EA006737B1 - Растения, устойчивые к микотоксину трихоцену, и способы их получения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, семенам и клеткам растений, включающим полинуклеотид, кодирующий трихотецен-3-О-ацетилтрансферазу, и к способам их получения и применения. Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения и/или снижения роста грибов на растении, на его семенном материале или растительной клетке. Кроме того, в настоящем изобретении раскрыты предупреждение и/или снижение загрязнения микотоксином растения или его семенного материала, а также устойчивые к грибам растения и их семенной материал.

Description

Настоящее изобретение относится к трансгенным хозяевам, прежде всего, трансгенным растениям, тканям, семенам и клеткам растений, устойчивым к трихотецену, и к способам их получения и применения. Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения и/или снижения роста грибов на растении, ткани и семенном материале растения или растительной клетке. Кроме того, настоящее изобретение относится к предупреждению и/или снижению загрязнения микотоксином растения, ткани или семенного материала растения. Настоящее изобретение также относится к применению трихотеценов в качестве селективных агентов в протоколах трансформации.

Многочисленные грибы являются серьезными вредителями экономически важных сельскохозяйственных культур. Кроме того, загрязнение культур грибными токсинами является серьезной проблемой для сельского хозяйства во всем мире. Микотоксины представляют собой токсичные метаболиты грибов, которые часто можно обнаружить в сельскохозяйственных продуктах, отличительной особенностью которых является способность вызывать нарушения здоровья позвоночных животных. Трихотецены представляют собой сесквитерпеновые эпоксиды микотоксинов, которые продуцируются видами Рикапит, ТпсйоИесшт и МугоШесшт, они являются выраженными ингибиторами синтеза протеинов в эукариотических организмах. Виды Рикапит, которые продуцируют такие трихотецены, включают Р. аситР иа!ит, Р. сгоокте11еике, Р. си1тогит, Р. ес.|шке1г Р. дгатшеагит (61ЬЬеге11а хеае). Р. 1а1еп1шт, Р. роае, Р. катЬисшит (6. рийсапк) и Р. крогоШсйюИек (Магакак ^.Р.О., №1кои Р.Е. и Тоиккоии, Т.А. 1984).

Как было описано ранее (А.Е. Эек)агбтк и Т.М. Но1и, Мусо1ох1ик ίη р1аи! ра1йодеиек1к. Мо1.Р1аи1МюгоЬе 1и1егас1. 10 (2):147-152, 1997), как острые, так и хронические микотоксикозы у сельскохозяйственных животных и людей связаны с потреблением пшеницы, ржи, ячменя, овсов, риса и кукурузы, загрязненных видами Рикапит, которые продуцируют трихотеценовые микотоксины. Эксперименты с химически чистыми трихотеценами, взятыми в низких дозах, позволили смоделировать многие особенности, которые характерны для токсикозов животных, связанных с зараженным плесенью зерном, включая анемию и иммуносуппрессию, кровотечение, рвоту и отказ от корма. Исторические и эпидемиологические данные, касающиеся человеческой популяции, свидетельствуют о связи между некоторыми эпидемиями болезней и потреблением зерна, зараженного видами Рикапит, продуцирующими трихотецены. В частности, вспышки смертельной болезни, известной как алиментарная токсичная алейкия, которая встречалась в России с 19 века, связывали с потреблением перезимовавших зерен, зараженных видами Рикапит, продуцирующими токсин трихотецен Т-2. В Японии вспышки аналогичной болезни, называемой акакаЬ1-Ьуо или болезнь, вызываемая красной плесенью, связывали с зерном, зараженным видами Рикапит, которые продуцируют трихотецен дезоксиниваленол (далее обозначен как ΌΟΝ). Трихотецены были обнаружены в токсичных образцах зерен, с которыми связаны вспышки болезней человека в Индии и Японии в настоящее время. Таким образом, существует необходимость в разработке сельскохозяйственных методов предупреждения загрязнения микотоксинами и в создании культурных растений, имеющих пониженные уровни микотоксинов.

Кроме того, продуцирующие трихотецен виды Рикапит являются деструктивными патогенами, и они поражают широкий диапазон видов растений. Острая фитотоксичность трихотеценов и их присутствие в растительных тканях также позволяют предположить, что эти микотоксины играют роль в патогенезе Рикапит на растениях. Отсюда следует, что микотоксины играют болезнетворную роль и, следовательно, снижение их токсичности для растения также может предупреждать или снижать симптомы заболевания у растения. Кроме того, еще одним преимуществом снижения уровня загрязнения микотоксинами является снижение уровня заболеваемости растений и, прежде всего зерна, когда растение представляет собой хлебный злак.

Для борьбы с болезнями растений, такими как сухая гниль початков и стеблей кукурузы, стеблевая гниль или гибберелез пшеницы, с различными степенями успеха применялись разнообразные методы. Одним из методов борьбы с болезнями растений является обработка культурных растений антимикробным химическим агентом. Этот метод связан с многочисленными, известными в данной области проблемами. Более современный альтернативным метод включает применение для борьбы биологических организмов (биологический метод борьбы), которые являются природными конкурентами или ингибиторами вредного организма. Однако агенты, предназначенные для биологической борьбы, трудно наносить на большие площади и еще труднее заставить эти живые организмы оставаться на обработанной площади в течение длительного периода времени. Наиболее современным является метод, основанный на применении рекомбинантной ДНК для встраивания в растительные клетки клонированных генов, которые экспрессируют соединения, обладающие антимикробной активностью. Однако недостатком этого метода является почти повсеместное развитие устойчивости микроорганизмов к хорошо известным, встречающимся в естественных условиях антимикробным агентам. Таким образом, все еще сохраняется необходимость в выявлении встречающихся в естественных условиях антимикробных агентов, таких как протеины, которые могут быть получены в растительных клетках непосредственно в результате трансляции сигнального гена.

В Рикапит крогойтсЫоИек была выявлена трихотецен-3-О-ацетилтрансфераза, которая катализирует ацетилирование на СЗ-гидроксильной группе многочисленных различных трихотеценов Рикапит, включая ΌΟΝ (8. Р. МсСогтюк, N. 1. А1ехапбег, 8. С. Тгарр и Т. М. Но1и. П1кгир1юи о! ТШ101, 1йе деие

- 1 006737 еисобтд трихотецен 3-О-асс1у11гап5Гсга5С. Ггот Ризалит зрого1лсЫо1без. Арр11еб.Епу1гои.М1сгоЫо1. 65 (12):5252-5256, 1999.) Ацетилирование трихотеценов на С3-ОН-группе в значительной степени снижает их токсичность в отношении позвоночных животных и растений, в результате этой реакции образуется продукт 3-ацетилдезоксиниваленол (далее обозначаемый как 3ΑΌΟΝ) (см. Клтига и др. ниже).

Были опубликованы последовательности структурных генов, кодирующих трихотецен-3-Оацетилтрансферазы Ризалит дгаттеагит, Ризалит зрогойтсЫоПез, а также последовательности других ортологов (см. например, Клтига и др., ВюзсЕ Вю1есйио1. Вюсйет., 62 (5) 1033-1036 (1998) и К1тига и др., ЕЕВ8 Ьейегз, 435 , 163-168 (1998)). Кроме того, было высказано предположение, что ген Ризалит зрого1лсЫо1без, кодирующий трихотецен-3-О-ацетилтрансферазу, может применяться для создания сортов растений, обладающих повышенной устойчивостью к Ризалит (см., например, Нойи Т.М. и др. Мо1еси1аг СеиеНсз оГ Ноз1-8ресШс Тохтз ш Р1аи1 О1зеазе, 17-24 (1998) и К1тига и др. 1. Вю1ощса1 Сйет1з1гу, 273(3) 1654-1661 (1998)).

Однако до создания настоящего изобретения было далеко не очевидно, что экспрессия в растении трихотецен-3-О-ацетилтрансфераз действительно может привести к получению устойчивых к трихотецену растений. Например, реакция, катализируемая трихотецен-3-О-ацетилтрансферазой Ризалит зрого1лсйо1без, является обратимой, и следовательно, может оказаться неэффективной в отношении защиты растительных клеток от трихотеценов, таких как ΌΟΝ. Также имелась вероятность того, что в растительных клетках могут присутствовать эстеразы, которые могут конкурировать с активностью 3-Оацетилтрансфераз, приводя к образованию токсичного ΌΟΝ из 3ΑΌΟΝ. Также было непонятно, какое влияние на растение может оказывать метаболизм продукта реакции 3ΑΌΟΝ, например, не может ли интродукция трихотецен-3-О-ацетилтрансферазы изменить рост и развитие растения таким образом, что это будет нивелировать все положительные воздействия, обусловленные ацетилтрансферазой, например, путем воздействия на природные механизмы устойчивости растений к болезням. Также оставалось неясным, не может ли 3ΑΌΟΝ в результате метаболизма в растении образовывать новые вторичные метаболиты, обладающие токсичными действиями. Даже в том случае, когда продуцируемый внедрившимся грибом ΌΟΝ эффективно превращается в 3ΑΌΟΝ, также оставалось непонятным, может ли это превращение обусловливать повышенную устойчивость растения к патогену. Перечисленные выше сомнения составляют лишь часть из имеющихся в данной области к моменту создания настоящего изобретения.

Таким образом, объектом изобретения являются растительная клетка или клетки, включающие гетерологичный полинуклеотид, кодирующий продукт гена, который экспрессируется в растительной клетке, причем продукт гена обладает активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену.

Еще одним объектом изобретения является растение, включающее описанную выше растительную клетку, где растение обладает устойчивостью к трихотецену.

Следующим объектом изобретения является растение по изобретению, которое обладает устойчивостью к трихотецену, несущему С-3-гидроксильную группу.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, которое обладает устойчивостью к грибам, продуцирующим трихотецен, предпочтительно трихотецен, несущий С-3-гидроксильную группу.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, которое обладает устойчивостью к Ризалит, ТлсйоИесшт или МугоИесшт.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, которое обладает устойчивостью к Ризалит, прежде всего (но не ограничиваясь ими) к Ризалит дгатшеагит, Ризалит си1тогит, Ризалит зрогоМсЫоИез, Ризалит роае, Ризалит затЬисшит, Ризалит ецшзей, Ризалит аситта1ит, Ризалит 1а1ел1шт и Ризалит рзеибодгаттеагит.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, которое обладает устойчивостью к Ризалит дгаттеагит.

Следующим объектом изобретения является растение по изобретению, которое включает гетерологичный полинуклеотид, кодирующий продукт гена, который экспрессируется в растительной клетке, причем продукт гена обладает активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, где гетерологичный полинуклеотид представляет собой микробный полинуклеотид, предпочтительно полинуклеотид дрожжей или грибов.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, в котором грибной полинуклеотид представляет собой полинуклеотид Ризалит, предпочтительно полинуклеотид Ризалит дгаттеагит или Ризалит зрогойюЫоИез.

Следующим объектом изобретения является растение по изобретению, в котором гетерологичный полинуклеотид включает последовательность, практически аналогичную нуклеотидной последовательности, представленной в 8ЕЦ ГО ΝΟ:1, 5 или 7.

Следующим объектом изобретения является растение по изобретению, в котором гетерологичный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО ΝΟ:1, 5 или 7, или ее гомологи.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, включающее гетерологичный полинуклеотид, который включает область, состоящую по крайней мере из 80 последовательных пар

- 2 006737 оснований, идентичную последовательности области, состоящей из 80 последовательных пар оснований, 8ЕО ГО N0:1, 5 или 7, предпочтительно область, состоящую по крайней мере из 50 последовательных пар оснований, идентичную последовательности области, состоящей из 50 последовательных пар оснований, 8ЕО ГО N0:1, 5 или 7, и более предпочтительно область, состоящую по крайней мере из 21 последовательной пары оснований, идентичную последовательности области, состоящей из 21 последовательной пары оснований, 8Е0 ГО N0:1, 5 или 7, и наиболее предпочтительно область, состоящую по крайней мере из 18 последовательных пар оснований, идентичную последовательности области, состоящей из 18 последовательных пар оснований, 8Е0 ГО N0:1, 5 или 7.

Следующим объектом изобретения является растение по изобретению, устойчивое к трихотецену, где трихотецен выбирают из группы, включающей Т-2-токсин, НТ-2-токсин, изотриходермол, 4,15диацетоксискрипенол (ΌΆ8), 3-деацетилкалонектрин, 3,15-дидеацетилкалонектрин, скирпентриол, неосоланиол; трихотецен типа В: 15-ацетилдезоксиниваленол, ниваленол, 4-ацетилниваленол (фусаренонХ), 4,15-диацетилниваленол, 4,7,15-ацетилниваленол и дезоксиниваленол (Э0Х).

Следующим объектом изобретения является растение по изобретению, устойчивое к Э0Х или ΌΆ8.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, в котором продукт гена кодируется полинуклеотидом по изобретению.

Еще одним объектом изобретения является растение по изобретению, в котором продукт гена представляет собой 3-О-ацетилтрансферазу.

Следующим объектом изобретения является растение по изобретению, в котором продукт гена представляет собой полипептид, включающий последовательность, практически аналогичную 8Е0 ГО N0:2, 6 или 8.

Еще одним объектом изобретения является семенной материал любого из растений по изобретению.

Следующим объектом изобретения является любое из указанных выше растений, где растение представляет собой растение пшеницы, кукурузы, ячменя или риса.

Еще одним объектом изобретения является способ получения устойчивого к трихотецену растения, предусматривающий стадии:

а) трансформации растительной клетки гетерологичным геном, кодирующим продукт гена, где продукт гена повышает устойчивость к трихотецену; и

б) экспрессии продукта гена с уровнем, достаточным для проявления биологической активности;

в) регенерации растительной клетки в растение; и

г) отбор растения, обладающего повышенной устойчивостью к трихотецену.

Следующим объектом изобретения является описанный выше способ, дополнительно включающий стадию отбора растения, на котором понижен рост гриба, где гриб продуцирует трихотецен.

Следующим объектом изобретения является описанный выше способ, где гриб относится к роду Ризалит.

Еще одним объектом изобретения является устойчивое к трихотецену растение, полученное согласно любому из указанных выше способов.

Следующим объектом изобретения является семенной материал, полученный самоопылением или перекрестным опылением описанного выше растения по изобретению, причем растение, выращенное из семенного материала, обладает повышенной устойчивостью к трихотецену.

Следующим объектом изобретения является способ предупреждения загрязнения растения, включая семенной материал растения, микотоксином, предусматривающий выращивание растения по изобретению, как описано выше, предпочтительно в зоне с уровнем заражения грибом от среднего до серьезного, причем растение предпочтительно представляет собой культурное растение.

Еще одним объектом изобретения является способ снижения роста на растении гриба, предпочтительно роста на растении гриба из рода Ризалит, предусматривающий выращивание растения по изобретению, которое продуцирует трихотецен, предпочтительно трихотецен, включающий С-3гидроксильную группу, как описано выше, предпочтительно в зоне с уровнем заражения грибом от среднего до серьезного, причем растение предпочтительно представляет собой культурное растение.

Следующим объектом изобретения является способ получения устойчивого к грибам растения, предусматривающий:

(а) трансформацию растительной клетки гетерологичным геном, кодирующим продукт гена, где продукт гена повышает устойчивость к трихотецену;

(б) экспрессию продукта гена с уровнем, достаточным для проявления биологической активности;

(в) регенерацию растительной клетки в растение; и (г) отбор растения, обладающего повышенной устойчивостью к трихотецену; и (д) необязательно самоопыление и перекрестное опыление растения, полученного на стадии (г).

Следующим объектом изобретения является способ, где гриб представляет собой гриб из рода Ризалит.

Еще одним объектом изобретения является способ получения семенного материала, где растение, выращенное из семенного материала, обладает устойчивостью к грибам, предусматривающий самоопы

- 3 006737 ление или перекрестное опыление растения по изобретению.

Следующим объектом изобретения является указанный выше способ, где семенной материал обладает устойчивостью к грибам из рода Ризалит.

Еще одним объектом изобретения является способ отбора трансформированных клеток-хозяев, предусматривающий:

трансформацию клетки-хозяина нуклеотидной конструкцией, кодирующей трихотецен - 3-Оацетилтрансферазу, выращивание трансформированной растительной клетки в присутствии трихотецена в качестве селективного агента.

Еще одним объектом изобретения является способ отбора трансформированных клеток-хозяев, где клетки-хозяева представляют собой растительные клетки или микробные клетки, предпочтительно, если микробные клетки представляют собой грибные клетки.

Следующим объектом изобретения является способ отбора трансформированных клеток-хозяев, как он описан выше, согласно которому клетку-хозяина дополнительно трансформируют вторым представляющим интерес полинуклеотидом.

Еще одним объектом изобретения является способ отбора трансформированных клеток-хозяев, в которых трихотецен выбирают из группы, включающей Т-2-токсин, НТ-2-токсин, изотриходермол, ΌΆ8, 3-деацетилкалонектрин, 3,15-дидеацетилкалонектрин, скирпентриол, неосоланиол; трихотецен типа В: 15-ацетилдезоксиниваленол, ниваленол, 4-ацетилниваленол (фусаренон-Х), 4,15-диацетилниваленол, 4,7,15-ацетилниваленол и ΌΘΝ.

Следующим объектом изобретения является устойчивое к трихотецену растение, получаемое способом по изобретению.

Еще одним объектом изобретения является устойчивое к грибам растение, получаемое способом по изобретению.

Следующим объектом изобретения является семенной материал растения, получаемый способом по изобретению.

Для облегчения понимания ниже приведены объяснения некоторых понятий, применяемых в описании.

Экспрессия: относится к транскрипции и/или трансляции эндогенного гена или трансгена в растениях. В случае антисмысловых конструкций понятие экспрессия может относиться к транскрипции только антисмысловой ДНК.

Соединенный с/функционально связанный с: относится к регуляторной последовательности ДНК, которая функционально связана с или соединена с последовательностью ДНК, кодирующей РНК или протеин, если две последовательности расположены так, что регуляторная последовательность ДНК оказывает воздействие на уровень экспрессии кодирующей последовательности ДНК.

Понятие гетерологичный полинуклеотид или гетерологичная последовательность ДНК в контексте настоящего описания каждое относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая в естественных условиях не связана с клеткой-хозяином, в которую она интродуцирована, включая генетические конструкции, не встречающиеся в естественных условиях множественные копии встречающейся в естественных условиях молекулы нуклеиновой кислоты; и другие гомологи молекулы нуклеиновой кислоты, функционально связанные с не встречающейся в естественных условиях молекулой нуклеиновой кислоты. Таким образом, гетерологичный ген в клетке-хозяине включает ген, являющийся эндогенным относительно конкретной клетки-хозяина, но который модифицирован, например, в результате применения перестановки ДНК. Так, понятия относятся к сегменту ДНК, который является чужеродным или гетерологичным относительно клетки или гомологичным клетке, но который находится в нуклеиновой кислоте клетки-хозяина в положении, в котором этот элемент в норме не присутствует.

Понятия нуклеиновая кислота или полинуклеотид относятся к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам, имеющим либо одно-, либо двухцепочечную форму. Если не указано иное, то понятие включает нуклеотидные кислоты, содержащие известные аналогии встречающихся в естественных условиях нуклеотидов, которые обладают сходными характеристиками связывания с нуклеиновой кислотой, с которой проводится сравнение, и которые метаболизируются аналогично тому, как этот происходит с встречающимися в естественных условиях нуклеотидами. Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность также включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также специально указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов могут быть получены в результате создания последовательностей, в которых в третьем положении в одном или в нескольких выбранных (или во всех кодонах) произведена замена смешанным основанием и/или остатками дезоксиинозина (Ва1хсг и др., №с1ею Λοίά Вез. 19: 5081 (1991); ОЫзика и др., 1. ΒίοΙ. Сйет. 260: 2605-2608 (1985); Коззо11И1 и др., Μοί. Се11. РгоЬез 8: 91-98 (1994)). Понятия нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность или полинуклеотид также могут использоваться взаимозаменяемо с понятиями ген, кДНК и мРНК, кодируемая геном.

В наиболее широком смысле понятие практически аналогичная, если оно используется в отноше

- 4 006737 нии молекулы нуклеиновой кислоты, обозначает, что молекула нуклеиновой кислоты соответствует нуклеотидной последовательности, с которой проводится сравнение, причем, соответствующая молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий практически такие же строение и функцию, что и полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой проводится сравнение, например, если в нем имеют место только замены аминокислот, которые не влияют на функцию полипептида. Предпочтительно практически аналогичная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой проводится сравнение. Подразумевается, что понятие практически аналогичная в частности включает молекулы нуклеиновых кислот, последовательность которых модифицирована с целью оптимизации экспрессии в конкретных клетках, например, растительных клетках. Желательно, чтобы практически аналогичные молекулы нуклеиновых кислот по крайней мере на 45%, более желательно по крайней мере на 65%, еще более желательно по крайней мере на 75%, предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95% и наиболее предпочтительно по крайней мере на 99%, были идентичны нуклеотидной последовательности, с которой проводится сравнение. Предпочтительно процент практической идентичности характерен для части последовательностей, включающей по крайней мере 50 остатков, предпочтительно включающей по крайней мере 100 остатков и наиболее предпочтительно для последовательностей, в которых практически идентичны по крайней мере примерно 150 остатков. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления последовательности практически идентичны на всем протяжении кодирующих областей. Сравнения последовательностей могут быть проведены с использованием алгоритма сравнительного анализа последовательностей СмитаВатермана (8тИй-^а1егтаи), который описан ниже более подробно (см., например, \Уа1сгтап. М.8. 1п1гобисИоп 1о Сотри1а1юпа1 Βίοίοβν: Марк, кециепсек апб депотек. Сйартап & На11. Ьопбоп: 1995. Ι8ΒΝ 0412-99391-0, ог а! 1Шр://\у\у\у-1ио.икс.еби/коП\уаге/кес.|а1п/тбех.1и1п1). Используют программу 1оса18, версия 1.16 со следующими параметрами: совпадение: 1, пенальти (штраф) за несовпадение: 0,33, пенальти за открытую брешь: 2, пенальти за расширенную брешь: 2.

Другим доказательством того, что нуклеотидные последовательности практически идентичны нуклеиновой кислоте по изобретению, является то, что они гибридизуются с молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению в строгих условиях. Фраза специфично гибридизуется с относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью в строгих условиях, когда последовательность присутствует в комплексной смеси (например, общей клеточной) ДНК или РНК. Практически связан(ы) относится к комплементарной гибридизации между нуклеиновой кислотой-зондом и нуклеиновой кислотой-мишенью и подразумевает наличие небольшого количества ошибочных спариваний, которые могут найти соответствующее применение путем снижения строгости среды для гибридизации для достижения требуемого обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

Строгие условия гибридизации и условия отмывки при строгой гибридизации в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и Нозерн-гибридизации, зависят от последовательности и являются разными при применении различных параметров окружающей среды. Для специфичной гибридизации более длинных последовательностей используются более высокие температуры. Подробным руководством по гибридизации нуклеиновых кислот является работа Туккеп (1993) 'ЪаЬогаЮгу Тес11пк|иек ш ВюсНетМгу апб Мо1еси1аг Вю1оду-НуЬпб|/а1юп \уй11 №с1ею Λάά РгоЬек, часть I, глава 2: Оусгу1с\у о£ рппс1р1ек о£ 11уЬпб|/а1юп апб Не к1га!ецу о£ пискю асИ ргоЬе аккаук Е1кеу1ег, №\у Уогк. Как правило, выбирают очень строгие условия гибридизации и отмывки, при которых температура примерно на 5°С ниже, чем конечная температура плавления (Т_т) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Как правило, при строгих условиях зонд должен гибридизоваться с подпоследовательностью-мишенью, но не гибридизоваться с другими последовательностями.

Т_т обозначает температуру (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% последовательностей-мишеней гибридизуется с точно подобранным зондом. При выборе очень строгих условий гибридизации температура равна Т_т конкретного зонда. Примером строгих условий гибридизации на фильтре методом Саузерн- или Нозерн-блоттинга, для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков, является применение 50%-ного формамида с 1 мг гепарина при 42°С при осуществлении гибридизации в течение ночи. Примером очень строгих условий отмывки является применение 0,15М №-1С1 при 72°С в течение примерно 15 мин. Примером строгих условий отмывки является отмывка 0,2х88С (0,2-кратный 88С) при 65°С в течение 15 мин. (описание 88С-буфера см. у 8атЬгоок, ниже). Часто отмывке в очень строгих условиях предшествует отмывка в расслабленных условиях для удаления фонового сигнала зонда. Примером отмывки в условиях средней жесткости для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 1х88С при 45°С в течение 15 мин. Примером расслабленных условий отмывки для дуплексов, состоящих, например, более чем из 100 нуклеотидов, является применение 4-6х88С при 40°С в течение 15 мин. Для коротких зондов (например, состоящих примерно из 10-50 нуклеотидов) строгие условия, как правило, включают концентрации солей, соответствующие менее чем 1,0М концентрации

- 5 006737 ионов Ыа, как правило, примерно от 0,01 до 1,0М концентрации ионов Να (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, при этом температура, как правило, составляет по крайней мере примерно 30°С. Строгие условия также могут быть получены при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Как правило, величина отношения сигнала к шуму, равная 2 (или выше) по сравнению с обнаруженной при применении неродственного зонда в конкретном опыте по гибридизации, свидетельствует о наличии специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в строгих условиях, еще являются практически идентичными, если протеины, которые они кодируют, являются практически идентичными. Это имеет место, например, в случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

Ниже приведены примеры конкретных вариантов условий гибридизации/отмывки, которые могут применяться для идентификации гомологичных нуклеотидных последовательностей, которые практически идентичны нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению, с которыми производится сравнение: тестируемая последовательность гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, с которой проводится сравнение, в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М ЫаРО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 2х88С, 0,1%-ным ДСН при 50°С, предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М ЫаРО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 1х88С, 0,1%-ным ДСН при 50°С, более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М ЫаРО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,5х88С, 0,1%-ным ДСН при 50°С, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М ЫаРО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,1х88С, 0,1%-ным ДСН при 50°С, и еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М ЫаРО₄, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,1х88С, 0,1%-ным ДСН при 65°С. Полинуклеотид по изобретению, который гибридизуется в указанных выше условиях, предпочтительно включает по крайней мере 80 пар оснований, более предпочтительно по крайней мере 50 пар оснований, еще более предпочтительно по крайней мере 21 пару оснований и наиболее предпочтительно по крайней мере 18 пар оснований. Предпочтительные применяемые согласно изобретению гомологи включают молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 45% идентична 8ЕО Ш ЫО:2, 6 или 8 при оценке с помощью описанных выше параметров, причем аминокислотная последовательность, кодируемая гомологом, обладает активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, например 3-Оацетилтрансферазной активностью.

Понятие практически аналогичный, если оно относится к протеину, обозначает, что протеин соответствует протеину, с которым проводится сравнение, причем протеин имеет практически такие же строение и функцию, что и протеин, с которым проводится сравнение, например, если в нем имеют место только замены аминокислот, которые не влияют на функцию полипептида. Если понятие используется в отношении протеина или аминокислотной последовательности, то желательно, чтобы практически аналогичный протеин или аминокислотная последовательность по крайней мере на 45%, более желательно по крайней мере на 65%, еще более желательно по крайней мере на 75%, предпочтительно по крайней мере на 85%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, еще более предпочтительно по крайней мере на 95% и наиболее предпочтительно по крайней мере на 99%, были идентичны протеину или аминокислотной последовательности, с которыми проводится сравнение, при использовании анализа на основе заданных по умолчанию параметров программы ВБА8Т, что более подробно описано ниже.

Предпочтительные полипептидные гомологи, которые могут применяться согласно изобретению, включают гомологи, у которых аминокислотные последовательности по крайней мере на 45% идентичны 8ЕО Ш ЫО:2, 6 или 8, причем аминокислотная последовательность, кодируемая гомологом, обладает активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, например 3-О-ацетилтрансферазной активностью.

Оптимальный сравнительный анализ нуклеотидных или аминокислотных последовательностей может быть проведен, например, с помощью алгоритма локальной гомологии, описанного у διηίΐΐι и \Уа1сгтап, Λάν. Арр1. Ма1й. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма сравнительного анализа гомологии, описанного у Ыееб1етап и \Уипкс11. 1. Мо1. Βίο1. 48: 443 (1970), методом поиска сходства, описанного у Реагкоп и Ыртап, Ргос. №1' 1. Асаб. 8с1. И8А 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризованных версий этих алгоритмов (САР, ВЕ8ТЕ1Т, ЕА8ТА и ТЕА8ТА, входящих в пакет программ ХУЕсопкш СепеИск 8ой^аге Раскаде, СепеИск Сотри1ег Сгоир, 575 8с1епсе Эг., Мэдисон, штат Висконсин), или путем визуальной оценки (см. общий метод у АикиЬе1 и др., ниже).

Одним из примеров алгоритма, пригодного для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм ВБА8Т, описанный у А11ксйи1 и др., 1. Мо1. Вю1. 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления анализа с использованием алгоритма ВБА8Т может быть предоставлено Национальным центром биотехнологической информации (Ыа1юпа1 Сейег £ог Вю1есйпо1оду 1п£огта1юп) (1Шр://\\л\лу.псЬгп1т.ш11.до\7). В этом алгоритме сначала производится идентификация пар последовательности с высокими баллами (Н8Р) путем идентификации коротких слов длины в рассматриваемой последовательности, которые или совпадают или удовлетворяют определенной положительной пороговой оценке (баллу) Т при сравнении со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговой оценкой (баллом) близкого сло

- 6 006737 ва (Л118сйи1 и др., 1990). Эти исходные выборки близкого слова используются в качестве затравки для инициации поиска, предназначенного для нахождения включающих их более длинных Н8Р. Затем выборки слова удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор пока происходит увеличение кумулятивного (накопительного) балла при сравнительном анализе. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей вычисляют с использованием параметров М (призовой балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного балла используют матрицу баллов. Удлинение выборки слова в каждом направлении прекращается в том случае, если кумулятивный балл при сравнительном анализе снижается на величину X от своего максимального достигнутого значения, если кумулятивный балл снижается до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательных баллов при сравнительном анализе остатков, или если достигается конец какойлибо последовательности. Параметры V, Т и X алгоритма ВЬЛ8Т определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. В программе ΒΕΑ8ΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) в качестве задаваемых по умолчанию параметров используются длина слова (V), равная 11, ожидание (Е), равное 10, предельное значение 100, М = 5, N = -4, при этом производится сравнение обеих цепочек. Для аминокислотных последовательностей в программе ВБА8ТР используются в качестве задаваемых по умолчанию параметров длина слова (V), равная 3, ожидание (Е), равное 10, и матрица баллов ВБО8ИМ62 (см. НешкоГГ и Пешкой, Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А 89: 10915 (1989)).

Помимо вычисления процента идентичности последовательностей алгоритм ВБА8Т также позволят провести статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, КагИи и А118сйц1, Ргос. №11'1 Асаб. 8сг И8А 90: 5873-5787 (1993)). Одним из критериев степени сходства, который позволяет получить алгоритм ВБА8Т, является наименьшая суммарная вероятность (Р(№)), которая дает оценку вероятности, с которой случайным образом может произойти совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, считается, что тестируемая нуклеотидная последовательность является сходной с последовательностью, с которой производится сравнение, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение, меньше приблизительно 0,1, более предпочтительно меньше приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 0,001.

Еще одним доказательством того, что две нуклеотидные последовательности или протеины являются практически идентичными, является то, что протеин, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно реактивным с протеином, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, или специфично связывается с ним. Так, протеин, как правило, практически идентичен второму протеину, например, когда два протеина отличаются только консервативными заменами.

Фраза специфично (или избирательно) связывается с антителом или специфично (или избирательно) иммунореактивен с применительно к протеину или пептиду обозначает реакцию связывания, которая позволяет выявить наличие протеина в присутствии гетерогенной популяции протеинов и других биологических объектов. Так, в предназначенных для иммуноанализа условиях, специфические антитела связываются с конкретным протеином и не связываются со значительным количеством других протеинов, присутствующих в образце. Специфическое связывание с антителом в таких условиях может требовать наличие антитела, который выбирают с точки зрения его специфичности по отношению к определенному протеину. Например, могут быть отобраны антитела, которые вырабатываются на протеин, аминокислотная последовательность которого, кодируемая любой из нуклеотидных последовательностей по изобретению, для получения антител, обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к этому протеину, но не обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к другим протеинам за исключением полиморфных вариантов. Для отбора моноклональных антител, обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к конкретному протеину, могут применяться различные форматы иммуноанализа. Например, твердофазный иммуноферментный анализ ЕЕ18А, Вестернблоттинг или иммуногистохимия обычно применяются для отбора моноклональных антител, обладающих специфичной иммунореактивностью по отношению к протеину (описание форматов иммуноанализов и условий, которые могут применяться для определения специфичной иммунореактивности, см. у Наг1оте и Вале (1988) Ап11Ьоб1е8, А ЕаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог РиЬИсабоик, Νονν Уогк Наг1оте апб Ьапе). Как правило, уровень специфичной или избирательной реакции должен по крайней мере в 2 раза превышать фоновой сигнал или шум и более предпочтительно превышать фоновой уровень в 10-100 раз.

Понятие консервативно модифицированные вариации конкретной нуклеотидной последовательности относится к тем нуклеотидным последовательностям, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или в случае, когда нуклеотидная последовательность не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода любой конкретный полипептид может кодироваться большим числом функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все кодоны СОТ, СОС, СОА, СОО, АОА и АОО кодируют аминокислоту аргинин. В результате этого в любом положении,

- 7 006737 в котором аргинин кодируется определенным кодоном, этот кодон может быть заменен любым из соответствующих указанных кодонов без изменения кодируемого протеина. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой молчащие вариации, которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. Каждая приведенная в настоящем описании нуклеотидная последовательность, которая кодирует протеин, если не указано иное, также включает все возможные молчащие вариации. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (за исключением АТС, который в норме представляет собой единственный кодон метионина) может быть модифицирован с помощью стандартных методов с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, при описании каждой указанной последовательности подразумеваются все молчащие вариации нуклеиновой кислоты, которая кодирует протеин.

Кроме того, специалисту в данной области должно быть очевидно, что отдельные замены, делеции или добавления, которые изменяют, добавляют или удаляют отдельную аминокислоту или небольшой процент аминокислот (как правило, менее 5%, более предпочтительно менее 1%) в кодируемой последовательности, представляют собой консервативно модифицированные вариации, если изменения приводят к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Перечень консервативных замен, включающий функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известен в данной области. Он включает 5 групп, в каждую из которых входят аминокислоты, которые могут применяться для консервативной замены друг друга: алифатические: глицин (С), аланин (А), валин (V), лейцин (Ь), изолейцин (I); ароматические: фенилаланин (Т), тирозин (Υ), триптофан (XV); серусодержащие: метионин (М), цистеин (С); основные: аргинин (К), лизин (К), гистидин (Н); кислотные: аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е), аспарагин (Ν), глутамин Ю) (см. также СгещЫоп (1984) Рго1еш5, ν.Η. Егеешал алб Сотрапу). Кроме того, отдельные замены, делеции или добавления, которые изменяют, добавляют или удаляют отдельную аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, также представляют собой консервативно модифицированные вариации.

Подпоследовательность: обозначает последовательность нуклеиновых кислот или аминокислот, которая включает часть более длинной последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот (например, протеина) соответственно.

Нуклеиновые кислоты являются удлиненными, когда в нуклеиновую кислоту включены дополнительные нуклеотиды (или другие аналогичные молекулы). Наиболее часто это происходит с помощью полимеразы (например, ДНК-полимеразы), например, полимеразы, которая добавляет последовательности к З'-концу нуклеиновой кислоты.

Две нуклеиновые кислоты являются рекомбинированными, когда последовательности каждой из двух нуклеиновых кислот объединены в потомстве нуклеиновой кислоты. Две последовательности являются непосредственно рекомбинированными, когда обе нуклеиновые кислоты являются субстратами для рекомбинации. Две последовательности являются опосредованно рекомбинированными, когда последовательности рекомбинируют с использованием промежуточного звена, такого как олигонуклеотидкроссовер. Для опосредуемой рекомбинации не более одной последовательности может являться истинным субстратом для рекомбинации, а в некоторых случаях ни одна из последовательностей не является субстратом для рекомбинации.

Аффинность специфического связывания между двумя молекулами, например, между лигандом и рецептором, обозначает предпочтительное связывание одной молекулы с другой в смеси молекул. Связывание молекул может рассматриваться как специфическое, если аффинность связывания составляет от примерно 1х10⁴ М^-1 до примерно 1х 10⁶М^-1 или более.

Субстрат: понятие субстрат обозначает молекулу, которую фермент распознает в естественных условиях и превращает в продукт в биохимическом пути метаболизма, в котором фермент в естественных условиях осуществляет свою функцию, или представляет собой модифицированную версию молекулы, которая тоже распознается ферментом или превращается с помощью фермента в продукт в результате ферментативной реакции, аналогичной встречающейся в естественных условиях реакции.

Трансформация: обозначает процесс интродукции гетерологичной ДНК в клетку-хозяина или организм. Следует понимать, что трансформированные клетки, ткани или насекомые включают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и их трансгенное потомство.

Трансформированный, трансгенный и рекомбинантный: относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растение, в который интродуцирована гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может обладать способностью к саморепликации. Следует понимать, что трансформированные клетки, ткани или растения включают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и его трансгенное потомство. ^трансформированный, нетрансгенный или нерекомбинантный: относятся к организму дикого типа, например, бактерии или растению, который не содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение относится к трансгенным хозяевам, в частности к трансгенным растениям, тканям растений, семенам растений и клеткам растений, которые включают гетерологичный полинук

- 8 006737 леотид, кодирующий продукт гена, который обладает активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, и к способам их получения. Активность, обусловливающая устойчивость к трихотецену, в контексте настоящего описания относится к активности, которая снижает или ингибирует фитотоксичность трихотецена, прежде всего к грибу и/или растению, в одном из вариантов осуществления изобретения понятие активность, обусловливающая устойчивость к трихотецену, относится к активности, посредством которой ацетат переносится в положение С-3 трихотецена.

Настоящее изобретение также относится к трансгенным хозяевам, в частности к трансгенным растениям, тканям растений, семенам растений и клеткам растений, которые экспрессируют гетерологичный полинуклеотид, кодирующий продукт гена, где продукт гена обладает активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, в частности продукт гена, представляющий собой ацетилтрансферазу, более конкретно продукт гена, представляющий собой 3-О-ацетилтрансферазу, более конкретно продукт гена, представляющий собой трихотецен-3-О-ацетилтрансферазу, и к способам их получения. Экспрессия гетерологичного полинуклеотида по изобретению включает синтез РНК и может быть обнаружена с помощью анализа методом Нозерн-блоттинга. В частности, экспрессия гетерологичного полинуклеотида по изобретению может быть выявлена, когда меченый зонд, полученный из гетерологичного нуклеотида по изобретению, в конкретных вариантах осуществления из 8ЕЦ ГО N0: 1, 5 или 7, гибридизуют с РНК, выделенной из трансгенного растения по изобретению в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М фосфате натрия, рН 7,0, 1мМ ЭДТК, 10 мг/мл БСА при 65°С с отмывкой в 0,5%-ном БСА (фракция V), 5%-ным ДСН, 40мМ фосфате натрия, рН 7,0, 1мМ ЭДТК, 0,25М хлориде натрия при 65°С, предпочтительно в 1%-ном ДСН, 40мМ фосфате натрия, рН 7,0, 1мМ ЭДТК, 0,125М хлориде натрия при 65°С и более предпочтительно в 1%-ном ДСН, 40мМ фосфате натрия, рН 7,0, 1мМ ЭДТК при 65°С.

Настоящее изобретение также относится к трансгенным растениям, тканям растений, семенам растений и клеткам растений, которые экспрессируют гетерологичный полинуклеотид по изобретению, причем растение, клетка растения, ткань растения или семенной материал растения обладают устойчивостью к трихотецену. В контексте настоящего описания под устойчивыми к трихотецену растениями, клетками растений, тканями растений и семенами растений понимают таковые, обладающие способностью осуществлять процессы метаболизма в присутствии трихотецена, как это может быть обнаружено согласно способу, описанному ниже в примере 7. В конкретном варианте осуществления в устойчивых к трихотецену растениях, тканях растений, клетках растений и семенах растений уровень удельной ферментативной активности по крайней мере на 10 нмолей триацетоксискирпенола (далее обозначен как ТА8)/микрограмм протеина/15 мин инкубации при насыщающих уровнях субстрата, более конкретно по крайней мере на 5 нмолей ТА8/микрограмм протеина/15 мин, более конкретно по крайней мере на 1 нмоль ТА8/микрограмм протеина/15 мин, более конкретно по крайней мере на 0,8 нмоля ТА8/микрограмм протеина/15 мин, более конкретно по крайней мере на 0,5 нмоля ТА8/микрограмм протеина/15 мин, более конкретно удельная активность по крайней мере на 0,25 нмоля ТА8/микрограмм протеина/15 мин, более конкретно удельная активность по крайней мере на 0,1 нмоля ТА8/микрограмм протеина/15 мин, более конкретно удельная активность по крайней мере на 0,05 нмоля ТА8/микрограмм протеина/15 мин, и особенно предпочтительно удельная активность по крайней мере на 0,01 нмоля ТА8/микрограмм протеина/15 мин выше фоновых уровней активности, встречающихся в естественных условиях в контроле дикого типа, прежде всего при определении с помощью анализа, описанного ниже в примере 6.

Устойчивые к трихотецену растения по изобретению включают растения, у которых более высокий процент семян прорастает и образует корни в присутствии трихотецена по сравнению с контрольными семенами дикого типа, причем трихотецен присутствует в концентрации по крайней мере 5 мкг/мл, более предпочтительно по крайней мере 10 мкг/мл, более предпочтительно по крайней мере 15 мкг/мл, более предпочтительно по крайней мере 20 мкг/мл и еще более предпочтительно по крайней мере 25 мкг/мл. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления устойчивые к трихотецену растения по изобретению включают растения, у которых по крайней мере на 10% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 20% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 30% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 40% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 50% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 60% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 70% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 80% больше семян и еще более предпочтительно по крайней мере на 90% больше семян прорастает и образует корни в присутствии трихотецена по сравнению с контрольными семенами дикого типа.

Трихотецены часто подразделяют на несколько различных по строению групп. В конкретных вариантах осуществления рассматривается устойчивость к группе А и В трихотеценов. Группы А и В включают трихотецены Ризалит и прежде всего дифференцируются по отсутствию (группа А) или присутствию (группа Б) карбонильной функциональной группы в положении С-8. Таким образом, группа В трихотеценов, т.е. ΌΟΝ, включает карбонильную группу в положении С-8.

Более конкретно настоящее изобретение относится к устойчивости к трихотеценам, которые содержат гидроксил в положении С-3. Такие трихотецены включают Т-2-токсин, НТ-2-токсин, изотриходермол, ЭА8. 3-деацетилкалонектрин, 3,15-дидеацетилкалонектрин, скирпентриол, неосоланиол; 15

- 9 006737 ацетилдезоксиниваленол, ниваленол, 4-ацетилниваленол (фусаренон-Х), 4,15-диацетилниваленол, 4,7,15ацетилниваленол и ΌΟΝ и их различные ацетилированные производные.

Согласно конкретному варианту осуществления устойчивые к трихотецену растение, его клетка, ткань или семенной материал обладают устойчивостью к трихотецену, который продуцируется грибами, в частности грибами рода Ризалит. В контексте настоящего описания понятие устойчивость к грибам относится к отсутствию начала поражения после инокуляции грибом или к уменьшению распространения поражения после инокуляции грибом по сравнению с контролем дикого типа.

Согласно предпочтительному варианту осуществления устойчивое к грибам трансгенное растение по настоящему изобретению представляет собой хлебный злак и после заражения грибом содержит меньшее количество пораженных зерен или семян по сравнению с контролем дикого типа, предпочтительно по крайней мере на 10% меньше пораженных зерен или семян по сравнению с таким же количеством зерен или семян, оцененных для контроля дикого типа, более предпочтительно по крайней мере на 20% меньше, более предпочтительно по крайней мере на 40% меньше и еще более предпочтительно по крайней мере на 50% меньше пораженных зерен или семян по сравнению с таким же количеством зерен или семян, оцененных для контроля дикого типа. Устойчивые к грибам трансгенные хлебные злаки по изобретению включают (но не ограничиваясь ими) кукурузу, пшеницу, ячмень рис и овсы.

У пшеницы распространение поражения грибом на метелку может быть оценено согласно анализу, описанному ниже в примере 9, путем подсчета колосков с признаками болезни и без них (симптоматических и асимптоматических колосков) на каждой инокулированной метелке и определения процента колосков в каждой метелке, которые являются симптоматическими. Согласно предпочтительному варианту осуществления устойчивые к грибам растения пшеницы по изобретению после контрольного заражения грибом включают меньше пораженных колосков по сравнению с контролем дикого типа, предпочтительно по крайней мере на 10% меньше пораженных колосков по сравнению с таким же количеством колосков, проанализированных для контроля дикого типа, более предпочтительно по крайней мере на 20% меньше, более предпочтительно по крайней мере на 40% меньше и более предпочтительно по крайней мере на 50% меньше пораженных колосков по сравнению с таким же количеством колосков в контроле дикого типа.

У кукурузы распространение поражения грибом на початок может определяться визуальной оценкой процента пораженных зерен согласно анализу, описанному ниже в примере 9. Согласно предпочтительному варианту осуществления устойчивые к грибам растения кукурузы по изобретению после контрольного заражения грибом включают меньше пораженных зерен по сравнению с контролем дикого типа, предпочтительно по крайней мере на 10% меньше пораженных зерен по сравнению с таким же количеством початков, визуально проанализированных для контроля дикого типа, более предпочтительно по крайней мере на 20% меньше, более предпочтительно по крайней мере на 40% меньше и более предпочтительно по крайней мере на 50% меньше пораженных зерен по сравнению с таким же количеством початков, визуально проанализированных для контроля дикого типа. У кукурузы внутреннее распространение в стебель может быть оценено визуально путем расщепления стебля и оценки степени обесцвечивания. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения для трансгенных растений кукурузы по изобретению характерна меньшая степень внутреннего и/или наружного обесцвечивания стебля по сравнению с контролем дикого типа.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления устойчивые к грибам растения по изобретению включают растения, для которых характерен более высокий процент проросших семян при наличии контрольного заражения грибом по сравнению с процентом проросших семян в контроле дикого типа. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления устойчивые к грибам растения по изобретению включают растения, у которых прорастает по крайней мере на 10% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 20% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 30% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 40% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 50% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 60% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 70% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 80% больше семян и более предпочтительно по крайней мере на 90% больше семян, более предпочтительно по крайней мере на 100% больше семян, наиболее предпочтительно по крайней мере на 150% больше семян, в присутствии Ризалит по сравнению с прорастанием семян в контроле дикого типа.

Другим предпочтительным вариантом осуществления являются устойчивые к грибам трансгенные растения, которые продуцируют семена или зерна, содержащие меньшее количество микотоксина, например трихотецена, по сравнению с семенами контроля дикого типа. Особенно предпочтительным вариантом осуществления являются культурные растения и наиболее предпочтительно хлебные злаки, продуцирующие семена, содержащие по крайней мере на 10% меньше трихотецена, более предпочтительно по крайней мере на 20% меньше трихотецена, более предпочтительно по крайней мере на 30% меньше трихотецена, более предпочтительно по крайней мере на 40% меньше трихотецен, более предпочтительно по крайней мере на 50% меньше трихотецена, более предпочтительно по крайней мере на 60% меньше трихотецена, более предпочтительно по крайней мере на 70% меньше трихотецена и наиболее предпочтительно по крайней мере на 80% меньше трихотецена, по сравнению с контролем дикого

- 10 006737 типа. Загрязнение трихотеценом может быть определено согласно анализу, описанному ниже в примере 10.

Полинуклеотиды, применяемые согласно изобретению, включают гетерологичные полинуклеотиды, кодирующие ацетилтрансферазы, прежде всего, полинуклеотиды, кодирующие ацетилтрансферазы, которые обладают способностью обусловливать устойчивость к трихотецену, наиболее предпочтительно которые кодируют трихотецен-3-О-ацетилтрансферазы. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления гетерологичный полинуклеотид по изобретению может быть получен из грибов (но не ограничиваясь происхождением из грибов), более конкретно из Ризалит, ТлсйоФестт и МугоФестт, в частности, из таких видов Ризалит, как Р. аситтаФт, Р. сгоок^еПеизе, Р. си1тогит, Р. ес.|тзе1г Р. дгаттеагит (С1ЬЬеге11а хеае), Р. 1а1ел1шт, Р. роае, Р. затЬистит (С. рийсалз) и Р. зрогойгсЫоИез. Гетерологичные полинуклеотиды, применяемые согласно изобретению, включают 8ЕО ΙΌ N0:1, 5 и/или 7 и последовательности, практически аналогичные 8Е0 ΙΌ N0:1, 5 и/или 7.

Полинуклеотид, применяемый согласно изобретению, может быть включен в клетки-хозяева, такие как растительные, грибные или бактериальные клетки с помощью общепринятой методики рекомбинантной ДНК. Как правило, она включает встраивание полинуклеотида в систему экспрессии, для которой полинуклеотид является гетерологичным, с использованием стандартных методов клонирования, известных в данной области. Вектор содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции полинуклетида по изобретению в содержащей вектор клетке-хозяине. Может применяться широкое разнообразие векторных систем, известных в данной области, таких как плазмиды, бактериофаги и другие модифицированные вирусы. Компоненты экспрессионной системы также могут быть модифицированы с целью повышения уровня экспрессии. Например, могут применяться усеченные последовательности, нуклеотидные замены, оптимизация нуклеотидов или другие модификации. Экспрессионные системы, известные в данной области, могут применяться для трансформации фактически клетки любого культурного растения в соответствующих условиях. Гетерологичным полинуклеотидом по изобретению предпочтительно стабильно трансформируют и его интегрируют в геном клетки-хозяина. В другом предпочтительном варианте осуществления гетерологичный полинуклеотид по изобретению включают в саморплицирующийся вектор. Примерами саморплицирующихся векторов являются вирусы, в частности Сетίηί-вирусы. Трансформированные клетки могут быть регенерированы с получением целых растений, т.е. трансгенных растений, в которых выбранная форма полинуклеотида по изобретению обусловливает устойчивость трансгенных растений к трихотецену.

Полинуклеотиды по изобретению, предназначенные для экспрессии в трансгенных растениях, сначала объединяют в кассеты экспрессии за пригодным промотором, обладающим способностью экспрессироваться в растениях. Кассеты экспрессии также могут включать любые другие последовательности, необходимые или выбранные для экспрессии гетерологичного полинуклеотида по изобретению. Такие последовательности включают (но не ограничиваясь ими) терминаторы транскрипции, чужеродные последовательности, предназначенные для усиления экспрессии, такие как интроны, витальные последовательности и последовательности, предназначенные для направленного переноса продукта гена в конкретные органеллы и клеточные компартменты. После этого такие кассеты экспрессии легко могут быть перенесены в растительные трансформирующие векторы, описанные ниже. Далее приведено описание различных компонентов типичных кассет экспрессии.

Выбор промотора, применяемого в кассетах экспрессии, определяет пространственную и временную схему экспрессии гетерологичного полинуклеотида по изобретению в трансгенном растении. Выбранные промоторы позволяют осуществлять экспрессию гетерологичных полинуклеотидов по изобретению в определенных типах клеток (таких как эпидермальные клетки листьев, мезофильные клетки, клетки коры корня) или в определенных тканях или органах (например, в корнях, листьях или цветках), и этот выбор зависит от требуемого места накопления продукта гена. В альтернативном варианте выбранный промотор может обеспечивать экспрессию гена при различных условиях индуцирования. Промоторы могут различаться по своей силе, т.е. способности обеспечивать транскрипцию. В зависимости от используемой системы клетки-хозяина может применяться любой из многочисленных пригодных промоторов, известных в данной области. Например, для конститутивной экспрессии могут использоваться промотор 358 СаМУ, промотор актина риса или промотор убикитина. Для регулируемой экспрессии могут применяться химически индуцируемый промотор РР-1 табака или АгаЬ1борз1з (см., например, патент И8 5689044).

Для применения в кассетах экспрессии пригодно широкое разнообразие терминаторов транскрипции. Они ответственны за прекращение транскрипции за гетерологичным полинуклеотидом по изобретению и за его правильное полиаденилирование. Соответствующие терминаторы транскрипции представляют собой терминаторы, для которых известно, что они обладают способностью функционировать в растениях, и они включают терминатор 358 СаМУ, терминатор 1т1, терминатор нопалинсинтазы и терминатор Е9 гЬс8 гороха. Они могут применяться как в однодольных, так и в двудольных растениях.

Известны многочисленные последовательности, усиливающие экспрессию единицы транскрипции гена, и эти последовательности могут применяться в сочетании с полинуклеотидами по настоящему изобретению для усиления их экспрессии в трансгенных растениях. Например, различные интронные после

- 11 006737 довательности, такие как интроны гена Λάΐιΐ кукурузы, усиливают экспрессию, прежде всего в клетках однодольных растений.

Также известно большое количество нетранслируемых лидерных последовательностей, происходящих из вирусов, которые усиливают экспрессию, и которые особенно эффективны в клетках двудольных растений.

Кодирующую последовательность выбранного гена необязательно конструируют с помощью методов генной инженерии, изменяя кодирующую последовательность для оптимальной экспрессии в представляющих интерес видах культурных растений. Методы модификации кодирующих последовательностей с целью достижения оптимальной экспрессии в конкретных видах культурных растений хорошо известны (см. например, Рег1ак и др., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А 88: 3324 (1991); и Κοζίοΐ и др., Бю/1есЬпо1. 11: 194 (1993); Реппоу и Вайеу-8еггек. Ыис1. Аабк Век. 21: 5294-5300 (1993)). Методы модификации кодирующих последовательностей с учетом наиболее часто встречающихся кодонов в генах растений, в том числе высших растений, зеленых водорослей и цианобактерий, хорошо известны (см. таблицу 4 в: Миггау и др. Ыис1. Аабк Век. 17: 477-498 (1989); СатрЬе11 и Со\гп Р1ап1 РЬ.укю1. 92: 1-11 (1990)).

У растений известны различные механизмы направленного переноса продуктов гена, и последовательности, контролирующие функционирование этих механизмов, охарактеризованы весьма подробно. Например, направленный перенос продуктов гена в хлоропласт контролируется сигнальной последовательностью, обнаруженной на Ν-конце различных протеинов, которая отщепляется во время импорта к хлоропласту, в результате чего получается зрелый протеин (см., например, у Сота1 и др., 1. Вю1. Сйет. 263: 15104-15109 (1988)). Другие продукты гена локализованы в других органеллах, таких как митохондрия и пероксисома (см., например, у Ипдег и др., Р1ап1 Мо1ес. Вю1. 13: 411-418 (1989)). кДНК, кодирующие эти продукты, также могут быть подвергнуты воздействиям для осуществления направленного переноса гетерологичных продуктов гена, кодируемых последовательностями ДНК, в эти органеллы. Кроме того, были охарактеризованы последовательности, приводящие к направленному переносу продуктов, кодируемых последовательностями ДНК, в другие клеточные компартменты. Ν-концевые последовательности ответственны за направленный перенос в эндоплазматический ретикулум (ЭР), апопласт и за внеклеточную секрецию из алейронных клеток (КоеЫег и Но, Р1ап1 Се11 2: 769-783 (1990)). Кроме того, Ν-концевые последовательности в сочетании с С-концевыми последовательностями ответственны за направленный перенос продуктов гена в вакуоли (81ппк1н и др., Р1ап1 Мо1ес. Вю1. 14: 357-368 (1990)).

Путем слияния описанных выше соответствующих направляющих последовательностей с гетерологичным полинуклеотидом по изобретению можно направлять трансгенный продукт в любую органеллу или любой компартмент клетки.

Специалистам в данной области известны многочисленные трансформирующие векторы, пригодные для трансформации растений, и полинуклеотиды по настоящему изобретению могут применяться в сочетании с любым из таких векторов. Выбор вектора зависит от предпочтительного метода трансформации и от видов-мишеней, предназначенных для трансформации. Для определенных видов-мишеней предпочтительными могут оказаться различные маркеры для селекции по признаку устойчивости к антибиотику или гербициду. Обычно применяемые для трансформации селектируемые маркеры включают ген пр!11, который обусловливает устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (Меккшд и У1егга, Сепе 19: 259-268 (1982); Веуап и др., №1иге 304:184-187 (1983)), ген Ьаг, обусловливающий устойчивость к гербициду фосфинотрицину (^Ы!е и др., №с1. Ас1бк Век 18: 1062 (1990), 8репсег и др. Тйеог. Арр1. Сепе! 79: 625-631 (1990)), ген ЬрН, обусловливающий устойчивость к антибиотику гигромицину (В1осЫпдег и Ощде1тапп. Мо1. Се11 Вю1 4: 2929-2931 1984)), и ген бЫг, который обусловливает устойчивость к метотрексату (Воигошк и др., ЕМВО 1. 2(7): 1099-1104 (1983)), и ген ЕР8Р8, обусловливающий устойчивость к глифосату (патенты И8 4940935 и 5188642), ген фосфоманнозоизомеразы тапА, который обусловливает избирательное метаболическое преимущество в присутствии маннозы (патент И8, сер. №. 5767378, включенный во всей своей полноте в настоящее описание в качестве ссылки, и Мйек и Сиек!, СЕ№, 32:41-48 (1984)); селектируемый маркер РАТ, который обусловливает устойчивость к гербициду ВА8ТА (8ипд Н. Рагк и др., 1п Уйго Се11.Пеу.Вю1.-Р1ап!, 34: 117-121 (1998)).

Для трансформации с использованием АдгоЬас!егшт !ите£ ааепк пригодны многочисленные векторы. Они обычно несут по крайней мере одну пограничную последовательность Т-ДНК и включают такие векторы, как рВШ19 (Веуап, №с1. Аабк Век., 1984). Обычные векторы, пригодные для трансформации с использованием АдгоЬас!егшт, включают бинарные векторы рС1В200 и рС1В2001, а также бинарный вектор рС1В10 и его производные, отобранные по признаку устойчивости к гигромицину (см., например, патент И8 5639949).

Трансформация без использования АдгоЬас!егшт !ите£ ааепк дает возможность обойти требование наличия последовательностей Т-ДНК в выбранном трансформирующем векторе и, следовательно, векторы, в которых отсутствуют эти последовательности, могут быть использованы в дополнение к векторам, таким как описанные выше, которые содержат последовательности Т-ДНК. Методы трансформации, которые не основаны на использовании АдгоЬас!егшт, включают трансформацию с помощью бомбардировки частицами, поглощение протопластом (например, с помощью ПЭГ и электропорации) и микро

- 12 006737 инъекцию. Выбор вектора в значительной степени зависит от выбора предпочтительных видов, подлежащих трансформации. Типичные векторы, пригодные для трансформация без использования АдгоЬасГегшт, включают рС1В3064, р8ОС19 и р8ОС35 (см. например, патент И8 5639949).

После того, как представляющий интерес полинуклеотид клонирован в экспрессионной системе, ей трансформируют растительную клетку. Методы трансформации и регенерации растений хорошо известны в данной области. Например, для введения чужеродной ДНК, а также для непосредственного поглощения ДНК, введения с помощью липосом, электропорации, микроинъекции и с помощью микроснарядов, используют Τί-плазмиды. Кроме того, для трансформации растительных клеток могут быть использованы бактерии рода АдгоЬасГегшт.

Методы трансформации двудольных растений хорошо известны в данной области и включают методики, основанные на применении АдгоЬасГегшт, и методики, для которых не требуется применение АдгоЬасГегшт. Методы, для которых не требуются АдгоЬасГегшт, включают поглощение экзогенного генетического материала непосредственно протопластами или клетками. Это может быть осуществлено путем поглощения, опосредованного ПЭГ, или электропорацией, введения с помощью бомбардировки частицами, или путем микроинъекции. В каждом случае трансформированные клетки регенерируют до целых растений, используя стандартные методы, известные в данной области. Трансформация большинства однодольных видов растений в настоящее время также стала традиционной. Предпочтительные методы включают прямой перенос генов в протопласты с использованием методов на основе ПЭГ или электропорации, бомбардировки частицами ткани каллюса или опосредуемую АдгоЬасГегшт трансформацию. Ткань-мишень может быть получена из такого источника, как культивар пшеницы ИС703 или генотип кукурузы СС000526. Например, опосредуемая АдгоЬасГегшт трансформация кукурузы может быть осуществлена согласно методике, описанной в заявке на патент И8 09/089111, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки и которая опубликована как XVО 98/54961, а трансформация ячменя может быть осуществлена согласно методу, описанному у: М. Ско, 1. νοη§, С. Магх, V. Лапд, Р. Ьетаих и В. Вискапап (1999), Оуегехргеззюп оГ Шюгебохт к 1еабз Го епкапсеб аскуку оГ з!агск беЬгапсктд епхуте (ри11и1апазе) ш Ьаг1еу дгат, ΡΝΑ8 96: 14641-14646; 8. 2капд, М. Ско, Τ. Коргек, В. Уип, Р. Вгедкхег и Р. Ьетаих (1999), Семекс ГгапзГогтакоп оГ соттегс1а1 сШкуагз оГ оа1 (Ауепа закга Ь.) апб Ьаг1еу (Ногбеит уи1даге Ь.) изтд ш укго зкооГ тепзГетакс си1Гигез бепуеб Ггот дегттаГеб зеебкпдз, Р1апГ Се11 Вер. 18: 959-966; Р. Вгедйхег 8. Наг1Ьей и Р. Ьетаих (1998), 8отас1опа1 уапакоп ш 1ке ргодепу оГ трансгенный Ьаг1еу, ТАС 96: 421-425; М. Ско, V. Лапд и р. Ьетаих (1998), ТгапзГогтаРоп оГ геса1сйгапГ Ьаг1еу си1куагз 1кгоидк ипргогетегИ оГ гедепегаЬкку апб бесгеазеб аЫтзт, Р1апГ зсг 138: 229-244; Р. Ьетаих, т. Ско, 8. 2капд и р. Вгедкхег (1998), Трансгенный сегеа1з: Ногбеит уи1даге Ь. сштепГ зГаГиз апб Ги1иге ргозресГз В: Уазк I, РЫШрз В (ред.) Мо1еси1аг 1тргогетеп1 оГ Сегеа1 Сгорз, К1иуег Асабетк РиЬ1, ЭогбгескГ, Тке №Шег1апбз, стр. 255-316; 8. 2капд, В. V^11^атз-Са^^^е^. Ό. 1аскзоп и Р. Ьетаих (1998), Ехргеззюп оГ ΓΌΓ’2Ζιη апб ΚΝΟΤΤΕΌ1 биппд ш укго аахШагу зкооГ тепзГет ргокГегаРоп апб абгепРРоиз зкооГ тепзГет ГогтаРоп ш иии/е ^еа тауз Ь.) апб Ьаг1еу (Ногбеит уи1даге Ь.), Р1ап1а 204: 542-549; Ό. МсЕ1гоу, 1. Ьоиуегзе, 8. МсЕ1гоу и Р. Ьетаих (1997), Эеуе1ортепГ оГ а З1тр1е ГгапЗ1еп1 аззау Гог Ас/Эз аскуку т се11з оГ тГасГ Ьаг1еу кззие, Р1ап1 Ь 11: 157-165; 8. ^пдау, Ό. МсЕ1гоу, В. Ка11а, 8. Е1ед, М. '№апд, 8. ΤкοтГοη и В. ВгеПе11 (1997), АдгоЬасГепит ГитеГас1епз-теб1аГеб Ьаге1еу 1гапзГогтакоп, Τке Р1апГ Ь 11: 1369-1376; ГОигезкг Ζ. Вазп, В. 8тдк, В. ВшГоп, М. Эакоп, Ь Ко11тогдеп и С. Етскег (1988), АдгоЬасГепит-теб1аГеб капзГогтакоп оГ 1\\ό уапекез оГ Ьаг1еу (Ногбеит уи1даге Ь.), Ргос. 42^ой Конференции австралийского общества биохимии и молекулярной биологии (СопГегепсе оГ Аизкакап 8ос1е1у Гог Вюскет1зку апб Мо1еси1аг Вю1оду), 28 сентября - 1 октября 1998 г., Аделаид, Австралия; Ь Оигезкг В. 8шдк, Ζ. Вазп, В. 8Ге^ак, В. ВшГоп, Ь Ко11тогдеп и С. Етскег (1997), 8(га(ед1ез Гог депекс капзГогтакоп оГ е1ке АизГгакап Ьаг1еу уапекез Ргос. 8-ого АизГ. Ваг1еу Τескη^са1 зутр. Со1б СоазГ, Циеепз1апб, 7-12 сентября 1997 г. 2:8.9-11; Р. Ьетаих, М. Ско, 1. Ьои^егзе, В. ’№11катз и Υ. ^№ап (1996), ВотЬагбтепГ-теб1аГеб капзГогтакоп теШобз Гог Ьаг1еу, Вю-Ваб И8/ЕС Ви11 2007: 1-6; Τ. Коргек, В. Напзск, А. №гНск В. Мепбе1 и Ь 8ски1хе (1996), ЕегШе Ггапздешс Ьаг1еу оГ бгГГегепГ си1куагз оЫатеб Ьу абщзИпеп! оГ ЬотЬагбтепГ сопбйюпз Го кззие гезропзе, Р1апГ 8сг 119: 79-91; Τ. Надю, Τ. НкаЬауазЫ, Н. Маски и Н. ШтиГзипе (1995), Ргобископ оГ Гегк1е Ггапздешс Ьаг1еу (Ногбеит уи1даге Ь.) р1апГз изтд Гке кудготуст-гез1зГапсе тагкег, Р1апГ Се11 Вер. 14: 329-334; Н. ЕипаГзик1, Н. Кигоба, М. К1кага, Р. Ьаххегг Е. Ми11ег, Н. Ьогх и I. К1зктат1 (1995), Еегк1е Ггапздешс Ьаг1еу гедепегаГеб Ьу б1гесГ ^NΑ капзГег Го ргоГор1азГз, ΤΑС 91: 707-712; А. 1акпе, Ό. Вескег, В. ВгеГГзскпе1бег и Н. Ьогх (1994), Ведепегакоп оГ 1гапздешс, ткгозсроге-бепуеб, ГеПбе Ьагеу, ΤΑС 89: 525-533; Υ. ^№ап и Р. Ьетаих (1994), Сепегакоп оГ 1агде питЬегз оГ тберепбепку ГгапзГогтеб ГегШе Ьаг1еу р1апГз, Р1апГ Ркузю1. 104: 37-48. Полинуклеотиды по изобретению могут применяться для придания устойчивости к трихотецену широкому спектру растительных клеток, включая клетки голосеменных, однодольных и двудольных растений. Хотя гетерологичный полинуклеотид по изобретению может быть встроен, например, перенесен в любую растительную клетку в указанных широких классах, особенно ценными являются клетки культурных растений, таких как рис, пшеница, ячмень, рожь, кукуруза, овсы, картофель, сладкий картофель, турнепс, тыква крупноплодная, тыква пепо, цуккини, дыня, соя и сорго. Полинуклеотиды, применяемые согласно изобретению, которые придают растениям устойчивость к трихотецену, могут применяться в сочетании с другими ха

- 13 006737 рактеристиками, важными с точки зрения продуктивности и качества. Полинуклеотиды по изобретению могут быть включены в линии растений с помощью принципов и методов селекции, которые являются известными в данной области.

После того как аллель гена, обусловливающий устойчивость к трихотецену, получен путем трансформации в культурном растении или культуре клеток растения, из которой культурное растение может быть регенерировано, его переносят в коммерческие сорта с помощью традиционных методов селекции с целью получения устойчивой к трихотецену культуры без применения методов генетической инженерии аллеля и трансформации им растения.

Для различных стадий селекции характерно целенаправленное вмешательство человека, такое как отбор линий, подлежащих скрещиванию, непосредственное опыление родительских линий или отбор соответствующего потомства растений. В зависимости от требуемых свойств выбирают различные методы селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают (но не ограничиваясь ими) гибридизацию, инбридинг, возвратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешивание сортов, межвидовую гибридизацию, методы анэуплодии и т.д. Методы гибридизации также включают стерилизацию растений с целью получения мужских или женских стерильных растений с помощью механических, химических или биохимических средств. Перекрестное опыление мужского стерильного растения пыльцой различных линий гарантирует, что геном мужского стерильного, но фертильного женского растения будет равным образом приобретать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные семена и растения по изобретению могут применяться для селекции улучшенных линий растений, которые отличаются тем, что на растении, ткани растения или его семенном материале грибы не растут вообще или растут в меньшей степени, что предупреждает и/или снижает загрязнение микотоксином этого растения, ткани растения или семенного материала.

Устойчивость к трихотецену, сконструированная в описанных выше трансгенных семенах и растениях, передается с помощью полового размножения или вегетативного роста и, таким образом, может сохраняться и передаваться по наследству потомству растений. Обычно указанное сохранение и передачу потомству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, разработанных для конкретных целей, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая. Поскольку выращиваемые культурные растения подвержены нападению и повреждениям, которые вызываются насекомыми или инфекциями, для улучшения урожая проводят мероприятия по борьбе с болезнями растений, насекомыми, нематодами и другими вредными факторами. Они включают механические методы, такие как обработка почвы или удаление зараженных растений, а также применение агрохимических средств защиты растений, таких как фунгициды, гаметоциды, нематоциды, регуляторы роста, агенты, способствующие созреванию, и инсектициды.

При производстве семян качество прорастания и однородность семян являются важными характеристиками продукта, в то время как качество прорастания и однородность семян, собираемых и продаваемых фермером, не являются важными. Поскольку трудно выращивать культурное растение вне контакта с семенами другого культурного и сорного растения, для борьбы с передающимися с семенами болезнями и для получения семян с хорошим прорастанием производителями, занимающимися выращиванием, кондиционированием и продажей чистых семян, разработаны довольно обширные и целенаправленные методы производства семян. Так, обычно фермер практикует покупку сертифицированного семенного материала, удовлетворяющего определенным стандартам качества, вместо того, чтобы использовать семенной материал, полученный от его собственной культуры. Материал для размножения, который используют в качестве семенного материала, обычно обрабатывают защитным покрытием, включающим гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или их смеси. Обычно применяемые защитные покрытия включают такие соединения как каптан, карбоксин, тирам (ΤΜΤΌ®), металаксил (Аргоп®) и пиримифос-метил (Ас1еШс®). При необходимости эти соединения изготавливают в виде препаративных форм вместе с дополнительными носителями, поверхностноактивными веществами или способствующими нанесению адъювантами, обычно применяемыми в области препаративных форм, для защиты от повреждения, вызванного бактериями, грибами или насекомыми-вредителями. Защитные покрытия могут быть нанесены путем пропитывания материала для размножения жидкой композицией или путем покрытия объединенной влажной или сухой композицией. Также возможны другие способы нанесения, такие как обработка почек или плодов.

Еще одним предметом изобретения являются новые сельскохозяйственные методы, такие как приведенные выше методы, для которых характерно применение трансгенных растений, трансгенного растительного материала или трансгенных семян по настоящему изобретению.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения являются трансгенные растительная клетка, ткань, орган, семенной материал или части растения, полученные из трансгенного растения. Также под объем изобретения подпадают трансгенные потомки растения, а также трансгенные растительные клетки, ткани, органы, семена и части растений, полученные из потомков.

Согласно еще одному из вариантов осуществления гетерологичный полинуклеотид по изобретению может применяться в качестве селектируемого маркера в процессах трансформации. В этом варианте клетку-хозяина трансформируют вторым представляющим интерес гетерологичным полинуклеотидом, а

- 14 006737 также гетерологичным полинуклеотидом по изобретению, который кодирует продукт гена, обладающий активностью, которая обусловливает устойчивость к трихотецену, с помощью кассет экспрессии и методов трансформации, приведенных выше в качестве примера, и известных в данной области. После трансформации трансформированные клетки отбирают в отношении их способности выживать при контакте с трихотеценом, в частности ΌΆ8 или ΌΘΝ или Т-2-токсином. Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую или прокариотическую клетку-хозяина, и в отношении них применяются методы трансформации и системы экспрессии, известные в данной области. Клетка-хозяин может представлять собой клетку растения, клетку гриба, клетку бактерии, клетку дрожжей, клетку животного или клетку насекомого.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения полинуклеотид, который кодирует продукт гена, обладающий активностью, которая обусловливает устойчивость к трихотецену, используют в качестве селектируемого маркера в методах трансформации растительной клетки. Например, растения, ткань растения, семена растения или клетки растения, экспрессирующие по крайней мере вторую представляющую интерес гетерологичную последовательность ДНК, также могут быть трансформированы так, что они экспрессируют последовательность, кодирующую полипептид, который включает последовательность, практически аналогичную 8ЕО ΙΌ N0:2, 6 или 8. Трансформированные клетки переносят в среду, содержащую фитотоксичный трихотецен, в частности ΌΆ8 и/или Ό0Ν и/или Т-2-токсин, в количестве, достаточном для того, чтобы ингибировать рост или выживаемость растительных клеток, которые не экспрессируют полипептид, практически аналогичный полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:2, 6 или 8, при этом только трансформированные клетки могут расти или могут оставаться не угнетенными. Концентрации трихотеценов, которые могут применяться для отбора растений, экспрессирующих полипептид, практически аналогичный полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:2, 6 или 8, составляют от 1 мкг/мл до 90 мкг/мл. Способ применим к любой растительной клетке, которая обладает способностью экспрессировать полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, практически аналогичную последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:1, 5 или 7, и может использоваться в сочетании с любой представляющей интерес гетерологичной последовательностью ДНК. Экспрессия второй гетерологичной последовательности ДНК и гетерологичного полинуклеотида по изобретению может находиться под контролем одного и того же промотора, который функционирует в клетках растений, или под контролем различных промоторов.

Описание последовательностей

8Е0 ΙΌ N0:1 обозначает последовательность кДНК Еикагшт 8рого1псЫо1бе8, которая кодирует полипептид по изобретению, обладающий активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену.

8Е0 ΙΌ N0:2 обозначает полипептид, обладающий активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, кодируемый 8Е0 ΙΌ N0:1.

8Е0 ΙΌ N0:3 обозначает ДНК-праймер.

8Е0 ΙΌ N0:4: обозначает ДНК-праймер.

8Е0 ΙΌ N0:5 обозначает последовательность ДНК Еикагшт дгатшеагцт, которая кодирует полипептид по изобретению, обладающий активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену.

8Е0 ΙΌ N0:6 обозначает полипептид, обладающий активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, кодируемый 8Е0 ΙΌ N0:5.

8Е0 ΙΌ N0:7 обозначает последовательность ДНК Зассйаготусек сегеуШае, которая кодирует полипептид по изобретение, обладающий активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену.

8Е0 ΙΌ N0:8 обозначает полипептид, обладающий активностью, обусловливающей устойчивость к трихотецену, кодируемый 8Е0 ΙΌ N0:7.

8Е0 ΙΌ N0:9 обозначает последовательность ДНК рОВ9818.

8Е0 ΙΌ N0:10 обозначает последовательность ДНК рАдгоТПг.

8Е0 ΙΌ N0:11 обозначает последовательность ДНК ρN0V1704.

Примеры

В приведенных ниже примерах дополнительно описаны материалы и методы, применяемые для осуществления изобретения, и полученные результаты. Они даны с целью иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения.

Пример 1. Строение ρN0V1700, ρΟΙΒ9818, рАдгоТПг и рШ 1704.

1. р^У1700.

ρN0V1700 в соответствии с Будапештским договором депонирован 19 марта 1999 г. в Коллекции запатентованных культур службы сельскохозяйственных исследований (^ККБ), 1815 №г111егп Ишуегайу 5>1гееЕ Пеория, штат Иллинойс 61604, США, под регистрационным номером NΚΚ^ Β-30117.

В целом, ρN0V1700 включает 8Е0 ΙΌ N0:1, функционально связанную с промотором убикитана

2.тау§, включая часть экзона и интрона, и с сигналом полиаденилирования нопалинсинтазы.

2. рСГВ9818.

Плазмида рСГВ9818 представляет собой состоящую из 6111 пар оснований кольцевую плазмиду, последовательность ДНК которой представлена в 8Е0 ΙΌ N0:9. Промотор убикитина Ζ. таук, прости

- 15 006737 рающийся от основания 12 до 1993 8Еф ΙΌ N0:9, включая часть экзона, простирающуюся от основания 896 до 1011, и интрон, простирающийся от основания 1047 до 1993, функционально связан с селектируемым маркером, геном фосфатманнозоизомеразы, который простирается от основания 2090 до 3193, инвертированным интроном № 9 РЕРС, простирающимся от основания 3248 до 3355 и последовательностью терминатора гена 358 СаМУ, простирающейся от основания 3357 до 3434.

3. рЛдгоТШг.

Плазмида рЛдгоТШг представляет собой кольцевой бинарный вектор длиной 13737 пар оснований, имеющий последовательность ДНК, представленную в 8Еф ΙΌ N0:10. В целом, рАдгоТКЗг включает селектируемый маркер, функционально связанный с промотором и последовательностью терминатора, и область полинуклеотида, последовательность которого приведена в 8Еф ΙΌ N0:1, который расположен позади и в рамке считывания с промотором ЛгаЫйорз1з Ша11апа ИВ1 3 (8. №гпз. 8. Меуег и 1. Са11из, Р1ап( Мо1еси1аг Вю1оду 22:895-906, (1993)) и впереди и в рамке считывания с сигналом полиаденилирования поз.

4. р№у1704.

Плазмида рN0V1704 представляет собой кольцевой бинарный вектор длиной 12949 пар оснований, имеющий последовательность ДНК, представленную в 8Еф ΙΌ N0:11. Промотор убикитина Ζ. тауз, простирающийся от основания 11 до 1992 8Еф ΙΌ N0:11 ( включая экзон 1: 895-1010 и интрон 1: 10461992), функционально связан с последовательностью селектируемого маркера, геном фосфатманнозоизомеразы, который простирается от основания 2089 до 3192, и последовательностью терминатора нопалинсинтазы, простирающейся от основания 3557 до 3688. Кроме того, рN0V1704 включает промотор убикитина Ζ. тауз, основания 9218-11218 (включая экзон 1: от 10110 до 10224 и интрон 1: от 10225 до 11218), функционально связанный с последовательностью трихотецен-3-0-ацетилтрансферазы, которая представлена в 8Еф ΙΌ N0:1, основания от 11234 до 12662 и последовательностью терминатора поз, основания от 12667 до 12935.

Пример 2. Трансформация пшеницы, селекция и регенерация.

Трансформация.

Незрелые зиготические зародыши (0,75-1,25 мм) отсекают от поверхности стерилизованных зерновок пшеницы (10% СЫогох X 10 мин), затем помещают вверх скутелумом на основную среду М8 (МигазЫде и 8коод, (1962) РНузю1. Р1ап( 15:473-439), дополненную 3% сахарозы, 3 мг/л 2,4-Д (дихлорфеноксиуксусная кислота), 150 мг/л глутамина, 75 мг/л аспарагина и отвержденную с помощью 0,7% фитоагара (среда 3М838). Зародыши инкубируют в темноте при 28°С в течение 5-10 дней до бомбардировки. Оптимальным временем для бомбардировки являются 6-7 дни после посева. За 4 ч до бомбардировки зародыши помещают в среду для плазмолиса (такую же среду, как описана выше, но с добавлением 15% мальтозы вместо сахарозы) и располагают по окружности диаметром 2,5 см вверх скутелумом.

Описанную выше в примере 1 плазмиду рN0V1700 расщепляют с помощью РуцП и ΧιηπΙ и выделяют фрагмент длиной 4117 пар оснований, который включает полинуклеотидную область, имеющую последовательность, представленную в 8Еф ΙΌ N0:1, а также промотор убикитина и сигнал полиаденилирования N08. Плазмиду рСГВ9818, также описанную выше в примере 1, расщепляют с помощью ЛзН и выделяют фрагмент длиной 4246 пар оснований, включающий промотор υΒΙ кукурузы, селектируемый маркер и последовательность терминатора 358 СаМУ.

Выделенные фрагменты ДНК осаждают на золотые частицы размером 0,3 мкм с помощью метода, описанного у 8апГогб. При постоянном перемешивании 5 мкг выделенного фрагмента ДНК каждой конструкции, 50 мкл 2,5М СаС1₂ и 20 мкл 0,1М спермидина добавляют в пробирку Эппендорфа, которая содержит 50 мкл 50%-ного глицерина и 3 мг золотых частиц. Смесь ДНК/золотые частицы подвергают двум промывкам этанолом. После отбрасывания супернатанта, образовавшего при последней промывке, добавляют этанол до получения конечного объема 70 мкл. Это позволяет получить объем смеси золотые частицы/ДНК, необходимый для осуществления 6 выстрелов из 1 пробирки. Пластины-мишени обстреливают дважды, что позволяет нанести на каждую пластину-мишень примерно 3 мкг ДНК (если, как принято, используют по 5 мкг каждой из 2 конструкций) и 1,0 мг золотых частиц. Используют давление залпа 1100 фунтов/кв.дюйм. После бомбардировки пластины-мишени возвращают на ночь в темноту. После примерно 24-часового плазмолиса зародыши возвращают в среду 3М838 и выдерживают в темноте в течение 3 недель для инициации развития каллюса. В это время пересевы не осуществляют.

Селекция/Регенерация.

Эмбриогенную ткань, которая развилась в течение 3-недельного периода инициации, отсекают от неэмбриогенной ткани и помещают в среду для регенерации/селекции. Основная среда для регенерации представляет собой среду 3М838 без добавления 2,4-Д, но с добавлением вместо него 1 мг/л СА3 (гибберелин А₃) - НУК (1-нафталинуксусная кислота) и НУК (обозначена как среда N6). Добавляют 10 г/л маннозы и 5 г/л сахарозы (ХС1М.58). Ткань подвергают начальной фазе регенерации и селекции в течение 2 недель. После 2-недельного периода ткань выдерживают в освещенной комнате. На этой фазе начинается развитие побегов и корней и через 2 недели ткань переходит на следующую стадию развития.

Во время второй фазы регенерации и отбора маннозой, концентрацию маннозы понижают до 5 г/л, а концентрацию сахарозы повышают до 20 г/л (среда М828.5М). Как правило, ткань выдерживают в этой

- 16 006737 среде в течение примерно 4 недель, во время которых происходит дополнительное развитие побегов и корней.

Интенсивно растущие проростки с хорошей окраской и развитыми побегами и корнями изымают из пластин и помещают в более крупные контейнеры, обозначенные как СА7'з. Это является конечной стадии селекции и регенерации. Среда содержит только 1/2 Μδ-солей и 15 г/л маннозы. Наилучшим индикатором того, что растение трансформировано, является активный рост корней в среде. До переноса в теплицу листовую ткань активно растущих проростков собирают и осуществляют ПЦР с целью доказательства присутствия либо представляющего интерес гена, либо селектируемого маркера.

Пример 3. Трансформация АгаЬ1борз1з.

Конструкциями бинарного вектора рАдгоТШг, описанными выше в примере 1, трансформируют путем электропорации штамм АдгоЬас!егшт ШтеГ ааеиз СУ3101 (ВесНю1б Ν. и др., СВ Асаб. 8с1. Рапз, 8с1еисез бе 1а У1е, 316:1194-1199 (1993)) (Ио^ег V.!, Μοί. Βίοί. Вер 1:5 (1987)). 25 мл культуры из индивидуальных колоний штамма АдгоЬас!егшт СУ3101, которые содержат плазмиды рАдгоТВ1г в среде ΥΕΒ + рифампсин 100 (ВИатрзш 100) и канамицин 100 (Капотуст 100) инкубируют при 30°С в течение ночи. Образование крупных культур инициируют, инокулируя 500 мл этой же среды с помощью 5 мл небольшой культуры, и инкубируют в течение ночи при 30°С. Определяют значения ОП при 600 нм культур и затем культуры и центрифугируют при 5 К в С8А-роторе в течение 1 мин. Клетки ресуспендируют в среде типа ΙΜ Μο6ί^6 тП11га1юп теб1а до достижения конечного значения ОП при 600 нм 0,08. Добавляют 200 мкл 8П\уе1 на литр клеточной суспензии. По 3 отобранных цветочных горшка, в которых находится примерно по 4 растения А^аЬабοрз^з уаг ^ШтНа, погружают вниз головой примерно в 500 мл клеточной суспензии. Цветки встряхивают в клеточной суспензии для удаления пузырьков воздуха и растения инкубируют в клеточной суспензии в течение 15 мин. Поддон накрывают колпаком для того, чтобы поддерживать влажность растений в течение ночи.

Растениям дают развиваться в течение примерно 3-4 недель, после чего их не поливают в течение примерно до 1 недели. Стручки с семенами собирают и сушат в сушильной комнате в течение примерно

1,5 недели. Семена высаживают и дают расти в течение примерно 2 недель. Растения опрыскивают селектирующим агентом и затем опрыскивание повторяют вновь через 2 дня и через 4 дня. Примерно через 3 недели выжившие растения могут быть перенесены в новые цветочные горшки.

Пример 4. Биобаллистическая трансформация кукурузы.

Развитие культур эмбриогенного каллюса типа I (Сгееп и др. 1983, 8οтаΐ^с се11 депеБс зуз!етз ΐη тот. А. Ра7е1айтаб, К. ^ο\νηеу. 1. ЗсНиИ/, ВV Уοе11ту, (ред.) Абуапсез ίη Сепе ТесНгюкду: Μο1еси1а^ СепеОсз οΓ Р1ап!з апб Ашта1з. Μίηιηί νίπ^ι· 8утрοз^ит 8епез, том 20. Асабетю Ргезз, ΝΥ.) инициируют из незрелых зародышей кукурузы длиной 1,5 - 2,0 мм, полученных из выращенного в теплице материала. Зародыши выделяют в асептических условиях из початков со стерилизованной поверхностью приблизительно через 14 дней после опыления. Зародыши помещают на Ό-среду для инициации развития каллюса, содержащую 2% сахарозы и 5 мг/л хлорамбена (Эипсап и др., Р1ап!а 165: 322-332 (1985)). Затем зародыши и эмбриогенный каллюс культивируют в темноте. Из эксплантатов примерно через 14 дней выделяют зародыши, дающие эмбриогенную реакцию. Дающие эмбриогенную реакцию зародыши помещают на Ό-среду для поддержания развития каллюса, содержащую 2% сахарозы и 0,5 мг/л 2,4-Д. После инкубации в течение примерно 6 недель с еженедельным пересевом на свежую поддерживающую среду, получают компактные эмбриогенные культуры высокого качества. Кусочки активно растущего эмбриогенного каллюса отбирают в качестве ткани-мишени для введения гена. Кусочки каллюса помещают на пластины-мишени, содержащие поддерживающую среду, дополненную 12% сахарозы, примерно за 4 ч до введения гена.

Кусочки каллюса размещают по окружностям радиусами 8 и 10 мм от центра пластины-мишени.

Описанную выше в примере 1 плазмиду рNОУ1700 расщепляют с помощью РуцП и Хтп1 и выделяют фрагмент длиной 4117 пар оснований, который содержит полинуклеотидную область, имеющую последовательность, представленную в 8Εφ ΙΌ N0:1, а также промотор и сигнал полиаденилирования. Также описанную выше в примере 1 плазмиду рС1В9818 расщепляют с помощью Азс1 и выделяют фрагмент длиной 4246 пар оснований, также содержащий маркерный ген, промотор и сигнал терминации. Выделенные фрагменты ДНК осаждают на золотые микроносители согласно руководству □υΓοΒΐ ВюНзБс. Два-три мкг каждой плазмидной конструкции используют для обработки 6 применяемых в качестве снарядов микроносителей. Полинуклеотиды по изобретению вводят в клетки ткани-мишени с помощью устройства типа РИ8-1000Не ВюБзБсз. Устройство типа ВюБзБсз имеет следующие параметры настройки: расстояние между разрушающимся диском и макроносителем 8 мм, расстояние между макроносителем и задерживающим экраном 10 мм и расстояние между задерживающим экраном и мишенью 7 см. Каждую пластину-мишень обстреливают, используя диски, разрушаемые при давлении залпа 650 фунтов/кв.дюйм. Между задерживающим экраном и тканью-мишенью помещают экран из нержавеющей стали размером 200x200 (фирма ΜсΜазΐе^-Са^^, Нью-Брунсвик, штат Нью-Джерси). Через 7 дней после введения гена кусочки ткани-мишени переносят из среды с высоким осмотическим давлением на среду с селектирующим агентом.

Ткань-мишень помещают в поддерживающую среду без сахарозы, но содержащую 1% маннозы.

- 17 006737

Через 3-5 недель растущие кусочки каллюса пересевают в среду для поддерживания, не содержащую сахарозу и содержащую 1,5% маннозы. Эмбриогеный каллюс, растущий на среде для селекции, пересевают каждые 2 недели в течение 6-10 недель до получения количества каллюса, достаточного для образования 10-20 растений.

Выжившую после селекции ткань, образовавшуюся из исходного кусочка ткани-мишени, пересевают в виде одной колонии и обозначают как независимый случай трансформации. Колонии переносят на модифицированную Μδ-среду (МигазЫде и 8коод 1962, А гсу1зей тейшт £ог гарШ дго\\И1 апй Ьюаз8ау8 \νί11ι ЮЬассо йззие сикигез, Ркузюк Р1аШ 15: 473-497), содержащую 2% сахарозы и 1% маннозы (М838 + 1М), дополненную 0,25 мг/л анцимидола и 0,5 мг/л кенетина. Через 2 недели регенерирующие колонии переносят на безгормональную среду М838 + 1М. Регенерирующие побеги с корнями и без корней из всех колоний переносят в ящики типа Маде1а, содержащие среду М838, и в конце концов получают небольшие растения с корнями, которые переносят в почву в теплицу.

Пример 5. Анализ экспрессии в трансгенных растениях.

Ткань трансформированных растений анализируют на присутствие полинуклеотида, включающего последовательность, представленную в 8Е^ ΙΌ N0:1. ДНК экстрагируют из трансформированного растения и осуществляют анализ с помощью ПЦР согласно стандартным протоколам. Для амплификации конструкций генов применяют следующие праймеры: (5'-асдаа1сайсассдаддад-3') (8Ε^ ΙΌ N0:3) и (5'с1сасас1с1саддс11асс-3') (8Ε^ ΙΌ N0:4). Проводят обнаружение фрагмента длиной 650 нуклеотидов последовательности 8Ε^ ΙΌ N0:1 пшеницы, полученного согласно методике, описанной выше в примере 2.

6. Анализ методом Нозерн-блоттинга.

Трансформированные растения анализируют в отношении присутствия РНК гибридизацией с помощью метода Нозерн-блоттинга. Для анализа методом Нозерн-блоттинга экстрагированную из ткани растения РНК разделяют по размеру и блоттируют на найлоновую мембрану. Эту мембрану затем гибридизуют с радиоактивным зондом, полученным из ЗМ-фрагмента длиной 429 нуклеотидов полинуклеотида, представленного в 8Ε^ ΙΌ N0:1, который используют в качестве зонда. Проводят анализ РНК из растений пшеницы и АгаЬайорзЕ трансформированных, как описано выше в примерах 2 и 3.

Пример 6. Ферментативный анализ трихотецен-3-О-ацетилтрансферазной активности.

а) Экстракция растительной ткани для ферментативных анализов: Отбирают три кусочка листа размером 1x1/8 дюйма (примерно 50 мг) трансгенных растений по изобретению, включая растения, трансформированные и регенерированные согласно методикам, описанным в примерах 2-4.

б) Размалывание в стеклянной шаровой мельнице: Ткань помещают в круглодонную пробирку объемом 2 мл и закрывают крышку. Пробирку погружают в жидкий азот и инкубируют в течение ночи при -80° С. Пробирку периодически встряхивают в течение 24 с и добавляют 0,4 мл натрий-фосфатного буфера. Пробирку встряхивают в течение 10 с и помещают на лед. Пробирку встряхивают в течение еще 5 мин и затем центрифугируют при 14000 об/мин в центрифуге Эппендорфа в течение 5 мин. Супернатант удаляют и переносят в чистую пробирку.

Смешивают следующие компоненты: субстрат, представляющий собой трихотецен: 2 мкл ΌΑ8 (20%-ный ацетон в 50мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,0). Также может применяться 00Н.

Субстрат, представляющий собой ацетил-Со: 2 мкл [¹⁴С]-ацетил-СоА фирма ПЕК, каталожный № №С313 (60 мКи/ммоль и 0,02 мКи/мл).

Буфер доводят до конечного объема 50 мкл с помощью натрий-фосфатного буфера, рН 7,0.

Анализ начинают, добавляя указанный ниже препарат ферментов и инкубируют при 30° С в течение 15 мин.

Препарат ферментов: 10 мкл экстракта растения в натрий-фосфатном буфере, рН 7,0.

Через 15 мин добавляют 100 мкл этилацетата и пробирку встряхивают дважды в течение нескольких секунд. Затем пробирку центрифугируют в течение 2 мин при 14000 об/мин в центрифуге Эппендорфа. Отбирают 50 мкл этилацетатной фазы и вносят во флакон, содержащий сцинтилляционную жидкость. Радиоактивность в пробирке подсчитывают в течение 2 мин, используя сцинтилляционный счетчик.

Выявлено 20 отдельных растений пшеницы, полученных согласно методике, описанной выше в примере 2, в которых обнаружена удельная активность от 0,60 до 13,4 нмоля ацетилированного продукта/мкг протеина/15 мин. Удельные активности в трансформированных растениях оказались существенно выше по сравнению с отрицательным контролем. Отрицательный контроль представляет собой нетрансформированный культивар пшеницы, удельная активность которого составляет от 0,1 до 0,2 нмоля ацетилированного продукта/мкг протеина/15 мин.

Выявлено 5 отдельных растений АгаЫйорзЕ полученных согласно методике, описанной выше в примере 3, в которых обнаружена удельная активность от 3,8 до 28 нмолей ацетилированного продукта/мкг протеина/15 мин. Удельные активности в трансформированных растениях пшеницы оказались существенно выше по сравнению с отрицательным контролем. Отрицательный контроль представляет собой растения АгаЫйорзН Файапа уаг Со1итЫа, трансформированные конструкцией нуклеиновой кислоты с целью экспрессии селектируемого маркера, их удельная активность составляет менее 0,1 нмоля ацетилированного продукта/мкг протеина/15 мин.

- 18 006737

Выявлены растения кукурузы по крайней мере из 2 различных трансформантов, полученных согласно методике, описанной выше в примере 4, в которых обнаружена удельная активность от 11,1 до 17,9 нмоля ацетилированного продукта/мкг протеина/15 мин. Удельные активности в трансформированных растениях оказались существенно выше по сравнению с отрицательным контролем. Отрицательный контроль представляет собой растения кукурузы, имеющие нетрансформированный генотип, удельная активность которых составляет менее 0,2 нмоля ацетилированного продукта/мкг протеина/15 мин.

Выявлены растения кукурузы по крайней мере из 16 различных трансформантов, полученных с помощью опосредуемой АдгоЬас1егшт трансформации с использованием плазмиды ρΝΟν 1704, в которых удельная активность составляет от 17 до 183 нмоля/мкг/15 мин.

Пример 7. Биологическая оценка устойчивости к трихотецену трансгенных растений.

Готовят 250 мл СРЯ-среды, которая включает следующие компоненты, и значение рН доводят до

6,5 с помощью КОН.

Μδ-соли половинной крепости 0,54 г

Μδ-витамины 1,25 мл

Сахароза 1% (необязательно) 2,50 г

К указанной выше среде добавляют агарозу в концентрации 1% (2,50 г) и среду автоклавируют. К проавтоклавированной среде добавляют 25 мл 50 мг/мл хлорфенолового красного.

Поддерживая температуру среды на уровне 55° С, добавляют различные концентрации ΌΑ8 или ΌΟΝ в ацетоне (т.е. к 1,7 мл добавляют 4, 8 или 16 мкл 10 мг/мл ΌΟΝ или 2, 4 или 6 мкл 50 мг/мл ΌΑ8). В каждую лунку 48-луночного титрационного микропланшета вносят аликвоту среды, составляющую примерно 0,5 мл.

В лунки титрационного микропланшета вносят кусочки ткани трансформированных растений размером 1/3 х 1/8 дюйма или контрольной ткани, полученной из контрольных нетрансформированных растений дикого типа. Кусочкам листьев дают подсохнуть в чашке Петри и с помощью пинцетов помещают в среду в лунку титрационного микропланшета. Титрационные микропланшеты инкубируют на свету в течение 2-4 дней при 20° С. В результате метаболических процессов в кусочках листьев происходит изменение их цвета (понижение рН) с красного на желтый. Наличие активности, которая в результате трансформации обусловливает устойчивость к трихотецену или пониженную чувствительность к трихотеценам, проявляется по наличию желтого окрашивания в лунках в присутствии ΌΑ8 или ΌΟΝ.

Изменение цвета с красного на желтый с сохранением красного цвета в контроле обнаружено также у растений пшеницы и кукурузы, полученных согласно изобретению. Таким образом, для некоторых кусочков листьев характерна существенно более низкая степень хлороза по сравнению с соответствующим контролем.

Пример 8. Анализ прорастания.

А. Анализ прорастания при наличии устойчивости к трихотецену.

Семенной материал, полученный от трансгенных растениях по изобретению, выращивают в среде с селектирующим агентом в условиях давления отбора и полученным в результате растениям дают самоопылиться. Полученные семена помещают в среду Μ838 (Μδ-соли 4,3 г/л, Μδ-витамины 100Х, сахароза 30 г/л и фитагар 8 г/л), в которую добавляют либо ΌΑ8, либо ΌΟΝ (20 мг/мл) с плотностью 1000-1200 семян/на чашку Петри (диаметром 100 мм). После инкубации на свету в течение 4 дней оценивают прорастание всходов в чашках.

Семена растений АгаЬИоркЕ, полученных согласно методике, описанной выше в примере 3, которые выращивают в среде, содержащей ЭЛЗ. дали много растений с развитыми корнями и побегами. В то время как контрольные семена (родительская линия АгаЬайоркщ, уаг. Со1итЫа) плохо прорастают и у них не происходит формирования корней при выращивании в среде, дополненной ЭА8. При выращивании трансформированных и контрольных семян в такой же среде без добавления ЭА8 между ними не выявлено никаких различий.

Б. Анализ прорастания при наличии устойчивости к грибам с целью обнаружения устойчивости проростков к увяданию.

1. Анализ прорастания устойчивой к грибам пшеницы.

Анализ прорастания устойчивой к грибам пшеницы в основном осуществляют согласно методу, описанному у Я. Н. Ргос1ог, Т. М. Но1п и 8. Р. ΜсСо^т^ск, Яейисей У1ги1епсе оГ 61ЬЬеге11а хеае саикей Ьу йЕгирБоп оГ а 1пс1ю111есепе 1охт ЬюкупШейс депе, Μо1.Р1аηΐ-Μ^с^оЬе 1п1егас1. 8 (4):593-601, 1995, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Инокулят представляет собой макроконидии Г. дгат1еагит, разбавленные в воде до концентрации 1х10⁶ конидий на мл. Инокулят приготавливают путем промывки макроконидий культуры, выращенной в агаре с добавлением сока ν-8, в белом или близком к ультрафиолетовому свете в течение 7-10 дней. В экспериментах по анализу проростков поверхность семян двух различных трансгенных линий пшеницы, полученных согласно методике, описанной выше в примере 2, и семян контрольной линии дикого типа стерилизуют, промывая в 10%-ном растворе хлорной извести и 0,05%-ном растворе Твин в течение примерно 15 мин и 5-кратно промывая стерильной дистиллированной водой. Семена замачивают в суспензии макроконидий примерно на 10 мин и затем высаживают в заполненные вермикулитом 10

- 19 006737 сантиметровые пластиковые горшки (20 семян на горшок). Перед посадкой горшки заполняют примерно на 3/4 вермикулитом и выдерживают в 2-4-сантиметровом слое воды до тех пор пока верхняя часть вермикулита не увлажнится. После посева семена покрывают дополнительным слоем вермикулита толщиной 1-2 см и горшки помещают по отдельности в пластиковые ящики и инкубируют в вегетационной камере в течение недели при 22° С и световом режиме 16 ч света и 8 ч темноты. Примерно через 1 неделю горшки вынимают из ящиков и через 2 недели оценивают признаки болезни, подсчитывая количество проростков, появившихся в каждом горшке. Контрольные семена обрабатывают, как описано выше, за исключением того, что семена замачивают в стерильной воде и для опытов используют 40 семян. Обнаружено, что прорастание семян двух различных трансгенных линий растений составило 50 и 43% по сравнению с прорастанием таких же трансгенных семян, обработанных водой, а в контроле дикого типа проросло 17% семян по сравнению с прорастанием таких же семян, обработанных водой.

2. Анализ прорастания устойчивой к грибам кукурузы.

Инокулят получают из культур Р. дгаттеагцт, выращенных на агаре с добавлением маша (полученного с использованием жидкости после кипячения бобов маша) при световом цикле 12 ч света и 12 ч темноты при 25°С. Споры собирают после первой промывки планшета стерильной водой с последующим соскабливанием планшета стеклянной палочкой. Раствор собирают и в день инокуляции концентрацию спор доводят до 1 х 10⁶ спор/мл с помощью дважды дистиллированной стерильной воды.

Почву, состоящую из стерилизованной смеси почвы, торфа и вермикулита, инокулируют из расчета 1 мл раствора спор/л почвы в 5-литровых ящиках для выгонки рассады и зараженную почву перед внесением перемешивают в смесители для цемента в течение 2 мин. В контрольные образцы вносят незараженную почву. В ящики для выгонки рассады высевают по 30 зерен каждой из трансгенной линии семян по изобретению или контроля дикого типа и инкубируют в вегетационных камерах, поддерживая температуру на уровне 55° Р в полунасыщенной почве в течение 4 недель. В течение 14 дней после посадки растения выдерживают все 24 ч в темноте, а в течение 15-24 дней после посадки - при световом цикле 12 ч света, 12 ч темноты. Ящики для выгонки рассады помечают колышками, вносят в климатическую камеру и размещают случайным образом.

Подсчет растений начинают сразу после их появления и проводят ежедневно или через день до тех пор, пока не перестанут появляться новые растения.

Визуально оценивают симптомы изменения цвета и увядания взошедшей рассады и используют их для характеристики уровня устойчивости растений по сравнению с контролями дикого типа. Отбирают растения, которые при визуальной оценке отличаются меньшим изменением цвета и/или увядания взошедшей рассады по сравнению с контролем дикого типа.

Пример 9. Анализ устойчивости к грибам.

А. Тестирование трансгенных растений пшеницы.

Возбудителем гиббереллеза или парши пшеницы является Ризалит дгаттеагит (телеморф: 01ЬЬеге11а хеае). Культуры Р. дгаттеагит выращивают на агаровой среде У-8 (приготовленной с добавлением сока У-8) или на агаре с добавлением маша (полученного с использованием жидкости после кипячения бобов маша) при световом цикле 12 ч света и 12 ч темноты при 25°С. Споры собирают после первой промывки планшета стерильной водой с последующим соскабливанием планшета стеклянной палочкой. Раствор собирают и в день инокуляции концентрацию спор доводят до 5 х 10⁴ спор/мл с помощью дважды дистиллированной стерильной воды.

Трансгенные растения, полученные согласно методике, описанной выше в примере 2, и контрольные растения могут выращиваться в теплице до цветения или образования метелок. Метелки инокулируют путем инъекции примерно 20 мкл (примерно 1000 спор) инокулята между нижней цветковой чешуей и верхней цветковой чешуей одного цветка, расположенного примерно в середине каждой метелки. Часть метелок оставляют незараженными или их инокулируют стерильной водой и используют в качестве контролей. Затем растения переносят в вегетационную камеру и инкубируют при высокой влажности вплоть до 21 дня или растения сначала инкубируют в увлажняющей камере в течение 72 ч при температуре 65-70°Р и затем инкубируют в теплице в течение еще 18 дней.

Трансгенные растения по изобретению и контрольные растения также могут быть выращены в полевых условиях, при этом метелки инокулируют опрыскиванием.

Проявление болезни оценивают, подсчитывая количество симптоматических и асимптоматических колосков на каждой инокулированной метелке с использованием репрезентативного количества трансгенных метелок и метелок контроля дикого типа, и на основе этих данных рассчитывают процент симптоматических колосков в каждой метелке. Симптомы включают преждевременное этиолирование по сравнению с контрольными растениями и в некоторых случаях некроз колосков. Отбирают растения, у которых обнаружено меньшее количество симптоматических колосков по сравнению с контролем дикого типа.

Установлено, что когда трансгенные и контрольные растения инкубируют в теплице, как описано выше, то у шести различных трансгенных растений, которые по данным анализа методом Саузернблоттинга несут различное число копий 8ЕО Ш N0:1 и различные количества инсерционных сайтов, средний процент симптоматических колосков на метелку находится в диапазоне от 10,40 до 31,20% по

- 20 006737 сравнению с 44,75% в контроле дикого типа. Ферментативная активность этих же трансгенных растений, оцененная согласно методу, описанному выше в примере 6, составляет от 0,874 до 29,1 нмоль/мкг/15 мин.

Б. Тестирование трансгенных растений кукурузы.

Оценка сухой гнили початков кукурузы.

Сухая гниль початков кукурузы вызывается Ризалит дгаттеагит (телеморф: О1ЬЬеге11а хсас). Культуры Р. дгаттеагит выращивают на агаровой среде ν-8 (приготовленной с добавлением сока ν-8) при световом цикле 12 ч света и 12 ч темноты при 25°С. Споры собирают после первой промывки планшета стерильной водой с последующим соскабливанием планшета стеклянной палочкой. Раствор собирают и в день инокуляции концентрацию спор доводят до 5 х 10⁵ спор/мл с помощью дважды дистиллированной стерильной воды. Трансгенные растения и контрольные растения выращивают в теплице или в полевых условиях. При выращивании в теплице трансгенные и контрольные растения выдерживают в теплице до появления пестичных столбиков (шелка) и в течение 4-7 дней после их появления, затем в канал пестичных столбиков вносят 2 мл суспензии спор (внутрь полости листовой обертки и выше стержня початка). Это осуществляют с помощью гиподермальной иглы из нержавеющей стали 18-ого размера, присоединенной к крупному шприцу. Помимо инокуляции канала пестичных столбиков для оценки устойчивости к болезни также применяют метод инокуляции зерен. Инокуляция зерен включает введение суспензии спор (примерно 0,4 мл) в группу из 4 зерен с помощью множественных инъекций с использованием иглы 18 размера, присоединенной к шприцу. Симптомы болезни оценивают визуальным осмотром початков, собранных через 5-7 недель после инокуляции, выявляя заметно пораженные зерна. Для оценки симптомов болезни початков в листовой обертке используется следующая балльная система, основанная на визуальном выявлении процента зерен в початке с видимыми признаками поражения: 1 балл соответствует 0%; 2 балла соответствует 1-3%; 3 балла соответствует 4-10%; 4 балла соответствует 11-25%; 5 баллов соответствует 26-50%; 6 баллов соответствует 51-75%; 7 баллов соответствует 76100%. Отбирают растения кукурузы, у которых процент зерен с видимыми признаками поражения ниже, чем в контроле дикого типа.

Пример 10. Оценка загрязнения микотоксином.

Образцы для анализа концентрации микотоксина получают следующим образом. С трансгенных растений по изобретению получают семена, взвешивают и объединяют. Если проводят анализ семян пшеницы, то семена пшеницы получают из метелок одних и тех же трансгенных растений по изобретению и взвешивают и объединяют. Если проводят анализ трансгенной кукурузы, то початки кукурузы сушат с целью снижения уровня влажности, початки вручную шелушат и зерна из початков одних и тех же трансгенных растений взвешивают и объединяют. Каждый из образцов семян или зерен тщательно перемешивают для того, чтобы обеспечить случайное распределение семян. Образец семян или зерен массой 50 г растирают в мельнице (например с использованием центрифужной мельницы Ве1зс11 и11га типа ΖΜ1, фирма Влпктап1пз1гитеи1з 1пс., Рекдал, Онтарио, мельницы типа Вотег 8елез II, Юнион, штат Миссури, США), получая тонкоизмельченный порошок. Затем определяют концентрацию представляющего интерес микотоксина, такого как ΌΟΝ, с помощью имеющихся в продаже тестов, таких как ЭОМез! ТАО™ тусо!охт 1ез1тд зуз1ет (ШСАМ, ЬР, 313 Р1еазап1 8(гее(, Ватертаун, штат Миннесота, 02472), или осуществляя анализ в имеющихся на рынке компаниях (например Вотег ЬаЬз, 1пс, Юнион, Миссури, США или Тл1оду Апа1у11са1 ЬаЬогаФгу, 1пс., Бьюфорд, штат Миссури, США). Во всех аспектах анализа следуют инструкциям производителя. Для системы анализа микотоксина ЭОМез! ТАО™ конечное определение ^ΟN осуществляют флуорометрически. Отбирают растения, продуцирующие семена или зерна с более низким содержанием микотоксина, такого как ЭОН по сравнению с контролем дикого типа.

Пример 11. Применение полинуклеотида, имеющего последовательность, представленную в 8Еф ГО NΟ:1, в качестве селектируемого маркера.

А. Селектируемый маркер в клетках гриба.

АзРЬуа доззур1 трансформируют с помощью стандартных методов трансформации грибов с использованием конструкции ДНК, включающей полинуклеотид, последовательность которого представлена в 8Еф ГО NΟ:1, функционально связанный с промотором галактозидазы. Трансформированные клетки выращивают в среде, содержащей ИА8 в концентрациях от 1,56 нг/мл до 196 пг/мл, а нетрансформированные клетки гриба дикого типа выращивают без добавления ИА8.

Б. Селектируемый маркер в растительных клетках.

Семена, полученные с растений АгаЬИорз1з, трансформированных согласно методике, описанной выше в примере 3, но еще не подвергавшиеся отбору, высаживают в 0,1%-ную агарозную среду, содержащую 0, 5 или 10 мкг/мл ИА8. После инкубации в фитотроне при 22°С при световом цикле 16 ч света и 8 ч темноты в течение 2 недель из планшетов с добавлением ИА8 пересаживают наиболее крупные растения без признаков угнетения и соответствующее количество растений пересаживают из контрольного планшета.

Ферментативную активность в листьях растений АгаЬ1йорз1з, пересаженных из планшета с концентрацией ИА8 5 мкг/мл, оценивают после 2-недельного периода роста, при этом установлено, что 11 из 11

- 21 006737 растений без признаков угнетения обладали ферментативной активностью, при оценке методом, описанным в примере 6, в то время как 9 из 10 растений, которых не подвергали отбору с помощью ОА8, проявили отрицательную активность при таком же анализе. Ферментативная активность, обнаруженная у одного из не подвергавшихся отбору растений, была существенно ниже по сравнению с любым из проанализированных растений, подвергавшихся селекции с помощью ЭА8.

Приведенные выше варианты осуществления даны с целью иллюстрации. Как должно быть очевидно специалисту в данной области в описание изобретения могут быть внесены многочисленные вариации. Подразумевается, что все такие очевидные и поддающиеся предвидению вариации включены в объем приведенной ниже формулы изобретения.

Claims (23)

1. Растительная клетка, включающая гетерологичный полинуклеотид, кодирующий трихотецен-3О-ацетилтрансферазу, который экспрессируется в растительной клетке, и обусловливает устойчивость растительной клетки к трихотецену, несущему С-3 гидроксильную группу, причем указанный гетерологичный полинуклеотид включает:

а) нуклеотидную последовательность 8Е^ ΙΌ N0:1 Ризалит зрого1пс1ио1Йез или последовательность по меньшей мере на 65% идентичную указанной последовательности;

б) нуклеотидную последовательность, кодирующую трихотецен-3-0-ацетилтрансферазу Ризалит зрого1пс1ио1Йез с аминокислотной последовательностью 8Е^ ΙΌ N0:2, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 65% идентичной указанной аминокислотной последовательности.

2. Растение, включающее растительную клетку по п.1.

3. Растение по п.2, обладающее устойчивостью к грибам, продуцирующим трихотецен, несущий С3-гидроксильную группу.

4. Растение по п.3, обладающее устойчивостью к грибам рода Ризалит, предпочтительно к Ризалит дгаттеагит или Ризалит зрого1пс1ио1Йез.

5. Растение по любому из пп.2-4, где гетерологичный полинуклеотид представляет собой микробный полинуклеотид или предпочтительно полинуклеотид дрожжей или грибов.

6. Растение по п.5, где грибной полинуклеотид представляет собой полинуклеотид Ризалит, предпочтительно полинуклеотид Ризалит дгаттеагит.

7. Растение по п.6, где гетерологичный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, представленную в 8Е^ ΙΌ N0:5.

8. Растение по любому из пп.2-6, где гетерологичный полинуклеотид включает область, состоящую по крайней мере из 80 последовательно расположенных пар оснований последовательности 8Е^ ΙΌ N0:1, предпочтительно область, состоящую по крайней мере из 50 последовательно расположенных пар

- 51 006737 оснований последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1, и более предпочтительно область, состоящую по крайней мере из 21 последовательно расположенных пар оснований последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1, и наиболее предпочтительно область, состоящую по крайней мере из 18 последовательно расположенных пар оснований последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:1.

9. Растение по любому из пп.2-8, обладающее устойчивостью к трихотецену, выбранному из группы, включающей Т-2-токсин, НТ-2-токсин, изотриходермол, 4,15-диацетоксискрипенол (ΌΑ8), 3деацетилкалонектрин, 3,15-дидеацетилкалонектрин, скирпентриол, неосоланиол; трихотецен типа В: 15ацетилдезоксиниваленол, ниваленол, 4-ацетилниваленол (фусаренон-Х), 4,15-диацетилниваленол, 4,7,15ацетилниваленол и дезоксиниваленол (00Х), но предпочтительно Э0Х или ΌΑ8.

10. Растение по любому из пп.2-9, представляющее собой растение пшеницы, кукурузы, ячменя или риса.

11. Семенной материал растения по любому из пп.2-10.

12. Способ получения растения, устойчивого к трихотецену, несущему С-3 гидроксильную группу, предусматривающий стадии:

а) трансформации растительной клетки гетерологичным полинуклеотидом, кодирующим трихотецен-3-О-ацетилтрансферазу, обеспечивающим устойчивость растения к трихотецену, несущему С-3 гидроксильную группу, причем указанный гетерологичный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:1 Ризалит зрогойтсЫоИез или последовательность по меньшей мере на 65% идентичную указанной последовательности;

нуклеотидную последовательность, кодирующую трихотецен-3-0-ацетилтрансферазу Ризалит зрогойтсЫоИез с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:2, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 65% идентичной указанной аминокислотной последовательности;

б) обеспечение экспрессии трихотецен-3-О-ацетилтрансферазы с уровнем, достаточным для проявления биологической активности;

в) регенерации растительной клетки в растение; и

г) отбор растения, обладающего повышенной устойчивостью к трихотецену.

13. Способ по п.12, дополнительно включающий стадию отбора растения, на котором менее активно растут грибы, продуцирующие связанный с трихотеценом вирулентный фактор.

14. Способ по п.13, где грибы относятся к роду Ризалит.

15. Способ предупреждения загрязнения растения, включая семенной материал растения, микотоксином, предусматривающий получение трансгенного растения с помощью способа по любому из пп.12-14, и выращивание растения предпочтительно в зоне с уровнем заражения грибом от среднего до серьезного.

16. Способ снижения и/или предупреждения роста на растении грибов, предпочтительно грибов рода Ризалит, продуцирующих трихотецен, несущий С-3-гидроксильную группу, предусматривающий получение трансгенного растения с помощью способа по любому из пп.12-14, и выращивание растения предпочтительно в зоне с уровнем заражения грибами от среднего до серьезного.

17. Способ по любому из пп.12-16, где растение представляет собой культурное растение.

18. Способ получения устойчивого к грибам растения, предусматривающий стадии:

а) трансформации растительной клетки гетерологичным полинуклеотидом, кодирующим трихотецен-3-О-ацетилтрансферазу, обеспечивающим устойчивость растения к трихотецену, несущему С-3 гидроксильную группу, причем указанный гетерологичный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:1 Ризалит зрогойтсЫоИез или последовательность по меньшей мере на 65% идентичную указанной последовательности;

нуклеотидную последовательность, кодирующую трихотецен-3-0-ацетилтрансферазу Ризалит зрогойтсЫоИез с аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:2, или с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 65% идентичной указанной аминокислотной последовательности;

б) обеспечения экспрессии трихотецен-3-О-ацетилтрансферазы с уровнем, достаточным для проявления биологической активности;

(в) регенерации растительной клетки в растение; и (г) отбора растения, обладающего повышенной устойчивостью к трихотецену; и (д) необязательно самоопыления или перекрестного опыления растения, полученного на стадии (г).

19. Способ по п.18, где грибы относятся к роду Ризалит.

20. Способ получения семенного материала для выращивания растения, обладающего устойчивостью к грибам, предусматривающий самоопыление или перекрестное опыление растения по любому из пп.2-10 или растения, полученного согласно способу по пп.18-19, и сбор семян.

21. Способ по п.20, где семенной материал обладает устойчивостью к грибам из рода Ризалит.

22. Устойчивое к грибам растение, получаемое способом по любому из пп.18-19.

23. Семенной материал растения, получаемый способом по любому из пп.20-21.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6