CN102115750B

CN102115750B - Tt1基因在提高植物产量中的用途

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Publication number: CN102115750B
Application number: CN200910312711.1A
Authority: CN
Inventors: 杨毅
Original assignee: SICHUAN BIODESIGN BIOLOGY GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SICHUAN BIODESIGN BIOLOGY GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2029-12-30
Also published as: CN102115750A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物产量中的用途。本发明要解决的技术问题是为提高植物产量的转基因技术领域提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高植物产量中的用途，经实验证明转入了TT1基因并过表达的植物的产量有了明显的提高。本发明培育出高产量植物的方法也简便而有效，为本领域提供了新的有效选择。

Description

TT1基因在提高植物产量中的用途

技术领域

本发明涉及农作物育种技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物产量中的用途。

技术背景

预计本世纪30年代，我国人口将增加到16亿，需要粮食6.5亿吨左右，人均耕地将减少到1亩左右，面对人口逐年增加、耕地面积逐年减少，粮食自给成为人类的紧迫问题。解决这一问题行之有效的手段就是通过农作物品种改良提高粮食单产。

水稻是人类赖以生存的最重要的粮食作物，今天，全球50％以上的人口靠水稻果腹。但在水稻生产中，由于病虫草的危害和不良气候与环境的影响，严重制约了水稻的高产、优质和稳产，从而直接威胁到人类的生存与发展；同时随着发展中国家城市化和农用土地的退化，耕作用地面积将会持续减少，仅依靠现有常规杂交选育法提高产量的困难越来越大。基于DNA水平的植物基因工程研究为21世纪新的“绿色革命”提供了新的技术平台。利用基因工程技术，大规模发掘可用基因，不但可以大幅度提高农作物生产率，而且还能选育出抗干早、耐盐碱、抗病虫和其他性状优良的农作物，从而解决人类、资源和环境之间日益尖锐的矛盾，促进农业可持续发展。

随着水稻基因组学和分子遗传学研究的快速发展，寻找水稻增产基因已取得大的发展。分蘖是影响水稻产量的一种重要农艺性状，水稻形成的分蘖数是决定穗数的前提，而穗数又是构成产量的重要基础。影响水稻分蘖发生的栽培条件和生理机制已有广泛深入的研究，但关于水稻如何控制分蘖发生的生物学机制，目前尚不清楚。水稻的分蘖按结实多少可分为有效分蘖和无效分蘖。在生产上也不是分蘖越多越好，据有关研究资料表明，一棵直播的水稻可分蘖120～130个，但如果不能完全结实则成无效分蘖，为了争取更多的有效分蘖必须争取多的有效分蘖。至今尚鲜有报道发现有效分蘖数增多而株高不受影响或者降低的水稻突变体。在申请人之前递交的中国专利申请200810045667.8中记载了分离自油菜的新基因，命名为TT1。将该基因转入水稻中，可提高水稻有效分蘖数、千粒重以提高产量，同时降低株高以抗倒伏。

油菜是我国播种面积最大、地区分布最广的油料作物。在几种主要油料作物中，油菜具有以下几个显著的优点：①品种类型多，适应范围广，对自然条件要求不严。总的说来，油菜是喜凉作物，对热量要求不高，对土壤的要求也不严，酸、碱、中性土壤均能种植。因此油菜具有地区上广泛分布的可能性。②它是油、肥兼收，用地、养地结合的作物。③油菜可以利用冬闲地种植，不与粮棉争地。在粮棉生产任务重而人多地少、耕地安排较紧张的地区，扩大油菜种植较其他作物更为容易。

新中国50年来，油菜作为最主要的油料和经济作物发展稳中有升，新品种推广实现了三次革命。进入90年代，无论是种植面积、单产水平和总产量均继续保持快速增长的势头，但由于传统育种方式过程复杂、耗时长，造成近几年油菜产量增加达到瓶颈期。通过转基因技术与传统育种相结合，全国20多个科研单位近二十年的协作科技攻关以及中国一加拿大或澳大利亚、美国等重大国际合作研究，致力于研发出高产、稳产、性状优良的优质新品种。可见利用基因工程方法获得的油菜转基因植株，使其成为生产上可以应用的新品种就成为当今继续提高油菜产量的新途径。

多年生黑麦草原产西南欧、北非和西南亚的温带。目前世界各国均有栽培。在我国主要分布于华东、华中和西南等地，以长江流域的高山地区生长最好。多年生黑麦草质优良，叶量丰富，茎叶柔嫩，适口性好，是马、牛、羊、兔草食家畜的优质牧草；也是养鱼的好饲料。可青饲、青贮或调制干草，也适于放牧利用。多年生黑麦草是一草多用的优良牧草。由于其根系发达，生长迅速，耕地种植可增加种植地的土壤有机质，改善种植地土壤的物理结构；坡地种植，可护坡固土，防止土壤侵蚀，减少水土流失。因而选择高产、优质、抗逆牧草品种就显得十分重要。

本领域需要开发出能够提高作物产量的备选基因，以运用基因工程技术提高作物产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为提高植物产量的转基因技术领域提供一种新的有效选择。

本发明解决该技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高植物产量中的用途。

其中，上述TT1基因的核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。也能提高植物产量性。

本发明同时提供了TT1基因编码的多肽在提高植物产量中的用途。

上述TT1基因具有如下核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

本发明还提供了一种培育产量植物的方法。该方法包括以下步骤：

(1)将TT1基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TT1基因的重组载体；

(2)将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞；

(3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因产量植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

其中，上述植物可为一般的各种农作物，如常见禾本科或十字花科植物。其中的禾本科植物如小麦、水稻等农作物和黑麦草等牧草物，十字花科植物如油菜、甘蓝等作物。

本发明中所述的TT1基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，该基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜(Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法，筛选到油菜中的一个EST序列，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE的方法获得序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。然后根据SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计一对PCR引物，从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在本发明中，“在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的TT1基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO.1所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1同源性低至约89％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ IDNO.1中的核苷酸序列的同源性至少80％，较佳地至少89％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高植物的产量。

该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO.1相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。比如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，其编码的多肽也能提高植物的产量。

本发明所述重组载体，是将TT1基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如pBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上述重组载体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后将转化细胞培育成转基因高产量植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT1基因在提高植物产量方面的用途，在本发明的实施例中也通过实验证明转入了TT1基因并过表达的植物较野生型的各项产量相关指标，如种子数，有了显著的提高。本发明培育出高产量植物的方法也简便而有效，为提高植物产量提供了新的有效选择，具有好的应用前景。

附图说明

图1、转基因水稻植株中潮霉素hpt基因的PCR电泳检测结果。从左至右依次为分子量Maker(M，片段从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，阳性对照(+)，野生型阴性对照(-)，待检测植株1～6号。

图2、转基因水稻植株中TT1基因的PCR电泳检测结果。从左至右依次为分子量Maker(M，片段从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，阳性对照(+)，野生型阴性对照(-)，待检测植株1～5号)。

图3、转基因水稻植株中TT1基因的RT-PCR电泳检测结果。从左至右依次为分子量Maker(M，片段大小依次为2000bp；1000；750bp；500bp；250bp；100bp)，1号为野生型阴性对照，2～5号为待检测植株。

图4、水稻的外观直接比较。1～3为转基因阴性植株；4～6为转基因阳性植株。

图5、TT1基因过量表达甘蓝型油菜的PCR检测结果。从左至右依次为分子量Marker(M，片段大小依次为2000bp；1000；750bp；500bp；250bp；100bp)，1～4为TT1基因过量表达甘蓝型油菜。

图6、转基因黑麦草植株中TT1基因的PCR电泳检测结果。从左至右依次为分子量Maker(M，片段从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，阳性对照(+)，野生型阴性对照(-)，空白对照(0)，待检测植株1～6号)。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆菌(E.coli)采用DH5a菌株，菌株均购自于Qiagen公司。载体pBI121购自于Clontech公司。其余化学实际均为市售分析纯。下述实施例中，“SEQ ID NO：1”单独出现时，本领域技术人员可理解1其为“SEQ ID NO：1所示核苷酸序列”的简称。

实施例一使用TT1基因增加水稻产量

一、TT1基因的克隆及获取

以油菜中的atp6(genebank gi：89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法(见Clontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID NO：2所示)，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE(见Takara公司所公开的资料)的方法获得本发明所述提高植物经济产量的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO.3)：5’-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO.4)：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

PCR程序如下：

1.95℃ 4min(预变性)

2.95℃ 30s (变性)

3.53℃ 30s (复性)

4.72℃ 50s (延伸)

5.2～4步骤循环30次

6.72℃ 5min(终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到序列SEQ ID NO：1的基因片段。

二、过表达TT1基因的水稻植株制备

1、采用的水稻材料(Oryza sativa L.)为粳稻日本晴，为四川农业大学水稻研究所保存。农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆菌(E.coli)采用DH5a菌株。

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，构建目的基因过量表达重组质粒。

上游引物(SEQ ID NO.5)：5’-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO.6)：5’-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

用上述引物，经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，PCR程序如下：

1.95℃ 4min(预变性)

2.95℃ 30s(变性)

3.53℃ 30s(复性)

4.72℃ 50s(延伸)

5.2～4步骤循环30次

6.72℃ 5min(终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒。在大肠杆菌DH5α中繁殖后，提取质粒(见Qiagen公司公开资料)，将含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒转入农杆菌LBA4404中。

2、外植体培养方法

幼胚愈伤组织的诱导和继代：取田间开花后12-15天的水稻未成熟颖果，剥壳后在75％酒精中浸泡1分钟，用无菌水冲洗干净后，0.1％升汞灭菌20分钟，再用无菌水冲洗干净。在超净工作台上晾干，用镊子剥取幼胚接种在诱导培养基(NB+2，4-D 2.5mg/L)上，于26℃下暗培养。一周后统计愈伤组织的诱导情况并进行继代，以后每2周继代一次。

成熟胚愈伤组织的诱导和继代：选取外观健康，饱满，无病斑的成熟种子脱去颖壳，75％酒精中浸泡1分钟，用无菌水冲洗干净后，0.1％升汞灭菌20分钟，再用无菌水冲洗干净。在超净工作台上晾干，接种到诱导培养基上，于26℃下暗培养。2周后统计愈伤组织的诱导情况并进行继代，以后每2周继代一次。

3、水稻基因转化实验方法

3.1、工程菌的活化

用无菌牙签在平板上挑取农杆菌单菌落，放在10mlYEP培养液(酵母提取物(YeastExtract)10g+胰蛋白胨(Tryptone)5g+NaCl 10g+加水至1L+Rif 50μg/mL+Hyg 25μg/mL)中培养；或着取保存于-20℃冰箱无菌农杆菌菌液50-100μl于2ml的含相应抗生素的YEP培养基上，250r/min，28℃培养过夜。取过夜培养液300μl于3ml的含相应抗生素的YEP液体培养基中，在250r/min，28℃的条件下遮光振动培养，至菌液达OD600＝0.5左右，即可用于转化。

上述含目的基因的菌液在无菌的50ml的离心管中以5000r/min离心5分钟后回收菌体，用30ml的NBCO(NB+2，4-D 2.0mg/L+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L)液体培养基重悬含目的基因的菌体。选择生长状态良好的，颗粒状胚性愈伤组织用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染时间为10～30min，之后放入有滤纸的平皿中吸干多余菌液。

3.2、共培养

将吸干菌液的愈伤置于NBCO(NB+2，4-D 2.0mg/L+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L)固体培养基上，共培养培养基上放1层滤纸，滤纸上放愈伤组织。22-25℃暗培养2-3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。

3.3、脱菌与筛选

共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈，再浸泡于含Cef(头孢霉素)500mg/l NBCO液体培养基中，在摇床上中速振荡30-60min，弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上暗培养三周，再转入二筛培养基上暗培养三周，温度控制在25～27℃。

3.4、分化与生根

选择将两次筛选后新长出的抗性愈伤组织接种到预分化培养基(NB+KT1mg/L+NAA0.25mg/L)上，暗培养10天。再转到分化培养基(NB+KT1mg/L+NAA 0.25mg/L+6-BA1mg/L+Hyg(潮霉素)25mg/L)上光照培养，用日光灯每天照明12小时，温度控制在25～27℃。约1～2个月，可获得2cm左右高的幼苗。将幼苗转到生根培养基上培养，当根长到2cm左右高时取出，洗净根部的培养基，移栽于大田。

3.5、转基因水稻的检测

3.5.1、取一小片再生植株新鲜叶片，抽提总DNA(见Qiagen公司所公开的资料)，以提取的DNA做模板，分别进行检测。

转基因水稻植株中潮霉素hpthpt基因的PCR检测：

潮霉素hpt基因的PCR引物序列为

上游引物hpt-1(SEQ ID NO.7)：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’

下游引物hpt-2(SEQ ID NO.8)5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’

PCR程序如下：

1.95℃ 4min(预变性)

2.95℃ 30s(变性)

3.53℃ 30s(复性)

4.72℃ 50s(延伸)

5.2～4步骤循环37次

6.72℃ 5min(终延伸)

7.4℃ 保存

以上PCR反应完成，在琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图1，若有有目标条带出现则代表目的基因已转入水稻中。

转基因水稻植株中TT1基因的PCR检测：

TT1基因的PCR引物序列为

TT1-1(SEQ ID NO.9)：5’-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3’

TT1-2(SEQ ID NO.10)：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3’

PCR程序如下：

1.95℃ 4min(预变性)

2.95℃ 30s(变性)

3.53℃ 30s(复性)

4.72℃ 50s(延伸)

5.2～4步骤循环37次

6.72℃ 5min(终延伸)

7.4℃ 保存

以上PCR反应完成，在琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图2。有目标条带出现则代表目的基因已转入水稻中。

RT-PCR检测：

提取了经PCR检测为阳性的植株和野生型植株，抽提植株的总RNA(见Qiagen公司所公开的资料)，进行RT-PCR检测。检测转基因植株是否在RNA水平上得到了表达。

One Step RT-PCR的方法

在RNase-free 0.2ml PCR管中加入(50μl体系)：

10×One Step RT-PCR buffer 5μl

MgCl₂(25mM) 10μl

dNTP Mixture(10mM) 5μl

RNase Inhibitor(40U/μl) 1μl

AMV Rtase XL(5U/μl) 1μl

AMV-Optimized Taq(5U/μl) 1μl

上游特异引物(20μM) 1μl

下游特异引物(20μM) 1μl

Total RNA(≤1μg) 1μl

RNase Free ddH₂O 24μl

Total 50μl/Sample

RT-PCR的反应程序为：

1.50℃ 30min

2.94℃ 3min

3.94℃ 40s

4.58℃ 30s

5.72℃ 40s

6.3～5步骤循环40次

7.72℃ 5min

8.4℃ 保存

电泳检测结果见图3，在阴性对照植株中没有扩增出特异条带，而在待检测植株中扩增出与目的片段大小一致条带，证明在显示条带的植株中，转入的TT1基因发生了转录，在RNA水平上得到了表达。

三、过表达TT1基因的水稻农艺性状分析

将检测确定的转基因植株及未检测出的阴性对照移至温室大棚中，使其自交结实，以备单株收种。

水稻成熟后，两种材料各选取10株进行室内考种，考察得到结果见表1，直观比较见图4。

表1TT1转基因水稻与阴性对照的产量性状比较

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒。将含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒转入农杆菌中，利用下胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜(见步骤2)。

2、胚轴浸染的方法转化甘蓝型油菜

2.1、无菌苗的获取

选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，4℃过夜春化(保持种子发芽同步)，然后取出，用70％乙醇浸泡30s，0.1％的升汞(HgCl₂)溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5次，滤纸吸干，接种于MS固体培养基上。置培养室中24℃，暗培养2～3天，然后取出光照16h/d继续萌发。取5～7cm(约7～8天)无菌苗下胚轴作为转化受体。

2.2、下胚轴的预培养

将油菜下胚轴切成7mm左右小段，分散均匀置于预培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L2，4-D，2.5mg/L AgNO₃，19.62mg/L AS)中进行2～3天的预培养(可见下胚轴变粗)。

2.3、下胚轴的浸染及共培养

挑取含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌、含SEQ ID NO：1的抑制表达重组质粒的农杆菌，分别接种于含20mg/L Str，50mg/L Kan，40mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃摇菌过夜后收集菌体，重悬于含100mg/L AS的MS液体培养基中至OD₆₀₀＝0.4～0.6，28℃摇菌1～2h。

将经预培养的健壮的油菜下胚轴分别浸入含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒的农杆菌和含SEQ ID NO：1的抑制表达重组质粒的农杆菌的菌液中30s～1min，此期间不断振荡使菌液与油菜下胚轴充分接触。用无菌滤纸迅速吸干多余的菌液，将油菜下胚轴平放于共培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L 2，4-D，2.5mg/L AgNO₃，19.62mg/L AS)上，共培养2d。

2.4、筛选培养与芽的诱导

将共培养后的两种油菜下胚轴分别接入分化培养基(MS+2mg/L 6-BA，1mg/L 2，4-D，2.5mg/L AgNO₃，19.62mg/L AS)中继续培养。每2周更新培养基一次，培养4周，得到愈伤芽。

2.5、生根

在筛选培养基(MS+2mg/L 6-BA，2.5mg/L AgNO₃，500mg/L Carb，10mg/L Kan)上待两种愈伤芽长至有4～6片真叶时，将芽从愈伤组织中切下，移入生根培养基(1/2MS，0.15mg/L NAA，250mg/L Cef)中。待再生苗根系生长发达时，将培养罐移至室外2～3d，然后将培养罐盖揭开，在培养室中炼苗2～3d。

2.6、盆栽培养

将含SEQ ID NO：1的过量表达和含SEQ ID NO：1的抑制表达转基因植株分别在生根培养基上发育出完整根系，将其转入盆栽。

3、转基因油菜的PCR检测

待土壤中两种再生植株长大后，各取叶片少量抽提总DNA，以提取的DNA做模板，分别进行PCR检测。目的基因过量表达甘蓝型油菜转基因株系检测：

上游引物(SEQ ID NO.11)：5’ATTTCATTTGGAGAGAACACGG 3’

下游引物(SEQ ID NO.12)：5’TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT 3’

PCR程序如下：

1.95℃ 4min(预变性)

2.95℃ 30s(变性)

3.53℃ 30s(复性)

4.72℃ 50s(延伸)

5.2～4步骤循环37次

6.72℃ 5min(终延伸)

7.4℃ 保存。

然后琼脂糖电泳检测，检测结果见图5，若有目标条带出现则代表目的基因已转入甘蓝型油菜。所检测出目的条带的大小和预期SEQ ID NO：1大小一致，约为860bp。制得SEQ IDNO：1核苷酸序列过量表达甘蓝型油菜植株和种子备用。

三、过表达TT1基因的油菜产量测定

将经鉴定的转基因油菜和同一生长期的野生油菜一同移栽到温室大棚中中，待成熟后，进行产量的测定，得到实验数据如表2。

表2油菜产量相关指标测定结果

	单株种子产量g	千粒重g	单株角果数	每果粒数
					野生型	10.16	4.16	164.50	17.44
转基因型	15.89	4.21	202.75	18.95

可以看出，转基因阳性油菜单株产量明显高于野生型油菜，这主要表现在转基因型油菜的单株角果数比野生型多、每个角果中种子的粒数比野生型多、种子千粒重比野生型重等方面。综上可以得知，转TT1基因油菜的产量要明显高于野生型油菜。

实施例三：使用TT1基因增加黑麦草产量

一、过表达TT1基因的黑麦草植株制备和种子的获得

1、目的基因过量表达重组质粒构建

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO.5)：5’-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’，

下游引物(SEQ ID NO.6)：5’-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’。

经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，PCR程序如下：

1.95℃ 4min(预变性)

2.95℃ 30s(变性)

3.53℃ 30s(复性)

4.72℃ 50s(延伸)

5.2～4步骤循环30次

6.72℃ 5min(终延伸)

7.4℃ 保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒。将含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒转入农杆菌中，转化黑麦草(市售多年生黑麦草品种多福)。

2、转化黑麦草方法

下表为黑麦草转化中使用的各种培养基：

培养基类型	培养基组分
		LB培养基	胰蛋白胨10g/L+酵母粉5g/L+NaCl 10g/L，pH＝7.2
MS基本培养基	Murashige and Skoog Medium
		愈伤组织诱导培养基	MS+麦芽糖30g/L+2，4-D 5mg/L+0.1mg/L KT，2.4g/L结冷胶，pH＝5.8，高压蒸气灭菌15磅，15分钟
愈伤组织继代培养基	MS+麦芽糖30g/L+2，4-D 3mg/L，pH＝5.8，2.4g/L结冷胶，高压灭菌同上
		浸染培养基	MS+麦芽糖30g/L+葡萄糖10g/L+2，4-D 3mg/L，pH＝5.2；高压灭菌后加入VC、AS，终浓度分别为100mg/L、200μmol/L。液体
共培养基	与浸染培养基同，但需加入2.4g/L结冷胶，pH＝5.2，；高压灭菌后加入100mg/L VC、200μmol/L AS和50mg/L硫辛酸。
		恢复除菌培养基	愈伤组织继代培养基，高压灭菌后加入200mg/L特美汀(Timentin)和硫辛酸50mg/L
选择继代培养基	愈伤组织继代培养基，高压灭菌后加入200mg/L特美汀和10~50mg/L巴龙霉素
		植株分化再生选择培养基	MS+蔗糖40g/L+6-BAP 0.5mg/L+2，4-D 0.1mg/L，琼脂粉6g/L，pH＝5.8，高压灭菌后加入100mg/L特美汀，50mg/L巴龙霉素
植株生根选择培养基	MS+蔗糖30g/L+奈乙酸0.02mg/L，pH＝5.8，琼脂粉6g/L，高压灭菌后加入100mg/L特美汀，50mg/L巴龙霉素

基于28℃、200rpm培养3-5hr至O.D值约0.6，即可用于转化。

2.2.2、浸染及共培养

愈伤组织在培养皿中加入液体共培养基切成直径约4mm的小块，立即加入适量上述农杆菌菌液混合均匀5min，取出愈伤组织置于无菌滤纸上吸去附着的菌液(或者沥去多余的菌液)，立即置于共培养基上25℃暗培养3天。

2.2.3、恢复除菌培养

共培养后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于恢复培养基上，无选择培养7天。

2.2.4、选择培养

将愈伤组织转移到含巴龙霉素的选择培养基上进行选择培养，3轮选择，每2周为一轮，巴龙霉素的浓度分别为：第1轮10mg/L，第2轮25mg/L，第3轮50mg/L。

2.2.5、分化培养

经过选择，将抗性愈伤组织置于植株再生选择培养基上，25℃光照培养，光周期为16hr光照/8hr暗进行分化。

2.2.6、植株培养

将分化出的抗性植株置于植株继代选择培养基上培养，至苗约10cm高，生根后，移至盆石本。

3、转基因黑麦草的PCR检测

待植株长大后，各取叶片少量抽提总DNA，以提取的DNA做模板，分别进行PCR检测。

上游引物(SEQ ID NO.11)：5’ATTTCATTTGGAGAGAACACGG 3’

下游引物(SEQ ID NO.12)：5’TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT 3’

PCR程序如下：

1.95℃ 4min(预变性)

2.95℃ 30s(变性)

3.53℃ 30s(复性)

4.72℃ 50s(延伸)

5.2～4步骤循环37次

6.72℃ 5min(终延伸)

7.4℃ 保存。

然后琼脂糖电泳检测，所检测出目的条带的大小和预期SEQ ID NO：1大小一致(见图6)，约为860bp。制得SEQ ID NO：1核苷酸序列过量表达黑麦草植株和种子备用。

	干草产量kg/m2	叶干重kg/m2	茎干重kg/m2	单株叶片数	叶长cm	叶宽cm
							野生型	0.21	0.08	0.13	12.73	34.16	0.87
转基因型	0.49	0.19	0.30	19.97	38.41	0.92

SEQUENCE LISTING

<110>四川贝安迪生物基因工程有限公司

<120>TT1基因在提高植物产量中的用途

<130>A090524K

<160>12

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>861

<212>DNA

<213>Brassica napus

<400>1

atgtcggatg atttgagttt atgtaccgat cgtctgataa cggccgagag cttggaatca 60

gaaaaggatt ctggagaaag ttccaggctt caaggcaaag atgtggcttc ttcttcatct 120

gcggatgaag ctgaagatgc taggaagtac tatgctgttg ttgcagaaga ggagccgctt 180

ctgcaatctg ttgagtgccg tatttgccag gaggaagata tcactaagaa cttggagact 240

ccttgtgctt gcaatggcag tttgaagtat gctcaccgca agtgtgttca gcgttggtgt 300

aatgagaaag gcgacataat ctgcgaaata tgccaccagc cttatcaatc tggatataca 360

gcacctccac ctcctcctcc tgatgaaact ataattcaca ttggtgacga ctgggaggat 420

ggagttcact tggactcgag cgacccgcgc attctagcaa tggctgcggc ggaacgacat 480

ttcttggaag ctgactatga cgagtactct gagtctaact ctagcggtgc tgccttctgt 540

cgctctgctg ctctcatcct gatggcactt ttactgttac gtgatgcact aaacctcaca 600

actaacccag atgacgagga cgatcccact gccttcttct ctcttttcct tcttcgtgct 660

gctggttttc tcctcccatg ttatatcatg gcatgggcca tcggtattct ccagcgccgg 720

aggcaaagac aggaagcagc tgcgctagct gcggcggaag ttgccttcat gatacacggt 780

ggtgtgccac aacgcagggg actacacttt gctgtagcac cagagcagcc gccgccaata 840

tccaacccaa caccagtctg a 861

<210>2

<211>696

<212>DNA

<213>Brassica napus

<400>2

gaagaggagc cgcttctgca atctgttgag tgccgtattt gccaggagga agatatcact 60

aagaacttgg agactccttg tgcttgcaat ggcagtttga agtatgctca ccgcaagtgt 120

gttcagcgtt ggtgtaatga gaaaggcgac ataatctgcg aaatatgcca ccagccttat 180

caatctggat atacagcacc tccacctcct cctcctgatg aaactataat tcacattggt 240

gacgactggg aggatggagt tcacttggac tcgagcgacc cgcgcattct agcaatggct 300

gcggcggaac gacatttctt ggaagctgac tatgacgagt actctgagtc taactctagc 360

ggtgctgcct tctgtcgctc tgctgctctc atcctgatgg cacttttact gttacgtgat 420

gcactaaacc tcacaactaa cccagatgac gaggacgatc ccactgcctt cttctctctt 480

ttccttcttc gtgctgctgg ttttctcctc ccatgttata tcatggcatg ggccatcggt 540

attctccagc gccggaggca aagacaggaa gcagctgcgc tagctgcggc ggaagttgcc 600

ttcatgatac acggtggtgt gccacaacgc aggggactac actttgctgt agcaccagag 660

cagccgccgc caatatccaa cccaacacca gtctga 696

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>3

atgtcggatc atttgagttt atg 23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>4

tcagactggt gttgggttgg atat 24

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>5

cgcggatcca tgtcggatca tttgagttta tg 32

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>6

ccggagctct cagactggtg ttgggttgga tat 33

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

taggagggcg tggatatgtc 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>8

tacacagcca tcggtccaga 20

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>9

atttcatttg gagagaacac gg 22

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>10

tcagactggt gttgggttgg atattg 26

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>11

atttcatttg gagagaacac gg 22

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>12

tcagactggt gttgggttgg atat 24

Claims

1.TT1基因在提高植物产量中的用途，所述TT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于所述的植物为水稻、甘蓝型油菜或黑麦草。

2.TT1基因编码的多肽在提高植物产量中的用途，所述TT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的植物为水稻、甘蓝型油菜或黑麦草。

3.一种培育高产量植物的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将TT1基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TT1基因的重组载体；

（2）将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞；

（3）经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因高产量植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织；

所述TT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的植物为水稻、甘蓝型油菜或黑麦草。