CN102127553B - Tt1基因在提高植物抗病性中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物抗病性中的用途。本发明要解决的技术问题是为提高植物抗病性的转基因技术领域提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高植物抗病性方面的用途，经实验证明转入了TT1基因并过表达的植物，尤其是禾本科植物对多种疾病都表现出了良好的抗性。本发明培育出抗病植物的方法也简便而有效，为本领域提供了新的有效选择。

Description

TT1基因在提高植物抗病性中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及TT1基因在提高植物抗病性中的用途。

背景技术

植物在自然界中经常遭受病原物的侵害，这些病原物包括细菌、真菌、线虫和病毒等。对于农作物来说，病害是制约农作物高产、稳产的重要因素。比如：全球每年由各种病害造成的水稻产量损失足以养活9000万人以上，中国常年发生面积580余万公顷，由于其危害面积与危害程度日趋严重，已成为水稻持续高产稳产的严重障碍。

植物真菌病，是由植物病原真菌引起的病害，约占植物病害的70～80％。一种作物上可发现几种甚至几十种真菌病害。主要有藻菌纲中霜霉菌(Peronospora)引起的霜霉病；子囊菌纲中囊壳菌(Gibberella)引起的水稻恶苗病、麦类赤霉病；担子菌纲中锈菌引起的锈病，黑粉菌(Ustilago)引起的黑粉病，半知菌类引起的稻瘟病、稻胡麻斑病等。

稻曲病(Ustilaginoidea virens(cooke)Tak)是世界性真菌病害，属于子囊菌纲麦角菌科。稻曲病也是我国近几年逐步蔓延、日趋严重的水稻危险性病害之一。稻曲病又称伪黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病，俗称“丰产果”。该病只发生于穗部，为害部分谷粒。受害谷粒内形成菌丝块渐膨大，内外颖裂开，露出淡黄色块状物，即孢子座，后包于内外颖两侧，呈黑绿色，初外包一层薄膜，后破裂，散生墨绿色粉末，即病菌的厚垣孢子，有的两侧生黑色扁平菌核，风吹雨打易脱落。河北、长江流域及南方各省稻区时有发生。稻曲病的危害损失不仅限于病粒，而且影响整个稻穗，随着病粒的增加，结实率不断降低，产量损失逐渐加大。

水稻稻瘟病作为水稻栽培中的一个主要病害，病原称灰梨孢、稻梨孢(Pyriculariagrisea(Cooke)Sacc)，属半知菌亚门真菌。从秧田中的苗瘟、叶瘟到移栽大田后的节瘟、颈瘟、谷粒瘟和叶枕瘟(叶片与叶鞘交界处)均可发病，几乎贯穿水稻的整个生育期，严重危害水稻的正常生长，对产量构成很大的威胁，严重时减产40％～50％，甚至颗粒无收。世界各稻区均匀发生。本病在各地均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。近年来，稻瘟病年发生面积出现逐年增加趋势，局部大爆发并不少见，目前，稻瘟病可能发生在国内的任何年头、任何季节。

赤霉病是全球性小麦主要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害。该病由多种镰刀菌引起，有禾谷镰孢(Fusarium graminearum Schw)、燕麦镰孢(F.avenaceum Sacc)、黄色镰孢(F.culmorum Sacc)、串珠镰孢(F.moniliforme Sheld)等，都属于半知菌亚门真菌。小麦赤霉病从苗期至穗期均可发生，引起苗腐、基腐、秆腐和穗腐，其中以穗腐危害最大。穗腐一般于小麦扬花后6～10d出现症状，最初在小穗和颖壳上呈现水渍状褐色斑点，后逐渐扩展至全部小穗，病部呈褐色或青黄色，受害处的以上部分全部枯黄而死。受害麦粒皱缩干瘪，呈白色或粉红色霉层，从而影响小麦产量和品质。随着全球性气候变暖和玉米-小麦轮作制度的增加，近10多年来小麦赤霉病在北美和欧洲也大面积发生，造成了严重的产量和经济损失。同样，中国黄淮麦区和关中麦区近年来小麦赤霉病发生也日趋严重，从而影响着国内小麦主产区的粮食安全和食品安全。

纹枯病为我国麦区常发病害。病原Ceratobasidium cornigerum(Borud.)Rogers称喙角担菌，属担子菌亚门真菌。小麦受纹枯菌侵染后，在各生育阶段出现烂芽、病苗枯死、花秆烂茎、枯株白穗等症状。烂芽芽鞘褐变，后芽枯死腐烂，不能出土；病苗枯死发生在3-4叶期，初仅第一叶鞘上现中间灰色，四周褐色的病斑，后因抽不出新叶而致病苗枯死；花秆烂茎拔节后在基部叶鞘上形成中间灰色，边缘浅褐色的云纹状病斑，病斑融合后，茎基部呈云纹花秆状；枯株白穗病斑侵入茎壁后，形成中间灰褐色，四周褐色的近圆形或椭圆形眼斑，造成茎壁失水坏死，最后病株因养分、水分供不应求而枯死，形成枯株白穗。

实践证明，采用基因工程与常规育种相结合的方法，利用植物自身所携带抗性基因培育和推广抗病品种是防治和控制病害最经济、有效、环保的方法。但是，禾谷类作物种类多，病害类型也多，抗病机理复杂，至今有许多问题还未被澄清。抗病基因的筛选尽管经过多年来的努力，至今禾谷类作物的抗病基因/蛋白质还没有筛选与分离出来。目前主要从非寄主植物抗病系统的转移等方面入手进行探索。

随着分子生物技术的迅速发展和基因克隆技术的不断完善，植物基因工程研究正向纵深发展，抗性基因研究已由单面抗性向多面抗性(抗生物胁迫与非生物胁迫)转移。但是目提高植物多面抗性的备选基因还较少，需要为此提供新的有效选择。在申请人之前递交的中国专利申请200810045667.8中记载了分离自油菜的新基因，命名为TT1。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为提高植物抗病性的转基因技术领域提供一种新的有效选择。

本发明解决该技术问题的技术方案是提供了TT1基因在提高植物抗病性中的用途。

其中，上述TT1基因的核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

进一步的，上述(2)为：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或几个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

本发明同时提供了TT1基因编码的多肽在提高植物抗病性中的用途。

上述TT1基因具有如下核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

进一步的，上述(2)为：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或几个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

其中，上述用途中植物可为一般的各种农作物。进一步的，上述植物为禾本科(Poaceae)植物。

其中，上述用途中所述的病为真菌性病。进一步的，上述用途中所述的病为稻瘟病、稻曲病、纹枯病或赤霉病。进一步的上述的方法中所述的病为水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小麦纹枯病或小麦赤霉病。

进一步的，上述用途为TT1基因在提高禾本科植物对真菌性病的抗性中的用途。

本发明还提供了一种培育抗病植物的方法。该方法包括以下步骤：

(1)将上述TT1基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TT1基因的重组载体；

(2)将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞；

(3)经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因抗病植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

上述TT1基因具有如下核苷酸序列：

(1)：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其简并序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

进一步的，上述(2)为：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加1个或几个(10个以内)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.1的序列编码功能相同或相似的多肽。

其中，上述植物可为一般的各种农作物。上述植物为禾本科(Poaceae)植物。

其中，上述方法中所述的病为真菌性病。

其中，上述方法中所述的病为稻瘟病、稻曲病、纹枯病或赤霉病。进一步的上述的方法中所述的病为水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小麦纹枯病或小麦赤霉病。

本发明中所述的TT1基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，该基因来源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥属(Brassica)的植物油菜(Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID NO：3)，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE的方法获得序列表中SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。然后根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列设计一对PCR引物，从油菜cDNA中扩增出SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明中，“在SEQ ID NO：1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的TT1基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO：1所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1同源性低至约89％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO：1中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO：1核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列的同源性至少80％，较佳地至少89％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。在本发明中的相同功能是指提高植物的抗病性。

该术语还包括能编码具有与天然的SEQ ID NO：1相同功能的蛋白的SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。比如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，其编码的多肽也能提高植物的抗病性。

本发明所述重组载体，是将TT1基因插入到载体中获得，上述载体可选用本领域已知的各种载体，尤其是真核表达载体(如pBI121或pCAMBIA2301)。本发明用上述重组载体转化宿主植物细胞，筛选获得转化细胞。然后将转化细胞培育成转基因抗病植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

本发明中所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

本发明的有益效果在于：本发明提供了TT1基因在提高植物抗病性方面的用途，在本发明的实施例中也通过实验证明转入了TT1基因并过表达的植物抗病性有了显著的提高。尤其是提供TT1基因在提高禾本科植物对真菌性疾病中的用途，经试验证明，过表达TT1基因的多种植物对多种真菌性疾病表现出了良好的抗性。本发明培育出抗病植物的方法也简便而有效，为提高植物抗病性尤其是禾本科植物对真菌病的抗性提供了新的有效选择，具有好的应用前景。

附图说明

图1为转基因水稻植株中hpt(潮霉素磷酸转移酶基因，为表达载体自带的抗性筛选基因)基因的PCR检测。从左至右依次为分子量Maker(片段从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，阳性对照(+)，野生型阴性对照(-)，待检测植株1～6。

图2为转基因水稻植株中TT1基因的PCR检测。从左至右依次为分子量Maker(片段从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，阳性对照(+)，野生型阴性对照(-)，待检测植株1～5。

图3为大田水稻染病情况对比图。图左为野生型，图右为转基因型，如图可见，野生日本晴水稻染病程度较转基因型高。图左圈内麦穗上黑色斑点即为稻曲病霉斑。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图，进一步说明而不限定本发明。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆菌(E.coli)采用DH5α菌株，菌株均购自于Qiagen公司。表达载体Pzh01、pCAMBIA1304购自于Clontech公司。其余化学实际均为市售分析纯。

下述实施例中，“SEQ ID NO：1”单独出现时，本领域技术人员可理解1其为“SEQ IDNO：1所示核苷酸序列”的简称。

实施例一：TT1基因的克隆及获取

以油菜中的atp6(genebank gi：89279377)基因为诱饵蛋白，根据酵母双杂交方法(见Clontech公司所公开的资料)，筛选到油菜中的一个EST序列(SEQ ID NO：3所示，其编码序列如SEQ ID NO：4所示)，再根据这段筛选到的序列，通过5’RACE(见Takara公司所公开的资料)的方法获得本发明所述提高植物抗病性的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物：5’-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’(SEQ ID NO：5)，

下游引物：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’(SEQ ID NO：6)。

然后经PCR从油菜cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

PCR程序如下：

1.95℃     4min(预变性)

2.95℃     30s(变性)

3.53℃     30s(复性)

4.72℃     50s(延伸)

5.2～4步骤 循环30次

6.72℃     5min(终延伸)

7.4℃      保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到序列SEQ ID NO：1的基因片段。

实施例二：过表达TT1基因的水稻植株制备

1、采用的水稻材料(Oryza sativa L.)为粳稻日本晴，为四川农业大学水稻研究所保存。农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆菌(E.coli)采用DH5α菌株。

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，构建目的基因过量表达重组质粒：

上游引物：

5’-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3’(SEQ ID NO：7)，

下游引物：

5’-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’(SEQ ID NO：8)。

经PCR，从油菜cDNA中扩增完整的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

PCR程序如下：

1.95℃        4min(预变性)

2.95℃        30s(变性)

3.53℃        30s(复性)

4.72℃        50s(延伸)

5.2～4步骤    循环30次

6.72℃        5min(终延伸)

7.4℃         保存。

对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的资料)，然后用BamH1与Sac1酶切，胶回收，与载体Pzh01连接(连接位点：BamH1与Sac1)，获得含SEQ ID NO：1序列的过量表达重组质粒。在大肠杆菌DH5α中繁殖后，提取质粒(见Qiagen公司公开资料)，将含SEQID NO：1的过量表达重组质粒转入农杆菌LBA4404中。

2、外植体培养方法

幼胚愈伤组织的诱导和继代：取田间开花后12-15天的水稻未成熟颖果，剥壳后在75％酒精中浸泡1分钟，用无菌水冲洗干净后，0.1％升汞灭菌20分钟，再用无菌水冲洗干净。在超净工作台上晾干，用镊子剥取幼胚接种在诱导培养基(NB+2，4-D 2.5mg/L)上，于26℃下暗培养。一周后统计愈伤组织的诱导情况并进行继代，以后每2周继代一次。

成熟胚愈伤组织的诱导和继代：选取外观健康，饱满，无病斑的成熟种子脱去颖壳，75％酒精中浸泡1分钟，用无菌水冲洗干净后，0.1％升汞灭菌20分钟，再用无菌水冲洗干净。在超净工作台上晾干，接种到诱导培养基上，于26℃下暗培养。2周后统计愈伤组织的诱导情况并进行继代，以后每2周继代一次。

3、水稻基因转化实验方法

3-1工程菌的活化

用无菌牙签在平板上挑取农杆菌单菌落，放在10mlYEP培养液(酵母提取物(YeastExtract)10g+胰蛋白胨(Tryptone)5g+NaCl 10g+加水至1L+Rif 50μg/mL+Hyg 25μg/mL)中培养；或着取保存于-20℃冰箱无菌农杆菌菌液50-100μl于2ml的含相应抗生素的YEP培养基上，250r/min，28℃培养过夜。取过夜培养液300μl于3ml的含相应抗生素的YEP液体培养基中，在250r/min，28℃的条件下遮光振动培养，至菌液达OD600＝0.5左右，即可用于转化。

上述含目的基因的菌液在无菌的50ml的离心管中以5000r/min离心5分钟后回收菌体，用30ml的NBCO(NB+2，4-D 2.0mg/L+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L)液体培养基重悬含目的基因的菌体。选择生长状态良好的，颗粒状胚性愈伤组织用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染时间为10～30min，之后放入有滤纸的平皿中吸干多余菌液。

3-2共培养

将吸干菌液的愈伤置于NBCO(NB+2，4-D 2.0mg/L+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L)固体培养基上，共培养培养基上放1层滤纸，滤纸上放愈伤组织。22-25℃暗培养2-3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。

3-3脱菌与筛选

共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈，再浸泡于含Cef(头孢霉素)500mg/l NBCO液体培养基中，在摇床上中速振荡30-60min，弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上暗培养三周，再转入二筛培养基上暗培养三周，温度控制在25-27℃。

3-4分化与生根

选择将两次筛选后新长出的抗性愈伤组织接种到预分化培养基(NB+KT1mg/L+NAA 0.25mg/L)上，暗培养10天。再转到分化培养基(NB+KT1mg/L+NAA 0.25mg/L+6-BA1mg/L+Hyg(潮霉素)25mg/L)上光照培养，用日光灯每天照明12小时，温度控制在25-27℃。约1-2个月，可获得2cm左右高的幼苗。将幼苗转到生根培养基上培养，当根长到2cm左右高时取出，洗净根部的培养基，移栽于大田。

3-5转基因水稻的检测

3-5-1取一小片再生植株新鲜叶片，抽提总DNA(见Qiagen公司所公开的资料)，以提取的DNA做模板，分别进行检测。

3-5-1-1转基因水稻植株中hpt基因的PCR检测

hpt基因的PCR引物序列为

hpt-1：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’(SEQ ID NO：9)

hpt-2：5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’(SEQ ID NO：10)。

PCR程序如下：

1.95℃        4min(预变性)

2.95℃        30s(变性)

3.53℃        30s(复性)

4.72℃        50s(延伸)

5.2～4步骤    循环37次

6.72℃    5min(终延伸)

7.4℃     保存

以上PCR反应完成后，在琼脂糖凝胶上电泳检测是否有目标条带出现，若有则代表目的基因已转入水稻中，如图1。

3-5-1-2转基因水稻植株中TT1基因的PCR检测

TT1基因的PCR引物序列为

上游引物TT1-1：5’-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3’(SEQ ID NO：11)

下游引物TT1-2：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3’(SEQ ID NO：12)。

PCR程序如下：

1.95℃        4min(预变性)

2.95℃        30s(变性)

3.53℃        30s(复性)

4.72℃        50s(延伸)

5.2～4步骤    循环37次

6.72℃        5min(终延伸)

7.4℃         保存

以上PCR反应完成后，在琼脂糖凝胶上电泳检测。若有目标条带出现则代表目的基因已转入水稻中，见图2。继续培养转基因植株，留种以备后续试验。

实施例三：过表达TT1基因的小麦植株制备

1、采用的小麦材料为Bobwhite。农杆菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章鱼碱型菌系的LBA4404菌株；大肠杆菌(E.coli)采用DH5α菌株，构建目的基因过量表达重组质粒pCAMBIA1304(具体方法参见本发明实施例二)。

2、外植体培养方法

幼胚愈伤组织的诱导和继代：采集扬花后12-15天的麦穗，取小麦幼穗中部大小一致的未成熟子粒，将幼胚消毒后接种在愈伤组织诱导培养基(NB+2，4-D 2mg/L)表面，25℃下暗培养，20d后转入相同培养基进行继代培养。

3、小麦基因转化实验方法

3-1工程菌的活化

用无菌牙签在平板上挑取农杆菌单菌落，放在10mlYEP培养液(酵母提取物(YeastExtract)10g+胰蛋白胨(Tryptone)5g+NaCl 10g+加水至1L+Rif 50μg/mL+Hyg 25μg/mL)中培养；或着取保存于-20℃冰箱无菌农杆菌菌液50-100μl于2ml的含相应抗生素的YEP培养基上，250r/min，28℃培养过夜。取过夜培养液300μl于3ml的含相应抗生素的YEP液体培养基中，在250r/min，28℃的条件下遮光振动培养，至菌液达OD600＝0.5左右，即可用于转化。

上述含目的基因的菌液在无菌的50ml的离心管中以5000r/min离心5分钟后回收菌体，用30ml的NBCO(NB+2，4-D 2.0mg/L+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L)液体培养基重悬含目的基因的菌体。选择生长状态良好的，颗粒状胚性愈伤组织用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染时间为10～30min，之后放入有滤纸的平皿中吸干多余菌液。

3-2共培养

将吸干菌液的愈伤置于NBCO(NB+2，4-D 2.0mg/L+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L)固体培养基上，共培养培养基上放1层滤纸，滤纸上放愈伤组织。24-26℃暗培养3-4天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。

3-3脱菌与筛选

共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈，再浸泡于含Cef(头孢霉素)500mg/l NBCO液体培养基中，在摇床上中速振荡30-60min，弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或在超净工作台上吹干后接放在继代培养基上，避光恢复培养15-20天继代一次。培养30天后，转到筛选培养基上，培养15天。

3-4分化与生根

选择将筛选后新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基(NB+KT 1mg/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 1mg/L+潮霉素25mg/L)上光照培养，用日光灯每天照明12小时，温度控制在25-27℃。试管苗经过在壮苗生根培养基中生根、壮苗后，移入花盆，长至10-15cm时移栽于大田。

3-5转基因小麦的检测

取一小片再生植株新鲜叶片，抽提总DNA(见Qiagen公司所公开的资料)，以提取的DNA做模板，进行检测。

TT1基因的PCR引物序列为：

TT1-1：5’-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3’(SEQ ID NO：11)

TT1-2：5’-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3’(SEQ ID NO：12)。

PCR反应完成后，在琼脂糖凝胶上电泳检测。若有目标条带出现则代表目的基因已转入小麦中。继续培养转基因植株，留种以备后续试验。

实施例四：水稻稻曲病抗性测试

1、孢子悬浮液的制备

采用组织培养法对稻曲球进行组织切割，然后置于马铃薯蔗糖培养液(称取去皮马铃薯小块200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成20％马铃薯煮汁。在20％马铃薯煮汁中加入20克蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。)中，放在摇床上进行27℃和130rpm的振荡培养，5天后可获得大量菌丝和薄壁分生孢子。然后将振荡培养液倒人组织捣碎机，高速打碎菌丝，形成菌丝片段与薄壁分生孢子的混合液，用4％的马铃薯煮汁(称取马铃薯小块40克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成4％马铃薯煮汁)稀释2倍后备用。

2、接种

稻曲病侵染的时期在水稻孕穗至开花期侵染为主，抽穗扬花期遇雨及低温则发病重。为鉴定转基因水稻的抗病性，此实验选取田中抽穗前3-10天的水稻植株进行抗病实验。

用马铃薯蔗糖培养液培养的病菌分生孢子，在多数植株抽穗前3-10天进行第1次喷雾接种，第2次在多数植株抽穗达20％-60％进行，接种于下午4-6时进行。在接种液里添加少量吐温，喷雾时要求整个穗部能见到菌液。

3、数据统计

于品种的腊熟期转黄熟期，即大约于第2次接种后25-30天进行调查。调查内容包括：病丛数和不同病粒的穗数，每个株系50丛穗，计算病丛率、病穗率(结果见表1)。

表1病丛率、病穗率检测结果

处理组	病丛率	病穗率
			野生日本晴1	46％	16.30％
野生日本晴2	42％	16.28％
			野生日本晴3	42％	13.02％
转TT1株系1	2％	0.12％
			转TT1株系2	4％	0.34％
转TT1株系3	0％	0.00％
			转TT1株系4	4％	0.38％
转TT1株系5	0％	0.00％
			转TT1株系6	0％	0.00％
转TT1株系7	0％	0.00％
			转TT1株系8	2％	0.08％
转TT1株系9	2％	0.13％
			转TT1株系10	0％	0.00％

实验结果表明，野生型日本晴水稻对稻曲病的抗病性较低，病丛率和病穗率都比较高；而转TT1基因型日本晴水稻对稻曲病的抗病性较高，待检测10个株系中甚至有5个株系完全没有被侵染。

实施例五：水稻苗期稻瘟病抗性测试

1、孢子悬浮液的制备

稻瘟病标样采集于四川省部分(内江、蒲江)稻作区的经鉴定的颈瘟标本，采用组织培养法进行组织切割，然后置于马铃薯蔗糖培养液(称取去皮马铃薯小块200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成20％马铃薯煮汁。在20％马铃薯煮汁中加入20克蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。)中，放在摇床上进行27℃和130rpm的振荡培养，5天后可获得大量菌丝和薄壁分生孢子。然后将振荡培养液倒人组织捣碎机，高速打碎菌丝，形成菌丝片段与薄壁分生孢子的混合液，用4％的马铃薯煮汁(称取马铃薯小块40克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成4％马铃薯煮汁)稀释2倍后备用。

2、接种

由于不同生育期抗性表现也不同，秧苗四叶期、分蘖期和抽穗期易感病，圆秆期发病轻。为鉴定转基因水稻的抗病性，此实验选取处于四叶期的水稻秧苗进行抗病实验(野生型40株，转基因型100株)。

用马铃薯蔗糖培养液培养的病菌分生孢子，进行喷雾接种，接种后立即在26-28℃下黑暗保湿(湿度95％)24小时，令孢子萌发侵染，然后移至25-30℃，湿度＞95％的高湿环境下培育，8-10天后观察染病情况，感病株数、感病率(结果见表2)。

3、数据统计见表2

表2感病株数、感病率统计结果

处理组	感病株数	感病率
			野生日本晴1	20	100％
野生日本晴2	20	100％
			转TT1株系A	2	10％
转TT1株系B	0	0％
			转TT1株系C	0	0％
转TT1株系D	3	15％
			转TT1株系E	0	0％

实验结果表明，在野生型水稻全部感病的对照下，转TT1基因水稻基本都表现抗性。

实施例六：小麦纹枯病抗性测试

本实验采用人工接菌鉴定的常用方法——牙签接种法。事先将小麦纹枯病病菌菌株进行平板培养，待用。将牙签对折后直立整齐放入盒体中，浸泡24h，将溶化的PDA固体培养基加入盒体使牙签1/4处浸没；常规高压蒸气灭菌后，将事先在平皿中培养好的小麦纹枯病菌菌株无菌操作移入含牙签的PDA固体培养基中，再放入25℃恒温箱中培养，待菌丝长满牙签后形成有菌牙签备用。

选取长势一致的转TT1基因型小麦和非转基因对照，在小麦3叶期-4叶期接种，用消毒镊子夹取有菌的牙签段，轻轻地嵌人麦苗茎秆与叶鞘内，每个叶鞘嵌入1个有菌牙签段，每个实验组接种20个单株。接种处缠绕浸湿的医用脱脂棉球，并用双层遮阳网覆盖，通过弥雾器使接种幼苗在近100％的相对湿度下48h，然后去除遮阳网，幼苗正常生长管理，每天喷水1次；在接种30d后调查病级数，然后计算病情指数。苗期调查后的麦苗继续进行正常生长管理，每天喷水1次；在小麦乳熟期调查纹枯病病级，然后计算病情指数。

纹枯病抗性苗期评价方法共分为6级等级：0级，外层叶鞘无病斑；1级，外层叶鞘有病斑；2级，第二、第三叶鞘有病斑；3级，第四、第五叶鞘有病斑；4级，茎秆上有病斑；5级，整株枯死。

成株期病情分级标准共分为6级等级：0级，无病；1级，叶鞘发病但不侵染茎；2级，病菌侵染茎，病斑环茎不超过1/4；3级，茎秆上病斑环茎1/4～1/2；4级，病斑绕茎1/2～3/4；5级，病斑绕茎3/4以上或枯死形成枯孕穗或白穗。

病情指数＝(∑各级病株数或病叶数×各级病情代表值)/(总株数×最高级代表值)×100％。

抗病程度以病情指数为基础评价，病情指数0为免疫；病情指数＜20.00％为高抗(HR)；病情指数20.01％～40.00％为抗(R)；病情指数40.01％～50.00％为中抗(MR)；病情指数50.01％～60.00％为中感(MS)；病情指数60.01％～80.00％为感(S)；病情指数80.01％～100.00％为高感(HS)。

统计结果(见表3)如下：

表3抗病程度统计结果

处理组	苗期病情指数	抗病程度	成株期病情指数	抗病程度
					非转基因对照1	76.44	S	81.46	HS
非转基因对照2	80.13	HS	80.55	HS
					转TT1株系A	26.17	R	27.03	R
转TT1株系B	20.66	R	19.23	HR
					转TT1株系C	21.87	R	22.69	R
转TT1株系D	22.95	R	21.38	R
					转TT1株系E	27.80	R	26.52	R

从小麦对纹枯病的抗性检测结果可看出，小麦苗期、成株期的抗病鉴定结果基本一致，非转基因对照组对纹枯病的抗性为感至高感(S-HS)，而转TT1基因型小麦对纹枯病的抗性基本为抗(R)，其中转基因株系B的抗病程度相对较好，在成株期甚至为高抗(HR)。

实施例七：小麦赤霉病抗性测试

由于小麦赤霉病发生的原因与气候条件有重要相关性，当春季平均气温为9℃以上，3-5d雨天时，越冬菌源便产生子囊孢子。小麦抽穗扬花期在有大量成熟子囊孢子存在的情况下，如遇连续3d以上有一定降水量的阴雨天气，即可造成小麦赤霉病的大流行。因此采用组织培养法对侵染源组织进行菌体培养，制备孢子悬浮液，于抽穗扬花期进行接种，统计相关数据。

结果得出，非转基因对照组感病率约为100％，病部呈青黄色，上部出现大部分枯死；而转TT1基因型小麦感病程度较小，感病率为5％-34％，感病程度较轻，出现褐色或青黄色斑点，基本没出现枯死现象。

Claims (3)

1.TT1基因在提高植物抗病性中的用途，所述TT1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示或为SEQ ID NO.1的简并序列，所述的植物为禾本科植物水稻或小麦，所述的病为水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小麦纹枯病或小麦赤霉病。

2.TT1基因编码的多肽在提高植物抗病性中的用途，TT1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示或为SEQ ID NO：1的简并序列，所述的植物为禾本科植物水稻或小麦，所述的病为水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小麦纹枯病或小麦赤霉病。

3.一种培育抗病植物的方法，所述的植物为禾本科植物水稻或小麦，所述的病为水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小麦纹枯病或小麦赤霉病，其特征在于包括以下步骤：

（1）将TT1基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成所述TT1基因的重组载体；所述TT1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示或为SEQ ID NO：1的简并序列；

（2）将步骤(1)中的重组载体转入植物细胞；

（3）经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因抗病植株及其后代，所述后代包括植物种子及植物组织。

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