KR20020013518A

KR20020013518A - 마이코톡신 내성 형질전환 식물 및 방법

Info

Publication number: KR20020013518A
Application number: KR1020017012541A
Authority: KR
Inventors: 토마스 엠 혼; 체릴 피터스; 존 매뉴엘 살머론; 자넷 엔 리드; 존 엘 더슨
Original assignee: 릴리 엠 씨즐러 스피허, 아네뜨 워너; 신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2002-02-20
Also published as: HK1044793A1; WO2000060061A3; AU4540600A; JP2002540787A; MXPA01009810A; AU776923B2; EP1477557B1; HUP0200451A3; ATE369418T1; ATE393820T1; CA2365479A1; DZ3146A1; CA2365479C; EA200100927A1; CN1232638C; HUP0200451A2; EP1173553A2; DE60035863T2; WO2000060061A2; DE60038748T2

Abstract

본 발명은 식물내에서 발현되는 유전자 산물을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포로서, 유전자 산물이 트리코테센 내성 활성을 가짐을 특징으로 하는 식물 세포에 관한 것이다.

Description

마이코톡신 내성 형질전환 식물 및 방법{Transgenic plant resistant to mycotoxins and methods}

본 발명은 트리코테센에 대한 내성을 갖는 형질전환 숙주, 특히 형질전환 식물, 식물 조직, 종자 및 세포, 및 이들을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물, 식물 조직, 종자 또는 식물 세포 상에서 진균 성장을 억제하고/하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물, 식물 조직 또는 종자의 마이코톡신 오염을 방지하고/하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 형질전환 프로토콜에서 선택 제제로서 트리코테센을 사용하는 방법에 관한 것이다.

다수의 진균은 경제적으로 중요한 농작물의 심각한 해충이다. 또한, 진균 독소에 의한 작물 오염은 전세계에 걸쳐 농업에 있어서 주요한 문제점이다. 마이코톡신은 척추동물에 대해 건강상 문제를 유발시키는 이의 능력을 특징으로 하는 농산물에서 종종 발견되는 독성 진균의 대사산물이다. 트리코테센은, 진핵세포 단백질 합성의 강력한 단백질로서 작용하는 푸사리움(Fusarium), 트리코테시움(Trichothecium) 및 미로테시움(Myrothecium) 종에 의해 생산되는 세스퀴테르펜 에폭사이드이다. 이러한 트리코테센을 생산하는 푸사리움 종은 에프. 아쿠미나툼(F. acuminatum), 에프. 크룩웰렌스(F. crookwellense), 에프.쿨모룸(F. culmorum), 에프. 에퀴세티(F. equiseti), 에프. 그라미네아룸[F. graminearum(지베렐라 제애: Gibberella zeae)], 에프. 라테리티움(F. lateritium), 에프. 포애(F. poae), 에프. 삼부시눔[F. sambucinim(지. 푸리카리스: G. pulicaris)] 및 에프. 스포로트리키오이데스(F. sporotrichiodes)를 포함한다[참조: Marasas, W.F.O., Nelson, P.E., Toussoun, T.A. 1984].

문헌[참조: A. E. Desjardins and T. M Hohn, Mycotoxins in plant pathogenesis. Mol. Plant-Microbe Interact. 10(2):147-152, 1997]에서 이미 기술된 바와 같이, 농장 동물 및 사람에 있어서의 급성 마이코톡신 중독증 및 마이코톡신 중독증 둘 다는 트리코테센 마이코톡신을 생산하는 푸사리움 종에 오염된 밀, 호밀, 보리, 귀리, 벼 및 옥수수의 소비와 관련되어 있다. 낮은 투여량 수준에서 화학적으로 순수한 트리코테센을 사용한 실험에서는 동물에서의 곰팡이 슨 곡물 중독증, 예를 들어, 빈혈 및 면역억제, 출혈, 구토 및 사료 거부에서 관찰되는 다수의 특징이 재현되었다. 사람 집단으로부터의 역사적 및 역학적 데이터는 특정 질환 유행과 트리코테센을 생산하는 푸사리움 종에 감염된 곡물의 소비와의 관계를 제시한다. 특히, 19세기 이후로 러시아에서 발생된 식사성 독성 무백혈구증으로서 공지된 치명적 질환의 돌발은 트리코테센 T-2 독소를 생산하는 푸사리움 종에 오염된 월동한 곡물의 소비와 관련되어 있다. 일본에서는, 아카카비-비요(akakabi-byo)로 불리는 유사한 질환 또는 붉은 곰팡이병의 돌발은 트리코테센인 데옥시니발레놀(이하, "DON)을 생산하는 푸사리움 종에 감염된 곡물과 관련되어 있다. 트리코테센은 인도와 일본에서의 최근 사람 질환 돌발의 원인인 독성 곡물 샘플에서 검출되었다. 따라서, 마이코톡신 오염을 방지하는 농업적 방법 및 마이코톡신 오염의 수준이 감소된 작물에 대한 요구가 존재한다.

또한, 트리코테센-생산 푸사리움 종은 파괴성 병원균이며, 광범위한 식물 종을 공격한다. 트리코텐센의 급성 식물독성 및 식물 조직에서의 이의 발생은 또한 이들 마이코톡신이 식물에서의 푸사리움의 발병기전에서 작용함을 제시한다. 이는 마이코톡신이 질병에서 작용하므로, 식물에 대한 이의 독성을 감소시킴으로써 또한 식물에서 질환을 억제하거나 감소시킬 수 있음을 암시한다. 또한, 질환 수준의 감소는 식물, 특히 곡류 식물인 곡물에 대한 마이코톡신 오염도를 감소시키는 추가의 이점을 가질 수 있다.

식물에서 질병, 예를 들어, 옥수수 이삭 썩음병, 줄기 썩음병 또는 밀 이삭 마름병을 방제하는 다양한 방법은 성공도를 변화시키면서 사용되어 왔다. 식물 질병을 방제하는 한 방법은 항균제를 작물에 살포하는 것이었다. 이러한 방법은 다수의 당해 분야에 인지된 문제점을 갖고 있다. 또는, 보다 최근 방법은 해로운 유기체의 천연 경쟁제 또는 억제제인 생물학적 방제 유기체("생물방제제")의 사용을 포함한다. 그러나, 생물방제제를 넓은 지역에 살포하는 것이 어렵고, 살아있는 유기체가 지속적인 기간 동안 처리된 지역에서 유지되도록 하는 것은 더 어렵다. 보다 최근에, 재조합 DNA에서의 기술은 항생 화합물을 발현시키는 클로닝된 유전자를 식물 세포내로 삽입하는 기회를 제공한다. 그러나, 이러한 기술은 익히 공지된 천연 항생물질에 대한 궁극적인 미생물 내성에 대한 염려를 초래한다. 따라서, 단일 유전자의 해독에 의해 직접적으로 식물 세포에 의해 형성될 수 있는 단백질과 같은항균제를 동정할 필요가 지속적으로 존재한다.

DON을 포함한 다수의 상이한 푸사리움 트리코테센의 아세틸화를 C3 하이드록실 그룹에서 촉매화시키는 3-O- 아세틸트랜스퍼라제가 푸사리움 스포로트리키오이데스에서 동정되어 있다[참조: S. P. McCormick, N. J. Alexander, S. C. Trapp, and T. M. Hohn. Disruption of TRI101, the gene encoding trichothecene 3-O-adetyltransferase, from Fusarium sporotrichioides. Applied. Environ. Microbiol. 65(12):5252-5256, 1999]. 트리코테센의 C3-OH에서의 아세틸화는 척추동물 및 식물에서 이들의 독성을 현저하게 감소시켜, 반응 생성물인 3-아세틸데옥시발레놀(이하, "3ADON")을 생성시킨다[참조: Kimura et al. infra].

푸사리움 그라미네아룸 및 푸사리움 스포로트리키오이데스로부터의 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 구조 유전자의 서열뿐만 아니라, 다른 오르토로그의 서열이 문헌[참조예: Kimura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(5) 1033-1036 (1998), 및 Kimura et al., FEBS Letters, 435, 163-168 (1988)]에 공개되어 있다. 또한, 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 푸사리움 스포로트리키오이데스로부터의 유전자가 푸사리움에 대한 내성이 증가된 식물 변형체를 발생시키는데 유용할 것으로 추측되어 왔다[참조예: Hohn, T. M. et al., Molecular Genetics of Host-Specific Toxins in Plant Disease, 17-24 (1998), 및 Kimura et al., J. Biological Chemistry, 273(3) 1654-1661 (1998)].

그러나, 본 발명 이전에, 수많은 불확실로 인해 식물에서의 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제를 발현시키는 것이 실제적으로 트리코테센 내성 식물을 유도할수 있는지의 여부가 전혀 명백하지 않게 되었다. 예를 들어, 푸사리움 스포로트리코이데스의 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제에 의해 촉매화된 반응은 가역적이므로, DON과 같은 트리코테센으로부터 식물 세포를 보호할 수 없을지도 모른다. 또한, 3-O-아세틸트랜스퍼라제와 경쟁하여 3ADON으로부터 독성 DON을 생성시킬 수 있는 에스테라제가 식물 세포내에 존재할 것인지의 여부도 불확실하였다. 또한, 반응 생성물인 3ADON의 대사가 식물에 어떠한 방식으로 영향을 미치는지, 예를 들어, 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제의 도입이, 예를 들어, 식물의 자연발생적 질환 내성 대사를 방해함으로써 아세틸트랜스퍼라제의 임의의 긍정적인 기여를 부정할 수 있는 방식으로 식물 성장 및 발육을 변경시킬 수 있는지의 여부도 불확실하였다. 또한, 3ADON이 식물에 의해 대사되어, 독성 효과를 갖는 신규한 제2 대사물질을 형성할 수 있는지의 여부도 불확실하였다. 또한, 진균에 침입함으로써 생성된 DON이 3ADON으로 효율적으로 전환되더라도, 이러한 전환이 식물에 있어서 증강된 병원균 내성을 제공할 수 있는지의 여부도 불확실하였다. 상기한 것들은 본 발명 이전의 당해 분야에서의 단지 몇가지 불확실일 뿐이다.

본 발명의 목적은 트리코테센 내성 활성을 포함하는, 식물 세포내에서 발현되는 유전자 산물을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포(들)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 식물 세포를 포함하는, 트리코테센 내성 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 C-3 하이드록실 그룹을 포함하는 트리코테센에 대해 내성을 갖는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 트리코테센, 바람직하게는 C-3 하이드록실 그룹을 포함하는 트리코테센을 생산하는 진균에 대한 내성을 갖는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 푸사리움, 트리코테시움 또는 미로테시움에 대한 내성을 갖는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 특히 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 쿨모룸, 푸사리움 스포로트리키오데스, 푸사리움 포애, 푸사리움 삼부시눔, 푸사리움 에퀴세티, 푸사리움 아쿠미나툼, 푸사리움 라테리티움 및 푸사리움 슈도그라미네아룸(Fusarium pseudograminearum)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 푸사리움에 대한 내성을 갖는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 푸사리움 그라미네아룸에 대한 내성을 갖는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 트리코테센 내성 활성을 포함하는, 식물 세포내에서 발현되는 유전자 산물을 암호화하는, 미생물 뉴클레오티드, 바람직하게는 효모 또는 진균 폴리뉴클레오티드인 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진균 폴리뉴클레오티드가 푸사리움 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 푸사리움 그라미네아룸 또는 푸사리움 스포로트리키오이데스 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이종 폴리뉴클레오티드가 서열 1, 서열 5 또는 서열 7의 핵산 서열과 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이종 폴리뉴클레오티드가 서열 1, 서열 5 또는 서열 7의 핵산 서열과 실질적으로 유사한 서열 또는 이의 동족체를 포함하는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 80개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 80개 이상의 연속적인 염기쌍 부분, 바람직하게는 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 50개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 50개 이상의 연속적인 염기쌍 부분, 보다 바람직하게는 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 21개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 21개 이상의 연속적인 염기쌍 부분 및 가장 바람직하게는 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 18개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 18개의 연속적인 염기쌍 부분을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 T-2 독소, HT-2 독소, 이소트리코데르몰, 4,15-디아세톡시스크리페놀(이하, "DAS"), 3-데아세틸칼로네크트린, 3,15-디데아세틸칼로네크트린, 시르펜트리올, 네오솔라니올; B형: 15-아세틸데옥시니발레놀, 니발레놀, 4-아세틸니발레놀(푸사레논-X), 4,15-디아세틸니발레놀, 4,7,15-아세틸니발레놀 및 DON으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 트리코테센에 대한 내성을 갖는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 DAS 또는 DON에 대한 내성을 갖는 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 산물이 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 산물이 3-O-아세틸트랜스퍼라제인 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 산물이 서열 2, 서열 6 또는 서열 8과 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 본 발명의 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 임의의 식물의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 밀, 옥수수, 보리 또는 벼 식물인 상기한 식물 중의 하나를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

(a) 식물 세포를 트리코테센에 대한 내성을 증가시키는 유전자 산물을 암호화하는 이종 유전자로 형질전환시키는 단계,

(b) 유전자 산물을 생물학적으로 유의한 수준으로 발현시키는 단계,

(c) 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계 및

(d) 트리코테센에 대한 내성이 증가된 식물을 선택하는 단계를 포함하여, 트리코테센 내성 식물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 트리코테센을 생산하는 진균의 성장이 감소된 식물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 상기한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진균이 푸사리움 속인 상기한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 방법에 따라서 수득된 트리코테센 내성 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 종자로부터 성장한 식물이 증가된 트리코테센 내성을 갖는, 상기한 본 발명의 식물을 자가수정 또는 이계교배시킴으로써 생산된 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 본 발명의 식물을, 바람직하게는 농작물을, 바람직하게는 중간 내지 심각한 진균 감염 지역에서 성장시킴을 포함하여, 식물의 종자를 포함한 식물의 마이코톡신 오염을 방지하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 식물, 바람직하게는 농작물을 중간 내지 심각한 진균 감염 지역에서 성장시키는 것을 포함하여, 식물에서의 진균 성장, 바람직하게는 트리코테센, 바람직하게는 상기한 바와 같은 C-3 하이드록실을 포함하는 트리코테센을 생산하는 푸사리움 속 진균의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

(c) 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계,

(d) 트리코테센에 대한 내성이 증가된 식물을 선택하는 단계 및

(e) 임의로, 단계(d)에서 수득된 식물을 자가수정시키거나 이계교배시키는 단계를 포함하여, 진균 내성 식물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진균이 푸사리움 속인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 식물을 자가수정시키거나 이계교배시킴을 포함하여, 종자로부터 성장한 식물이 진균 내성을 갖는 종자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 종자가 푸사리움 속에 속하는 진균에 대한 내성을 갖는 상기한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

숙주 세포를 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 작제물로 형질전환시키는 단계 및

형질전환된 숙주 세포를 트리코테센 선택 제제의 존재하에 성장시키는 단계를 포함하여, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 숙주 세포가 식물 세포 또는 미생물 세포이고, 특히 미생물 세포가 진균 세포인, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 형질전환된 숙주 세포를 관심의 대상인제2 폴리뉴클레오티드로 추가로 형질전환시키는, 상기한 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 트리코테센이 T-2 독소, HT-2 독소, 이소트리코데르몰, DAS, 3-데아세틸칼로네크트린, 3,15-디데아세틸칼로네크트린, 시르펜트리올, 네오솔라니올; B형: 15-아세틸데옥시니발레놀, 니발레놀, 4-아세틸니발레놀(푸사레논-X), 4,15-디아세틸니발레놀, 4,7,15-아세틸니발레놀 및 DON으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 트리코테센인, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 트리코테센 내성 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 진균 내성 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 식물 종자를 제공하는 것이다.

명백함을 위해, 본 명세서에서 사용된 특정 용어를 아래에 정의하고 제시한다.

"발현"은 내인성 유전자 또는 형질전환 유전자의 식물내에서의 전사 및/또는 해독을 의미한다. 안티센스 작제물의 경우에, 예를 들어, 발현은 안티센스 DNA만의 전사를 의미할 수 있다.

조절 DNA 서열이 RNA 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열"에 작동적으로 연결"되거나 당해 서열"과 관련"됨을 의미하는 경우에 "작동적으로 연결/관련"은 2개의 서열이 조절 DNA 서열이 암호화 DNA 서열의 발현에 영향을 주도록 위치함을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "이종 폴리뉴클레오티드" 또는 "이종 DNA"는 각각 핵산 분자를 도입시킬 숙주 세포와 자연발생적으로 관련되지 않는 핵산 분자, 예를 들어, 천연 핵산 분자의 유전자 작제물인 비천연 다중 복사체 및 비천연 핵산 분자에 작동적으로 연결된 다른 동종 핵산을 의미한다. 이와 같이, 숙주 세포내의 이종 유전자는, 특유의 숙주 세포에 대해 내인성이나, 예를 들어, DNA 셔플링의 사용을 통해 개질된 유전자를 포함한다. 이와 같이, 당해 용어는 세포에 대해 이질 또는 이종이거나, 세포에 대해 동종이나 성분이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산내에 위치하는 DNA 절편을 포함한다.

용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 의미한다. 구체적으로 한정하지 않는 한, 당해 용어는 참조 핵산으로서 유사한 결합 특성을 가지며 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사하는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시하지 않는 한, 개별적인 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 개질된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환) 및 상보성 서열뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로는, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 전체) 코돈의 세 번째 위치를 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환시킨 서열을 생성시킴으로써 수득할 수 있다[참조:Batzer et al., Nucleic Acid Red. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)]. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 또한 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 치환가능하게 사용할 수도 있다.

가장 광범위한 의미로, 용어 "실질적으로 유사한"은 핵산 분자와 관련하여 사용되는 경우에, 참조 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 구조와 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하고, 예를 들어, 폴리펩타이드 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산에서의 변화만이 발생하는, 참조 뉴클레오티드 서열과 상응하는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 실질적으로 유사한 핵산 분자는 참조 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 암호화한다. 용어 "실질적으로 유사한"은 구체적으로는 서열이 특정 세포, 예를 들어, 식물 세포내에서의 발현을 최적화시키도록 개질된 핵산 분자를 포함함을 의미한다. 실질적으로 유사한 핵산 분자와 참조 뉴클레오티드 서열간의 상동성 퍼센트는 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 한층 더 바람직하게는 99% 이상이다. 바람직하게는, 상동성의 퍼센트는 길이가 약 50개 이상의 잔기인 서열의 영역에 걸쳐, 보다 바람직하게는 약 100개 이상의 잔기의 영역에 걸쳐 존재하고, 가장 바람직하게는 서열이 약 150개 이상의 잔기에 걸쳐 실질적으로 유사하다. 가장 바람직한 양태에 있어서, 서열은 암호화 영역의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 유사하다. 서열 비교는 스미스-워터만 서열 정렬 알고리듬(Smith-Waterman sequence alignment algorithm)을 이용하여 아래에 보다 상세히 기술한 바와 같이 수행할 수 있다[참조예: Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0, 또는http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html]. 로컬 S 프로그램, 버젼 1.16을 하기 파라미터: 매치: 1, 미스매치 페널티: 0.33, 오픈-갭 페널티: 2, 연장-갭 페널티: 2로 사용한다.

핵산 서열이 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산이라는 또 다른 지시는 당해 서열이 엄격한 조건하에 본 발명의 핵산 분자에 하이브리드화한다는 것이다. 구 "에 특이적으로 하이브리드화"는 서열이 복합 혼합물(예를 들어, 전체 세포) DNA 또는 RNA내에 존재할 경우에 엄격한 조건하에 분자가 단지 특유의 뉴클레오티드 서열에 결합하거나, 이중화되거나 하이브리드화됨을 의미한다. "실질적으로 결합"은 프로브 핵산과 표적 핵산간의 상보성 하이브리드화를 의미하고, 하이브리드화 배지의 엄격도를 표적 핵산 서열의 목적하는 검출을 달성하도록 저하시킴으로써 수용할 수 있는 사소한 미스매치를 포함한다.

써던 및 노던 하이브리드화와 같은 핵산 하이브리드화 실험과 관련하여 "엄격한 하이브리드화 조건" 및 "엄격한 하이브리드화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 상이한 환경 파라미터하에서는 상이하다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 상세한 가이드는 문헌[참조: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York]에서 찾아볼 수 있다. 일반적으로는, 고도로 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 융점(T_m)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 전형적으로는, "엄격한 조건"하에 프로브는 이의 표적 서열에 하이브리드화하나, 다른 서열에는 하이브리드화하지 않을 것이다.

T_m은 표적 서열의 50%가 완전하게 매치된 프로브에 하이브리드화하는 온도(한정된 이온 강도 및 pH하에)이다. 매우 엄격한 조건은 특유의 프로브에 대한 T_m과 동일하도록 선택된다. 써던 또는 노던 블롯에서의 필터 상에서 100개 이상의 상보성 잔기를 갖는 상보성 핵산에 대한 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 42℃에서 헤파린 1mg을 함유하는 50% 포름아미드이고, 하이브리드화는 밤새 수행한다. 고도로 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안의 0.15M NaCl 세척이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안의 0.2x SSC 세척이다[SSC 완충액의 기술에 대한 참조: Sambrook, infra]. 종종, 고 엄격도 세척보다 저 엄격도 세척을 선행하여, 배경 프로브 시그널을 제거한다. 예를 들어, 100개 이상의 뉴클레오티드의 이본쇄에 대한 중간 엄격도 세척의 예는 45℃에서 15분 동안의 1x SSC 세척이다. 예를 들어, 100개 이상의 이본쇄에 대한 저 엄격도 세척의 예는 40℃에서 15분 동안의 4-6x SSC 세척이다. 짧은 프로브(예를 들어, 약 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우, 엄격한 조건은 전형적으로는 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M 미만의 Na이온, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0M Na 이온 농도의 염 농도(또는 다른 염)를 포함하고, 온도는 전형적으로는 약 30℃ 이상이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성할 수도 있다. 일반적으로는, 특유의 하이브리드화 검정에서 관련되지 않은 프로브에 대해 관찰된 것보다 2배(또는 그 이상)인 시그널 대 노이즈 비는 특이적 하이브리드화의 검출을 지시한다. 엄격한 조건하에 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은 이들이 암호화하는 단백질이 실질적으로 유사할 경우에 여전히 실질적으로 유사하다. 이는, 예를 들어, 핵산의 복사체가 유전자 암호에 의해 가능하게 된 최대 코돈 축퇴를 이용하여 생성될 경우에 발생한다.

다음은 본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 동종 뉴클레오티드 서열을 동정하기 위해 사용할 수 있는 하이브리드화/세척 조건의 세트의 예이다: 시험 서열을 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM EDTA에서 참조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 50℃에서 2X SSC, 0.1% SDS로 세척, 보다 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM EDTA에서 참조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 50℃에서 1X SSC, 0.1% SDS로 세척, 보다 더 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM EDTA에서 참조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 50℃에서 0.5X SSC, 0.1% SDS로 세척, 바람직하게는 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM EDTA에서 참조 뉴클레오티드에 하이브리드화시키고, 50℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척, 보다 바람직하게는 50℃에서 7%나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM EDTA에서 참조 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화시키고, 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척. 상기 조건하에 하이브리드화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 80개 이상의 염기쌍, 보다 바람직하게는 50개 이상의 염기쌍, 특히 바람직하게는 21개 이상의 염기쌍, 보다 특히 18개 염기쌍을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바람직한 동족체는 아래에 기술된 파라미터를사용하여 측정된 바와 같이 서열 2, 서열 6 또는 서열 8과 45% 이상 상동성인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서, 동족체에 의해 암호화된 아미노산 서열은 트리코테센 내성 활성, 예를 들어, 3-O-아세틸트랜스퍼라제 활성을 갖는다.

용어 "실질적으로 유사한"은 단백질과 관련하여 사용될 경우에, 단백질이, 예를 들어, 폴리펩타이드 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산에서의 변화만이 발생하는 참조 단백질과 실질적으로 동일한 구조와 기능을 갖는 참조 단백질에 상응하는 단백질을 의미한다. 단백질 또는 아미노산 서열에 대해 사용할 경우에, 실질적으로 유사한 단백질 또는 아미노산 서열과 참조 단백질 또는 아미노산 서열간의 상동성 퍼센트는, 디폴트 BLAST 분석 파라미터를 사용하고 아래에 보다 상세히 기술한 바와 같이 측정한 바, 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 한층 더 바람직하게는 99% 이상이다.

본 발명에서 사용되는 폴리펩타이드의 바람직한 동족체는 서열 2, 서열 6 또는 서열 8과 45% 이상 상동성인 아미노산 서열을 갖는 것들을 포함하며, 여기서, 동족체에 의해 암호화된 아미노산 서열은 트리코테센 내성 활성, 예를 들어, 3-O-아세틸트랜스퍼라제 활성을 갖는다.

비교용 핵산 또는 단백질 서열의 최적 정렬은 상기한 바와 같이 및, 예를 들어, 스미스 앤드 워터맨의 로컬 상동성 알고리듬[참조: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)], 니들맨 앤드 운쉬의 상동성 정렬 알고리듬[참조: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], 퍼어슨 앤드 립맨의 유사성 방법에 대한 서치[참조: Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)], 상기 알고리듬의 컴퓨터화 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 육안 검사[일반적 참조: Ausubel et al., infra]에 의해 수행할 수 있다.

서열 상동성 및 서열 유사성의 퍼센트를 측정하기에 적합한 알고리듬의 일례는 문헌[참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]에 기술되어 있는 BLAST 알고리듬이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리듬은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 정렬될 경우 특정의 양의 값을 갖는 한계 점수 T를 정합시키거나 충족시키는, 조회 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 동정함으로써 높은 점수의 서열 쌍(HSP)를 먼저 동정함을 포함한다. T는 이웃 워드 점수 한계로서 칭한다(Altschul et al., 1999). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위해 서치를 개시하는 근원으로서 작용한다. 다음, 워드 히트를 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장시킨다. 누적 점수는, 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M(매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수: 항상 0 초과) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 0 미만)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 점수 기록 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 워드 히트의 각각의 방향으로의 연장은 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성치로부터 X 양만큼 감소할 경우에 중지되거나, 누적 점수는 하나 이상의 음수를 득점하는 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 또는 그 미만에 달하거나, 각각의 서열의 말단에 이른다. BLAST 알고리듬 파라미터 W, T 및 X가 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)을 디폴트로서 워드 길이(W) 11, 기대치(E) 10, 절단치 100, M=5, N=-4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이(W) 3, 기대치(E) 10 및 BLOSUM62 점수 기록 매트릭스를 사용한다[참조: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)].

BLAST 알고리듬은, 서열 상동성의 퍼센트를 계산하는 것 이외에, 또한 2종의 서열간의 통계학적 분석을 수행한다[참조예: Karlin & Altschul, Proc. Nat'l, Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)]. BLAST 알고리듬에 의해 제공되는 유사성의 한 측정치는 가장 작은 합 확률(P(N))이며, 이는 2종의 뉴클레오티드 또는 아미노산간의 매치가 변화에 의해 발생할 수 있는 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산 서열은, 시험 핵산 서열과 참조 핵산 서열과의 비교에서의 가장 작은 합 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에, 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.

2종의 핵산 서열 또는 단백질이 실질적으로 유사하다는 추가의 표시는 제1 핵산이 제2 핵산에 의해 암호화된 단백질과 면역학적으로 상호 반응성이거나, 이에 특이적으로 결합한다는 것이다. 이와 같이, 단백질은 전형적으로 2종의 단백질이 단지 보존적 치환에 의해 상이할 경우에 제2 단백질과 실질적으로 유사하다.

단백질 또는 펩타이드를 언급할 경우에, 구 "항체에 특이적으로 (또는 선택적으로) 결합" 또는 "와 특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응성"은 단백질의 다른 생물학적 제제의 이종 집단의 존재하에서 단백질의 존재를 결정하는 요인인 결합 반응을 의미한다. 이와 같이, 명시된 면역검정 조건하에, 특정화된 항체는 특유의 단백질에 결합하나, 샘플내에 존재하는 다른 단백질에 충분한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에 항체에의 특이적 결합은 특유의 단백질에 대한 이의 특이성에 대해 선택된 항체를 필요로 한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 사용하여 단백질에 대해 생성된 항체를 선택하여, 상기 단백질과는 특이적으로 면역반응성이나 다형성 변이체 이외의 다른 단백질과는 특이적으로 면역반응성이지 않은 항체를 수득할 수 있다. 다양한 면역검정 포맷을 사용하여, 특유의 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역검정, 웨스턴 블롯 또는 면역조직화학을 단백질과 특이적으로 면역반응성인 모노클로날 항체를 선택하는데 통상적으로 사용한다. 특이적 면역반응성을 측정하기 위해 사용할 수 있는 면역검정 포맷 및 조건의 기술에 대해서는, 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York "Harlow and Lane"]을 참조한다. 특이적 또는 선택적 반응은 전형적으로는 2배 이상의 배경 시그널 또는 노이즈, 보다 전형적으로는 10 내지 100배 배경일 것이다.

특유의 핵산 서열의 "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 의미하거나, 핵산 서열이 아미노산 서열을 암호화하지 않을 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 암호의 축퇴로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 제공된 폴리펩타이드를 암호화한다. 예를 들어, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 암호화한다. 이와 같이, 아르기닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈을 암호화된 단백질의 치환없이 기술된 임의의 상응하는 코돈으로 치환할 수 있다. 이러한 핵산 변이체는 "보존적으로 변경된 변이체" 중의 한 종인 "사일런트 변이체"이다. 단백질을 암호화하는 본원에 기술된 모든 핵산 서열은 또한 달리 특기하지 않는 한 모든 가능한 사일런트 변이체를 기술한다. 당해 분야의 숙련가는 핵산내의 각각의 코돈(통상적으로 단지 메티오닌에 대한 코돈인 ATG는 제외)을 표준 기술에 의해 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 단백질을 암호화하는 핵산의 각각의 "사일런트 변이체"는 각각의 기술된 서열에서 함축된다.

또한, 당해 분야의 숙련가는 암호화된 서열내에서 단일 아미노산 또는 적은비율의 아미노산(전형적으로는 5% 미만, 보다 전형적으로는 1% 미만)을 치환하거나, 부가하거나 결실시키는 각각의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이"이며, 여기서, 치환이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시킴을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 목록은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 다음 5종 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 지방족: 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 로이신(L), 이소로이신(I); 방향족: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 황-함유: 메티오닌(M), 시스테인(C); 염기성: 아르기닌(R), 라이신(K), 히스티딘(H); 산성: 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글라타민(Q)[참조: Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]. 또한, 암호화된 서열내에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 치환하거나, 부가하거나 결실시키는 치환, 결실 또는 부가는 또한 "보존적으로 변형된 변이"이다.

"서열"은 핵산 또는 아미노산(예를 들어, 단백질) 각각의 보다 긴 서열의 일부를 포함하는 핵산 또는 아미노산의 서열을 의미한다.

핵산은 추가의 뉴클레오티드(또는 다른 유사체 분자)가 핵산내로 도입될 경우에 "연장"된다. 보다 통상적으로는, 이는 폴리머라제(예를 들어, DNA 폴리머라제), 예를 들어, 핵산의 3' 말단에서 서열을 부가하는 폴리머라제를 사용하여 수행된다.

2종의 핵산은 각각의 2종의 핵산으로부터의 서열을 자손 핵산내에 조합시키는 경우에 "재조합"된다. 2종의 서열은 양쪽 핵산이 재조합용 기질인 경우에 "직접적으로" 재조합된다. 2종의 서열은 당해 서열이 교차 올리고뉴클레오티드와 같은 중간체를 사용하여 재조합되는 경우에 "간접적으로 재조합"된다. 간접 재조합의 경우에, 단지 하나의 서열이 재조합용 실제 기질이고, 어떤 경우에는, 어떠한 서열도 재조합용 기질이 아니다.

2종의 분자, 예를 들어, 리간드 및 수용체간의 "특이적 결합 친화성"은 분자들의 혼합물내에서 한 분자의 다른 분자에 대한 우선적 결합을 의미한다. 분자의 결합은 결합 친화성이 약 1 x 10⁴M^-1내지 약 1 x 10⁶M^-1또는 그 이상인 경우에 특이적인 것으로 간주할 수 있다.

기질: 기질은, 효소가 천연적으로 인식하여, 효소가 천연적으로 이의 기능을 수행하는 생화학적 경로에서의 산물을 이것으로 전환되는 분자이거나, 또한 효소에 의해 인식되어, 천연 발생 반응과 유사한 효소 반응내의 산물로 효소에 의해 전환되는 분자의 변형된 버젼이다.

형질전환: 이종 DNA를 세포, 조직 또는 곤충내로 도입하는 공정. 형질전환된 세포, 조직 또는 곤충은 형질전환 공정의 최종 산물뿐만 아니라, 이의 형질전환 자손도 포함하는 것으로 이해된다.

"형질전환된", "형질전환" 및 "재조합"은 이종 핵산 분자가 도입된 세균 또는 식물과 같은 유기체를 의미한다. 핵산 분자는 숙주의 게놈내로 안정하게 통합시킬 수 있거나, 핵산 분자는 또한 염색체외 분자로서 존재할 수 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가 복제할 수 있다. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 공정뿐만 아니라, 이의 형질전환 자손을 포함하는 것으로 이해된다. "비형질전환된", "비형질전환" 또는 "비재조합" 숙주는 야생형 유기체, 예를 들어, 이종 핵산 분자를 함유하지 않는 세균 또는 식물을 의미한다.

본 발명은 트리코테센 내성 활성을 포함하는 유전자 산물을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 숙주, 특히 형질전환 식물, 식물 조직, 식물 종자 및 식물 세포, 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 트리코테센 내성 활성은 특히 진균 및/또는 식물에 대한 트리코테센의 식물독성을 저하시키거나 억제하는 활성을 의미하고, 본 발명의 특정 양태에 있어서, 트리코테센 내성 활성은 아세테이트를 트리코테센의 C-3 위치로 이동시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 트리코테센 내성 활성을 갖는 유전자 산물, 특히 아세틸트랜스퍼라제 유전자 산물, 보다 특히 3-O-아세틸트랜스퍼라제 유전자 산물, 보다 특히 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제 유전자 산물을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 형질전환 숙주, 특히 형질전환 식물, 식물 조직, 식물 종자 및 식물 세포, 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드의 발현은 RNA의 합성을 포함하고, 노던 블롯 분석에 의해 검출할 수 있다. 특히, 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드의 발현은 본 발명의 이종 뉴클레오티드, 특정 양태에서 서열 1, 서열 5 또는 서열 7로부터 유래된 표지된 프로브를 본 발명의 형질전환 식물로부터 분리된 RNA와 65℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M 인산나트륨 pH 7.0, 1mM EDTA, 10mg/mol BSA내에서 하이브리드화시키고, 65℃에서 0.5% BSA(분획 V), 5% SDS, 40mM 인산나트륨 pH 7.0, 1mM EDTA, 0.25M 염화나트륨, 바람직하게는 65℃에서 1% SDS, 40mM 인산나트륨 pH 7.0, 1mM EDTA, 0.125M 염화나트륨, 및 바람직하게는 65℃에서 1% SDS, 40mM 인산나트륨 pH 7.0, 1mM EDTA로 세척하는 경우에 검출된다.

또한, 본 발명은 트리코테센 내성인, 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 형질전환 식물, 식물 조직, 식물 종자 및 식물 세포에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 트리코테센 내성 식물, 식물 세포, 식물 조직 및 식물 종자는 아래 실시예 7에서 기술한 바와 같이 측정할 수 있는 트리코테센의 존재하에 대사할 수 있는 것들이다. 특정 양태에 있어서, 트리코테센 내성 식물, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자는 특히 아래 실시예 6에서 기술한 바와 같은 검정법으로 측정한 바와 같은, 야생형 대조군에서 천연적으로 발생하는 활성의 배경 수준을 초과하여 포화 기질 수준에서 10nmol 이상의 트리아세톡시시르페놀(이하, "TAS")/mg 단백질/15분 배양의 특이적 효소 활성, 보다 특히 5nmol 이상의 TAS/mg 단백질/15분, 보다 특히 1nmol 이상의 TAS/mg 단백질/15분, 보다 특히 0.8nmol 이상의 TAS/mg 단백질/15분, 보다 특히 0.5nmol 이상의 TAS/mg 단백질/15분, 보다 특히 0.25nmol의 TAS/mg 단백질/15분의 특이적 활성, 보다 특히 0.1nmol의 TAS/mg 단백질/15분의 특이적 활성, 보다 특히 0.05nmol의 TAS/mg 단백질/15분의 특이적 활성, 보다 더 특히 0.01nmol의 TAS/mg 단백질/15분의 특이적 활성을 갖는다.

본 발명의 트리코테센 내성 식물은 트리코테센이 5mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 10mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 15mg/ml 이상, 보다 바람직하게는20mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 25mg/ml 이상의 농도로 존재하는 야생형 대조군으로부터의 종자보다 트리코테센의 존재하에 더 큰 비율로 종자를 발아시키고 뿌리를 형성시키는 것들을 포함한다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 트리코테센 내성 식물은 트리코테센의 존재하에 야생형 대조군의 종자보다 10% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 20% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 30% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 40% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 50% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 60% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 70% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 80% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 90% 이상의 종자를 발아시키고 뿌리를 형성시킨다.

트리코테센은 빈번하게 수개의 상이한 구조 그룹으로 분할된다. 본 발명의 특정 양태는 그룹 A 및 B 트리코테센에 대한 내성을 유출해낸다. 그룹 A 및 B는 푸사리움 트리코테센을 포함하고, 주로 위치 C-8에서의 카보닐 작용성 그룹의 부재(그룹 A) 또는 존재(그룹 B)에 의해 식별된다. 따라서, 그룹 B 트리코테센 DON은 C-8 위치에서 카보닐 그룹을 포함한다.

본 발명은 보다 특히 C-3 하이드록실을 함유하는 트리코테센에 대한 내성을 유출해낸다. 이러한 트리코테센은 T-2 독소, HT-2 독소, 이소트리코데르몰, DAS, 3-데아세틸칼로네크트린, 3,15-디데아세틸칼로네크트린, 시르펜트리올, 네오솔라니올; 15-아세틸데옥시니발레놀, 니발레놀, 4-아세틸니발레놀(푸사레논-X), 4,15-디아세틸니발레놀, 4,7,15-아세틸니발레놀 및 DON, 및 이들의 각종 아세틸화된 유도체를 포함한다.

특정 양태에 있어서, 트리코테센 내성 식물, 이의 세포, 조직 또는 종자는 트리코테센 생산 진균, 특히 푸사리움 속 진균에 대한 내성을 갖는다. 본원에서 사용되는 진균 내성은 진균 접종 후 감염이 개시되지 않음 또는 진균 접종 후에 야생형 대조균과 비교하여 감소된 감염 확산을 의미한다.

바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 진균 내성 형질전환 식물은 곡류 식물이고, 진균 챌린지하에 야생형 대조군과 비교하여 보다 덜 감염된 핵 또는 종자, 야생형 대조군에서 평가된 동일한 수의 핵 또는 종자와 비교하여 감염된 핵 또는 종자의 바람직하게는 10% 이상의 감소, 야생형 대조군에서 평가된 동일한 수의 핵 또는 종자와 비교하여 감염된 핵 또는 종자의 보다 바람직하게는 20% 이상의 감소, 보다 바람직하게는 40% 이상의 감소, 보다 바람직하게는 50% 이상의 감소를 포함한다. 본 발명의 진균 내성 형질전환 곡류 식물은 옥수수, 밀, 보리, 벼 및 귀리를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

밀에서, 이삭에서의 진균 확산은 아래 실시예 9에서 기술한 바와 같이 각각의 접종된 이삭에서 증후성 및 무증후성 잔이삭의 수를 계산하고 증후성인 각각의 이삭에서 잔이삭의 퍼센트를 계산함으로써 평가할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 진균 내성 밀은 진균 챌린지하에 야생형 대조군보다 덜 감염된 잔이삭, 야생형 대조군에서 평가된 동일한 수의 잔이삭과 비교하여 감염된 잔이삭의 바람직하게는 10% 이상의 감소, 야생형 대조군에서 평가된 동일한 수의 잔이삭과 비교하여 감염된 잔이삭의 보다 바람직하게는 20% 이상의 감소, 보다 바람직하게는 40% 이상의 감소, 보다 바람직하게는 50% 이상의 감소를 포함한다.

옥수수에서, 이삭에서 진균 확산은 아래 실시예 9에서 추가로 기술한 바와 같이 감염된 핵의 퍼센트의 육안 추정에 의해 평가할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 진균 내성 옥수수는 진균 챌린지하에 야생형 대조군보다 덜 감염된 핵, 야생형 대조군에서 육안으로 평가된 동일한 수의 이삭에서 감염된 핵의 수와 비교하여 감염된 핵의 바람직하게는 10% 이상의 감소, 야생형 대조군에서 육안으로 평가된 동일한 수의 이삭에서 감염된 핵의 수와 비교하여 감염된 핵의 보다 바람직하게는 20% 이상의 감소, 보다 바람직하게는 40% 이상의 감소, 보다 바람직하게는 50% 이상의 감소를 포함한다. 옥수수에서, 줄기에서 내부 진균 확산은 줄기를 개열하여 변색량을 평가함으로써 육안으로 평가할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 형질전환 옥수수는 야생형 대조군과 비교하여 줄기의 보다 적은 내부 및/또는 외부 변색을 포함한다.

또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 진균 내성 식물은 진균 챌린지의 존재하에 야생형 대조군에서의 발아보다 큰 비율로 종자를 발아시키는 것을 포함한다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 진균 내성 식물은 야생형 대조군으로부터 종자를 발아시키는 것보다 푸사리움의 존재하에 10% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 20% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 30% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 40% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 50% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 60% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 70% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 80% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 90% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 100% 이상의 종자, 보다 바람직하게는 150% 이상의 종자를 발아시키는 것을 포함한다.

또 다른 바람직한 양태에 있어서, 야생형 대조군의 종자보다 적은 마이코톡신, 예를 들어, 트리코테센 오염을 갖는 종자 또는 핵을 생산하는 진균 내성 형질전환 식물을 제공한다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 야생형 대조군보다 10% 이상 적은 트리코테센 오염도, 보다 바람직하게는 20% 이상 적은 트리코테센 오염도, 보다 바람직하게는 30% 이상 적은 트리코테센 오염도, 보다 바람직하게는 40% 이상 적은 트리코테센 오염도, 보다 바람직하게는 50% 이상 적은 트리코테센 오염도, 보다 바람직하게는 60% 이상 적은 트리코테센 오염도, 보다 바람직하게는 70% 이상 적은 트리코테센 오염도, 보다 바람직하게는 80% 이상 적은 트리코테센 오염도를 갖는 농작물, 보다 특히 곡류 식물을 제공한다. 트리코테센 오염도는 아래 실시예 10에서 기술한 바와 같이 측정할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드, 특히 트리코테센 내성을 제공할 수 있는 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 것들, 보다 특히 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 것들을 포함한다. 특정 양태에 있어서, 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드는 진균 기원, 보다 특히 푸사리움, 트리코테시움 및 미로테시움 기원, 보다 특히 푸사리움 종, 예를 들어, 에프. 아쿠미나툼, 에프. 크룩웰렌스, 에프. 쿨모룸, 에프. 에퀴세티, 에프. 그라미네아룸(지베렐라 제애), 에프. 라테리티움, 에프. 포애, 에프. 삼부시눔(지. 푸리카리스) 및 에프. 스포로트리키오이데스로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용되는 이종 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 서열 5 및/또는 서열 7, 및 서열 1, 서열 5 및/또는 서열 7과 유사한 서열을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하여, 식물, 진균 또는 세균 세포와 같은 숙주 세포내에 도입할 수 있다. 일반적으로는, 이는 당해 분야에 공지된 표준 클로닝 과정을 이용하여 폴리뉴클레오티드를, 폴리뉴클레오티드가 이종성인 발현 시스템내로 삽입함을 포함한다. 벡터는 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드를, 벡터를 함유하는 숙주 세포내에서 전사하고 해독하기 위해 필요한 요소를 함유한다. 당해 분야에 공지된 다수의 벡터 시스템, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파아지 바이러스 및 다른 변형된 바이러스를 사용할 수 있다. 발현 시스템의 성분을 또한 변형시켜, 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 절단된 서열, 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 최적화 또는 다른 변형을 이용할 수 있다. 당해 분야에 공지된 발현 시스템을 사용하여, 적합한 조건하에 임의의 농작물 세포를 실제적으로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드를 바람직하게는 숙주 세포 내로 안정하게 형질전환시키고 통합시킬 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드는 자가 복제 벡터 상에 위치한다. 자가 복제 벡터의 예는 바이러스, 특히 제미니 바이러스이다. 형질전환된 세포를 완전한 식물로 재생시켜, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 선택된 형태가 형질전환 식물에서 트리코테센 내성을 제공하도록 할 수 있다.

형질전환 식물내에서 발현되도록 의도된 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 먼저 식물내에서 발현가능한 적합한 프로모터에 뒤따라 발현 카세트내에 어셈블링시킨다. 발현 카세트는 또한 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 필요하거나 선택된 임의의 추가의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 전사 터미네이터, 인트론과 같은 발현을 증강시키기 위한 외인성 서열, 바이탈 서열, 및 유전자 산물을 특이적인 세포기관 및 세포 구획으로 표적화시키도록 의도된 서열을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다음, 이들 발현 카세트를 하기한 식물 형질전환 벡터로 용이하게 전달할 수 있다. 다음은 전형적인 발현 카세트의 다양한 성분의 기술이다.

발현 카세트에서 사용되는 프로모터의 선택은 형질전환된 식물에서의 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드의 공간 및 시간적 발현 패턴을 결정할 것이다. 선택된 프로모터는 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드를 특이적 세포 유형(예를 들어, 잎 표피 세포, 엽육 세포, 뿌리 피질 세포) 또는 특이적 조직 또는 기관(예를 들어, 뿌리, 잎 또는 꽃)내에서 발현시킬 것이고, 선택은 유전자 산물의 축적의 목적하는 위치를 반영할 것이다. 또는, 선택된 프로모터는 다양한 유도 조건하에 유전자의 발현을 구동시킬 수 있다. 프로모터들은 이들의 강도, 즉 전사를 촉진시키는 능력이 상이하다. 사용되는 숙주 세포 시스템에 따라, 당해 분야에 공지된 다수의 적합한 프로모터 중의 하나를 사용할 수 있다. 예를 들어, 구성 발현의 경우에, CaMV 35S 프로모터, 벼 액틴 프로모터 또는 우비퀴틴 프로모터를 사용할 수 있다. 조절가능한 발현의 경우, 담배 또는 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 화학적으로 유도가능한 PR-1 프로모터를 사용할 수 있다(참조예: 미국 특허 제5,689,044).

다양한 전사 터미네이터가 발현 카세트에서 사용하기에 유용하다. 이들은본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드가 미치지 않는 전사의 종료 및 이의 정확한 폴리아데닐화를 초래한다. 적합한 전사 터미네이터는 식물에서 작용을 하는 것으로 공지된 것이고, CaMV 35S 터미네이터, tmI 터미네이터, 노팔린 신타제 터미네이터 및 완두콩 rbcS E9 터미네이터를 포함한다. 이들은 단자엽 및 쌍자엽 식물 둘 다에서 사용할 수 있다.

다수의 서열이 전사 단위 내부로부터 유전자 발현을 증강시키는 것으로 밝혀져 있으며, 이들 서열을 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 함께 사용하여, 형질전환 식물내에서의 이들의 발현을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 다양한 인트론 서열, 예를 들어, 옥수수 AdhI 유전자의 인트론이 특히 단자엽 식물 세포내에서 발현을 증강시키는 것으로 제시되어 있다. 또한, 바이러스로부터 유래된 다수의 비해독된 리더 서열이 또한 발현을 증강시키는 것으로 공지되어 있고, 이들은 쌍자엽 식물 세포내에서 특히 유효하다.

선택된 유전자의 암호화 서열을 임의로 관심의 대상인 작물 종내에서의 최상의 발현을 위해 암호화 서열을 치환함으로써 유전적으로 조작한다. 특히 작물 종내에서의 최상의 발현을 달성하기 위해 암호화 서열을 변형시키는 방법이 익히 공지되어 있다[참조예: Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 (1991); 및 Koziel et al., Bio/technol. 11: 194 (1993); Fennoy and Bailey-Serres. Nucl. Acids Res. 21: 5294-5300 (1993)]. 식물 유전자 및 고등 식물, 녹조류 및 남조류에서의 코돈 이용을 고려함으로써 암호화 서열을 변형하는 방법이 익히 공지되어 있다[참조: Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989),table 4; Campbell and Gowri Plant Physiol. 92: 1-11 (1990)].

유전자 산물을 표적화시키는 다양한 메카니즘이 식물내에 존재하는 것으로 공지되어 있고, 이들 메카니즘의 작용을 조절하는 서열은 다소 상세하게 특성화되어 있다. 예를 들어, 유전자 산물의 엽록체에 대한 표적화를 엽록체 이입 동안 절단되는 각종 단백질의 아미노 말단에서 발견되는 시그널 서열에 의해 조절하여, 성숙한 단백질을 수득한다[참조예: Comai et al. J. Biol. Chem.263: 15104-15109 (1988)]. 다른 유전자 산물을 다른 세포기관, 예를 들어, 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에 위치시킨다[참조예: Unger et al. Plant Molec. Biol.13: 411-418 (1989)]. 이들 산물을 암호화하는 cDNA를 또한 조작하여, DNA 서열에 의해 암호화된 이종 산물의 이들 세포기관에의 표적화를 달성할 수 있다. 또한, DNA 서열에 의해 암호화된 산물의 다른 세포 구획에의 표적화를 유발시키는 서열이 특성화되어 있다. 아미노 말단 서열은 ER, 아포플라스트, 및 호분 세포로부터의 세포외 분비에의 표적화를 초래한다[참조: Koehler & Ho, Plant Cell2: 769-783 (1990)]. 또한, 아미노 말단 서열은 카복시 말단 서열과 함께 유전자 산물의 액포 표적화를 초래한다[참조: Shinshi et al. Plant Molec. Biol.14: 357-368 (1990)]. 상기한 적합한 표적화 서열의 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드에의 융합에 의해, 생성된 산물을 임의의 세포기관 또는 세포 구획에 지시하는 것이 가능하다.

식물 형질전환에 이용가능한 다수의 형질전환 벡터는 식물 형질전환 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 본 발명에 속하는 폴리뉴클레오티드를 임의의 상기 벡터와 함께 사용할 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기법 및 형질전환에 대한 표적 종에 따라 달라질 것이다. 특정 표적 종의 경우, 상이한 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 선택 마커는 카나마이신에 대한 내성을 제공하는 nptII 유전자 및 관련된 항체[참조: Messing & Vierra. Gene19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature304: 184-187 (1983)], 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 bar 유전자[참조: White et al., Nucl. Acids Res18: 1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet79: 625-631 (1990)], 항체 하이그로마이신에 대한 내성을 제공하는 hph 유전자[참조: Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol4: 2929-2931], 메톡트렉세이트에 대한 내성을 제공하는 dhfr 유전자[참조: Bourouis et al., EMBO J.2(7): 1099-1104 (1983)], 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는 EPSPS 유전자[참조: 미국 특허 제4,940,935호 및 제5,188,642호], 만노즈의 존재하에 선택적 대사 이점을 제공하는 포스포만노즈 이소머라제 유전자, manA[참조: 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제5,767,378호 및 Miles & Guest, GENE, 32: 41-48 (1984)], 및 BASTA에 대한 내성을 제공하는 PAT 선택가능한 마커[참조: Sung H. Park et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 34: 117-121 (1998)]를 포함한다.

다수의 벡터가 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하는 형질전환에 이용가능한다. 이들은 전형적으로는 하나 이상의 T-DNA 보더 서열을 보유하고, pBIN19[참조: Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)]와 같은 벡터를 포함한다. 아그로박테리움 형질전환에 적합한 전형적인 벡터는 이원 벡터 pCIB200 및 pCIB2001뿐만 아니라, 이원 벡터 pCIB10, 및 이들의 하이그로마이신 선택 유도체를 포함한다[참조예: 미국 특허 제5,639,949호].

아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환에서 T-DNA 서열에 대한 필요를 회피하고, 결과적으로 이들 서열이 결핍된 벡터를 T-DNA 서열을 함유하는 상기한 것들과 같은 벡터와 함께 이용할 수 있다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기법은 입자 충격법, 원형질체 흡수법(예를 들어, PEG 및 전기천공) 및 미세주사법에 의한 형질전환을 포함한다. 벡터의 선택은 주로 형질전환시킬 종에 대한 바람직한 선택에 결정된다. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 전형적인 벡터는 pCIB3064, pSOG19 및 pSOG35를 포함한다[참조예: 미국 특허 제5,639,949호].

일단 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드가 발현 시스템내로 클로닝되면, 이를 식물 세포내로 형질전환시킨다. 식물의 형질전환 및 재생 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, Ti 플라스미드 벡터가 외래 DNA의 전달뿐만 아니라, 직접 DNA 흡수, 리포좀, 전기천공, 미세주사 및 미세발사에 사용되어 왔다. 또한, 아그로박테리움 속으로부터의 세균을 식물 세포를 형질전환시키는데 사용할 수 있다.

쌍자엽 식물에 대한 형질전환 기법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 아그로박테리움계 기법 및 아그로박테리움을 필요로 하지 않는 기법을 포함한다. 비-아그로박테리움 기법은 외인성 유전자 물질의 원형질체 또는 세포에 의한 직접적 흡수를 포함한다. 이는 PCG 또는 전기천공 매개된 흡수, 입자 충격-매개된 전달 또는 미세주사에 의해 달성될 수 있다. 각각의 경우에, 형질전환된 세포를 당해 분야에 공지된 표준 기법을 이용하여 완전한 식물로 재생시킨다.

대부분의 단자엽 식물 종의 형질전환이 또한 현재 통상적인 것으로 되어 있다. 바람직한 기법은 PEG 또는 전기천공 기법을 이용한 원형질체내로의 직접적인 유전자 전달, 캘러스 조직으로의 입자 충격뿐만 아니라, 아그로박테리움-매개된 형질전환을 포함한다. 표적 조직은 밀 재배 변종 UC703 또는 옥수수 유전자형 CG000526과 같은 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 옥수수의 아그로박테리움-매개된 형질전환은 제WO 98/54961호에 상응하게 공개된, 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허원 제09/089,111호에 기술된 바와 같이 수행할 수 있으며, 보리의 형질전환은 다음과 같은 문헌에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다: 참조: M. Cho, J. Wong, C. Marx, W. Jiang, P. Lemaux and B. Buchanan (1999). 티오레독신 h의 과발현은 보리 알곡에서 전분 탈측쇄 효소(풀라나제)의 증강된 활성을 유도한다[참조: PNAS 96: 14641-14646; S. Zhang, M. Cho, T. Koprek, R. Yun, P. Bregitzer and P. Lemaux(1999)]. 발아된 모종으로부터 유래된 시험관내 발사 분열조직적 배양물을 사용한 귀리(아베나 사티바 엘.: Avena sativa L.) 및 보리(호르데움 불가레 엘.: Hordeum vulgare L.)의 시판용 재배 변종의 유전자 형질전환[참조: Plant Cell Rep. 18: 959-966; P. Bregitzer, S. Harlbert and P. Lemaux (1998)]. 형질전환 보리의 자손에서의 소마클로날 변이[참조: TAG 96: 421-425; M. Cho, W. Jiang and P. Lemaux (1998)]. 재생성의 향상 및 감소된 백화현상을 통한 내성 보리 재배 변종의 형질전환[참조: Plant sci. 138: 229-244; P. Lemaux, M. Cho, S. Zhang, and P. Bregitzer (1998)]. 형질전환 곡류: 호르데움불가레 엘.-현상태 및 차후 예상[참조: Vasil I, Phillips R(eds) Molecular Improvement of Cereal Crops, Kluwer Academic Publ, Dordrecht, The Netherlands, pp 255-316; S. Zhang, R. Williams-Carrier, D. Jackson, and P. Lemaux (1998)]. 옥수수(제아 마이즈 엘: Zea mays L.) 및 보리(호르데움 불가레 엘.)에서 생체내 액생 발사 분열조직 증식 및 부정 발사 분열조직 형성 동안 CDC2Zm 및 KNOTTED1의 발현[참조: Planta 204: 542-549; D. McElroy, J. Louwerse, S. McElroy and P. Lemaux (1997)]. 무손상 보리 조직의 세포에서 Ac/Ds 활성에 대한 단순 일시적 검정법의 전개[참조: Plant J. 11: 157-165; S. Tingay, D. McElroy, R. Kalla, S. Fieg, M. Wang, S. Thornton and R. Brettell (1997)]. 아그로박테리움-매개된 형질전환[참조: The Plant J. 11: 1369-1376; J. Qureshi, Z. Basri, R. Singh, R. Burton, M. Dalton, J. Kollmorgen and G. Fincher. 1988]. 보리(호르데움 불가레 엘.)의 2가지 변종의 아그로박테리움-매개된 형질전환[참조: Proc. 42^nd. Conference of Australian Society for Biochemistry and Molecular Biology, September 28-October 1, 1998, Adelaide, Australia; J. Qureshi, R. Singh, Z. Basri, R. Stewart, R. Burton, J. kollmorgen and G. Fincher(1997)]. 선발된 오스트레일리아산 보리 변종의 유전자 형질변환 방법[참조: Proc. 8th. Aust. Barley Technical symp. Gold Coast, Queensland, 7-12 September 1997. 2:8.9-11; P. Lemaux, M. Cho, J. Louwerse, R. Williams and Y. Wan (1996)]. 보리에 대한 충격-매개된 형질전환 방법[참조: Bio-Rad US/EG Bull 2007; 1-6; T.Koprek, R. Hansch, A. Nerlich, R. Mendel and J. Schulze (1996)]. 조직 반응에 대한 충격 조건의 조정에 의해 수득된 상이한 재배 변종의 수정능 형질전환 보리[참조: Plant Sci. 119: 79-91; T. Hagio, T. hirabayashi, H. Machii and H. Tomutsune(1995)]. 하이그로마이신-내성 마커를 사용한 수정능 형질전환 보리(호르데움 불가레 엘.)의 생산[참조: Plant Cell Rep. 14: 329-334; H. Funatsuki, H. Kuroda, M. Kihara, P. Lazzeri, E. Muller, H. Lorz and I. Kishinami (1995)]. 원형질에의 직접 DNA 전달에 의해 재생된 수정능 형질전환 보리[참조: TAG 91: 707-712; A. Jahne, D. Becker, R. Brettschneider and H. Lorz (1994)]. 형질전환, 소포자-유래된 수정능 보리의 재생[참조: TAG 89: 525-533; Y. Wan and P. Lemaux (1994)]. 다수의 독립적으로 형질전환된 수정능 보리 식물의 재생[참조: Plant Physiol. 104: 37-48]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 나자 식물, 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물의 세포를 포함한 다양한 식물 세포에 트리코테센 내성을 제공할 수 있다. 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 광범위한 부류내에 포함되는 임의의 세포내로 삽입, 예를 들어, 형질전환시킬 수 있음에도 불구하고, 이는 농작물 세포, 예를 들어, 벼, 밀, 보리, 호밀, 옥수수, 귀리, 감자, 사탕 옥수수, 순무, 스쿼시, 펌프킨, 주키니, 멜론, 대두 및 수수에서 특히 유용하다. 식물을 트리코테센 내성으로 만드는, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 생산 및 품질에 중요한 다른 특성과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드를 당해 분야에 공지된 육종 접근법 및 기법을 통해 식물 계통으로 도입할 수 있다.

트리코테센 내성 유전자 대립형질을 농작물 또는 상기 농작물을 재생시킬 수 있는 식물 세포 배양물내로 형질전환시킴으로써 수득할 경우에, 이는 전통적인 육종 기법을 이용하여 시판용 변종으로 이동시켜, 대립형질을 유전적으로 조작하고 이를 식물내로 형질전환시킬 필요없이 트리코테센 내성 작물을 발생시킨다.

다양한 육종 단계는 이종교배할 계통을 선택하거나, 부모 계통의 수분을 지시하거나, 적합한 자손 식물을 선택하는 것과 같은 잘 정의된 사람 중재에 의해 특성화된다. 목적하는 특성에 따라, 상이한 육종 수단을 취한다. 관련된 기법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 잡종 육종, 동계 육종, 역교배 육종, 다계 육종, 품종 블렌드, 이종간 잡종 육종, 이수성 기법 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 잡종 육종 기법은 또한 기계적, 화학적 또는 생화학적 수단에 의해 웅성 또는 자성 불임 식물을 수득하는 식물의 불임화를 포함한다. 웅성 불임 식물의 상이한 계통의 수분으로의 타화 수분은 웅성 불임이나, 자성 가임인 식물의 게놈이 양쪽 부모 계통의 특성을 균일하게 수득할 것임을 보증한다. 이와 같이, 본 발명에 따르는 형질전환 종자 및 식물을 식물, 식물 조직 또는 종자 상에서 진균 성장이 전혀 나타나지 않거나 감소된 개량된 식물 계통의 육종에 사용하여, 상기 식물, 식물 조직 또는 종자의 마이코톡신 오염을 방지하고/하거나 감소시킬 수 있다.

위에서 언급한 형질전환 종자 및 식물내로 조작된 트리코테센 내성은 유성 생식 또는 무성 성장에 의해 전달되어, 자손 식물에서 유지되고 유전될 수 있다. 일반적으로는, 상기 유지 및 유전은 경작, 파종 또는 수확과 같은 특이적 목적에 적합하도록 개발된 공지된 농경법을 이용한다. 성장하는 작물은 해충 또는 감염에의해 유발되는 공격 및 피해를 받기 쉽기 때문에, 식물 질병, 해충, 선충 및 다른 불리한 조건을 방제하는 수단을 취하여, 생산력을 향상시킨다. 이는 토양의 경작 또는 감염된 식물의 제거뿐만 아니라, 살진균제, 배우자불임유기제, 살선충제, 성장 조절제, 성숙 제제 및 살충제와 같은 농약의 살포와 같은 기계적 수단을 포함한다.

종자 생산에 있어서, 종자의 발아 품질 및 균일성은 본질적인 제품 특성인 반면, 농부에 의해 수확되어 판매되는 종자의 발아 품질 및 균일성을 중요하지 않다. 작물을 다른 작물 및 잡초로부터 보호하고, 종자가 매개하는 질환을 방제하고, 우수한 발아 능력을 갖는 종자를 생산하는 것이 어렵기 때문에, 매우 상세하고 잘 정의된 종자 생산 시행법이 순수한 종자의 재배, 컨디셔닝 및 마케팅 분야에서 경험이 있는 종자 생산자에 의해 개발되어 있다. 이와 같이, 농부가 자기 자신의 작물로부터 수확된 종자를 사용하는 대신에 특정한 품질 표준을 충족시키는 보증된 종자를 구입하는 것이 통상적인 관례이다. 종자로서 사용하는 보급 물질은 통상적으로 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들의 혼합물을 포함하는 보호 피복물로 처리된다. 통상적으로 사용되는 보호 피복물은 캅탄, 카르복신, 티람(TMTD^R), 메탈락실(Apron^R) 및 피리미포스-메틸(Actellic^R)과 같은 화합물을 포함한다. 필요한 경우, 이들 화합물을 세균, 진균 또는 동물 유해생물에 의해 유발되는 피해에 대한 보호를 제공하기 위해 제형 분야에서 통상적으로 사용되는 추가의 담체, 계면활성제 또는 도포-촉진 보조제와 함께 제형화시킨다.보호 피복물을 보급 물질을 액체 제형으로 침지시키거나 합한 습윤 또는 무수 제형으로 피복시킴으로써 도포할 수 있다. 싹 또는 과실에서 지시된 처리와 같은 다른 도포 방법이 또한 가능하다.

본 발명의 추가의 국면은 본 발명에 따르는 형질전환 식물, 형질전환 식물 재료 또는 형질전환 종자의 사용을 특징으로 하는 위에서 예시된 방법과 같은 신규한 농경법을 제공하는 것이다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 형질전환 식물로부터 수득된 형질전환 식물 세포, 조직, 기관, 종자 또는 식물 부분에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는 식물의 형질전환 자손뿐만 아니라, 자손으로부터 수득된 형질전환 식물 세포, 조직, 기관, 종자 및 식물 부분이 포함된다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 이종 폴리뉴클레오티드는 또한 형질전환 과정에서 선택가능한 마커로서 사용될 수 있다. 본 국면에 있어서, 숙주 세포는 위에서 예시되고 당해 분야에 공지된 발현 카세트 및 형질전환 기법을 이용하여 관심의 대상인 제2 이종 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 트리코테센 내성 활성을 포함하는 유전자 산물을 암호화하는 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드와 형질전환시킨다. 형질전환 후에, 형질전환된 세포를 트리코테센, 특히 DAS, DON 또는 T-2 독소에 노출될 경우에 생존하는 이의 능력에 대해 선택한다. 숙주 세포는 당해 분야에 공지된 형질전환 및 발현 시스템을 사용하는 진핵 또는 원핵 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 식물 세포, 진균 세포, 세균 세포, 효모 세포, 동물 세포 또는 곤충 세포일 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 양태에 있어서, 트리코테센 내성 활성을 포함하는 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 형질전환법에서 선택가능한 마커로서 사용한다. 예를 들어, 관심의 대상인 하나 이상의 제2 이종 DNA 서열을 발현시키는 식물, 식물 조직, 식물 종자 또는 식물 세포를 또한 형질전환시켜, 서열 2, 서열 6 또는 서열 8의 서열과 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 발현시킬 수 있다. 형질전환된 세포를, 식물독성 트리코테센, 특히 DAS 및/또는 DON 및/또는 T-2 독소를 서열 2, 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 폴리펩타이드를 발현시키지 않는 식물 성장 또는 생존성을 억제하기에 충분한 양으로 함유하는 배지로 전달하는데, 여기서 단지 형질전환된 세포만이 성장하거나 발육이 저해되지 않을 것이다. 서열 2, 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 폴리펩타이드를 발현시키는 식물의 선택에 유용한 트리코테센의 농도는 1 내지 90㎍/ml의 범위이다. 당해 방법은 서열 1, 서열 5 또는 서열 7의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 임의의 식물 세포에 적용가능하고, 관심의 대상인 임의의 이종 DNA 서열과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 제2 이종 DNA 서열 및 이종 폴리뉴클레오티드의 발현을 식물 세포내에서 기능성인 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 의해 구동시킬 수 있다.

서열의 기술:

서열 1은 트리코테센 내성 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 푸사리움 스포로트리키오이데스로부터의 cDNA 서열이다.

서열 2는 서열 1에 의해 암호화된 트리코테센 내성 활성을 갖는 폴리펩타이드이다.

서열 3은 DNA 프라이머이다.

서열 4는 DNA 프라이머이다.

서열 5는 트리코테센 내성 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 푸사리움 그라미네아룸으로부터의 DNA 서열이다.

서열 6은 서열 3에 의해 암호화된 트리코테센 내성 활성을 갖는 폴리펩타이드이다.

서열 7은 트리코테센 내성 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 푸사리움 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 DNA 서열이다.

서열 8은 서열 5에 의해 암호화된 트리코테센 내성 활성을 갖는 폴리펩타이드이다.

서열 9는 pCIB9818의 DNA 서열이다.

서열 10은 pAgroTRIr의 DNA 서열이다.

서열 11은 pNOV1704의 DNA 서열이다.

다음 실시예는 본 발명을 수행하는데 사용되는 재료 및 방법과 후속적인 결과를 추가로 기술한다. 이는 예시로써 제공된 것이며, 이의 열거가 청구된 발명을 한정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

실시예 1: pNOV1700, pCIB9818, pAgroTRIr 및 pNOV1704의 조성

1. pNOV1700

pNOV1700은 1999년 3월 19일에 부다페스트 조약의 조건하에 어그리컬츄럴 리서치 서비스, 페이턴트 컬쳐 컬렉션(Agricultural Research Service, Patent Culture Collection) (NRRL), 노던 레이져널 리서치 센터(Northern Regional Research Center: 미국 일리노이주 61604 페오리아 노던 유니버시티 스트리트 1815 소재)에 기탁되어, 기탁번호 NRRL 제B-30117호를 부여받았다.

따라서, pNOV1700은 엑손 및 인트론의 부분을 포함한 제트. 마이즈(Z. mays) 우비퀴틴 프로모터 및 노팔린 신타제 폴리아데닐화 시그널에 작동적으로 연결된 서열 1을 포함한다.

2. pCIB9818

플라스미드 pCIB9818은 서열 9에 따르는 DNA 서열을 갖는 6111개 염기쌍 원형 플라스미드이다. 염기 869번 내지 1011번의 엑손 및 염기 1047번 내지 1993번의 인트론 부분을 포함한, 서열 9의 염기 12번 내지 1993번의 제트. 마이즈 우비퀴틴 프로모터는 염기쌍 2090번 내지 3193번인 포스페이트 만노즈 이소머라제 선택가능한 마커, 염기 3248번 내지 3355번인 전위된 PEPC 인트론 #9 및 염기 3357번 내지 3434번인 CaMV 35S 유전자의 종료 서열에 작동적으로 연결되어 있다.

3. pAgroTRIr

플라스미드 pAgroTRIr은 서열 10에 따르는 DNA 서열을 갖는 13,737개 염기쌍 원형 이원 벡터이다. 따라서, pAgroTRIr은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) UBI 3 프로모터의 후방에 및 이를 함유하는 프레임내에[참조: S. Norris, S. Meyer, and J. Callus, Plant Molecular Biology 22: 895-906 (1993)] 및 nos 폴리아데닐화 시그널의 전방에 및 이를 함유하는 프레임내에 종료 서열 및 서열 1의 폴리뉴클레오티드 부분에 작동적으로 연결되어 있는 선택가능한 마커를 포함한다.

4. pNOV1704

플라스미드 pNOV1704는 서열 11에 따르는 DNA 서열을 갖는 12949개 염기쌍 원형 이원 벡터이다. 서열 11의 11번 내지 1992번 염기인 제트. 마이즈 우비퀴틴 프로모터(엑손 1: 895번 내지 1010번 및 인트론 1: 1046번 내지 1992번 포함)는 2089번 내지 3192번 염기인 포스페이트 만노즈 이소머라제 선택가능한 마커 서열 및 3557번 내지 3688번의 염기인 노팔린 신타제 종료 서열에 작동적으로 연결되어 있다. pNOV1704은 11234번 내지 12662번의 염기에서 서열 1의 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제 서열 및 12667번 내지 12935번의 nos 종료 서열에 작동적으로 연결되어 있는 9218번 내지 11218번 염기인 제트. 마이즈 우비퀴틴 프로모터(엑손 1: 10110번 내지 10224번 및 인트론 1: 10225번 내지 11218번 포함)를 포함한다.

실시예 2: 밀 형질전환, 선택 및 재생

형질전환

성숙한 접합 배아(0.75-1.25mm)를 표면 멸균된 밀 곡과(10% 클로록스 X 10분)로부터 절단한 다음, 3% 수크로즈, 3mg/ℓ 2,4-D (디클로로페옥시아세트산), 150mg/ℓ 글루타민 및 75mg/ℓ 아스파라긴이 보충되고 0.7% 파이트아가(3MS3S 배지)로 고형화된 MS계 배지[참조: Murashige and Skoog, (1962) Physiol. Plant 15: 473-439] 상에 배반을 플레이팅시킨다. 배아를 충격 전에 28℃에서 5 내지 10일 동안 암배양한다. 충격에 대한 최적 시간은 플레이팅 후 6 내지 7일이다. 충격주기 4시간 전에, 배아를 원형질분리 배지(수크로즈 대신에 15% 말토즈가 첨가된 것을 제외하고는 상기한 바와 동일한 배지) 상에 위치시키고, 착색된 배반을 2.5cm 직경의 환으로 배열한다.

상기 실시예 1에 기술된 pNOV1700을 PvuII 및 XmnI으로 분해하고, 서열 1에 따르는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 우비퀴틴 프로모터 및 NOS 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 4117bp 단편을 분리한다. 또한 상기 실시예 1에 기술된 pCIB9818을 AscI으로 분해하고, UBI 옥수수 프로모터, 선택가능한 마커 및 CaMV 35S 종료 서열을 포함하는 4246bp 단편을 분리한다.

분리된 DNA 단편을 표준 스탠포드(Stanford) 방법을 이용하여 0.3㎛ 금 입자상에 침전시킨다. 연속적으로 와동시키면서, 작제물당 분리된 단편 DNA 5㎍, 2.5M CaCl₂50㎕ 및 0,1M 스페르미딘 20㎕를 50% 글리세롤 50㎕ 및 금 3mg을 함유하는 에펜도르프 튜브에 가한다. DNA/금 혼합물을 2회 에탄올 세척한다. 마지막 세척액으로부터 상등액을 따라버린 후, 에탄올을 가하여, 최종 용적을 70㎕로 한다. 이는 금/DNA의 튜브당 6회 발사를 제공한다. 표적 플레이트를 2회 발사하여, 표적 플레이트당 약 3㎍ DNA(2종의 작제물을 각각 5㎍ 사용할 경우에 이는 통상적인 경우이다) 및 1.0mg 금의 전달을 제공한다. 사용된 파열 압력은 1100psi이다. 충격 후, 표적 플레이트를 밤새 암배양으로 복귀시킨다. 원형질분리한지 약 24시간 후, 배아를 3MS3S로 전달하고, 캘러스 형성을 개시한 후 3주 동안 암배양으로 복귀시킨다. 이 시간 동안 계대배양을 수행하지 않는다.

선택/재생

3주 개시 기간 동안 발생하는 배아발생성 조직을 비-배아발생성 조직으로부터 절단하고, 재생/선택 배지 상에 위치시킨다. 염기성 재생 배지는 2,4-D를 함유하지 않고 1mg/ℓ GA3(지베렐린 A3), NAA(1-나프텔렌아세트산) 및 대신 가해진 NAA를 함유하는 3MS3S(소위 NG 배지)이다. 10g/ℓ 만노즈 및 5g/ℓ 수크로즈를 가한다(NG1M.5S). 조직을 이러한 재생 및 선택의 최초 단계에 2주 동안 적용시킨다. 대부분의 2주 기간 동안, 조직은 명실(light room)에 위치시킨다. 줄기 및 뿌리 발생은 상기 단계 동안 개시되고, 2주 후에 모든 조직은 다음 단계로 전달된다.

만노즈 선택을 이용한 재생 및 선택의 제2 단계의 경우, 만노즈를 5g/ℓ로 감소시키고, 수크로즈를 20g/ℓ로 증가시킨다(MS2S.5M). 조직은 통상적으로 약 4주 동안 상기 배지 상에 정지시키며, 상기 기간 종안 추가의 발사 및 뿌리 발생이 일어난다.

우수한 색을 가지고 왕성하게 성장하는 모종, 및 뿌리 및 줄기 발생을 플레이트로부터 제거하여, GA7's로 불리는 보다 큰 용기내에 위치시킨다. 이는 선택 및 재생의 최종 단계이다. 매지는 단지 1/2MS 염 및 15g/ℓ 만노즈를 함유한다. 식물이 형질전환될 수 있다는 가장 우수한 지표는 배지내에서의 활성 뿌리 성장의 관찰이다. 활성적으로 성장하는 모종으로부터의 잎 조직을 채집하여, 온실로 이전하기 전에 관심의 대상인 유전자 또는 선택가능한 마커 각각에 대해 PCR을 수행한다.

실시예 3: 아라비돕시스 형질전환

상기 실시예 1에 기술된 이원 벡터 pAgroTRIr 작제물을 전기천공[참조: Dower, W.J., Mol. Biol. Rep 1:5 (1987)]에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101[참조: Bechtold, N. et al., CR Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie, 316:1194-1199 (1993)]내로 형질전환시킨다. pAgroTRIr 플라스미드를 YEB + 리팜프신 100 및 카나마이신 100내에 함유하는 GV3101 아그로박테리움의 단일 콜로니로부터의 25ml 배양물을 30℃에서 밤새 배양한다. 동일한 배지 500ml에 소형 배양물 5ml를 접종시킴으로써 대형 배양을 개시하고, 30℃에서 밤새 배양한다. 배양물의600nm에서의 OD를 측정하고, 이어서 배양물을 GSA 로터로 15분 동안 5K에서 스피닝시킨다. 세포를 "1M 개질된 침윤 배지"에 재현탁시켜, 600nm에서의 최종 O.D.를 0.08로 수득한다. 현탁된 세포 ℓ당 실웨트 200㎕를 가한다. 포트당 아라비돕시스 변종 콜럼비아 약 4종의 모종을 볼팅시킨 3개의 포트를 세포 현탁액 약 500ml에 엎어 놓는다. 꽃을 세포 현탁액내에서 진탕시켜, 공기 버블을 제거하고, 모종을 세포 현탁액내에서 15분 동안 배양한다. 돔을 트레이 상에 위치시키고, 모종의 습기를 밤새 유지시킨다.

모종을 약 3주 내지 4주 동안 성장시킨 후, 모종에 1주까지 급수하지 않는다. 종자 깍지를 채집하고, 건조실에서 약 1주일 반 동안 건조시킨다. 종자를 재식하고, 약 2주 동안 성장시킨다. 모종에 선택 제제를 분무한 다음, 2일 후 및 4일 후에 다시 분무한다. 약 3일 후, 생존하는 모종을 새로운 포트에 재식시킬 수 있다.

실시예 4: 옥수수 바이오리스틱 형질전환

I형 배아발생성 캘러스 배양[참조: Green et al 1983, Somatic cell genetic systems in corn. A. Fazelahmad, K. Downey, J. Schultz, RW Voellmy, eds. Advances in Gene Technology: Molecular Genetics of Plants and Animals. Miami Winter Symposium Series, Vol. 20. Academic Press, NY]을 온실 성장된 재료로부터유래된, 길이가 1.5 내지 2.0mm인 성숙한 옥수수 배아로부터 개시한다. 배아를 수분한지 약 14일 후에 표면-멸균된 이삭으로부터 무균적으로 절개한다. 배아를2% 수크로즈 및 5mg/ℓ 클로람벤이 보충된 D 캘러스 개시 배지[참조: Duncan et al. (1985) Planta 165: pp322-332] 상에 위치시킨다. 배아 및 배아발생성 배양물을 후속적으로 암배양한다. 배아발생성 반응물을 약 14일 후에 체외이식편으로부터 절개한다. 반응물을 2% 수크로즈 및 0.5mg/ℓ 2,4-D가 보충된 D 캘러스 유지 배지 상에 위치시킨다. 약 6주 동안의 매주 신선한 유지 배지로의 선택적 계대배양 후, 고품질의 조밀한 배아발생성 배양물을 성취한다. 활성적으로 성장하는 배아발생성 캘러스 단편을 유전자 전달에 대한 표적 조직으로서 선택한다. 캘러스 단편을 유전자 전달 약 4시간 전에 12% 수크로스가 보충된 유지 배지를 함유하는 표적 플레이트 상에 플레이팅시킨다.

캘러스 단편을 표적 플레이트의 중심으로부터 반경 8 내지 10mm의 환으로 배열한다.

상기 실시예 1에 기술된 pNOV1700을 PvuII 및 XmnI으로 분해하고, 서열 1에 따르는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 우비퀴틴 프로모터 및 NOS 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 4117bp 단편을 분리한다. 또한 상기 실시예 1에 기술된 pCIB9818을 AscI으로 분해하고, 마커 유전자, 프로모터 및 종료 시그널을 포함하는 4246bp 단편을 분리한다. 분리된 DNA 단편을 듀퐁 바이오리스틱스(DuPont Biolistics) 매뉴얼에 기술된 금 마이크로캐리어 상에 침전시킨다. 각각의 플라스미드 작제물당 2 내지 3㎍을 각각의 6종 발사 마이크로캐리어 제제에서 사용한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 PDS-1000He 바이오리스틱스 장치를 이용하여 표적 조직 세포로 전달한다. 바이오리스틱스 장치 상에서의 세팅은 다음과 같다: 파열디스크와 매크로캐리어 간격 8mm, 매크로캐리어와 차단 스크린 간격 10mm 및 차단 스크린 및 표적물 간격 7cm. 각각의 표적 플레이트를 650psi 파열 디스크를 이용하여 2회 발사한다. 200 X 200 스테인리스 스틸 메쉬(McMaster-Carr, New Brunswick, NJ)를 차단 스크린과 표적 조직 사이에 위치시킨다. 유전자 전달한지 7일 후에, 표적 조직편을 고 삼투성 배지로부터 선택 배지로 전달한다.

표적 조직을 수크로즈는 함유하지 않고 1% 만노즈를 함유하는 유지 배지 상에 위치시킨다. 3 내지 5주 후에, 성장하는 캘러스 단편을 수크로즈는 함유하지 않고 1.5% 만노즈를 함유하는 유지 배지로 계대배양한다. 선택 배지 상에서 성장하는 배아발생성 캘러스를 캘러스가 충분히 제조되어 10 내지 20개의 모종을 생성시킬 때까지 매 2주마다 계대배양한다. 최초의 표적 조직편으로부터의 조직 생존 선택물을 단일 콜로니로서 계대배양하고, 독립적인 형질전환 이벤트로서 디자인한다. 콜로니를 2% 수크로즈 및 1% 만노즈(MS2S+1M)를 0.25mg/ℓ 안시미돌 및 0.5mg/ℓ 키네틴과 함께 함유하는 개질된 MS 배지[참조: Murashige and Skoog, 1962(1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497]에 전달한다. 2주 후에, 재생 콜로니를 호르몬을 함유하지 않는 MS2S+1M에 전달한다. 모든 콜로니로부터 뿌리를 갖거나 갖지 않는 재생 줄기를 MS3S 배지를 함유하는 마젠타(Magenta) 박스에 전달하고, 뿌리를 갖는 작은 모종을 재생시켜 온실내의 토양에 이전한다.

실시예 5: 형질전환 식물 발현의 분석

형질전환된 식물로부터의 조직을 서열 1의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 존재에 대해 분석한다. DNA를 형질전환된 식물로부터 추출하고, PCR 분석을 표준 프로토콜에 따라 수행한다. 유전자 작제물의 증폭에 사용되는 프라이머는 (5'-acgaatcattcaccgaggag-3')(서열 3) 및 (5'-ctcacactctcaggcttacc-3')(서열 4)이다. 상기 실시예 2에 따라 수득된 밀에서 서열 1의 서열내의 650개 nt 단편을 검출한다.

b. 노던 분석

형질전환된 식물을 노던 블롯 하이브리드화에 의해 RNA의 존재에 대해 분석한다. 노던 블롯 분석을 위해, 식물 조직으로부터 추출한 RNA를 크기 분리하고, 나일론 막 상에서 블롯팅시킨다. 상기 막을 후속적으로 프로브로서 사용되는 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오티드의 429개 nt Styl 단편으로부터 유래된 방사성 프로브와 하이브리드화시킨다. RNA는 상기 실시예 2 및 3에 따라서 형질전환된 밀과 아라비돕시스 식물에서 검출된다.

실시예 6: 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제 활성에 대한 효소 검정

(a) 효소 검정용 식물 조직의 추출: 상기 실시예 2 내지 4에 따라서 형질전환되고 재생된 것들을 포함한 본 발명의 형질전환 식물로부터의 3개의 1 x 1/8in 엽편(약 50mg)을 선택한다.

(b) 유리 비드 밀: 조직을 2ml 환저 튜브에 위치시키고, 캡을 닫는다. 튜브를 액체 질소에 침지시키고, -80℃에서 밤새 배양한다. 튜브를 톱 상에서 24초 동안 진탕시키고, 인산나트륨 완충액 0.4ml를 가한다. 튜브를 약 10초 동안 와동시키고, 얼음 위에 위치시킨다. 튜브를 추가로 5분 동안 와동시킨 다음, 에펜도르프 원심분리기로 5분 동안 14,000rpm에서 스피닝시킨다. 상등액을 제거하고, 투명한 튜브에 위치시킨다.

다음 성분을 혼합한다:

트리코테센 기질, DAS 2㎕(인산나트륨 완충액, pH 7.0 50mM 중의 20% 아세톤). DON을 또한 사용할 수 있다.

아세틸 CoA 기질, [¹⁴C]-아세틸 CoA NEN cat. #NEC313(60mCi/mmol 및 0.02mCi/ml) 2㎕.

완충액, 인산나트륨 완충액 pH 7.0을 함유하는 최종 용적 50㎕.

당해 검정은 하기 효소 제제를 첨가함으로써 개시하고, 이를 30℃에서 15분 동안 배양한다.

효소 제제, 인산나트륨 완충액, pH 7.0 중의 식물 추출물 10㎕.

15분 후에, 에틸 아세테이트 100㎕를 가하고, 튜브를 수초 동안 2회 와동시킨다. 튜브를 에펜도르프 원심분리기로 14,000rpm에서 2분 동안 스피닝시킨다. 에틸 아세테이트 상 50㎕를 제거하고, 신틸레이션 칵테일을 함유하는 바이알에 가한다. 신틸레이션 카운터를 사용하여 튜브를 2분 동안 카운팅한다.

상기 실시예 2에 따라서 수득되고, 0.60 내지 13.4nmol의 아세틸화 생성물/㎍ 단백질/15분 범위의 특이적 활성을 갖는 20개의 별개의 밀 식물을 동정한다. 형질전환된 밀 식물의 특이적 활성은 음성 대조군의 것보다 상당히 크다. 음성 대조군은 0.1 내지 0.2nmol의 아세틸화 생성물/㎍ 단백질/15분의 특이적 활성을 갖는 밀 재배 변종이다.

상기 실시예 3에 따라서 수득되고, 3.8 내지 28nmol의 아세틸화 생성물/㎍ 단백질/15분 범위의 특이적 활성을 갖는 5개의 별개의 아라비돕시스 식물을 동정한다. 형질전환된 식물의 특이적 활성은 음성 대조군의 것보다 상당히 크다. 음성 대조군은 0.1nmol 미만의 아세틸화 생성물/㎍ 단백질/15분의 특이적 활성을 갖는 선택가능한 마커를 발현시키기 위한 핵산 작제물로 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 변종 콜럼비아이다.

상기 실시예 4에 따라 수득되고, 11.1 내지 17.9nmol 미만의 아세틸화 생성물/㎍ 단백질/15분의 특이적 활성을 갖는 2종 이상의 상이한 형질전환체로부터의 옥수수 식물을 동정한다. 형질전환된 식물의 특이적 활성은 음성 대조군의 것보다 상당히 크다. 음성 대조군은 0.2nmol 미만의 아세틸화 생성물/㎍ 단백질/15분의 특이적 활성을 갖는 비-형질전환된 옥수수 유전자형이다.

17 내지 183nmol/㎍/15분 범위의 특이적 활성을 갖는, pNOV1704의 아그로박테리움 매개된 형질전환을 이용하여 수득된 16종의 상이한 형질전환체로부터의 옥수수 식물을 동정한다.

실시예 7: 형질전환 식물내에서의 트리코테센 내성에 대한 생물학적 검정

하기 성분을 갖 CPR 배지 250ml를 제조하고, KOH를 사용하여 pH를 6.5로 조정한다.

½ MS 염 0.54g

½ MS 비타민 1.25ml

수크로즈 1%(선택적) 2.50g

아가로즈를 1%(2.50g)의 농도로 상기 배지에 가한 다음, 배지를 오토클레이빙시킨다. 50mg/ml 클로로페놀 레드 25ml를 오토클레이빙된 배지에 가한다.

배지를 55℃에서 유지시키고, DAS 또는 DON을 각종 농도로 아세톤에 가한다(즉, 1.7ml당 4, 8 또는 16㎕ 10mg/ml 농도의 DON 또는 2, 4 또는 6㎕ 50mg/ml 농도의 DAS). 배지 약 0.5ml를 48웰 미세적정 플레이트에서 각각의 웰에 분획화한다.

1/3 x 1/8in의 형질전환된 식물 조직편을 미세적정 플레이트뿐만 아니라, 비형질전환된 야생형 대조군으로부터의 대조군 조직에 가한다. 엽편을 페트리 디쉬에 놓고, 겸자로 미세적정 플레이트 웰 배지에 밀어낸다. 미세적정 플레이트를 20℃에서 2 내지 4일 동안 명배양한다. 엽편 대사는 적색으로부터 황색으로의 변색(pH 강하)을 유발한다. 형질전환체에 의한 트리코테센 내성 활성 또는 트리코테센에 대한 감소된 감수성은 DAS 또는 DON의 존재에서 황색으로 변색된 웰을 유발시킨다.

적색으로 유지되는 대조군과 비교하여 적색으로부터 황색으로의 변색은 본 발명의 밀 및 옥수수 식물에서 관찰된다. 또한, 각각의 엽편은 상응하는 대조군보다 상당히 적게 퇴록된다.

실시예 8: 발아 검정

A. 트리코테센 내성 발아 검정

본 발명의 형질전환 식물로부터의 종자를 선택 제제로부터 선택적 압력하에 성장시키고 발생된 식물을 자기화시킨다. 발생된 종자를 DAS 또는 DON(20mg/ml로)이 보충된 MS3S 배지(MS 염 4.3g/ℓ, MS 비타민 100X, 수크로즈 30g/ℓ 및 파이트아가 8g/ℓ) 상에 1000 내지 1200개 종자/페트리 디쉬(100mm 직경)의 밀도로 플레이팅시킨다. 4일 동안의 명배양 후에, 플레이트를 모종 성장에 대해 조사한다.

상기 실시예 3에 따라서 수득되고 DAS를 포함하는 배지에서 성장하는 식물로부터의 아라비돕시스 종자는 뿌리 및 줄기 발생을 갖는 다수의 모종을 갖는다. DAS 보충된 배지에서 성장시킬 경우, 대조 종자(모 아라비돕시스 계통, 변종 콜럼비아)는 발아하는 한편, 뿌리는 불량하게 형성되거나 전혀 형성되지 않는다. DAS를 함유하지 않는 동일한 배지에서 성장시킨 형질전환된 종자 및 대조 종자 사이에는 아무런 차이도 발견되지 않는다.

B. 모종 마름병에 대한 내성을 검출하기 위한 진균 내성 발아 검정

1. 밀 진균 내성 발아 검정:

밀에서의 진균 내성 발아 검정을 실질적으로 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[참조: R. H. Proctor, T. M. Hohn, and S. P. McCormick. Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruoption of a trichothecene toxinbiosynthetic gene. Mol. Plant-Microbe Interact. 8(4): 593-601, 1995]에 기술된 바와 같이 수행한다.

접종물은 ml당 1 x 10⁶개 분생자로 물에 희석시킨 에프. 그라미네아룸의 대분생자로 이루어져 있다. 접종물은 백색 및 근 UV 형광하에 7 내지 10일 동안 성장시킨 V-8 쥬스 아가 배양물로부터 대분생자를 세척함으로써 제조한다. 모종 검정에서, 상기 실시예 2로부터의 2종의 상이한 형질전환 밀 이벤트의 종자 및 야생형 대조군을 10% 표백제 및 0.05% 트윈 용액으로 약 15분 동안 세척함으로써 표면 멸균시키고, 멸균 증류수로 5회 세정한다. 종자를 대분생자의 현탁액에 약 10분 동안 침지시킨 다음, 10cm 플라스틱 포트에 함유된 질석에 파종한다(포트당 20개 종자). 파종 전에, 포트를 질석으로 약 ¾ 정도로 충전시키고, 질석의 상부가 젖을 때까지 2-4cm 물에 고정시킨다. 파종 후에, 종자를 추가의 1-2cm 질석으로 도포하고, 포트를 플라스틱 백에 개별적으로 위치시키고, 1주일간 성장실에서 22℃에서 16시간 동안 명배양 및 8시간 동안 암배양한다. 약 1주 후에, 포트를 백으로부터 제거하고, 2주 후에, 각각의 포트로부터 출연한 모종의 수를 카운팅함으로써 질병을 평가한다. 종자를 멸균수에 침지시키고 40개의 종자를 사용하는 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 대조군을 처리한다.

2종의 상이한 식물 이벤트로부터의 종자의 50% 및 43%가 물로 처리된 동일한 형질전환 종자와 비교하여 발아하는 한편, 야생형 대조군의 17%가 물로 처리된 동일한 종자와 비교하여 발아한다.

2. 옥수수 진균 내성 발아 검정:

접종물을 녹두 아가(비등된 녹두로부터의 액으로 제조) 상에서 명암 사이클을 12시간 교대로 25℃에서 에프. 그라미네아룸 배양물로부터 제조한다. 먼저 플레이트를 멸균수로 플러딩시킨 다음, 플레이트를 유리 막대를 이용하여 스크랩핑시킴으로서 포자를 수거한다. 용액을 수집하고, 접종한 날에 포자 농도를 2배 희석된 멸균수로 1 x 10⁶개 포자/ml로 조정한다.

토양, 이탄 및 질석의 멸균 혼합물로 이루어진 토양을 5ℓ 플랫에서 1ml 포자 용액/토양 ℓ로 접종하고, 접종된 토양을 로드당 2분 동안 시멘트 혼합기로 혼합하다. 대조 처리물은 비-감염된 토양으로 이루어져 있다. 플랫을 본 발명의 형질전환 종자 또는 야생형 대조군의 각각의 30개 핵으로 재식시키고, 반포화 토양 조건하에 4주 정도 성장실을 55℉로 유지시킨다. 광 수준을 재식 후 14일 동안 24시간 암 조건 및 재식 후 14 내지 24일 동안 12시간 광 조건으로 한다. 표지된 스테이크를 플랫에 가하여, 플랫을 성장실로 이동시키고, 랜덤화시킨다.

식물 카운트를 출현이 시작되자 마자 개시하고, 모종 출현에서 더 이상 변화가 없을 때까지 매일 또는 격일로 수행한다.

모종 출현의 가시적 변색 및 모잘록병의 증상을 측정하고 사용하여, 야생형 대조군과 비교하여 식물 내성도를 특성화시킨다. 야생형 대조군보다 낮은 모종 출현의 가시적 변색 및/또는 모잘록병을 갖는 식물을 선택한다.

실시예 9: 진균 내성 검정

A. 형질전환 밀 식물의 시험

밀 이삭 마름병 또는 이삭 붉은 곰팡이병은 푸사리움 그라미네아룸(유성생식형: 지베렐라 제애)에 의해 유발된다. 에프. 그라미네아룸 배양물을 V-8 아가 배지(V-8 쥬스로 제조) 또는 녹두 아가(비등된 녹두로부터의 액으로 제조) 상에서 명암 사이클을 12시간 교대로 25℃에서 성장시킨다. 먼저 플레이트를 멸균수로 플러딩시킨 다음, 플레이트를 유리 막대를 이용하여 스크랩핑시킴으로서 포자를 수거한다. 용액을 수집하고, 접종한 날에 포자 농도를 2배 희석된 멸균수로 5 x 10⁴개 포자/ml로 조정한다.

형질전환 식물을 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 획득하고, 대조 식물을 개화 또는 이삭발생할 때까지 온실에서 성장시킨다. 각각의 이삭의 중앙 가까이의 소화의 포엽 및 내영 사이에 접종물 약 20㎕(약 1000개 포자)를 주사함으로써 이삭을 접종시킨다. 몇개의 이삭을 비접종시킨 채로 두거나, 대조군으로서 멸균수를 접종시킨다. 다음, 식물을 성장실로 이동시키고, 고습도하에 21일 정도 배양하거나 식물을 처음에 안개실에서 65 내지 70℉에서 72시간 동안 배양한 다음, 추가의 18일 동안 온실에서 배양한다.

본 발명의 형질전환 식물 및 대조 식물을 또한 포장에서 성장시킬 수 있으며, 여기서 이삭은 분무에 의해 접종시킨다. 질병은 상당하는 수의 형질전환 이삭및 야생형 대조군 이삭 상에서 각각의 접종된 이삭에서 증후성 및 무증후석 잔이삭의 수를 카운팅하고, 이로부터 증후성인 각각의 이삭에서 잔이삭의 퍼센트를 계산함으로써 평가한다. 증상은 대조군 식물과 비교하여 시기상조 백화 및 몇몇 경우에 잔이삭의 괴사로 이루어져 있다. 야생형 대조군보다 적은 증후성 잔이삭을 갖는 식물을 선택한다.

서던 데이터에 따라 서열 1의 상이한 복제수 및 상이한 수의 삽입 부위를 갖는 6종의 상이한 형질전환 식물은 야생형 대조군에 대한 44.75%에 비해 10.40 내지 31.20% 범위의 이삭당 증후성 잔이삭 평균 퍼센트를 가지며, 여기서, 형질전환 식물 및 대조군은 상기한 바와 같이 온실에서 배양한다. 이들 동일한 형질전환 식물은 상기 실시예 6에서 기술한 바와 같이 측정된 효소 활성이 0.874 내지 29.1nm ol/㎍/15분이다.

B. 형질전환 옥수수 식물의 시험

옥수수 이삭 썩음병

옥수수 뿌리 썩음병은 푸사리움 그라미네아룸(유성생식형: 지베렐라 제애)에 의해 유발된다. 에프. 그라미네아룸 배양물을 V-8 아가 배지(V-8 쥬스로 제조) 상에서 명암 사이클을 12시간 교대로 25℃에서 성장시킨다. 먼저 플레이트를 멸균수로 플러딩시킨 다음, 플레이트를 유리 막대를 이용하여 스크랩핑시킴으로서 포자를 수거한다. 용액을 수집하고, 접종한 날에 포자 농도를 2배 희석된 멸균수로 5 x10⁵개 포자/ml로 조정한다. 형질전환 식물 및 대조 식물을 온실 또는 포장에서 성장시킨다. 온실에서 성장시킬 경우, 형질전환 및 대조 식물을 털 출현 후 4 내지 7일까지 온실에서 유지시키고, 이때 2ml 포자 현탁액을 털 채널(껍질 공동 내부 및 옥수수속 위)로 도입한다. 이는 대형 시린지가 부착된 18게이지 스테인리스 스틸 피하 니들을 이용하여 달성한다. 털 채널 접종 이외에, 핵 접종 방법을 또한 사용하여 질병 내성을 검정한다. 핵 접종은 포자 현탁액(약 0.4ml)을 시린지가 부착된 18게이지 니들로 다수회 주사를 통해 4개의 핵 그룹으로 도입함을 포함한다. 질환은 가시적으로 감염된 핵에 대해 접종한지 5 내지 7주 후에 수확된 이삭의 육안 검사에 의해 평가한다. 껍질을 벗긴 이삭에 대한 질병 등급 스케일은 다음과 같이 이삭에 대해 가시적으로 감염된 핵의 퍼센트의 육안 평가를 기준으로 한다: 1은 0%; 2는 1 내지 3%, 3은 4 내지 10%, 4는 11 내지 25%, 5는 26 내지 50%, 6은 51 내지 75%, 7은 76 내지 100%. 야생형 대조군에 비해 가시적으로 감염된 핵의 퍼센트가 낮은 옥수수 식물을 선택한다.

실시예 10: 마이코톡신 오염 검정

샘플을 다음과 같이 마이코톡신 농도 검정용으로 제조한다. 종자를 본 발명의 형질전환 식물로부터 채집하고, 칭량하고, 한데 모은다. 밀 종자를 검정할 경우, 밀 종자를 본 발명의 동일한 형질전환 식물의 이삭으로부터 채집하고, 칭량하고, 한데 모은다. 형질전환 옥수수를 검정할 경우, 옥수수 이삭을 낮은 수분도로건조시키고, 이삭을 손으로 따고, 동일한 형질전환 식물의 이삭으로부터의 핵을 칭량하고, 한데 모은다. 각각의 종자 또는 핵 샘플을 철저하게 혼합하여, 종자의 무작위 분포를 증진시킨다. 종자 또는 핵 샘플 50g을 제분기(예를 들어, 레취(Retsch) 초원심분리 제분기 ZM1형, 제조원: BrinkmanInstruments, Inc., Rexdale, Ontario, Romer Series3 II Mill, Union, Missouri, USA)을 이용하여 미세 분말로 분쇄한다. 다음, DON과 같은 관심의 대상인 마이코톡신의 농도를 상업적으로 구입가능한 시험, 예를 들어, DONtest TAG™ 마이코톡신 시험 시스템(VICAM, LP, 313 Pleasant Street, Watertown, MA 02472)을 이용하여 측정하거나 시판용 분석 컴파니(예를 들어, Romer Kabs, Inc, Union, Missouri, USA 또는 Trilogy Ananytical Laboratory, Inc., Beaufort, Missouri, USA)에 의해 분석한다. 제조업자의 지침서는 분석의 모든 국면에 대해 수반된다. DONtest TAG™ 마이코톡신 시험 시스템의 경우, DON에 대한 최종 형광계 측정을 수행한다. 야생형보다 적은 DON을 갖는 종자 또는 핵을 생산하는 식물을 선택한다.

실시예 11: 선택가능한 마커로서의 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오티드의 사용

A. 진균 세포에서의 선택가능한 마커

아시비야 고시피(Ashbya gossypi)를 갈락토시다제 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 서열 1의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 작제물을 사용하는 표준 진균 형질전환 기법을 이용하여 형질전환시킨다. 형질전환된 세포는 DAS를 1.56ng/ml 내지 196pg/ml의 농도로 포함하는 배지에서 성장하는 반면, 비형질전환된 야생형 진균 세포는 성장하지 않는다.

B. 식물 세포에서의 선택가능한 마커

상기 실시예 3에 따라서 형질전환되었으나, 선택에 적용시키지는 않은 아라비돕시스 식물로부터의 종자를 0, 5 또는 10㎍/ml DAS를 함유하는 0.1% 아가로즈 배지에 플레이팅시킨다. 성장실에서 2주 동안 22℃에서 16시간의 광조건 및 8시간의 암조건하에 배양한 후, 보다 큰 발육이 저해되지 않은 식물을 DAS 플레이트로부터 이식시키고, 상응하는 수를 대조군 플레이트로부터 이식시킨다.

5㎍/ml 플레이트로부터 이식된 아라비돕시스 식물의 잎을 2주 성장 기간 후에 효소 활성에 대해 검정하고, 11종의 발육이 비저해된 식물 중 11종이 실시예 6에 의해 측정된 바와 같이 효소적으로 활성이나, DAS에 의해 선택되지 않은 10종의 식물 중 9종이 동일한 검정에서 음성인 것으로 나타났다. 효소적으로 활성인 하나의 비선택된 식물은 검정된 DAS 선택된 식물 중의 어느 것보다 매우 덜 활성이다.

상기한 양태는 예시적인 것이다. 본 발명의 기술은 당해 분야의 숙련가가 본 발명의 다수의 변형을 소유하도록 할 것이다. 모든 이러한 명백하고 예측가능한 변형은 첨부된 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

Claims

식물 세포내에서 발현되는 유전자 산물을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포로서, 유전자 산물이 트리코테센 내성 활성을 가짐을 특징으로 하는 식물 세포.
제1항의 식물 세포를 포함하는 식물로서, 트리코테센에 대한 내성을 가짐을 특징으로 하는 식물.
제2항에 있어서, C-3 하이드록실 그룹을 포함하는 트리코테센에 대한 내성을 갖는 식물.
제1항에 있어서, 트리코테센, 바람직하게는 C-3 하이드록실 그룹을 포함하는 트리코테센을 생산하는 진균에 대한 내성을 갖는 식물.
제4항에 있어서, 푸사리움(Fusarium), 바람직하게는 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)에 대한 내성을 갖는 식물.
제2항에 있어서, 이종 뉴클레오티드가 미생물 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 효모 또는 진균 폴리뉴클레오티드인 식물.
제6항에 있어서, 진균 폴리뉴클레오티드가 푸사리움 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 푸사리움 그라미네아룸 폴리뉴클레오티드 또는 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides) 폴리뉴클레오티드인 식물.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 서열 1, 서열 5 또는 서열 7과 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 식물.
제8항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 서열 1, 서열 5 또는 서열 7의 핵산 서열을 포함하는 식물.
제8항에 있어서, 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 80개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 80개 이상의 연속적인 염기쌍 부분, 바람직하게는 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 50개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 50개 이상의 연속적인 염기쌍 부분, 보다 바람직하게는 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 21개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 21개 이상의 연속적인 염기쌍 부분 및 가장 바람직하게는 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 18개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 18개의 연속적인 염기쌍 부분을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물.
제10항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 서열 1, 서열 5 또는 서열 7에 제시된 연속적인 18개 염기쌍 부분과 서열에서 동일한 18개의 연속적인 염기쌍 부분을 포함하는 식물.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 트리코테센이 T-2 독소, HT-2 독소, 이소트리코데르몰, 4,15-디아세톡시스크리페놀(DAS), 3-데아세틸칼로네크트린, 3,15-디데아세틸칼로네크트린, 시르펜트리올, 네오솔라니올; B형: 15-아세틸데옥시니발레놀, 니발레놀, 4-아세틸니발레놀(푸사레논-X), 4,15-디아세틸니발레놀, 4,7,15-아세틸니발레놀 및 데옥시니발레놀(DON)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되지만, 바람직하게는 DON 또는 DAS인 식물.
제2항에 있어서, 유전자 산물이 제1항 및 제6항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따르는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 식물.
제13항에 있어서, 유전자 산물이 식물에 트리코테센 내성을 제공하는 단백질, 바람직하게는 아세틸트랜스퍼라제, 특히 3-O-아세틸트랜스퍼라제인 식물.
제14항에 있어서, 유전자 산물이 서열 2, 서열 6 또는 서열 8과 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 폴리펩타이드인 식물.
제2항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 밀, 옥수수, 보리 또는 벼 식물인 식물.
제2항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 식물의 종자.
(a) 식물 세포를 트리코테센에 대한 내성을 증가시키는 유전자 산물을 암호화하는 이종 유전자로 형질전환시키는 단계,

(b) 유전자 산물을 생물학적으로 유의한 수준으로 발현시키는 단계,

(c) 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계 및

(d) 트리코테센에 대한 내성이 증가된 식물을 선택하는 단계를 포함하여, 트리코테센 내성 식물을 제조하는 방법.
제18항에 있어서, 트리코테센 독성 인자를 생산하는 진균의 성장이 감소된 식물을 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 진균이 푸사리움 속인 방법.
제2항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 식물 또는 제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 제조된 식물을 바람직하게는 중간 내지 심각한 진균 감염 지역에서 성장시킴을 포함하여, 식물의 종자를 포함한 식물의 마이코톡신 오염을 방지하는 방법.
제20항에 있어서, 식물이 농작물인 방법.
제2항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 식물 또는 제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 제조된 식물을 바람직하게는 중간 내지 심각한 진균 감염 지역에서 성장시킴을 포함하여, 진균, 바람직하게는 푸사리움 속 진균의 성장을 트리코테센, 바람직하게는 C-3 하이드록실 그룹을 포함하는 트리코테센을 생산하는 식물에서 감소시키고/시키거나 억제하는 방법.
제18항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물이 농작물인 방법.
(a) 식물 세포를 트리코테센에 대한 내성을 증가시키는 유전자 산물을 암호화하는 이종 유전자로 형질전환시키는 단계,

(b) 유전자 산물을 생물학적으로 유의한 수준으로 발현시키는 단계,

(c) 식물 세포를 식물로 재생시키는 단계,

(d) 트리코테센에 대한 내성이 증가된 식물을 선택하는 단계 및

(e) 임의로, 단계(d)에서 수득된 식물을 자가수정시키거나 이계교배시키는 단계를 포함하여, 진균 내성 식물을 제조하는 방법.
제25항에 있어서, 진균이 푸사리움 속인 방법.
제2항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 식물 또는 제25항 또는 제26항에 따르는 방법에 의해 제조된 식물을 자가수정 또는 이계교배시키고, 종자를 채집함을 포함하는 종자 생산 방법으로서, 당해 종자로부터 성장한 식물이 진균 내성임을 특징으로 하는, 종자 생산 방법.
제27항에 있어서, 종자가 푸사리움 속에 속하는 진균에 대한 내성을 갖는 방법.
숙주 세포를 트리코테센 3-O-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 작제물로 형질전환시키는 단계 및

형질전환된 숙주 세포를 트리코테센의 존재하에 성장시키는 단계를 포함하여, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 방법.
제29항에 있어서, 숙주 세포가 식물 세포인 방법.
제30항에 있어서, 숙주 세포가 미생물 숙주 세포인 방법.
제31항에 있어서, 미생물 숙주 세포가 진균 숙주 세포인 방법.
제29항에 있어서, 트리코테센이 T-2 독소, HT-2 독소, 이소트리코데르몰, DAS, 3-데아세틸칼로네크트린, 3,15-디데아세틸칼로네크트린, 시르펜트리올, 네오솔라니올; B형: 15-아세틸데옥시니발레놀, 니발레놀, 4-아세틸니발레놀(푸사레논-X), 4,15-디아세틸니발레놀, 4,7,15-아세틸니발레놀 및 DON으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 수득가능한 트리코테센 내성 식물.
제25항 또는 제26항에 따르는 방법에 의해 수득가능한 진균 내성 식물.
제27항 또는 제28항에 따르는 방법에 의해 수득가능한 식물 종자.