等，1990.Nucl.Acids Res 18：1062，和Spencer等，1990.Theor.Appl.Genet 79：625-631)，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann，Mol Cell Biol 4：2929-2931)，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因(Bourouis等，1983.EMBO J.2(7)：1099-1104)，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因(U.S.专利号：4,940,935和5,188,642)，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因(美国专利号5,767,378和5,994,629)。然而，选择性标记的选择对本发明不是至关重要的。
在另一个优选的实施方式中，将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因，并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读框。在美国专利5,451,513、5,545,817和5,545,818中，PCT申请号WO95/16783中和McBride等，(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA91，7301-7305中详尽地描述了质体转化技术。叶绿体转化的基本技术包括例如利用生物轰击或原生质体转化(例如氯化钙或PEG介导的转化)将位于目的基因和选择标记侧翼的克隆质体DNA的区域一起引入适合的靶组织中。1到1.5kb侧翼区域，称为导向序列，可促进与质体基因组的同源重组，因此允许原质体系特定区域的置换或修饰。最初，可利用在提供了对壮观霉素和/或链霉素抗性的叶绿体16S rRNA和rps12基因的点突变作为转化的选择标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.，和Maliga，P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub，J.M.，和Maliga，P.(1992)Plant Cell 4，39-45)。这以约每100次靶叶片轰击1次的频率产生了稳定的同质转化体。这些标记间存在的克隆位点可以用来产生用于导入外源基因的质体靶向载体(Staub，J.M.，和Maliga，P.(1993)EMBO J.12，601-606)。通过用显性选择标记，编码壮观霉素去毒酶(spectinomycin-cletoxifyingenzyme)氨基糖苷类-3’-腺苷酰转移酶的细菌aadA基因置换隐性rRNA或r-蛋白质抗生素抗性基因可获得转化频率的显著增加(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，913-917)。以前，该标记成功地用于高频率转化绿藻Chlamydomonas reinhardtii质体基因组(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)Nucl.Acids Res.19：4083-4089)。其它用于质体转化的选择标记是本领域已知的，并且包含在本发明范围内。通常，转化后需要约15到20个细胞分裂周期以达到同质状态。通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千个环形质体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大大高于核表达基因的优势，使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白质的10％。在优选实施方式中，将本发明核苷酸序列插入到质体靶向载体中，并且转化进入期望的植物宿主质体基因组中。获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组而言属同质的植物，优选地，该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。
下列实施例只是举例描述，而不用来限制本发明的范围。
实施例
实施例1：水稻品种313和314的比较研究
本研究主要使用一对近等基因系，313(直立密穗，图1右)和314(弯曲和散穗，图1左)。
314是在浙江绍兴农科院田间发现的武运粳背景的弯曲散穗品种。313的前身是在浙江绍兴农科院田间发现的武运粳背景的直立密穗品种，后以314为轮回亲本，经过多代回交选育而成313，目前已回交8代。314不含Dep1基因，因为将314相应区段测序，其序列和日本晴(弯曲和散穗)的序列一致(见SEQ ID NO：2和3)。Dep1基因是313特有的基因。
313和314的种子样品已经于2008年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center，CGMCC)(地址：中国北京市中国科学院微生物研究所，P.O.Box 2714，邮政编码100080)，保藏号分别为CGMCCNo.2485和CGMCC No.2486。并于2008年5月13日将上述保藏转换为按照《布达佩斯条约》的保藏。
1.枝梗数、穗长和每穗粒数的测定
我们于2007年6月在北京昌平农场试验田播种313和314，待成熟后，分别统计一次枝梗数(primary branches，pb)，二次枝梗数目(secondary branches，sb)，穗长(panicle length，PL)和每穗粒数(number of grains on each panicle)。具体的统计方法：在水稻成熟后，分别在田间取313和314每株主孽上的穗30株，分别统计每穗上的籽粒数(panicle number per panicle)，一次枝梗数(number of primarybranches)，二次枝梗数(number of secondary branches)，穗长(paniclelength)。进行千粒重的测定，具体方法：从除去杂质的净粮中，用分样器或四公法分样，将样品分至接近规定的重量，准确称重(W)，然后计数，得粒数m。用下面的公式计算：千粒重(g/1000粒)＝W/mX1000。试验结果允许差：千粒重20g以下的不超过0.4g，千粒重20.1～50g的不超过0.7g，千粒重50.1g以上的不超过1.0g。差异显著性检测的方法：1.建立虚无假设，即先认为两者没有差异；2.通过统计运算，确定假设成立的概率P。3.根据P的大小，判断假设是否成立。我们的实验中的标准P＜0.05。统计表明313的穗长要比314短(图9，C)，但差异不显著(X2＝0.07，P＞0.05)，有更多的一次枝梗数和二次枝梗数(图9，A和B)，一次枝梗数差异不显著(X2＝0.6，P＞0.05)，二次枝梗数目差异极显著(X2＝7.75，p＜0.01)，但每穗上的穗粒数直立穗品种比弯曲品种要多的多(图9，D)，差异达极显著(X2＝29.47，P＜0.01)，但千粒重313较314要稍低(差异显著，X2＝1.66，P＞0.05)。因而313有比314有更高产量，表明直立密穗的水稻品种要比弯曲和散穗水稻品种有增加产量的潜能。
2.光合作用的测定和叶绿素含量的测定
(1)实验方法
生长在四叶期的水稻，进行叶绿素含量的测定，分别取313和314相应部位的叶片，称取重量，测定方法采用酒精法(见沈伟其，植物生理学通讯.1988(3)62～64)，分别测定665nm和649nm下的光吸收峰，用公式计算叶绿素含量：叶绿素含量(mg/g)＝色素浓度(c)×提取液体积×稀释倍数/样品鲜重或干重；在水稻抽穗时期，上午09:00-10:00测量313和314光合效率。测定方法：使用的光合仪是L1-6400(LI-CORInc.，Lincolin，NE.USA)，设定不同的光强(250，500，750，1000，1500，2000，2500umol photous m-2 sec-1)，分别测定在相应光强下的CO2的净吸收量(u mol m-2 sec-1)。
(2)实验结果
313比314有更多的叶绿素含量和更高的光合作用
田间光合作用的测定表明313的光合效率明显比314要高(图2)，而叶绿素含量，313也明显要比314高(图3)，本实验先后重复两次，给出的统计结果是两次重复实验中的代表性结果。表明直立穗品种的水稻能更好的利用光能，这与东北农业大学徐正进等认为直立穗有更高的光能利用效率、更高的水稻产量相一致。这表明直立穗品种的水稻比弯曲穗品种有提高水稻产量的潜力。
3.树脂切片测定维管束数量
(1)实验方法
●取材：分别取313和314幼嫩的倒一节和期叶相应的部位，用FAA固定液固定48小时以上。
●脱水：分别用40％，60％，80％，95％和95％的无水乙醇依次脱水30分钟。
●洗涤I：用3∶1的100％无水乙醇和historesin(Leica Historesinembedding kit，lot 010066，2022 18500)处理3-4hrs。
●洗涤II：用1∶1的100％无水乙醇和historesin处理3-4hrs。
●洗涤III：用1∶3的100％无水乙醇和historesin处理3-4hrs。
●洗涤IV：用100％的historesin洗2次，第二次洗涤过夜。
●洗涤V：第二天早晨换新鲜的historesin洗涤1hr。
●包埋：用16∶1的100％historesin和hardener(Leica Historesinembedding kit，lot 010066，2022 18500)包埋，用parafilm封盖。
●切片：待包埋剂充分凝固后(1-2天)，进行切片，8-10um厚。
●染色：用燃料染色(比如blue燃料)，显微镜下观察。
(2)实验结果
313比314有更多的维管束数量
对倒一节茎秆进行树脂切片，横切表明水稻茎秆的大小维管束排列成两轮同心圆，313的大小维管束分别是34个，而314的分别是30个(图4A)。这样，就倒一节茎秆维管束来说，313共有68个，而314的共有60个，直立穗比弯曲品种多了8个(图4B)。对旗叶的叶片横切表明，就中脉而言313是10个(图5，上图)，而314是8个(图5，下图)。
实施例2：水稻Dep1基因的克隆和测序、基因组序列的获得、启动子和3’UTR区的分离
我们利用F2分离群体，采用图位克隆的方法首次克隆了巴利拉型直立密穗基因Dep1(dense and erect panicle)。我们分离了该基因的启动子区域。具体方法：为了克隆Dep1基因，先后构建了个多个群体，首先用东北高产直立密穗品种沈农265，千重浪分别同粳稻品种日本晴和中华11，定位了一个负责直立密穗的主效QTL(数量性状基因座)，位于第9染色体长臂上，SSR标记RM3700和RM7424之间。为了精细定位Dep1基因，构建了更大的F2群体：用含有Dep1基因的粳稻品种W101同NJ6杂交，另外一个含有Dep1基因的粳稻品种Q169同93-11杂交，F1自交后获得F2群体，从中挑选出表现为弯曲穗型的单株1600个，利用这1600个单株将Dep1基因定位在一个BAC AP005419上，新发展的STS标记S2(5’-cttcaactgcctgcgagaccacc-3’和5’-gcttgactgacataatgccgcta-3’)和S11-2(5’-taagccgatgattactccagac-3’和5’-gttcatttaaagaagtcctcaccg-3’)之间，共85Kb的区域，含有14个可能推测的基因。通过对这14个基因的测序和比较分析，我们只发现其中的一个基因在两个亲本之间存在差异，将这个基因暂定为Dep1基因。利用引物Dep1-F：5’-GCTCTAGAGTCGACtcaacataagcaaccactgaga’-3和引物Dep1-R：5’-GCTCTAGAGTCG ACctagatgttgaagcaggtgcag’-3，以313和314cDNA为模板，分别扩增了Dep1和DEP1全长c DNA。利用引物5’-CGGAATTCgtctctcagtgagccgttcc-3’和5’-CGGGATCCtcatgggcattatagcagca-3’，以313基因组DNA为模板，扩增1.9Kb的启动子序列。
将所获得的序列进行序列测定，所得结果如下：
SEQ ID NO：1：Dep1 cDNA序列(获自313)
SEQ ID NO：2：DEP1 cDNA序列(获自314)
SEQ ID NO：3：DEP1 gDNA(基因组DNA)序列(获自314)
SEQ ID NO：4：Dep1 promoter序列(获自313)
SEQ ID NO：9：Dep1蛋白序列(获自313)
SEQ ID NO：10：DEP1蛋白序列(获自314)。
实施例3：基因转化
通过遗传互补和过量表达该基因的研究，证明了该基因Dep1的功能。
(1)实验方法
◆互补载体的构建：
分离Dep1基因的启动子和3’UTR区，然后中间连接上Dep1的ORF，最后连接到载体pCAMBI1300，构建成：pDep::Dep1。转入农杆菌GV3101，再通过农杆菌介导的方法转入314中。具体构建过程如下：
首先利用分别含有Pst I和Hind III酶切位点的引物5’-ctgcagtcgtaacccatgctgtctca-3’和5’-aagctttggcgagtaaatgagtccaa-3’，以313(NIL-Dep1，含有Dep1基因的近等基因系)基因组DNA为模板扩增Dep1基因的900bp的3’UTR区，连接到载体pBluescript(stratagene)，经测序正确后经Pst I和HindIII酶切，片段连接到双元载体pCAMBI1300上，得到pCAMBI1300-3’UTR。利用分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的引物5’-gaattcgtctctcagtgagccgttcc-3’和5’-ggatcctcatgggcattatagcagca-3’，以绍兴313基因组DNA为模板扩增Dep1基因的2Kb的启动子序列，连接到载体pBluescript(stratagene)，经测序正确后经EcoR I和BamH I酶切，将片段连接到经同样酶切的质粒pCAMBI1300-3’UTR，构建成pCAMBI1300-DEPP：3’UTR。利用引物5’-cgggatccatgggggaggaggcggtggtgatg-3’和5’-gtcgactcaacataagcaaccactgaga-3’(分别含有BamH I和Sal I酶切位点)，以绍兴313cDNA为模板扩增588bp的Dep1基因的cDNA序列，产物连接到pGEM 18T(Takala)。测序正确后，经BamH I和Sal I双酶切，将片段连接到经同样双酶切的质粒pCAMBI1300-DEPP：3’UTR质粒上，构建成互补载体pCAMBI1300-DEPP：Dep1-3’UTR。构建好的载体转入到农杆菌AGL1中，经农杆菌介导的方法转入绍兴314中。
◆过量表达载体的构建：
将Dep1基因的ORF连接到pCAMBI-2300-Actin上，构建成：pAct::Dep1。转入农杆菌AGL1，再通过农杆菌介导的方法转入粳稻日本晴中。
具体构建过程：利用带有双酶切位点的BamH I和Sal I的引物5’-cgggatccatgggggaggaggcggtggtgatg-3’和5’-gtcgactcaacataagcaaccactgaga-3’，以313cDNA为模板扩增588bp的Dep1基因的cDNA序列，产物连接到pGEM 18 T(Takala)。测序正确后，经BamH I和Sal I双酶切，将片段连接到经同样双酶切的质粒pCAMBI-2300-Actin质粒上，构建成过量表达载体pAct::Dep1。
水稻转化实验程序
●愈伤组织诱导：
将水稻种子脱去颖壳，置三角瓶中，用70％酒精消毒3’(分钟)，然后用2.5％的NaClO(次氯酸钠)溶液消毒45’，在无菌操作下，用灭菌水冲洗几遍，取出置于NB培养基(N6大量，B5微量，B5维生素，铁盐，酶解酪蛋白300mg/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，肌醇100mg/L，pH 5.8)上，胚向上，26℃下暗培养。
●继代：
培养一个月左右可长出愈伤，愈伤组织以干燥、分散、黄白色的为好，将好的愈伤置于新的诱导培养基(同上)上，以后每两周多继代一次。
●农杆菌转化愈伤：
共培养法(见Hiei，Y.，et al.，Efficient tansformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by agrobacterium and sequence analysisof the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994.6(2)：p.271-282)。
转化：提前一天培养农杆菌AGL1，取对数生长期的农杆菌菌液，3000rpm下离心15’，用转化用培养基(N6B5G I+AS)(培养基成分：N6大量，B5微量，B5维生素，铁盐，蔗糖40g/L，葡萄糖20g/L，pH5.2。分装于100ml三角瓶中，每瓶20ml，高压灭菌。用前，每瓶培养基中加20ul浓度为100m mol/L的AS(乙酰丁香酮))悬浮菌体，将悬浮液稀释到(OD600＝0.5左右)，把好的愈伤组织挑到悬浮液中与农杆菌共培养30分钟(可置于摇床上摇动)，然后将愈伤取出直接放到固体共培养培养基(NB+AS)(培养基成分：N6大量，B5微量，B5维生素，铁盐，酶解酪蛋白300mg/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，肌醇100mg/L，pH5.8，100mmol/L的AS(乙酰丁香酮))上，26℃下暗培养。
选择：共培养3天后，选择。方法是：将转化的愈伤组织取出，先用附加500mg/L的羧苄青霉素的灭菌水洗三遍，然后用附加500mg/L的羧苄青霉素的N6B5G II液体培养基(N6大量，B5微量，B5维生素，铁盐，蔗糖20g/L，葡萄糖10g/L，pH5.8)洗一遍。然后将愈伤组织置于放了一层滤纸的灭菌培养皿中，使吸去愈伤组织表面的菌液，将愈伤组织置于选择培养基中(培养基成分：N6大量，B5微量，B5维生素，铁盐，酶解酪蛋白300mg/L，脯氨酸500mg/L，蔗糖30g/L，肌醇100mg/L，pH 5.8，500mg/L cefotaxine(头孢霉素)，50mg/L hygromycin B(潮霉素B))，26℃下暗培养。
分化：选择后，将能正常生长的愈伤(阳性候选)挑到分化培养基(培养基成分：MS大量，MS微量，MS维生素，铁盐，蔗糖30g/L，色氨酸50mg/L，NAA 0.1mg/L，Gelrite(固化剂，北京振泰公司)2.6g/L，pH 5.8)中(为防止污染，可现在NB诱导愈伤的培养基(同上)中扩繁)，26℃、光照条件下培养使分化，一般一个月左右可分化出苗。
●生根和移苗：
分化出的小苗(是芽)移到生根培养基，具体成分：1/2MS，1/2 B5有机，Sucrose 10g/L，Gelrite(固化剂)2.6g/L，pH 5.8。在光照条件下使生根，一般一个月左右。生根后可得到基本正常的苗，此时可将之移出种到土中。(移苗时注意保湿)。
母液的配制：
1、N6大量元素20×1000ml
◆KNO3 56.6g
◆(NH4)2SO4 9.26g
◆MgSO4.7H2O 3.70g
◆KH2PO4 8.00g
◆CaCl2.2H2O(单独溶解) 3.32g
2、微量元素100×500ml
●MnSO4.H2O 165mg
●(MnSO4.4H2O) (220mg)
●ZnSO4.7H2O 75mg
●H3BO3 80mg
●KI 40mg
3、B5微量元素100×500ml
●MnSO4.4H2O 500mg
●H3BO3 150mg
●ZnSO4.7H2O 100mg
●KI 37.5mg
(以下三种选配成母液再加入)
●NaMoO4.2H2O 12.5mg
●CuSO4.5H2O 1.25mg
●CoCl2.6H2O 1.25mg
4、B5-有机100×500ml
●VB1 500mg
●VB6 50mg
●烟酸 50mg
5、Fe-Salt.100×500ml
●FeSO4.7H2O 1.39g
●Na-EDTA 1.87g
6、N6维生素100×500ml
●烟酸 25mg
●盐酸硫胺素(VB1) 5mg
●盐酸吡哆醇(VB6) 5mg
●甘氨酸(氨基乙酸) 100mg
●肌醇 5g
7、MS大量元素20×1000ml
●KNO3 38g
●NH4NO3 33g
●KH2PO4 3.4g
●MgSO4.7H2O 7.4g
●CaCl2.2H2O 8.8g
●(CaCl2.2H2O单独溶解)
8、MS微量元素100×500ml
●MnSO4.4H2O 1115mg
●ZnSO4.7H2O 430mg
●H3BO3 310mg
●KI 41.5mg
●NaMoO4.2H2O 2.5mg
●CuSO4.5H2O 1.25mg
●CoCl2.6H2O 1.25mg
9、MS维生素100×500ml
●甘氨酸(氨基乙酸) 100mg
●盐酸硫胺素B1 20mg
●盐酸吡哆素B6 25mg
●烟酸 25mg
●肌醇 5g
10、MS大量元素20×1000ml
●KNO3 38g
●NH4NO3 33g
●KH2PO4 3.4g
●MgSO4.7H2O 7.4g
●CaCl2.2H2O 8.8g
●(CaCl2.2H2O单独溶解)
11、MS微量元素100×500ml
●MnSO4.4H2O 1115mg
●ZnSO4.7H2O 430mg
●H3BO3 310mg
●KI 41.5mg
●NaMoO4.2H2O 2.5mg
●CuSO4.5H2O 1.25mg
●CoCl2.6H2O 1.25mg
(2)实验结果
互补实验的原理是将显性基因导入不含该基因的受体，如能使受体植株的表型变成被导入基因所表现的表型，就说明该基因是控制该表型的基因。
互补实验表明转基因314恢复了直立密穗的表型(图6，左为未转基因的314，右为Dep1转基因314)。因为314中本身没有Dep1基因，而把Dep1基因转入314中，使其变成了象313的表型，说明我们克隆的Dep1基因能使弯曲和散穗变成直立密穗，说明了Dep1基因是控制直立密穗的。
过量表达Dep1基因，稻穗变的更直和密(图7，从左至右：第1穗为未转基因的日本晴对照，第2-4穗为Dep1基因转基因日本晴)。并且我们提取不同转基因株系的叶片的总RNA，反转录成cDNA，进行RT-PCR。RNA的提取采用Trizol(Invitrogen，New Zealand)，方法参照说明书。cDNA模板的制备，根据反转录酶的说明(promega，USA)。内参引物采用Actin1-F：agcaactgggatgatatgga(SEQ ID NO：)，Actin-R：cagggcgatgtaggaaagc(SEQ ID NO：)，Dep1基因特异引物gcgagatcacgttcctcaag(SEQ ID NO：)和tgcagtttggcttacagcat(SEQ IDNO：)。PCR时，在25μl的反应体系中加入cDNA模板1μl，正反向引物各5nmol，2.5μl 10×PCR缓冲液(生工，上海)，dNTP各0.2mmol/L，1.5mmol/L MgCl2，1U Taq DNA聚合酶(生工，上海)，ddH2O补齐。PCR反应程序为：94℃3min后94℃30sec，60℃45sec，72℃1.5min，循环28，再72℃延伸10min。退火温度取决于引物。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上检测。
结果表明不同的转基因日本晴株系中，Dep1基因的转录水平相对于对照(未转基因日本晴)都有不同程度的提高(图10)。
实施例4：Dep1基因的组织表达研究
(1)实验方法
◆RNA提取和反转录成cDNA：分别提取313和314的根、茎、叶鞘、叶舌，顶端分生组织(SAM)和幼穗的RNA，采用Trizol试剂盒提取。分别反转录(反转录酶promega，USA)成cDNA。
◆RT-PCR：采用Dep1基因特异的引物(同上)扩增(条件)以上各组织的cDNA，电泳检测。
(2)实验结果
DEP基因主要是在分生组织表达的基因
通过半定量RT-PCR，发现Dep1基因的表达主要在顶端分生组织和幼穗分化的各时期均有很高表达，并且在313中的表达要比314的高，在茎秆中也有比较高表达，在其余组织中的表达均很低(图8)。
实施例5：其它植物同源基因的分离
通过电子克隆在小麦、大麦和玉米中找到了与Dep1同源的cDNA序列。以水稻的Dep1的cDNA序列为探针，在NCBI网站(www.ncbi.nih.nlm.gov)提供的数据库里，通过Basic logicalalignmengt search tool(BLAST)比对，分别在大麦和小麦的EST数据库里搜索同源的EST序列，将这些EST首尾拼接。这样我们获得了大麦和小麦中同水稻同源的cDNA序列，TaDEP1和HvDEP1，编码的蛋白的同源性分别为：TaDEP1同OsDEP1(水稻)相似性为49.1％，同OsDep1(水稻)的相似性为59.3％；HvDEP1同OsDEP1(水稻)的相似性为49.1％，OsDep1(水稻)为58.3％。所获得的同源序列如下：
SEQ ID NO：5：小麦cDNA序列
SEQ ID NO：6：大麦cDNA序列
SEQ ID NO：7：玉米cDNA序列-1
SEQ ID NO：8：玉米cDNA序列-2
SEQ ID NO：11：小麦蛋白序列
SEQ ID NO：12：大麦蛋白序列
SEQ ID NO：13：玉米蛋白序列-1
SEQ ID NO：14：玉米蛋白序列-2
本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的本文描述了本发明的具体实施方案，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方案和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。
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Claims (15)
1.分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO：1和5-8中的任何一个所示的核苷酸序列；
(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；
(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的核苷酸序列；
(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；
(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；
(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.权利要求1的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1和5-8中的任何一个所示的核苷酸序列。
3.构建体，其包含权利要求1或2的多核苷酸。
4.载体，其包含权利要求1或2的多核苷酸，所述载体可以是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。
5.细胞，其包含权利要求1或2的多核苷酸或权利要求3的构建体或权利要求4的载体，所述细胞可以是动物细胞、植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞，优选植物细胞。
6.转基因植物或者植物部分，其包含权利要求5的细胞，其中所述植物优选是农作物例如水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦，或来源于该植物的转基因种子。
7.分离的多肽，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列，
(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，
(3)与SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列，
(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段，和
(5)权利要求1或2的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
8.权利要求7的多肽，其包含SEQ ID NO：9和11-14中任何一个所示的氨基酸序列。
9.生产植物的方法，该方法包括：从权利要求5的植物细胞再生转基因植物，或者将权利要求6的植物与另一植物杂交；其中所述植物优选是直立密穗植物，其中所述植物优选是农作物例如水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。
10.权利要求9的方法生产的植物或来源于该植物的转基因种子。
11.提高作物植物产量、提高作物植物抗倒伏能力、提高作物植物穗数和穗粒数、提高作物植物光合效率、或提高作物植物结实期群体生长率或干物质生产量的方法，该方法包括制备含有权利要求1或2的多核苷酸或权利要求3的构建体或权利要求4的载体的作物植物，例如，所述方法可以包括从权利要求5的植物细胞再生转基因植物或者将权利要求6的植物与另一植物杂交。
12.权利要求1或2的多核苷酸或权利要求3的构建体或权利要求4的载体在提高作物植物产量、提高作物植物抗倒伏能力、提高作物植物穗数和穗粒数、提高作物植物光合效率、或提高作物植物结实期群体生长率或干物质生产量中的用途。
13.分离的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；
(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的核苷酸序列；
(4)(1)-(3)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
(5)与(1)-(4)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
14.权利要求13的启动子序列，其包含SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
15.包含权利要求13或14的启动子序列的构建体或载体、或包含该构建体或载体的细胞。
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