JP2002540787A - マイコトキシンに抵抗性を有する形質転換植物および方法 - Google Patents

マイコトキシンに抵抗性を有する形質転換植物および方法

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Abstract

(57)【要約】 この発明は、そこで遺伝子産物がトリコテセン抵抗性活性を含む植物細胞中で発現されるところの遺伝子産物をコード化する異種ポリヌクレオチドを含む植物細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は、形質転換宿主、特に形質転換植物、特にトリコテセンに抵抗性を有
する形質転換植物、植物組織、種子及び細胞、ならびにこれらを作成し、使用す
る方法に関する。本発明は更に、植物、植物組織、種子及び植物細胞上において
真菌の増殖を阻止および/もしくは低減する方法に関する。本発明は更に、植物
、植物組織もしくは種子のマイコトキシン汚染の阻止および/もしくは低減に関
する。本発明は更に、形質転換プロトコールにおいてトリコテセン類を選択剤と
して使用することに関する。
【0002】 多様な真菌が経済的に重要な農作物の重大な病害生物となっている。更に、真
菌毒素による作物汚染は全世界で主要な農業上の問題である。マイコトキシンは
真菌の有毒代謝物であり、農業生産物中にしばしば見出され、脊椎動物に対して
健康上の問題をもたらすその活性により特徴づけられる。トリコテセン類はフザ
リウム(Fusarium)、トリコテシウム(Trichothecium)、およびミロテシウム(Myro
thecium)属の各種により生産されるセスキテルペン・エポキシド系マイコトキシ
ンであり、真核生物のタンパク質合成の強力な阻害剤として作用する。このよう
なトリコテセン類を生産するフザリウム(Fusarium)属の種としてはF. acuminatu
m、F. crookwellense、F. culmorum、F. equiseti、F. graminearum (Gibberell
a zeae)、F. lateritium、F. poae、F. sambucinum (G.pulicaris)、およびF. s
porotrichioidesが含まれる(Marasas, W.F.O., Nelson, P.E., and Toussoun, T
.A. 1984)。
【0003】 先に記載されているように(A.E. Desjardins and T.M. Hohn, Mycotoxins in
plant pathogenesis. Mol. Plant-Microbe Interact. 10 (2): 147-152, 1997)
、家畜およびヒトにおける急性および慢性の両真菌中毒症は、トリコテセン系マ
イコトキシンを生産するフザリウム(Fusarium)種で汚染されたコムギ、ライムギ
、オオムギ、エンバク、コメおよびトウモロコシの消費と関連づけられてきた。
化学的に純粋なトリコテセンを低用量レベルで用いた実験により、動物の有黴穀
粒中毒症で観察される特徴の多くが再現されており、これらには貧血、免疫抑制
、出血、嘔吐および摂食拒否が含まれる。ヒト集団から得られた歴史的および疫
学的データから、特定の疾患の流行とトリコテセン生産性フザリウム(Fusarium)
種で感染した穀粒の消費との間の関連が指摘されている。特に、ロシアで19世
紀以来発生し、食中毒性無白血球症として知られる致死的疾患の突発は、トリコ
テセンT−2毒素を生産するフザリウム(Fusarium)種で汚染された越年穀粒の消
費と関連づけられてきた。日本では、赤カビ病と呼ばれる同様の疾病の突発がト
リコテセンであるデオキシニバレノール(以後「DON」と呼称)を生産するフザ
リウム(Fusarium)種で汚染された穀粒と関連づけられてきた。インドおよび日本
における最近のヒト疾患突発の原因となった有毒な穀粒のサンプル中にトリコテ
センが検出された。したがって、マイコトキシン汚染を阻止する農学的方法、お
よびマイコトキシン汚染のレベルが低減された作物の必要性が存在する。
【0004】 更に、トリコテセン生産性フザリウム(Fusarium)種は破壊活性を有する病原体
であり広い範囲の植物種を攻撃する。トリコテセン類の急性植物毒性およびそれ
らが植物組織中に存在することは、植物に対するフザリウム(Fusarium)の病因に
これらマイコトキシン類が役割を担っていることをも示唆している。このことは
、マイコトキシンが疾病において役割を担っており、そして、したがってまた、
その植物に対する毒性を低減することにより植物の疾病を阻止もしくは低減し得
ることを暗示している。更に、疾病レベルを低減することにより、植物上のマイ
コトキシン汚染を低減するという追加的利益を、特に植物が禾穀作物である穀粒
においてもたらし得る。
【0005】 トウモロコシ穂腐れ病、腰折病もしくはコムギ頭花立枯病のような植物病害を
制御する種々の方法が用いられてきたが、その有効性の程度は様々である。植物
病害を制御する一つの方法は抗菌性化学物質を作物に撒布することである。この
方法は当業界認識の夥しい問題を有している。一方、より最近の方法は、病害生
物に対する天然の拮抗生物もしくは阻害生物である生物学的制御系(「バイオコ
ントロール」)の使用を伴う。しかしながら、バイオコントロールを広い地域に
適用することは困難であり、これらの生物を処置地域に長期間に亘って留めてお
くことは更に困難である。より最近、遺伝子組換えDNA技術が抗菌性化合物を
発現するクローン化遺伝子を植物細胞中に挿入する機会を提供するようになった
。しかしながら、この技術は周知の天然に存在する抗菌物質に対してやがて微生
物が抵抗性になることに対する懸念を生じさせている。したがって、単一の遺伝
子の翻訳によって直接的に植物細胞で生成される、タンパク質のような天然に存
在する抗菌剤を同定することの必要性が継続して存在する。
【0006】 DONを含む、多数の異なるフザリウム(Fusarium)のトリコテセン類のC3ヒ
ドロキシル基のアセチル化を触媒するトリコテセン3−O−アセチルトランスフ
ェラーゼがFusrium sporotrichioides中で同定されている(S.P. McCormick, N.J
. Alexander, S.C. Trapp, and T.M. Horn。トリコテセン3−O−アセチルトラ
ンスフェラーゼをコード化する遺伝子であり、 Fusarium sporotrichioides から
のTRI101の破壊。 Applied. Environ. Microbiol. 65 (12): 5252-5256,
1999.)。トリコテセンをC3‐OH位でアセチル化することにより脊椎動物およ
び植物における毒性が有意に低減され、その結果反応生成物3‐アセチルデオキ
シバレノール(以下「3ADON」と呼称)が得られる。下記のKimuraらの文献を
参照のこと。
【0007】 Fusrium graminearumおよびFusrium sporotrichioides由来のトリコテセン3
−O−アセチルトランスフェラーゼをコード化する構造遺伝子の配列およびその
他のオルソロガス遺伝子の配列が発表されている。例えば、Kimura et al., Bio
sci. Biotechnol. Biochem., 62 (5) 1033-1036 (1998)およびKimura et al., F
EBS Letters, 435, 163-168 (1998)を参照のこと。更に、トリコテセン3−O−
アセチルトランスフェラーゼをコード化するFusarium sporotrichioides由来の
遺伝子が、フザリウム(Fusarium)に対する抵抗性を増強した植物品種の開発に有
効であろうと推測されている。例えば、Hohn, T.M. et al. Molecular Genetics
of Host-Specific Toxins in Plant Disease, 17-24 (1998)およびKimura et a
l. J. Biological Chemistry, 273 (3) 1654-1661 (1998)を参照のこと。
【0008】 しかしながら、本発明以前には多くの事が不確実であったため、植物にトリコ
テセン3−O−アセチルトランスフェラーゼを発現させることで実際にトリコテ
セン抵抗性を有する植物が得られるか否かについては全く不明であった。例えば
、Fusarium sporotrichioidesの3−O−アセチルトランスフェラーゼで触媒さ
れる反応は可逆的であり、したがってDONのようなトリコテセンから植物細胞
を守ることに失敗したかもしれなかった。また、植物細胞中には3−O−アセチ
ルトランスフェラーゼ活性に対抗して3ADONから有毒なDONを発生させる
エステラーゼがあるか否かも不明確であった。また、反応性生物3ADONの代
謝が植物にどのように作用するのか、例えば、トリコテセン3−O−アセチルト
ランスフェラーゼを導入すると、例えば、植物の持つ天然の病害抵抗機構を阻害
してアセチルトランスフェラーゼによる良い作用を帳消しにすることにより、植
物の成長および発育を変化させるか否か、も不明確であった。また、3ADON
が植物により代謝されて有害作用を有する新規二次代謝物になり得るか否かも不
明確であった。また、侵入する真菌により生産されるDONが効率よく3ADO
Nに変換されたとしても、この変換が病原生物抵抗性を植物に付与するか否かも
不明確であった。上記の事柄は、本発明がなされた時点以前において当業界では
不明確であった事柄のごく一部に過ぎない。
【0009】 植物細胞中で発現される遺伝子産物をコード化する異種ポリヌクレオチドを含
む植物細胞であって、遺伝子産物がトリコテセン抵抗性活性を含む、一個もしく
は複数個の植物細胞を提供することがこの発明の一つの目的である。
【0010】 この発明のもう一つの目的は、植物がトリコテセンに抵抗性を有する、上記植
物細胞を含む植物を提供することである。
【0011】 この発明のもう一つの目的は、トリコテセンがC3−ヒドロキシル基を含む、
トリコテセンに抵抗性を有するこの発明の植物を提供することである。
【0012】 この発明のもう一つの目的は、トリコテセン、好ましくはC3−ヒドロキシル
基を含むトリコテセンを生産する真菌に抵抗性を有するこの発明の植物を提供す
ることである。
【0013】 この発明のもう一つの目的は、フザリウム(Fusarium)、トリコテシウム(Trich
othecium)、もしくはミロテシウム(Myrothecium)に抵抗性を有するこの発明の植
物を提供することである。
【0014】 この発明のもう一つの目的はフザリウム(Fusarium)、特にただし非限定的にFu
sarium graminearum、Fusarium culmorum、Fusarium sporotrichioides、Fusari
um poae、Fusarium sambucinum、Fusarium equiseti、Fusarium acuminatum、Fu
sarium lateritium、およびFusarium pseudograminearumに抵抗性を有するこの
発明の植物を提供することである。
【0015】 この発明のもう一つの目的は、植物がFusarium graminearumに抵抗性を有する
、この発明の植物を提供することである。
【0016】 この発明のもう一つの目的は、植物細胞中で発現される遺伝子産物をコード化
する異種ポリヌクレオチドを含み、その場合遺伝子産物がトリコテセン抵抗活性
をふくみ、その異種ポリヌクレオチドが微生物ポリヌクレオチド、好ましくは酵
母もしくは真菌のポリヌクレオチドである、本発明の植物を提供することである
【0017】 この発明のもう一つの目的は、真菌のポリヌクレオチドがフザリウム(Fusariu
m)のポリヌクレオチド、好ましくはFusarium graminearumもしくはFusarium spo
rotrichioidesのポリヌクレオチドである、この発明の植物を提供することであ
る。
【0018】 この発明のもう一つの目的は、異種ポリヌクレオチドが配列番号1、5もしく
は7の核酸配列と実質的に類似した配列を含む、この発明の植物を提供すること
である。
【0019】 この発明のもう一つの目的は、異種ポリヌクレオチドが配列番号1、5もしく
は7の核酸配列またはそれらの相同配列を含むこの発明の植物を提供することで
ある。
【0020】 この発明のもう一つの目的は、配列番号1、5もしくは7に示された連続的8
0塩基対部分と配列が同一である連続的な少なくとも80塩基対部分、好ましく
は配列番号1、5もしくは7に示された連続的50塩基対部分と配列が同一であ
る連続的な少なくとも50塩基対部分、更に好ましくは配列番号1、5もしくは
7に示された連続的21塩基対部分と配列が同一である連続的な少なくとも21
塩基対部分、および最も好ましくは配列番号1、5もしくは7に示された連続的
18塩基対部分と配列が同一である連続的な18塩基対部分を含む、異種ポリヌ
クレオチドを含むこの発明の植物を提供することである。
【0021】 この発明のもう一つの目的は、T−2毒素、TH−2毒素、イソトリコデルモ
ール、4、15−ジアセトキシスクリペノール(以下「DAS」と呼称)、3−デ
アセチルカロネクトリン、3、15−ジデアセチルカロネクトリン、シルペント
リオール、ネオソラニオール;タイプB:15−アセチルデオキシニバレノール
、ニバレノール、4−アセチルニバレノール(フサレノン‐X)、4、15−ジア
セチルニバレノール、4、7、15−アセチルニバレノール、およびDONから
なるグループから選択されたトリコテセンに抵抗性を有するこの発明の植物を提
供することである。
【0022】 この発明のもう一つの目的は、DASもしくはDONに抵抗性を有するこの発
明の植物を提供することである。
【0023】 この発明のもう一つの目的は、遺伝子産物がこの発明のポリヌクレオチドによ
りコード化されている、この発明の植物を提供することである。
【0024】 この発明のもう一つの目的は、遺伝子産物が3−O−アセチルトランスフェラ
ーゼである、この発明の植物を提供することである。
【0025】 この発明のもう一つの目的は、遺伝子産物が配列番号2、6もしくは8に実質
的に類似した配列を含むポリペプチドである、この発明の植物を提供することで
ある。
【0026】 この発明のもう一つの目的は、この発明のいずれかの植物の種子を提供するこ
とである。
【0027】 この発明のもう一つの目的は、植物がコムギ、トウモロコシもしくはイネであ
る、上記植物のいずれかを提供することである。
【0028】 この発明のもう一つの目的は、 (a)遺伝子産物をコード化する異種遺伝子で植物細胞を形質転換させ、そこでは
遺伝子産物がトリコテセン抵抗性を増強しており; (b)遺伝子産物を生物学的に有意なレベルで発現させ; (c)植物細胞を植物に再生させ;および (d)トリコテセンに対する抵抗性が増強した植物を選抜する、 というステップより成るトリコテセン抵抗性を有する植物を生産する方法を提供
することである。
【0029】 この発明のもう一つの目的は、そこで真菌がトリコテセンを生産し、真菌の増
殖が低減される、植物を選抜するステップを更に含む上記方法を提供することで
ある。
【0030】 この発明のもう一つの目的は、真菌がフザリウム(Fusarium)属である、上記方
法を提供することである。
【0031】 この発明のもう一つの目的は、上記方法に従って得られたトリコテセン抵抗性
を有する植物を提供することである。
【0032】 この発明のもう一つの目的は、上記のこの発明の植物を自家受精もしくは異系
交配させることにより生産され、その場合種子から生育した植物が真菌に対する
抵抗性が増強している、種子を提供することである。
【0033】 この発明のもう一つの目的は、上記のこの発明の植物を、好ましくは作物であ
る植物を、好ましくは中等度から重度の真菌侵襲のある地域において生育させる
ことより成る、植物(植物の種子を含む)のマイコトキシン汚染を防止する方法を
提供することである。
【0034】 この発明のもう一つの目的は、トリコテセン、好ましくはC−3ヒドロキシル
基を有するトリコテセンを生産するこの発明の植物を、好ましくは作物である植
物を、好ましくは中等度から重度の真菌侵襲のある地域において生育させること
より成る、植物上での真菌、好ましくはフザリウム(Fusarium)属真菌の増殖を阻
止する方法を提供することである。
【0035】 この発明のもう一つの目的は、 (a)遺伝子産物をコード化する異種遺伝子で植物細胞を形質転換させ、そこでは
遺伝子産物がトリコテセン抵抗性を増強しており; (b)遺伝子産物を生物学的に有意なレベルで発現させ; (c)植物細胞を植物に再生させ; (d)トリコテセンに対する抵抗性が増強した植物を選抜し;および (e)任意に、ステップ(d)で得られた植物を自家受精もしくは異系交配させる、
というステップから成る、真菌に抵抗性を有する植物を生産する方法を提供する
ことである。
【0036】 この発明のもう一つの目的は、真菌がフザリウム(Fusarium)属である、この方
法を提供することである。
【0037】 この発明のもう一つの目的は、この発明の植物を自家受精もしくは異系交配さ
せることより成る、種子から生育した植物が真菌抵抗性を有する種子の生産法を
提供することである。
【0038】 この発明のもう一つの目的は、種子がフザリウム(Fusarium)属の真菌に抵抗性
を有する上記方法を提供することである。
【0039】 この発明のもう一つの目的は、その方法がトリコテセン3−O−アセチルトラ
ンスフェラーゼをコード化する核酸構築物で宿主を形質転換し、そして形質転換
宿主細胞をトリコテセン選択剤の存在下で生育させることより成る、形質転換宿
主細胞を選抜する方法を提供することである。
【0040】 この発明のもう一つの目的は、宿主細胞が植物細胞もしくは微生物細胞、特に
微生物細胞が真菌細胞である、形質転換宿主細胞を選抜する方法を提供すること
である。
【0041】 この発明のもう一つの目的は、宿主細胞が興味の対象である第二のポリヌクレ
オチドで更に形質転換される、上記宿主細胞を選抜する方法を提供することであ
る。
【0042】 この発明のもう一つの目的は、トリコテセンがT−2毒素、TH−2毒素、イ
ソトリコデルモール、DAS、3−デアセチルカロネクトリン、3、15−ジデ
アセチルカロネクトリン、シルペントリオール、ネオソラニオール;タイプB:
15−アセチルデオキシニバレノール、ニバレノール、4−アセチルニバレノー
ル(フサレノン‐X)、4、15−ジアセチルニバレノール、4、7、15−アセ
チルニバレノール、およびDONからなるグループから選択されたものである、
宿主細胞を選抜する方法を提供することである。
【0043】 この発明のもう一つの目的は、この発明の方法で得られるトリコテセン抵抗性
を有する植物を提供することである。
【0044】 この発明のもう一つの目的は、この発明の方法で得られる真菌抵抗性を有する
植物を提供することである。
【0045】 この発明のもう一つの目的は、この発明の方法で得られる植物種子を提供する
ことである。
【0046】 明確にするために、本明細書で用いられる特定の語句を以下のとおり定義して
示す: 「発現」は、植物における内在性遺伝子もしくは導入遺伝子の転写および/ま
たは翻訳を指す。例えば、アンチセンス構築物の場合、発現はアンチセンスDN
Aの転写のみを指すこともあり得る。
【0047】 調節DNA配列がRNAもしくはタンパク質をコード化するDNA配列と「機
能し得るように結合された」もしくは「関連している」と言うときの「機能し得
るように結合された/関連した」とは、調節DNA配列がコーディングDNA配
列の発現に影響を及ぼすように2個の配列が配置されていることを意味する。
【0048】 ここで用いられる「異種ポリヌクレオチド」もしくは「異種DNA」という語
句は、いずれも遺伝子構築物、天然に存在する核酸分子の天然には存在しない複
数コピーを含む、その中にそれが導入される宿主細胞と天然には関連していない
核酸分子;および非天然核酸分子に機能し得るように結合させた点を異にする相
同核酸分子を意味する。したがって、宿主細胞中の異種遺伝子は、その特定の宿
主細胞に内在性であるが、例えば、DNAシャフリングを用いて修飾されている
遺伝子を含む。即ち、これらの語句は細胞にとって異種もしくは異型であるDN
A断片、または細胞に同型であるが要素が通常には見出されない宿主核酸中の位
置にあるDNA断片を包含する。
【0049】 「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」という語句は、単鎖もしくは2重鎖形
状をしているデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリ
マーを指す。特に限定しない限り、これらの語句はレファレンス核酸と類似の結
合性を持ち天然ヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知
のアナログを含む核酸を包含する。特記しない限り、特定の核酸配列は明示され
た配列のみならず、それの保存的に修飾された変異体(例、縮重コドン置換)およ
び相補的配列をも暗黙に包含するものとする。特に、縮重コドン置換は1個もし
くはそれ以上の選択された(もしくは全ての)コドンの第3位を混合塩基および/
またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることにより達成され
る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J.
Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8
: 91-98 (1994))。「核酸」もしくは「核酸配列」もしくは「ポリヌクレオチド
」という語句はまた遺伝子、cDNAおよび遺伝子でコード化されるmRNAと
も互換的に使用され得る。
【0050】 最も広い意味において、「実質的に類似した」という語句が、ここでヌクレオ
チド配列に関して使用されているとき、それはレファレンスヌクレオチド配列に
対応するヌクレオチド配列を意味し、その場合対応する核酸分子は、レファレン
スヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチドと実質的に同じ構造およ
び機能を有するポリペプチドをコード化し、例えば、その場合ポリペプチド機能
に影響を及ぼすことのないアミノ酸の変化のみが生じている。望ましくは、実質
的に類似した核酸分子は、レファレンスヌクレオチド配列によりコード化される
ポリペプチドをコード化する。「実質的に類似した」という語句は、配列が特定
の細胞、例えば、植物細胞における発現を至適化するよう修飾された核酸分子を
含むことを特に意図している。実質的に類似したヌクレオチド配列とレファレン
スヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージは、望ましくは少なくとも45%
、さらに望ましくは少なくとも65%、さらに望ましくは少なくとも75%、好
ましくは少なくとも85%、更に好ましくは少なくとも95%、より更に好まし
くは少なくとも99%である。少なくとも50残基の長さの配列の領域に亘って
同一性のパーセンテージが存在するのが好ましく、少なくとも100残基の長さ
の配列の領域に亘って存在するのがより好ましく、少なくとも150残基の長さ
の配列の領域に亘って配列が実質的に類似していることが最も好ましい。最も好
ましい態様では、配列はコーディング領域の全長に亘って実質的に類似している
。配列の比較はスミス−ウォーターマン配列アラインメントアルゴリズムを用い
て実行することができるが、より詳細については以下に記載されている(例えば
、Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences
and genomes. Chapman & Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0、もしくはh
ttp://www-hto.usc.edu/software/segaln/index.html)。ローカルSプログラム
、バージョン1.16を以下のパラメーターを用いて使用する:マッチ:1、ミ
スマッチペナルティー:0.33、オープンーギャップペナルティー:2、イク
ステンデッドギャップペナルティー:2。
【0051】 核酸配列がこの発明の実質的に類似した核酸であることを示すもう一つの指標
は、それが厳格な条件下でこの発明の核酸分子とハイブリダイズすることである
。「へ特にハイブリダイズする」という語句は、複雑な混合(例えば、全細胞)D
NAもしくはRNA中に特別なヌクレオチド配列が存在する場合、その配列のみ
に分子が厳格な条件下で結合、二本鎖形成、もしくはハイブリダイズすることを
指す。「実質的に結合する」とは、プローブとなる核酸と標的核酸との間におけ
る相補的なハイブリダイゼーションを指し、そして標的核酸配列を所望どおりに
検出できるようハイブリダイゼーション用媒地の厳格度を低減することにより対
応できる軽度のミスマッチを包含する。
【0052】 サザンおよびノザンハイブリダーゼーションのような核酸ハイブダイゼーショ
ン実験に関連して用いられる「厳格なハイブリダイゼーション条件」および「厳
格なハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメ
ーターの下では異なってくる。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイ
ズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な指針は、Tijssen (199
3) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridiza
tion with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 「ハイブリダイゼーション
の原理および核酸プローブアッセイの戦略の概要」Elsevier, New Yorkに記載さ
れている。一般に、高度に厳格なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、所
定のイオン強度およびpHにおいて特定の配列の融解温度(Tm)より約5℃低い
ように選択される。典型的には、「厳格な条件」下ではプローブはその標的サブ
配列とハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしないであろう。
【0053】 Tmは目標配列が完全にマッチしたプローブと50%ハイブリダイズする温度
(所定のイオン強度およびpHで)である。非常に厳格な条件は、特定のプローブ
のTmと等しくなるように選択される。100個以上の相補的残基を有する相補
的核酸の、サザンもしくはノザンブロットのフィルター上での厳格なハイブリダ
イゼーション条件の一例は、1mgヘパリン含有50%ホルムアミド中42℃で
ハイブリダイゼーションを一夜行うことである。高度に厳格な洗浄条件の一例は
、0.15M NaClによる約15分間である。厳格な洗浄条件の一例は、0.
2xSSCによる65℃、15分間である(SSC緩衝液の記載については上記S
ambrook参照のこと)。しばしば、高厳格度の洗浄の前に低厳格度の洗浄によりバ
ックグラウンドのプローブシグナルを除去する。二本鎖、例えば、100ヌクレ
オチドより多い二本鎖の中厳格度洗浄の一例は、1xSSCによる45℃、15
分間である。二本鎖、例えば、100ヌクレオチドより多い二本鎖の低厳格度洗
浄の一例は、4−6xSSCによる45℃、15分間である。短いプローブ(例
、約10〜50ヌクレオチド)では、厳格な条件は典型的には約1.0M Naイ
オン未満の塩濃度、典型的にはpH7.0〜8.3で約0.01〜1.0MのNaイ
オン濃度(もしくは他の塩)を伴い、温度は典型的には少なくとも約30℃である
。厳格な条件はまた、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成さ
れる。一般に、特定のハイブリダイゼーション・アッセイにおいて無関係のプロ
ーブについて観察されるものより2倍(もしくはそれ以上)のシグナル−ノイズ比
は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。厳格な条件下で互いにハイブ
リダイズしない核酸は、もしそれらがコード化するタンパク質が実質的に類似し
ているならば、やはり実質的に類似している。これは、例えば、核酸のコピーが
遺伝子コードについて許容される最大のコドン縮重を用いて創られるときに起こ
る。
【0054】 以下は本発明のレファレンスヌクレオチド配列と実質的に類似している相同ヌ
クレオチドの同定に用いることができるハイブリダイゼーション/洗浄の条件の
セットの例である:7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO
4、1mM EDTA中50℃でハイブリダイズし2xSSC、0.1%SDS
中50℃で洗浄、より望ましくは7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5
M NaPO4、1mM EDTA中50℃でハイブリダイズし1XSSC、0
.1%SDS中50℃で洗浄、更に望ましくは7%ドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃でハイブリダイズし0.
5XSSC、0.1%SDS中50℃で洗浄、好ましくは7%ドデシル硫酸ナト
リウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中50℃でハイブリ
ダイズし0.1XSSC、0.1%SDS中50℃で洗浄、より好ましくは7%ド
デシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中5
0℃でハイブリダイズし0.1XSSC、0.1%SDS中65℃で洗浄により、
レファレンスヌクオチド配列にハイブリダイズする被検配列。上記条件下でハイ
ブリダイズする本発明のポリヌクレオチドは好ましくは少なくとも80塩基対を
含み、より好ましくは少なくとも50塩基対を含み、そして特に少なくとも21
塩基対を含み、より特には18塩基対を含む。この発明において好ましく用いら
れるホモログは、以下に記載するパラメーターを用いた測定により配列番号2、
6もしくは8と少なくとも45%同一なアミノ酸配列をコード化する核酸分子を
含み、この場合ホモログによりコード化されるアミノ酸配列はトリコテセン抵抗
活性、例えば、3−O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する。
【0055】 「実質的に類似した」という語が、ここでタンパク質に関して使用されている
場合、それはレファレンスタンパク質に対応するタンパク質を意味し、その場合
タンパク質はレファレンスタンパク質と実質的に同じ構造および機能を有してお
り、例えば、その場合ポリペプチド機能に影響を及ぼすことの無いアミノ酸の変
化のみが生じる。タンパク質もしくはアミノ酸配列に使用されているとき、実質
的に類似したタンパク質もしくはアミノ酸配列およびレファレンスタンパク質も
しくはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、デフォルトのBLAST分析
パラメーターを用い、下記に詳述するように、望ましくは少なくとも45%の同
一性、更に望ましくは少なくとも65%、更に望ましくは少なくとも75%、好
ましくは少なくとも85%、更に好ましくは少なくとも90%、なお更に好まし
くは少なくとも95%、それよりなお更に好ましくは少なくとも99%である。
【0056】 本発明で使用されるポリペプチドの好ましいホモログは、配列番号2、6もし
くは8と少なくとも45%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、そ
の場合ホモログによりコード化されるアミノ酸配列はトリコテセン抵抗活性、例
えば、3−O−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する。
【0057】 核酸もしくはタンパク質の配列を比較するための至適アラインメントは上述の
方法で、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的
ホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 44
3 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman
, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性検索法によって、これ
らのアルゴリズムのコンピューターによる実施(the Wisconsin Genetics Softwa
re Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI中のG
AP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)により、もしくは目
視検査(一般的方法については前出Ausubelら参照)により実施することができる
【0058】 配列同一性のパーセンテージおよび配列類似性の測定に適したアルゴリズムの
一例はBLASTアルゴリズムであり、これはAltschul et al., J. Mol. Biol.
215: 403-410 (1990)に記載されている。BLAST分析実施用ソフトウエアは
国立バイオテクノロジー・インフォーメーション・センターを通して一般に公開
され利用できる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムではまず、
データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントさせたときに、或る正
数の閾値スコアTにマッチするかそれを満足する検索配列中の長さWの短いワー
ドを同定することにより、ハイスコアを示す配列対(HSP)を同定することを伴
う。Tは近接ワードスコア閾値と呼ばれる(Atshul et al., 1990)。これら最初
の近接ワードヒットが、それらを含有するより長いHSPを探す検索を開始する
ためのシードとして働く。次いでワードヒットを各配列に沿って両方向に累積ア
ラインメントスコアが増加する限り伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配
列についてはパラメーターM(マッチした残基対に対する報償スコア;常に>0)
およびN(ミスマッチした残基対に対する懲罰スコア;常に<0)を用いて計算す
る。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを
計算する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその
達成した最大値よりXだけ低下したとき、1個もしくはそれ以上の負のスコアの
残基アラインメントの累積により累積スコアがゼロもしくはそれ以下になったと
き、またはいずれかの配列の末端に達したとき、停止する。BLASTアルゴリ
ズムのパラメーターW、T、およびXはアラインメントの感度および速度を決定
する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)ではデフォルトでワードの
長さ(W)を11、期待値(E)を10、カットオフを100、M=5、N=−4、
および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTNプログラム
ではデフォルトでワードの長さ(W)を3、期待値(E)を10、およびBLOSU
M62スコアリングマトリックスを用いる(Henikoff & Henifoff, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)参照) 。
【0059】 配列同一性のパーセンテージ計算に加えて、BLASTアルゴリズムは2個の
配列間の類似性の統計解析をも実施する(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Na
t'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)参照)。BLASTアルゴリズムで
提供される類似性の一つの指標は最小合計確率(P(N))であり、これは2個のヌ
クレオチドもしくはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を与える
。例えば、被検核酸配列をレファレンス核酸配列と比較した場合の最小合計確率
が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.0001
未満ならば、被検核酸配列はレファレンス配列と類似であると考えられる。
【0060】 2個の核酸配列もしくはタンパク質が実質的に類似していることの更なる指標
は、1番目の核酸によりコード化されるタンパク質が2番目の核酸によりコード
化されるタンパク質と免疫学的に交差反応するか、またはこれと特異的に結合す
ることである。したがって、2個のタンパク質が例えば同類置換においてのみ異
なっている場合には、タンパク質は2番目のタンパク質と一般に実質的に類似し
ている。
【0061】 「抗体に特異的に(もしくは選択的に)結合する」または「と特異的に(もしく
は選択的に)免疫反応性を有する」という語句は、タンパク質もしくはペプチド
について言及するとき、タンパク質および他の生物学的物質の不均一集団の存在
下でそのタンパク質が存在することを確定的に示す結合反応を指す。すなわち、
所定のイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は特定のタンパク質に結合し、試料
中の他のタンパク質には有意量での結合をしない。そのような条件下での抗体と
の特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性で選択した抗体が必要であ
ろう。例えば、本発明の核酸配列のいずれかによってコード化されるアミノ酸配
列を持つタンパク質に対して作成した抗体を選択して、そのタンパク質と特異的
に免疫反応性を有し、多型性変異体を除けば他のタンパク質とは反応しない抗体
を選択することができる。特定タンパク質と特異的に免疫反応性を有する抗体を
選別するために各種のイムノアッセイフォーマットを用いることができる。例え
ば、固相ELISAイムノアッセイ、ウエスタンブロット、もしくは免疫組織化
学はタンパク質と特異的に免疫反応性を有するモノクローナル抗体を選別するた
めに日常的に用いられている。イムノアッセイフォーマットの記載および特異的
免疫反応活性の測定に用いられる条件についてはHarlow and Lane (1988) Antib
odies, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York "H
arlow and Lane"を参照のこと。典型的には、特異的もしくは選択的反応はバッ
クグラウンドのシグナル即ちノイズの少なくとも2倍であり、より典型的にはバ
ックグラウンドの10〜100倍である。
【0062】 特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異体」とは、同一のもしくは本質的
に同一のアミノ酸配列をコード化する核酸配列を指し、あるいは核酸配列がアミ
ノ酸配列をコード化しない場合には本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの
縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が如何なる与えられたポリペプチド
であってもコード化する。例えば、コドンCGT、CGC、CGA、CGG、A
GA、およびAGGは全てアミノ酸アルギニンをコード化する。したがって、ア
ルギニンがコドンによって特定されている全ての位置で、コード化されたタンパ
ク質を変えることなく上記の対応コドンのいずれにでも変更することができる。
そのような核酸の変異体は「サイレント変異体」であり「保存的に修飾された変
異体」の一種である。ここに記載され、タンパク質をコード化する全ての核酸配
列はまた、特記しない限り、全ての可能なサイレント変異体について記載するも
のとする。核酸中の各コドン(通常メチオニンをコード化する唯一のコドンであ
るATGを除く)は標準的な技法により機能的に同一の分子を生成するように修
飾できることを当業者は認識するであろう。したがって、タンパク質をコード化
する核酸の各「サイレント変異体」は各々記載された配列に暗示的である。
【0063】 更に、コード化された配列中の個々のアミノ酸もしくは低パーセンテージのア
ミノ酸(典型的には5%未満、より典型的には1%未満)を変化、付加もしくは欠
失させる個々の置換、欠失または付加は、変化が化学的に類似なアミノ酸での置
換を結果としてもたらす場合、「保存的に修飾された変異」であることを当業者
は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表は当業界で
は周知である。以下の5群の各々は互いに同類置換であるアミノ酸を含んでいる
:脂肪族アミノ酸:グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、
イソロイシン(I);芳香属アミノ酸:フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、ト
リプトファン(W);含硫アミノ酸:メチオニン(M)、システイン(C);塩基性ア
ミノ酸:アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H);酸性アミノ酸:アスパ
ラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)。Creigh
ton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Companyも参照のこと。加えて、コー
ド化された配列中の個々のアミノ酸もしくは低パーセンテージのアミノ酸を変化
、付加もしくは欠失させる個々の置換、欠失もしくは付加も「保存的に修飾され
た変異」である。
【0064】 「サブ配列」はそれぞれより長い核酸もしくはアミノ酸(例、タンパク質)の一
部より成る核酸もしくはアミノ酸の配列を指す。
【0065】 核酸に追加的ヌクレオチド(もしくは他の類似分子)が取り込まれたとき、核酸
は「伸長された」という。最も一般的には、これはポリメラーゼ(例、DNAポ
リメラーゼ)、例えば、核酸の3’末端に配列を付加するポリメラーゼにより行
われる。
【0066】 2個の核酸の各々の配列が後代核酸中で結合している場合に、2個の核酸は「
組換えを起こした」という。両核酸が組換えの基質の場合には、2個の核酸は「
直接」組換えを起こしたという。交差オリゴヌクレオチドのような中間体を用い
て配列が組換えられる場合には、「間接的組換え」を起こしたという。間接的組
換えの場合には、組換えの実際の基質となるのは配列のうちの多くて1個であり
、場合によってはいずれの配列も組換えの基質にならない。
【0067】 2個の分子、例えば、リガンドと受容体の間の「特異的結合親和性」とは、分
子の混合物中で一つの分子が他の分子と優先的に結合することを指す。分子の結
合は、結合親和性が約1×10−1から約1×10−1もしくはそれ以
上の場合に特異的であると考えることができる。
【0068】 基質:基質は酵素が自然に認識し、そこで酵素が自然にその機能を発揮する生
化学的経路上で生成物に変換する分子、もしくは酵素により同様に認識され、酵
素により天然に起こる反応に類似の酵素反応で生成物に変換される修飾された分
子である。
【0069】 形質転換:異種DNAを細胞、組織、もしくは昆虫に導入する過程。形質転換
された細胞、組織、もしくは昆虫は形質転換過程の最終生成物のみでなくその形
質転換子孫をも包含すると解釈される。
【0070】 「形質転換された」、「形質転換した」、および「組換え体」は、その中に異
種核酸分子が導入された細菌もしくは植物のような宿主生物を指す。核酸分子は
宿主のゲノム中に安定的に組み込むことができ、もしくは核酸分子は染色体外分
子としても存在することができる。そのような染色体外分子は自律複製可能であ
ることができる。形質転換細胞、組織、もしくは植物は形質転換過程の最終生成
物のみでなくその形質転換子孫をも包含すると解釈される。“非形質転換”、“
形質転換されていない”、もしくは“非組換え体”は、野生型生物、例えば、異
種核酸分子を含有しない細菌もしくは植物を指す。
【0071】 本発明は、形質転換宿主、特に遺伝子産物をコード化する異種ポリペプチドを
含み、その遺伝子産物がトリコテセン抵抗活性を有する形質転換された植物、植
物組織、植物種子、および植物細胞、ならびにそれらの作成および使用に関する
。ここで用いられるトリコテセン抵抗活性は特に真菌および/もしくは植物にお
いてトリコテセンの植物毒性を低減もしくは阻止する活性を指し、この発明の特
別な態様では、トリコテセン抵抗活性とは酢酸エステルをトリコテセンのC−3
位に移動させる活性を指す。
【0072】 本発明は更に、形質転換宿主、特に遺伝子産物をコード化する異種ポリペプチ
ドを発現し、その遺伝子産物がトリコテセン抵抗活性を有するものである、特に
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子産物、より特には3−O−アセチルトランス
フェラーゼ遺伝子産物、更に特にはトリコテセン3−O−アセチルトランスフェ
ラーゼである形質転換された植物、植物組織、植物種子、および植物細胞、なら
びにそれらの作成および使用に関する。この発明の異種ポリヌクレオチドの発現
はRNA合成を含み、ノザンブロット分析により検出できる。特に、この発明の
異種ポリヌクレオチドの発現は検出することができ、その場合この発明の異種ヌ
クレオチドに、特別の態様では配列番号1、5もしくは7に、由来する標識プロ
ーブがこの発明の形質転換植物から単離されたRNAと7%ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)、0.5Mリン酸ナトリウム pH7.0、1mM EDTA、10
mg/mlBSA中65℃でハイブリダイズし、0.5%BSA(画分V)、5%
SDS、40mMリン酸ナトリウム pH7.0、1mM EDTA、0.25M
塩化ナトリウム中65℃で、好ましくは1% SDS、40mMリン酸ナトリウ
ム pH7.0、1mM EDTA、.125M塩化ナトリウム中65℃で、また
好ましくは1%SDS、40mMリン酸ナトリウム pH7.0、1mM ED
TA中65℃で洗浄される。
【0073】 本発明は更に、この発明の異種ポリヌクレオチドを発現する、形質転換された
植物、植物組織、植物種子、および植物細胞に関し、この場合この植物、植物組
織、植物種子、および植物細胞はトリコテセン抵抗性を有する。ここで用いる限
りでは、トリコテセン抵抗性を有する植物、植物細胞、植物組織および植物種子
はトリコテセン存在下での代謝が可能なものであるが、これは下記の実施例7記
載の方法で測定され得る。特別の態様では、トリコテセン抵抗性を有する植物、
植物組織、植物細胞および植物種子は、特に下記実施例6記載のアッセイで測定
すると、飽和基質濃度で少なくとも10nmolトリアセトキシシルペノール(
以下「TAS」と呼称)/マイクログムタンパク質/15分インキュベーション
の酵素比活性、より特には少なくとも5nmolTAS/マイクログムタンパク
質/15分の酵素比活性、より特には少なくとも1nmolTAS/マイクログ
ムタンパク質/15分の酵素比活性、より特には少なくとも0.8nmolTA
S/マイクログムタンパク質/15分の酵素比活性、より特には少なくとも0.
5molTAS/マイクログムタンパク質/15分の酵素比活性、より特には0
.25nmolTAS/マイクログムタンパク質/15分の酵素比活性、より特
には0.1nmolTAS/マイクログムタンパク質/15分の酵素比活性、よ
り特には0.05nmolTAS/マイクログムタンパク質/15分の酵素比活
性、更により特には0.001nmolTAS/マイクログムタンパク質/15
分の酵素比活性を野生型コントロールで自然に見られる活性のバックグラウンド
レベルを差し引いた値として有している。
【0074】 この発明のトリコテセン抵抗性を有する植物は、野生型コントロール由来の種
子より多くのパーセンテージの種子がトリコテセン存在下において発芽し根を形
成する植物を含むが、この場合トリコテセンは、少なくとも5マイクログラム/
ml、より好ましくは少なくとも10マイクログラム/ml、より好ましくは少
なくとも15マイクログラム/ml、より好ましくは少なくとも20マイクログ
ラム/ml、およびより好ましくは少なくとも25マイクログラム/mlの濃度
で存在する。特に好ましい態様では、この発明のトリコテセン抵抗性を有する植
物は、野生型コントロールの種子よりも少なくとも10%多数の種子、より好ま
しくは少なくとも20%多数の種子、より好ましくは少なくとも30%多数の種
子、より好ましくは少なくとも40%多数の種子、より好ましくは少なくとも5
0%多数の種子、より好ましくは少なくとも60%多数の種子、より好ましくは
少なくとも70%多数の種子、より好ましくは少なくとも80%多数の種子、よ
り好ましくは少なくとも90%多数の種子がトリコテセン存在下に発芽し根を形
成する植物を含む。
【0075】 トリコテセンはしばしば幾つかの異なる構造群に分類される。本発明の特別な
態様はA群およびB群トリコテセン抵抗性に関与する。A群およびB群はフザリ
ウム(Fusarium)のトリコテセンを含み、主としてC−8位におけるカルボニル官
能基の無し(A群)もしくは有り(B群)により区別される。したがって、B群トリ
コテセンであるDONはC−8位にカルボニル基を有する。
【0076】 本発明は、より特にはC−3ヒドロキシル基を含有するトリコテセンに対する
抵抗性に関する。そのようなトリコテセン類はT−2毒素、TH−2毒素、イソ
トリコデルモール、DAS、3−デアセチルカロネクトリン、3、15−ジデア
セチルカロネクトリン、シルペントリオール、ネオソラニオール、15−アセチ
ルデオキシニバレノール、ニバレノール、4−アセチルニバレノール(フサレノ
ン‐X)、4、15−ジアセチルニバレノール、4、7、15−アセチルニバレ
ノール、およびDON、ならびにそれらの種々のアセチル化誘導体を含む。
【0077】 特別の態様では、トリコテセン抵抗性を有する植物、その細胞、組織 もしく
は種子はトリコテセン生産真菌、特にフザリウム(Fusarium)属の真菌に抵抗性を
有する。ここで用いる限り、真菌抵抗性とは、真菌接種後に感染が開始されない
こと、もしくは真菌接種後に野生型コントロールと比較して感染の広がりが低減
されていることを指す。
【0078】 好ましい態様では、本発明の真菌抵抗性を有する形質転換植物は禾穀類であり
、真菌による攻撃の下で野生型に比較してより小数の感染穀粒もしくは種子を含
み、野生型コントロールで評価された同数の穀粒もしくは種子と比べて感染穀粒
もしくは種子が、好ましくは少なくとも10%減少し、より好ましくは少なくと
も20%減少し、より好ましくは少なくとも40%減少し、そして野生型コント
ロールで評価された同数の穀粒もしくは種子と比べて感染穀粒もしくは種子が、
より好ましくは少なくとも50%減少している。この発明の真菌抵抗性を有する
形質転換禾穀類はコムギ、オオムギ、コメ、およびエンバクを含むが、これらに
限定されるものではない。
【0079】 コムギでは、穂の中での真菌の広がりは下記実施例9記載の方法により、各々
の接種された穂の上の有症候性および無症候性の小穂の数を数え、各々の穂の上
の有症候性の小穂のパーセンテージを計算することにより評価することができる
。好ましい態様では、本発明の真菌抵抗性を有するコムギは、真菌攻撃下で、野
生型コントロールより少ない感染小穂を含み、野生型コントロールについて評価
された同数の小穂と比べて感染小穂が、好ましくは少なくとも10%減少し、よ
り好ましくは少なくとも20%減少し、より好ましくは少なくとも40%減少し
、そして野生型コントロールについて評価された同数の小穂と比べて感染小穂が
、より好ましくは少なくとも50%減少している。
【0080】 トウモロコシでは、雌穂中の真菌の広がりは、下記実施例9で更に記載される
ように、感染穀粒のパーセンテージの目視検査により評価することができる。好
ましい態様では、この発明の真菌抵抗性を有するトウモロコシは、真菌攻撃下で
、野生型コントロールよりもより少ない感染穀粒を含み、野生型コントロールに
ついて目視検査されたのと同数の雌穂中の感染穀粒が、好ましくは少なくとも1
0%少なく、より好ましくは少なくとも20%少なく、より好ましくは少なくと
も30%少なく、より好ましくは少なくとも40%少なく、そして野生型コント
ロールについて目視検査されたのと同数の雌穂中の感染穀粒が、より好ましくは
少なくとも50%少ない。トウモロコシでは、茎を裂いて変色の量を検査するこ
とによって茎の内部での真菌の広がりを目視で評価することができる。この発明
の好ましい態様では、この発明の形質転換トウモロコシは野生型コントロールと
比べて茎の内部および/もしくは外部の変色を少なく含む。
【0081】 もう一つの好ましい態様では、この発明の真菌抵抗性を有する植物は、真菌に
よる攻撃存在下で、野生型コントロールで発芽するよりもより大きなパーセンテ
ージの種子が発芽する植物を含む。特に好ましい態様では、この発明の真菌抵抗
性を有する植物は、野生型コントロールからの種子が発芽するよりも、少なくと
も10%多数の種子、より好ましくは少なくとも20%多数の種子、より好まし
くは少なくとも30%多数の種子、より好ましくは少なくとも40%多数の種子
、より好ましくは少なくとも50%多数の種子、より好ましくは少なくとも60
%多数の種子、より好ましくは少なくとも70%多数の種子、より好ましくは少
なくとも80%多数の種子、より好ましくは少なくとも90%多数の種子、より
好ましくは少なくとも100%多数の種子、より好ましくは少なくとも150%
多数の種子がフザリウム存在下で発芽する植物を含む。
【0082】 もう一つの好ましい態様では、野生型コントロールよりもより少ないマイコト
キシン、例えば、トリコテセンの汚染を有する種子もしくは穀粒を生産する真菌
抵抗性を有する形質転換植物が提供される。特に好ましい態様では、野生型コン
トロールよりも少なくとも10%少ないトリコテセン、より好ましくは少なくと
も20%少ないトリコテセン、より好ましくは少なくとも30%少ないトリコテ
セン、より好ましくは少なくとも40%少ないトリコテセン、より好ましくは少
なくとも50%少ないトリコテセン、より好ましくは少なくとも60%少ないト
リコテセン、より好ましくは少なくとも70%少ないトリコテセン、そしてより
好ましくは少なくとも80%少ないトリコテセンの汚染を有する種子を生産する
作物、更に特に禾穀植物が提供される。トリコテセン汚染は下記の実施例10記
載の方法で測定し得る。
【0083】 この発明で使用するポリヌクレオチドは、アセチルトランスフェラーゼをコー
ド化する非相同ポリヌクレオチド、特にトリコテセン抵抗性を付与できるアセチ
ルトランスフェラーゼをコード化するもの、更に特にトリコテセン3−O−アセ
チルトランスフェラーゼをコード化するものを含む。ある態様では、この発明の
非相同ポリヌクレオチドは、真菌性起源から、より特にはフサリウム(Fusarium)
、トリコテシウム(Trichothecium)、およびミロテシウム(Myrothecium)起源から
、より特にはF. acuminatum、F. crookwellense、F. culmorum、F. equiseti、F
. graminearum (Gibberella zeae)、F. lateritium、F. poae、F. sambucinum (
G. pulicaris)、およびF. sporotrichioidesのようなフサリウム(Fusarium)種か
ら誘導し得るが、それに限定されるものではない。この発明で使用する非相同ポ
リヌクレオチドは、配列番号1、5および/もしくは7ならびに配列番号1、5
および/もしくは7に実質的に類似の配列を含む。
【0084】 この発明で使用するポリヌクレオチドは、通常の組換えDNA技術を使用して
、植物、真菌もしくは細菌細胞のような宿主細胞に導入し得る。一般的にはこれ
は、当業界では公知である標準的なクローニング法を用いて、ポリヌクレオチド
が非相同である発現系中へそのポリヌクレオチドを挿入することを伴う。ベクタ
ーは、そのベクターを含む宿主細胞において、この発明で使用するポリヌクレオ
チドの転写および翻訳に必要なエレメントを含む。当業界では公知である多数の
ベクター系、例えば、プラスミド、バクテリオファージウイルスおよび他の修飾
されたウイルスを使用し得る。発現系の成分もまた、修飾して発現を増強するこ
とができる。例えば、切断配列、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド最適化もしく
は他の修飾を使用し得る。当業界では公知の発現系は、適切な条件の下で、ほと
んどすべての作物植物細胞の形質転換にも使用し得る。この発明の非相同ポリヌ
クレオチドは、好ましくは安定に形質転換されて、宿主細胞のゲノム中に組み込
まれる。もう一つの好ましい態様では、この発明の非相同ポリヌクレオチドは自
己複製ベクター上に置かれる。自己複製ベクターの例はウイルス、特にジェミニ
ウイルス(Gemini viruses)である。形質転換細胞は、選ばれた形のこの発明のポ
リヌクレオチドがその形質転換植物にトリコテセン抵抗性を付与するような、完
全植物に再生し得る。
【0085】 形質転換植物での発現を意図したこの発明のポリヌクレオチドは、植物で発現
し得る適切なプロモーターの背後において発現カセットに先ず組み立てられる。
この発現カセットはまた、この発明の非相同ポリヌクレオチドの発現のために要
求もしくは選択される更なる配列の何れをも含み得る。このような配列は、転写
ターミネイター、イントロンのような発現亢進のための外部配列、必須配列、お
よび遺伝子産物を特定の細胞内器官および細胞区画へターゲッティングさせる配
列を含むが、これらに限定されるものではない。これらの発現カセットはそこか
ら、以下に記載する植物形質転換ベクターに容易に移し得る。以下は典型的発現
カセットの種々の構成要素の記載である。
【0086】 発現カセットで使用するプロモーターの選択は、形質転換植物におけるこの発
明の非相同ポリヌクレオチドの空間的および時間的発現パターンを決定するであ
ろう。選択されたプロモーターは、特定の細胞型(葉上皮細胞、葉肉細胞、根皮
質細胞のような)または特定の組織もしくは器官(例えば、根、葉もしくは花)に
おいてこの発明の非相同ポリヌクレオチドを発現するであろうし、そしてその選
択はその遺伝子産物の蓄積の望ましい位置を反映するであろう。もう一方では、
選択されたプロモーターは種々の誘導条件の下でその遺伝子の発現を推進し得る
。プロモーターはその強度、すなわち転写を促進する能力で異なる。用いる宿主
細胞系によって、当業界では公知の多数の適切なプロモーターのいずれか一つが
用いられ得る。例えば、構成的発現に対しては、CaMV35Sプロモーター、
イネアクチンプロモーター、もしくはユビキチンプロモーターを使用し得る。調
節可能な発現に対しては、タバコもしくはアラビドプシス(Arabidopsis)からの
化学的に誘導できるPR−1プロモーター(例えば、米国特許第5,689,04
4号参照)を使用し得る。
【0087】 多様な転写ターミネイターが発現カセットにおける使用のために利用できる。
これらは、この発明の非相同ポリヌクレオチドを超える転写の終結およびその正
確なポリアデニル化に対して責任を負う。適切な転写ターミネイターは植物で機
能することが知られているものであり、CaMV35Sターミネイター、tml
ターミネイター、ノパリンシンターゼターミネイター、およびエンドウ豆rbc
SE9ターミネイターを含む。これらは単子葉植物および双子葉植物両者で使用
し得る。
【0088】 多数の配列が転写ユニット内から遺伝子発現を亢進することが見出され、そし
てこれらの配列はこの発明のポリヌクレオチドと共同で使用して、形質転換植物
でのそれらの発現を増加させ得る。例えば、トウモロコシAdhl遺伝子のイン
トロンのような種々のイントロン配列は、特に単子葉細胞において発現を亢進す
ることが示されている。加えて、ウイルスから誘導される多数の非翻訳リーダー
配列が発現を亢進することがまた知られ、そしてこれらは双子葉細胞において特
に有効である。
【0089】 選択された遺伝子のコーディング配列は、興味の対象である作物種での最適発
現のためにコーディング配列を変えることにより任意に遺伝子工学的に作られる
。コーディング配列を修飾して特定の作物種で最適発現を達成する方法は、周知
である(例えば、Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 (1991)
; およびKoziel et al., Bio/technol. 11: 194 (1993); Fennoy and Bailey-Se
rres. Nucl. Acids Res. 21: 5294-5300 (1993)参照)。植物遺伝子において、な
らびに高等植物、緑色藻類、および藍色細菌において、コドンの使用を考慮して
コーディング配列を修飾するための方法は周知である(Murray et al. Nucl. Aci
ds Res. 17: 477-498 (1989)の中の表4;Campbell and Gowri Plant Physiol.
92: 1-11 (1990)を参照)。
【0090】 遺伝子産物をターゲッティングする種々の機構が植物に存在することが知られ
、そしてこれらの機構の機能化を制御する配列はある程度詳細に特徴づけされて
いる。例えば、遺伝子産物の葉緑体へのターゲッティングは、葉緑体輸入の間に
切断されて成熟タンパク質を生じるところの種々のタンパク質のアミノ末端にお
いて見られるシグナル配列によって制御される(例えば、Comai et al. J. Biol.
Chem. 263: 15104-15109 (1988))。他の遺伝子産物は、ミトコンドリアおよび
ペルオキシソームのような他の細胞内器官に局在している(例えば、Unger et al
. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989))。これらの産物をコード化するcD
NAsはまた操作されて、DNA配列によってコード化される非相同産物のこれ
らの細胞内器官へのターゲッティングを効果的にし得る。加えて、DNA配列に
よってコード化される産物の他の細胞区画へのターゲッティングをもたらす配列
が特徴付けされている。アミノ末端配列はER、アポプラストへのターゲッティ
ング、および糊粉細胞からの細胞外分泌を担当している(Koehler & Ho, Plant C
ell 2: 769-783 (1990))。加えて、アミノ末端配列は、カルボキシ末端配列と共
同で遺伝子産物の液胞へのターゲッティングを担当している(Shinshi et al. Pl
ant Molec. Biol. 14:357-368 (1990))。上記の適切なターゲッティング配列を
この発明の非相同ポリヌクレオチドへ融合させることにより、生じる生成物を何
れかの細胞内器官もしくは細胞区画へ導くことが可能である。
【0091】 植物形質転換に利用できる多数の形質転換ベクターは、通常の植物形質転換業
界の当業者には公知であり、そしてこの発明に関係するポリヌクレオチドは、そ
のようなベクターの何れとも共同で使用し得る。ベクターの選択は、好ましい形
質転換技術および形質転換の標的種に依存するであろう。ある標的種に対しては
、異なる選択マーカーが好まれ得る。形質転換において日常的に使用される選択
マーカーとして以下のものが挙げられる:カナマイシンおよび関連抗生物質に抵
抗性を付与するnptII遺伝子(Messing & Vierra. Gene 19: 259-268 (1982)
; Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983))、除草剤ホスフィノトリシンに
抵抗性を付与するbar遺伝子(White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (199
0), Spencer et al., Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990))、抗生物質ハイ
グロマイシンに抵抗性を付与するhph遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol
Cell Biol 4: 2929-2931)、およびメトトレキサートに抵抗性を付与するdhf
r遺伝子(Bourouis et al., EMBO J. 2 (7): 1099-1104 (1983))、ならびにグリ
ホサートに抵抗性を付与するEPSPS遺伝子(米国特許第4,940,935お
よび5,188,642号)、マンノースの存在下に選択的な代謝的利点を付与す
るホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子、manA、(全体を出典明示により本
明細書の一部とする米国特許第5,767,378号およびMiles & Guest, GENE,
32: 41-48 (1984))およびBASTAに抵抗性を付与するPAT選択可能マーカ
ー(Sung H. Park et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 34: 117-121 (19
98))。
【0092】 多くのベクターがAgrobacterium tumefaciensを使用する形質転換に利用でき
る。これらは典型的には少なくとも一つのT−DNA境界配列を持ち、そしてp
BIN19(Bevan, Nucl. Acids Res.(1984))のようなベクターを含む。アグロ
バクテリウム(Agrobacterium)形質転換に適する典型的ベクターは、バイナリー
ベクターpCIB200およびpCIB201、ならびにバイナリーベクターp
CIB10およびそのハイグロマイシン選択誘導体を含む。(例えば、米国特許
第5,639,949号参照)。
【0093】 Agrobacterium tumefaciensを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベ
クターにおけるT−DNA配列の要求を回避し、その結果これらの配列を欠くベ
クターは、T−DNA配列を含む上記のもののようなベクターに加えて使用し得
る。アグロバクテリウム(Agrobacterium)に依存しない形質転換技術は、粒子衝
撃、プロトプラスト取り込み(例えば、PEGおよび電気穿孔法)、およびマイク
ロインジェクションを経由する形質転換を含む。ベクターの選択は、多くは形質
転換される種にとって好ましい選択に依存する。非アグロバクテリウム(non-Agr
obacterium)形質転換に適切な典型的ベクターは、pCIB3064、pSOG
19、およびpSOG35を含む。(例えば、米国特許第5,639,949号参
照)
【0094】 興味の対象であるポリヌクレオチドが一度発現系の中にクローン化されると、
それは植物細胞に形質転換される。植物の形質転換と再生の方法は当業界では周
知である。例えば、Tiプラスミドベクターは、外部DNA送達、ならびに直接
DNA取り込み、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、およびマ
イクロ発射体のために用いられている。加えて、アグロバクテリウム(Agrobacte
rium)属からの細菌を利用して植物細胞を形質転換し得る。
【0095】 双子葉植物のための形質転換技術は当業界では周知であり、アグロバクテリウ
ム(Agrobacterium)に基づく技術およびアグロバクテリウム(Agrobacterium)を必
要としない技術を含む。非アグロバクテリウム(non-Agrobacterium)技術は、プ
ロトプラストもしくは細胞による直接の外来性遺伝子物質の取り込みを含む。こ
れはPEGもしくは電気穿孔仲介取り込み、粒子衝撃仲介送達、またはマイクロ
インジェクションにより達成し得る。各場合において、形質転換細胞は当業界で
は公知の標準的技術を用いて完全植物に再生される。
【0096】 大部分の単子葉種の形質転換はまた、現在日常的となっている。好ましい技術
は、PEGもしくは電気穿孔技術を使用するプロトプラストへの直接的遺伝子移
動、カルス組織への粒子衝撃、ならびにアグロバクテリウム(Agrobacterium)仲
介形質転換を含む。標的組織は、コムギ栽培変種UC703もしくはトウモロコ
シ遺伝子型CG000526のような供給源から誘導し得る。例えば、トウモロ
コシのアグロバクテリウム(Agrobacterium)仲介形質転換は、対応的にWO98
/54961として公告され、全体を出典明示により本明細書の一部とする米国
特許出願第09/089,111号に記載されたように実施してもよく、そして
オオムギについては以下に記載されたように実施してもよい:M. Cho, J. Wong,
C. Marx, W. Jiang, P. Lemaux and B. Buchanan (1999)。チオレドキシンhの
過剰発現は、オオムギ穀粒におけるでんぷん脱分枝酵素 (プルラナーゼ)の活性
亢進を導く。PNAS 96: 14641-14646; S. Zhang, M. Cho, T. Koprek, R. Yun, P
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条分裂組織培養において用いるエンバク(Avena sativa L.)およびオオムギ(Hord
eum vulgare L.)の商業的栽培変種の遺伝的形質転換。Plant Cell Rep. 18: 959
-966; P. Bregitzer, S. Halbert and P. Lemaux (1998)。形質転換オオムギの
後代におけるソマクローナル変異。TAG 96: 421-425; M. Cho, W. Jiang and P.
Lemaux (1998)。再生性の改良と白化症低減による抵抗性を有するオオムギ栽培
変種の形質転換。Plant sci. 138: 229-244; P. Lemaux, m. Cho, S. Zhang, an
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未来展望。In: Vasil I, Phillips R (eds) Molecular Improvement of Cereal
Crops, Kluwer Academic Publ, Dordrecht, The Netherlands, pp 255-316; S.
Zhang, R. Williams-Carrier, D. Jackson, and P. Lemaux (1998)。トウモロコ
シ(Zea mays L.)およびオオムギ(Hordeum vulgare L.)におけるインビトロ腋性
苗条分裂組織増殖および不定苗条分裂組織形成中のCDC2ZmおよびKNOT
TED1の発現。Planta 204: 542-549; D. McElroy, J. Louwerse, S. McElroy
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l. 104: 37-48。
【0097】 この発明のポリヌクレオチドは、裸子植物、単子葉植物、および双子葉植物の
ものを含めて、広く多様な植物細胞にトリコテセン抵抗性を付与するために使用
し得る。この発明の非相同ポリヌクレオチドは、これらの広いクラスの範疇に入
る何れかの植物細胞にも挿入され、例えば、形質転換され得るが、それはイネ、
コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エンバク、ジャガイモ、サツマイ
モ、カブ、西洋トウナス、カボチャ、ズッキーニ、メロン、ダイズ、およびモロ
コシのような作物植物細胞において特に有用である。植物をトリコテセン抵抗性
にするこの発明において使用するポリヌクレオチドは、生産および品質において
重要な他の特性と組み合わせて使用し得る。この発明のポリヌクレオチドは育種
的アプローチおよび当業界では公知の技術により植物系統に導入し得る。
【0098】 トリコテセン抵抗性を有する遺伝子対立遺伝子が、作物植物もしくはそれから
作物植物が再生し得るところの植物細胞カルスへの形質転換により得られる場合
には、それは伝統的な育種技術を用いる商業的変種に移入されて、その対立遺伝
子を遺伝子工学的に作成してそれを植物に形質転換する必要なしにトリコテセン
抵抗性を有する作物を創り出す。
【0099】 種々の育種ステップは、交雑される系統の選択、親系統の受粉の管理、もしく
は適当な後代植物の選択のようなよく定義された人為的介入によって特徴付けら
れる。所望される特性に依存して異なる育種手段が取られる。関連技術は当業界
では公知であり、そしてハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交配、多系育
種、品種混合、種間ハイブリダイゼーション、異数性技術等を含むが、それらに
限定されるものではない。ハイブリダイゼーション技術はまた、植物の不稔化を
含み、機械的、化学的、もしくは生化学的手段によって雄性もしくは雌性不稔植
物を生み出す。雄性不稔植物と異なる系統の花粉との異種受粉は、受精し得る雌
性植物以外で雄性不稔植物のゲノムが両親系統の特性を均一に獲得するであろう
ということを確認する。それゆえに、この発明による形質転換種子および植物は
、植物、植物組織、もしくは種子上での真菌成長を示さないか低減した真菌成長
を示す改良植物系統の育種のために使用され、それにより当該植物、植物組織、
もしくは種子のマイコトキシン汚染を阻止および/もしくは低減し得る。
【0100】 上に記述した形質転換種子および植物に工学的に導入されたトリコテセン抵抗
性は、有性生殖もしくは無性生育により受け渡され、そしてそれゆえに後代植物
において保存され増殖され得る。一般的には、当該の保存および増殖は、耕作、
播種、もしくは収穫のような特定の目的に適合させるために開発された公知の農
業的方法を利用する。生育作物は昆虫類や感染症により引き起こされる攻撃や傷
害を受けやすいので、収穫を改善するために植物疾病、昆虫類、線虫類、および
他の有害状態を制御する方策がとられる。これらは、土壌耕作もしくは感染植物
除去、ならびに抗真菌剤、殺配偶子剤、抗線虫剤、生長抑制剤、成熟剤および殺
虫剤のような農薬類の撒布を含む。
【0101】 種子生産においては、発芽品質および種子の均一性は必須な製品特性であるが
、一方において農民により収穫され、販売される種子の発芽品質および種子の均
一性は重要ではない。作物から他の作物および雑草の種子を無くすること、種子
媒介性の疾病を制御すること、および良好な発芽性を有する種子を生産すること
は困難であるので、かなり広範囲でよく規定された種子の生産業務が種子生産者
によって開発され、彼等は純粋な種子の生育、調質、および販売の技術に熟練し
ている。それゆえに、農民にとっては、自身の作物から収穫された種子を使用す
る代わりに特定の品質規準に合った保証済み種子を購入することが普通の行為で
ある。種子として用いるべき増殖材は、除草剤、殺虫剤、抗真菌剤、殺菌剤、殺
線虫剤、殺陸貝剤もしくはそれらの混合物を含む保護被覆剤で通常は処理される
。通常に使用される保護被覆剤は、カプタン、カルボキシン、チラム(TMTD[
登録商標])、メタラキシル(アプロン[登録商標])、ピリミホス−メチル(アクテ
リック[登録商標])のような化合物を含む。所望により、これらの化合物は、更
に担体、界面活性剤、もしくは製剤の技術において通常に用いられる塗布促進補
助剤とともに製剤化され、細菌、真菌、もしくは動物害虫によりもたらされる傷
害に対し保護を与える。保護被覆剤は、増殖剤を液体製剤で含浸させるかもしく
は湿式および乾式製剤を組み合わせて被覆することにより塗布され得る。芽もし
くは果実で実行される処置のような他の塗布方法もまた可能である。
【0102】 本発明による形質転換植物、形質転換植物材、もしくは形質転換種子の使用を
特徴とする、上に例示した方法のような新しい農業的方法を提供することが本発
明の更なる態様である。
【0103】 もう一つの態様では、本発明は、形質転換植物から得られる、形質転換植物細
胞、組織、器官、種子、もしくは植物部分に関する。またこの発明の中に含まれ
るのは、その植物の形質転換後代ならびにその後代から得られる、形質転換植物
細胞、組織、器官、種子および植物部分である。
【0104】 もう一つの態様では、この発明で使用する非相同ポリヌクレオチドはまた、形
質転換法において選択可能マーカーとして使用し得る。この態様では宿主細胞は
、上で例示されて当業界では公知の発現カセットおよび形質転換技術を用いて、
興味の対象である第二の非相同ポリヌクレオチドならびにトリコテセン抵抗性活
性を含む遺伝子産物をコード化するところのこの発明の非相同ポリヌクレオチド
で形質転換される。形質転換後、形質転換した細胞は、トリコテセン、特にDA
SもしくはDONもしくはT−2トキシンにさらされるときに生存する能力によ
り選択される。宿主細胞は、当業界では公知の形質転換および発現系を用いる、
真核もしくは原核宿主細胞であってもよい。宿主細胞は植物細胞、真菌細胞、細
菌細胞、酵母細胞、動物細胞、もしくは昆虫細胞であってもよい。
【0105】 この発明の特に好ましい態様では、トリコテセン抵抗性活性を含む遺伝子産物
をコード化するポリヌクレオチドは、植物細胞形質転換法において選択可能マー
カーとして使用される。例えば、興味の対象の第二の非相同DNA配列を少なく
とも発現する、植物、植物組織、植物種子、もしくは植物細胞はまた、形質転換
されて、配列番号2,6、もしくは8のそれに実質的に類似する配列を含むポリ
ペプチドをコード化する配列を発現し得る。形質転換された細胞は、植物毒性の
トリコテセン、特にDASおよび/もしくはDONおよび/もしくはT−2トキ
シンを含有する培地中に、配列番号2、6、もしくは8のアミノ酸配列を持つも
のに実質的に類似するポリペプチドを発現しない植物細胞の成長もしくは生存能
力を阻害するのに十分な量で移されるが、その場合形質転換された細胞のみが成
長しもしくは発育阻害を受けないであろう。配列番号2、6、もしくは8のアミ
ノ酸配列を持つものに実質的に類似するポリペプチドを発現する植物の選択に対
して有用なトリコテセンの濃度は、1μg/mlから90μg/mlの範囲であ
る。この方法は、配列番号1、5、もしくは7のそれに実質的に類似するヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドを発現できる何れかの植物にも応用可能であ
り、そして興味の対象である何れかの非相同DNA配列と共に使用し得る。第二
の非相同DNA配列およびこの発明の非相同ポリヌクレオチドの発現は、植物細
胞において機能できる同じプロモーターにより、もしくは別個のプロモーターに
よって推進し得る。
【0106】 配列の記載: 配列番号1 トリコテセン抵抗性活性を有するこの発明のポリペプチドをコー
ド化するFusarium sporotrichioidesからのcDNA配列である。 配列番号2 配列番号1によりコード化されるトリコテセン抵抗性活性を有す
るポリペプチドである。 配列番号3 DNAプライマーである。 配列番号4 DNAプライマーである。 配列番号5 トリコテセン抵抗性活性を有するこの発明のポリペプチドをコー
ド化するFusarium graminearumからのDNA配列である。 配列番号6 配列番号3によりコード化されるトリコテセン抵抗性活性を有す
るポリペプチドである。 配列番号7 トリコテセン抵抗性活性を有するこの発明のポリペプチドをコー
ド化するSaccharomyces cerevisiaeからのDNA配列である。 配列番号8 配列番号5によりコード化されるトリコテセン抵抗性活性を有す
るポリペプチドである。 配列番号9 pCIB9818のDNA配列である。 配列番号10 pAgroTRIrのDNA配列である。 配列番号11 pNOV1704のDNA配列である。
【0107】 (実施例) 以下の実施例は更に、この発明の実施において使用される材料および方法なら
びにその後の結果を記載する。それらは例示により提供され、そしてそれらの叙
述はこの請求する発明を限定するものと考えるべきではない。
【0108】 実施例1:pNOV1700、pCIB9818、pAgroTRIr、および
pNov1704の構成 1.pNOV1700 pNOV1700は、ブダペスト条約の条項下に、1999年3月19日にth
e Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), North
ern Regional Research Center, 1815 Northern University Street, Peoria, I
llinois 61604, USAに寄託され、受け入れ番号NRRL B−30117を割り
当てられた。
【0109】 従って、pNOV1700は、エキソンおよびイントロンの一部分を含む、Z.
maysユビキチンプロモーター、ならびにノパリンシンターゼポリアデニル化の
シグナルに機能し得るように結合された配列番号1を含む。
【0110】 2.pCIB9818 プラスミドpCIB9818は、配列番号9に記載のDNA配列を持つ611
1塩基対の環状プラスミドである。Z. maysユビキチンプロモーターは、塩基8
96から1011までのエキソンの一部分および塩基1047から1993まで
のイントロンの一部分を含む配列番号9の塩基12から1993までであり、塩
基対2090から3193までのリン酸マンノースイソメラーゼ選択可能マーカ
ー、塩基3248から3355までの反転したPEPCイントロン#9および塩
基3357から3434までのCaMV35S遺伝子のターミネイション配列に
機能し得るように結合されている。
【0111】 3.pAgroTRIr プラスミドpAgroTRIrは、配列番号10に記載のDNA配列を持つ1
3,737塩基対環状バイナリーベクターである。従って、pAgroTRIr
は、アラビドプシスタリアーナ(Arabidopsis thaliana)UBI3プロモーターと
の後方および読み枠中で[S. Norris, S. Meyer, and J. Callus, Plant Molecul
ar Biology 22: 895-906, (1993)]そしてnosポリアデニル化シグナルとの前
方および読み枠中で、プロモーターおよびターミネイション配列ならびに配列番
号1のポリヌクレオチド領域と機能し得るように結合された選択可能マーカーを
含む。
【0112】 4.pNov1704 プラスミドpNov1704は、配列番号11に記載のDNA配列を持つ12
949塩基対環状バイナリーベクターである。配列番号11の塩基11から19
92(1:895から1010までのエキソンおよび1:1046から1992ま
でのイントロンを含む)までのZ. maysユビキチンプロモーターは、塩基2089
から3192までのリン酸マンノースイソメラーゼ選択可能マーカー配列、およ
び塩基3557から3688までのノパリンシンターゼターミネイション配列に
機能し得るように結合している。pNov1704は、塩基11234から12
662における配列番号1のトリコテセン3−O−アセチルトランスフェラーゼ
配列およびnosターミネイション配列12667から12935と機能し得る
ように結合した、塩基9218から11218(エキソン1:10110から1
0224までおよびイントロン1:10225から11218までを含む)までの
Z. maysユビキチンプロモーターを更に含む。
【0113】 実施例2:コムギ形質転換、選択および再生 形質転換 未成熟な接合性胚(0.75〜1.25mm)は、表面滅菌したコムギ穎果(10
%クロロックス×10分)から切断し、そこで胚盤を上向けて、3%蔗糖、3mg
/リットル2,4−D(ジクロロフェノキシ酢酸)、150mg/lグルタミン、
75mg/lアスパラギンを補足したMS基礎培地(Murashige and Skoog, (196
2) Physiol. Plant 15: 473-439)上にて平板培養し、0.7%植物性寒天(3MS
3S培地)で固化する。この胚は、衝撃以前に暗所、28℃で5〜10日間イン
キュベートされる。衝撃の最適時期は平板培養後6〜7日である。衝撃4時間前
に胚は原形質分離培地(蔗糖の代わりに15%マルトースを添加する以外、上記
と同様な培地)上に置かれ、そして胚盤を上面にして直径2.5cmの円の中に配
置される。
【0114】 上の実施例1で記載したpNOV1700は、PvuIIおよびXmnIで消
化され、そして配列番号1に記載の配列を持つポリヌクレオチド領域ならびにユ
ビキチンプロモーターおよびnosポリアデニル化シグナルを含む4117bp
フラグメントが単離される。上の実施例1でも記載されたpCIB9818は、
AscIで消化され、そしてUBIトウモロコシプロモーター、選択可能マーカ
ーおよびCaMV35Sターミネイション配列を含む4246bpフラグメント
が単離される。
【0115】 単離されたDNAフラグメントは標準的なSanford法を用いて0.3マイクロメ
ーターの金粒子上に沈殿させる。連続的にボルテックスしながら、構築物あたり
5マイクログラムの単離されたフラグメントDNA、50μlの2.5M Ca
Cl、および20μlの0.1Mスペルミジンを、50μlの50%グリセリ
ンおよび3mgの金を含有するエッペンドルフチューブに加える。このDNA/
金混合物を二回エタノール洗浄する。最終洗浄の上澄み液を廃棄後、エタノール
を加えて70μlの最終容積にする。これは金/DNAのチューブ当たり6ショ
ットを提供する。標的プレートは標的プレート当たりおよそ3マイクログラムの
DNA(もし一般的である、2つの構築物の各々5マイクログラムを用いるとす
ると)および1.0mgの金を送達するように2回シュートされる。用いられる断
裂圧力は1100psiである。衝撃後、標的プレートは暗所に終夜戻される。
およそ24時間の原形質分離の後、その胚は3MS3Sの方に移動され、3週間
のカルス開始のために暗所に戻される。この間には継代培養を行わない。
【0116】 選択/再生 3週間の開始期間の間に発育する胚形成組織は、非胚形成組織から切断されそ
して再生/選択培地上に置かれる。基本的な再生培地は2,4−Dが無いが、代
わりに1mg/lGA3(ジベレリンA)NAA(1−ナフタレン酢酸)およびN
AAが添加された3MS3Sである(NG培地と呼称される)。10g/lマンノ
ースおよび5g/l蔗糖を添加する(NG1M.5S)。その組織は2週間この再
生および選択の初期相に置かれる。2週間の期間の大部分の間では組織は明るい
部屋の中に置く。苗条と根の発育はこの相の期間に開始し、そして2週間後に全
ての組織は次ぎの段階に持ち込まれる。
【0117】 マンノース選択による再生および選択の第二段階に対しては、マンノースを5
g/lに低減しかつ蔗糖は20g/lに増加する(MS2S.5M)。組織は通常
これらの培地上でおよそ4週間の期間置かれ、その間に更なる苗条と根の発育が
起こる。
【0118】 良好な色彩ならびに根および苗条の発育を有する活発に成長している苗木をプ
レートから外してGA7’sと呼ばれるより大きなコンテナーに植える。これが
選択と再生の最終段階である。培地は1/2MS塩類および15g/lマンノー
スのみを含む。植物が形質転換し得るという最良の指標は、培地中への根の活発
な成長の観測である。活発に成長している苗木からの葉組織を収集して、温室に
移動する前に興味の対象である遺伝子もしくは選択可能マーカーの何れかに対し
てPCRを行う。
【0119】 実施例3:アラビドプシス(Arabidopsis)形質転換 上の実施例1で記載したバイナリーベクターpAgroTRIr構築物は、電
気穿孔法(Dower, W. J., Mol. Biol. Rep 1: 5 (1987))によりAgrobacterium tu
mefaciens株GV3101(Bechtold, N. et al., CR Acad. Sci. Pris, Science
s de la vie, 316: 1194-1199 (1993))中に形質転換される。YEB+リファン
ピシン100およびカナマイシン100中でのpAgroTRIrプラスミドを
含有するGV3101アグロバクテリウム(Agrobacterium)の単一コロニーから
の25ml培養液は、終夜30℃でインキュベートする。大規模培養は500m
lの同一培地を小規模培養液の5mlで接種することにより開始し、終夜30℃
でインキュベートする。培養液の600nmにおけるODを測定し、そして培養
液は15分間GSAローターにより5Kで遠心沈降させる。細胞を“1M修飾浸
透培地”に再懸濁させて600nmにおける0.08の最終O.D.を達成する
。懸濁した細胞のリットル当たり200マイクロリットルのSilwetを添加
する。ポット当たり約4本の苗のあるArabadopsis var Columbiaの抽だい株3個
のポットを約500mlの細胞懸濁液中で反転させる。花を細胞懸濁液中で振盪
して気泡を除き、苗を細胞懸濁液中で15分間インキュベートする。天蓋をトレ
イ上に置き苗を終夜湿潤に保つ。
【0120】 その苗を約3〜4週間成長させ、この後その植物は最高1週間水遣りしない。
種子鞘を収集しそして約1週間半乾燥室にて乾燥する。種子を播種し、約2週間
成長させる。その苗に選択剤を噴霧した後、2日後および4日後に再び噴霧する
。約3日後に生存する苗は新しいポットに移植することができる。
【0121】 実施例4:トウモロコシのバイオリスティック形質転換 タイプ1胚形成カルス培養(Green et al 1983, Somatic cell genetic system
s in corn. A. Fazelahmad, K. Downey, J. Schultz, RW Voellmy, eds. Advanc
es in Gene Technology: Molecular Genetics of Plants and Animals. Miami W
inter Symposium Series, Vol. 20. Academic Press, NY.)は、温室生育の、長
さ1.5〜2.0mmの未成熟なトウモロコシ胚から開始される。胚を授粉後およ
そ14日目に表面滅菌された穂から無菌的に切除する。胚を2%蔗糖および5m
g/Lのクロラムベンと共にDカルス開始培地(Duncan et al, (1985) Planta 1
65: pp 322-332)上に置く。胚および胚形成培養株はその後暗所にて培養される
。胚形成レスポンスは約14日後に外植片から切除される。レスポンスは2%蔗
糖および0.5mg/Lの2,4−Dと共にDカルス保存培地に置く。週に1回の
新鮮保存培地への選択的継代培養を約6週間行った後、高品質かつ緊密な胚形成
培養株が確立される。活発に成長する胚形成カルス片を遺伝子送達の標的組織と
して選択する。そのカルス片を12%蔗糖入りの保存培地を含有する標的プレー
ト上で、遺伝子送達前のおよそ4時間の間平板培養する。 それらのカルス片を標的プレートの中心から半径8および10mmの円周内に
配置する。
【0122】 上の実施例1で記載したpNOV1700はPvuIIおよびXmnIで消化
され、そして配列番号1に記載の配列ならびにプロモーターおよびポリアデニル
化シグナルを持つポリヌクレオチド領域を含む4117bpフラグメントが単離
される。上の実施例1でも記載されたpCIB9818はAscIで消化され、
そしてマーカー遺伝子、プロモーターおよびターミネイション配列を含む424
6bpフラグメントが単離される。単離されたDNAフラグメントは、DuPo
nt Biolisticマニュアルに記載のごとく、金マイクロ担体上に沈殿
させる。各プラスミド構築物に対し2〜3μgが各6ショットマイクロ担体標本
で用いられる。この発明のポリヌクレオチドはPDS−1000He Biol
istics装置を用いて標的組織細胞に送達される。Biolistics装
置におけるセッティングは以下の通りである:断裂盤とマイクロ担体の間8mm
、マイクロ担体と阻止スクリーンの間10mm、および阻止スクリーンと標的と
の間7cm。各標的プレートは650psi断裂盤を用いて2回シュートされる
。200×200のステンレス鋼の網(McMaster-Carr, New Brunswick, NJ)を阻
止スクリーンと標的組織の間に置く。遺伝子送達の7日後に、標的組織片は高浸
透性培地から選択培地に移される。
【0123】 標的組織を無蔗糖で1%マンノース含有の保存培地に置く。3〜5週間後に、
成長しているカルス片を無蔗糖で1.5%マンノース含有の保存培地に継代培養
する。選択培地で生育する胚形成カルスは、十分なカルスが生産され10〜20
個の植物を発生するまで、6週間〜10週間の間2週間毎に継代培養する。元の
標的組織片からの選択に生き残った組織は単一コロニーとして継代培養され、独
立な形質転換事象として提示される。0.25mg/Lアンシミドールおよび0.
5mg/Lカイネチンと共に2%蔗糖および1%マンノース(MS2S+1M)を
含有する修飾MS培地(Murashige and Skoog, 1962 (1962)。タバコ組織の早急
な成長とバイオアッセイのために改変された培地。Physiol. Plant 15: 473-439
)上にコロニーを移す。2週間後、そこで再生コロニーはホルモンの無いMS2
S+1Mに移される。全てのコロニーからの根を持つか持たない再生苗条がMS
3S培地を含有するMagentaボックスに移され、そして根を持つ小さな苗
が回収されて温室内の土壌に移される。
【0124】 実施例5:形質転換植物発現の分析 形質転換植物からの組織を配列番号1の配列を含むポリヌクレオチドの存在に
対して分析する。DNAを形質転換植物から抽出し、そしてPCR分析を標準的
プロトコルに従って実施する。遺伝子構築物の増幅に使用するプライマーは、(
5′−acgaatcattcaccgaggag−3′)(配列番号3)および(
5′−ctcacactctcaggcttacc−3′)(配列番号4)である
。上の実施例2に従って得られたコムギ中の配列番号1の配列内にある650n
tフラグメントを検出する。
【0125】 b. ノーザン分析 形質転換植物をノーザンブロット・ハイブリダイゼーションによりRNAの存
在に対して分析する。ノーザンブロット分析のために、植物組織から抽出された
RNAはサイズ分けされて、ナイロン膜上にブロットされる。この膜は次いで配
列番号1に記載のポリヌクレオチドの429nt Stylフラグメントから誘
導される放射性プローブとハイブリダイズされ、プローブとして用いられる。R
NAは、上の実施例2および3に従って形質転換されたコムギおよびアラビドプ
シス(Arabidopsis)植物で検出される。
【0126】 実施例6:トリコテセン3−O−アセチルトランスフェラーゼ活性に対する酵素
的アッセイ a.) 酵素アッセイのための植物組織の抽出: 上の実施例2〜4に従って形質
転換され、再生されたものを含むこの発明の形質転換植物から、3枚の1×1/
8 インチの葉切片(約50mg)を選択する。
【0127】 (b) ガラスビーズ粉砕機: 組織を2ml丸底チューブに置き、キャップを閉
じる。チューブを液体窒素につけ、−80℃で終夜インキュベートする。チュー
ブを目振り−全器(saws-all)上で24秒振盪し、0.4mlのリン酸ナトリウム
バッファーを添加する。チューブは約10秒ボルテックスして氷上に置く。チュ
ーブをさらに約5分ボルテックスし、そこでエッペンドルフ遠心分離機で14,
000rpmで5分回転する。上澄みを取り出して、きれいなチューブに入れる
【0128】 次の成分を混合する。 トリコテセン基質、2マイクロリットルのDAS(50mMリン酸ナトリウム
バッファーpH7.0中に20%アセトン)。DONもまた使用し得る。 アセチルCoA基質、2マイクロリットルの[14C]−アセチルCoA NE
N cat.#NEC313(60mCi/ミリモルおよび0.02mCi/ml) バッファー、リン酸ナトリウムバッファーpH7.0で50μlの最終容積に
【0129】 アッセイは次の酵素標本を添加して開始し、30℃で15分間インキュベート
する。 酵素標本、リン酸ナトリウムバッファーpH7.0中に植物抽出物10マイク
ロリットル
【0130】 15分後に、100マイクロリットルの酢酸エチルを添加し、チューブを2回
数秒間ボルテックスする。チューブをエッペンドルフ遠心分離機で14,000
rpmで2分間回転する。50マイクロリットルの酢酸エチル層を取り出して、
シンチレーションカクテルを含有するバイアルに加える。シンチレーションカウ
ンターを使用してチューブを2分間カウントする。
【0131】 上の実施例2に従って得られかつ0.60から13.4nmolアセチル化生成
物/μgタンパク質/15分の比活性を持つ20個の別個のコムギ苗が確認され
た。形質転換コムギ苗の比活性はネガティブコントロールよりも有意により大で
ある。ネガティブコントロールは非形質転換コムギ栽培変種であり、それは0.
1〜0.2nmolアセチル化生成物/μgタンパク質/15分の比活性を持つ
【0132】 上の実施例3に従って得られかつ3.80から28nmolアセチル化生成物
/μgタンパク質/15分の範囲にわたる比活性を持つ5個の別個のアラビドプ
シス(Arabidopsis)苗が確認された。この形質転換苗の比活性はネガティブコン
トロールのそれよりも有意に大である。ネガティブコントロールは、選択可能マ
ーカー発現のための核酸構築物で形質転換されたArabidopsis thaliana var Col
umbiaであり、 それは0.1nmolアセチル化生成物/μgタンパク質/15
分より低い比活性を持つ。
【0133】 上の実施例4に従って得られ、かつ11.1から17.9nmolアセチル化生
成物/μgタンパク質/15分の範囲にわたる比活性を持つ少なくとも二つの形
質転換体からのトウモロコシ苗が確認された。この形質転換苗の比活性はネガテ
ィブコントロールのそれよりも有意に大である。ネガティブコントロールは非形
質転換トウモロコシ遺伝子型であり、それは0.2nmolアセチル化生成物/
μgタンパク質/15分より低い比活性を持つ。
【0134】 pNOV1704のアグロバクテリウム(Agrobacterium)仲介形質転換を用い
て得られ、17から183nmolアセチル化生成物/μgタンパク質/15分
の範囲にわたる比活性を持つ少なくとも16個の異なる形質転換体からのトウモ
ロコシ苗が確認された。
【0135】 実施例7:形質転換植物におけるトリコテセン抵抗性に対するバイオアッセイ 次の成分を有するCPR培地の250mlを調整しそしてそのpHをKOHに
より6.5に調節する。 1/2MS塩類 0.54g 1/2MSビタミン類 1.25ml 蔗糖1% (任意) 2.50g
【0136】 アガロースを上の培地に1%濃度(2.50g)にまで加えて、培地をオートク
レーブにかける。クロロフェノールレッド(50mg/ml)の25mlをオート
クレーブにかけた培地に加える。
【0137】 培地を55℃に保ちながら、DASもしくはDONを各種の濃度でアセトン中
に加える。(即ち、1.7ml当たり、DONは4、8、もしくは16マイクロリ
ットル10mg/mlで、またはDASは2、4、8、もしくは16マイクロリ
ットル50mg/mlDASで)。約0.5mlの培地を48ウェルマイクロタイ
タープレートの各ウェルに分注する。
【0138】 形質転換植物組織の1/3×1/8インチ切片をマイクロタイタープレートな
らびに非形質転換野生型コントロールからのコントロール組織に加える。葉切片
をペトリー皿中に落下させて、ピンセットでマイクロタイタープレートウェル培
地に押し込む。マイクロタイタープレートを20℃、照明下で2〜4日間インキ
ュベートする。葉切片代謝は結果として赤色から黄色への色彩変化(pH下降)を
もたらす。形質転換体によるトリコテセン抵抗性活性もしくはトリコテセンに対
する低減した感受性は、結果としてDASもしくはDONの存在下で黄色に着色
したウェルをもたらす。
【0139】 赤色のままであるコントロールと比較して、赤色から黄色への色彩変化がこの
発明のコムギおよびトウモロコシ苗で観測される。更に、個々の葉切片は対応す
るコントロールよりも有意に低い退緑を有する。
【0140】 実施例8:発芽アッセイ A. トリコテセン抵抗性発芽アッセイ この発明の形質転換植物からの種子を選択剤からの選択プレッシャー下で生育
し、そして得られた植物を自家交配させる。得られた種子をMS3S培地(MS
塩類4.3g/L、MSビタミン100X、蔗糖30g/L、および植物性寒天
8g/L)上で平板培養し、そしてDASもしくはDON(20mg/mlで)の
何れかを1000から1200種子/ペトリ皿(直径100mm)の密度で補足す
る。照明下4日間インキュベーションした後、そのプレートを種子の成長に対し
て検査する。
【0141】 上の実施例3に従って得られ、DASを含む培地で生育された植物からのアラ
ビドプシス(Arabidopsis)種子は、根および苗条両者の成長を伴う多数の苗を生
じる。一方、コントロール種子(母体のアラバドプシス(Arabadopsis)系統、var.
Columbia)は発芽が貧弱で、そしてDAS補足培地で生育されるときには根が形
成しない。DAS無しの同じ培地で生育される形質転換およびコントロール種子
の間には、差異は観察されない。
【0142】 B.実生葉枯れ病に対する抵抗性検出に対する真菌抵抗性発芽アッセイ 1.コムギ真菌抵抗性発芽アッセイ コムギにおける真菌抵抗性発芽アッセイは、全体を出典明示により本明細書の
一部とする、R. H. Proctor, T. M. Horn, and S. P. McCormick. トリコテセン
トキシン生合成遺伝子の破壊により起こるGibberella zeaeの低減された病原性
。Mol. Plant-Microbe Interact. 8 (4): 593-601, 1995)に記載と実質的に同様
に施される。
【0143】 接種原は、水でml当たり1×1O分生子に希釈されたF. gramiearumの大
分生子より成る。接種原は、白色光もしくは近紫外蛍光の下で7〜10日間生育
されたV−8ジュース寒天培養からの大分生子を洗浄することにより調製する。
実生アッセイでは、上の実施例2での二つの異なった形質転換コムギ事象の種子
およびその野生型コントロール体を10%漂白剤と0.05%Tween溶液中
でおよそ15分表面滅菌しそして無菌蒸留水で5回リンスする。その種子をおよ
そ10分間大分生子の懸濁液に浸し、そしてそこで10cmプラスチックポット
(ポット当たり20個の種子)に入れられているバーミキュライトに植付ける。植
付け以前に、ポットをバーミキュライトで約3/4満杯に満たし、そしてバーミ
キュライトの上端が湿るまで2〜4cmの水中にセットする。植付け後、種子を
1〜2cmの追加のバーミキュライトで覆い、ポットを個別にプラスチック袋の
中に置き、そして生育室で22℃にて16時間照明下および8時間暗闇下にて1
週間インキュベートする。およそ1週間後にポットを袋から取り出し、そして2
週間後に、各ポット中で出現している実生の数を数えることにより疾病を評価す
る。コントロールは、種子が無菌水に浸され40個の種子が用いられるというこ
と以外は上記のように処置される。
【0144】 水で処置した同じ形質転換種子と比較すると、50%および43%の2種の異
なる形質転換植物事象からの種子は発芽するが、他方、水で処置された同じ種子
と比較すると、17%の野生型コントロール体が発芽する。
【0145】 2.トウモロコシ真菌抵抗性発芽アッセイ 接種原は、ヤエナリ寒天(ゆでたヤエナリからの液汁で作成)上、12時間毎に
照明と暗黒が交代するサイクル下に、25℃で生育したF. graminearum培養株か
ら生産する。胞子は、最初無菌蒸留水でプレートを冠水させた後、ガラス棒でプ
レートをこすって収穫する。溶液を収集し、そして接種日に、胞子濃度を2回蒸
留した無菌水で1×10胞子/mlに調整する。
【0146】 滅菌した土壌、ピートおよびバーミキュライトの混合物からなる土壌を、5リ
ットルの平かご中で、1ml胞子溶液/土壌リットルで接種し、接種した土壌を
セメントミキサーで負荷当たり2分間混合する。コントロール処置は非感染土壌
からなる。平かごは、この発明の形質転換もしくは野生型コントロール体の各3
0鞘の種子を植えられ、生育室中55°F、半飽和土壌条件下で最高4週間イン
キュベートされる。照明レベルは植付け後14日間は24時間暗闇であり、そし
て植付け後15〜24日は12時間照明下である。標識をつけた杭を平かごにつ
けて、平かごを生育室に移動しそして無作為化する。
【0147】 出芽が始まると直ぐに苗カウントを開始し、そして苗の出芽に変化が無くなる
まで毎日もしくは1日置きに実行する。
【0148】 実生出芽の視覚的退色および立枯れの症状が測定され、そして野生型コントロ
ール体と比較して植物抵抗性の程度を特徴づけるために用られる。野生型コント
ロール体よりも実生出芽の視覚的退色および/もしくは立枯れのより少ない苗を
選択する。
【0149】 実施例9:真菌抵抗性アッセイ A. 形質転換コムギ苗の試験 コムギ頭花立枯病もしくは頭花瘡痂病は、Fusarium graminearum(テレオモル
フ:Gibberella zeae)によって引き起こされる。F. graminearum培養株を、V−
8寒天培地(V−8ジュースで作成)上もしくはヤエナリ寒天(ゆでたヤエナリか
らの液汁で作成)上で、12時間毎に照明と暗黒が交代するサイクル下に25℃
で生育する。胞子は、最初に無菌蒸留水でプレートを冠水させた後、ガラス棒で
プレートをこすって収穫する。溶液を収集し、そして接種日に、胞子濃度を2回
蒸留した無菌水で5×10胞子/mlに調整する。
【0150】 形質転換苗は上の実施例2に記載したように得られ、そしてコントロール苗は
開花もしくは頭花まで温室にて生育させ得る。頭花は、各頭花の中央付近にある
一つの小花の外花穎と花穎の間におよそ20μl(約1000胞子)の接種原を注
射することにより接種される。幾つかの頭花は未接種で残すかもしくはコントロ
ール体として無菌水を接種される。苗をそこで生育室に移し、高湿度の下で最高
21日間インキュベートするかもしくは苗を最初65〜70°Fで霧箱中で72
時間インキュベートした後、温室でさらに18日間インキュベートする。
【0151】 この発明の形質転換苗とコントロール植物はまた農場で生育されてもよく、そ
の場合頭花は噴霧により接種される。 疾病は、代表数の形質転換頭花および野生型コントロール頭花上でそれぞれ接
種した頭花での症状および無症状の小穂の数を数え、これから症状を示す各頭花
上の小穂のパーセンテージを計算することにより評価する。症状は、コントロー
ル植物と比較した時期尚早な白化および幾つかの場合には小穂の壊死からなる。
野生型コントロール体よりも症状の少ない小穂を持つ苗を選択する。
【0152】 サザン・データーにより異なるコピー数の配列番号1および異なる数の挿入位
置を有する6個の異なる形質転換苗は、形質転換苗およびコントロール体が上記
したように温室でインキュベートされる場合、野生型コントロール体の44.7
5%と比較して、10.40%から31.20%の範囲にわたる頭花当たりの症状
を示す小穂の平均パーセントを有する。これらの同じ形質転換苗は、上の実施例
6で記載したように測定され、0.874から29.1nmol/マイクログラム
/15分の範囲にわたる酵素活性を有する。
【0153】 B.形質転換トウモロコシ苗の試験 トウモロコシ穂腐れ病アッセイ トウモロコシ穂腐れ病は、Fusarium graminearum(テレオモルフ:Gibberella
zeae)によって生じる。F. graminearum培養株を、V−8寒天培地(V−8ジュー
スで作成)上で、12時間毎に照明と暗黒が交代するサイクル下に25℃で生育
する。。胞子は、最初に無菌蒸留水でプレートを冠水させた後、ガラス棒でプレ
ートをこすって収穫する。溶液を収集し、そして接種日に、胞子濃度を2回蒸留
した無菌水で5×10胞子/mlに調整する。形質転換苗およびコントロール
苗は温室もしくは農場で生育させる。温室で生育させる場合、形質転換およびコ
ントロール苗は絹糸出現後4〜7日までその温室で保存し、その時2ml胞子懸
濁液を絹糸のチャネル(殻腔内および穂軸上部)に導入する。これは大きな注射器
に取り付けた18ゲージステンレス鋼皮下注射針を用いて遂行する。絹糸チャネ
ル接種に加えて、殻接種法もまた疾病抵抗性をアッセイするために使用される。
殻接種は胞子懸濁液(およそ0.4ml)を4個の殻の群へ、注射器に取り付けた
18ゲージステンレス鋼皮下注射針で頻回注射により導入することを伴う。疾病
は接種後5〜7週で収穫された穂を、視覚的に感染している殻に対し視覚検査し
て評価する。腐った穂に対する疾病格付けスケールは次のように、穂における視
覚的に感染している殻のパーセンテージの視覚的評価に基づいている:1は0%
;2は1〜3%;3は4〜10%;4は11〜25%;5は26〜50%;6は
51〜75%;7は76〜100%。野生型コントロール体と比較して視覚的に
感染している殻のより低いパーセンテージを有するトウモロコシ苗を選択する。
【0154】 実施例10:マイコトキシン汚染アッセイ 次のようにマイコトキシン濃度分析のために試料を調整する。種子をこの発明
の形質転換植物から収集し、秤量し、一緒に混ぜる。コムギ種子をアッセイする
場合、この発明の同じ形質転換植物の頭花から収集し、秤量し、一緒に混ぜる。
形質転換トウモロコシをアッセイする場合、トウモロコシ穂を低水分レベルにま
で乾燥させ、穂を手で殻をむき、同じ形質転換植物の穂からの殻を秤量し、一緒
に混ぜる。各種子もしくは殻試料を種子の無作為分布を促進するため十分混合す
る。種子もしくは殻試料の50gを粉砕機(例えば、Retsch超遠心粉砕機
ZM1型、BrinkmanInstruments, Inc., Rexdale, Ontario, Romer Series II M
ill, Union, Missouri, USA)中で細かな粉末に粉砕する。DONのような興味の
対象のマイコトキシンの濃度をそこでDONtest TAG[登録商標]マイコ
トキシン試験システム(VICAM, LP, 313 Pleasant Street, Watertown, MA 02472
)のような市販の試験手段を用いて測定するかもしくは商業的な分析会社(例えば
、Romer Labs, Inc, Union, Missouri, USAもしくはTrilogy Analytical Labora
tory, Inc, Beaufort, Missouri, USA)により分析するかである。分析のあらゆ
る態様に対しては製造者の指示書に従う。DONtest TAG[登録商標]マ
イコトキシン試験システムの場合には、DONに対する最終的な蛍光測定が行わ
れる。野生型コントロール体よりDONのようなマイコトキシンがより少ない種
子もしくは殻を生産する苗を選択する。
【0155】 実施例11:配列番号1に記載のポリヌクレオチドの選択可能マーカーとしての
使用 A.真菌細胞における選択可能マーカー Ashbya gossypiは、ガラクトシダーゼプロモーターに機能的に結合している配
列番号1の配列を持つポリヌクレオチドを含むDNA構築物で、標準的な真菌形
質転換技術を用いて形質転換される。形質転換細胞は1.56ng/mlから1
96pg/mlの範囲にわたる濃度でDASを含む培地で生育するが、一方では
、非形質転換野生型は生育しない。
【0156】 B.植物細胞における選択可能マーカー 上の実施例3に従って形質転換されているが未だ選択にかけられていないアラ
ビドプシス(Arabidopsis)植物からの種子を0、5、もしくは10μg/mlD
ASを含有する.1%アガロース培地中で平板培養する。生育室で22℃におい
て16時間照明および8時間暗闇で2週間インキュベーション後、より大きな発
育阻止されていない苗がDASプレートから移植され、そしてそれと対応する数
がコントロール体プレートから移植される。
【0157】 5マイクログラム/mlプレートから移植されたアラビドプシス(Arabidopsis
)植物の葉は、2週間の生育期間の後で酵素活性に対してアッセイされ、そして
発育阻止されていなかった11本の苗の内11本が、実施例6により測定すると
、酵素的に活性であったが、一方では、DASによって選択されなかった10本
の苗の内9本は同じアッセイでネガティブであった。酵素的に活性であった非選
択の一本の苗はアッセイされたDAS選択の何れかの苗よりもはるかに活性は低
かった。
【0158】 上に開示された態様は例示的である。この発明のこの開示は、当業者をこの発
明の多数の変形例を保有する状態に置くであろう。かかる明白かつ予見し得る変
形例はすべて付随の請求項により包含されることを意図するものである。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:645) C12N 5/00 C (C12N 5/10 C12R 1:91) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,AU, AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C N,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EE ,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR, HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,K P,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU ,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX, NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,S G,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ ,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 シェリル・ピーターズ アメリカ合衆国27612ノースカロライナ州 ローリー、バレー・エステイツ・ドライブ 6308番 (72)発明者 ジョン・マニュエル・サルメロン アメリカ合衆国27278ノースカロライナ州 ヒルズバーロウ、ブラックベリー・レイン 1308番 (72)発明者 ジャネット・エヌ・リード アメリカ合衆国27712ノースカロライナ州 ダーラム、レイク・ビスタ・ドライブ5415 番 (72)発明者 ジョン・エル・ドーソン アメリカ合衆国27403ノースカロライナ州 グリーンズボロ、イースト・エイボンデイ ル・ドライブ214番 Fターム(参考) 2B030 AA02 AB03 AD04 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD10 CD13 CD17 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 GA11 HA20 4B065 AA65Y AA88X AB01 AC20 BA01 CA53

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 植物細胞中で発現される遺伝子産物をコード化する異種ポリ
    ヌクレオチドを含む植物細胞であって、遺伝子産物がトリコテセン抵抗性活性を
    持つ、植物細胞。
  2. 【請求項2】 植物がトリコテセンに抵抗性を有する、請求項1記載の植物
    細胞を含む植物。
  3. 【請求項3】 植物がC−3ヒドロキシル基を含むトリコテセンに抵抗性を
    有する、請求項2記載の植物。
  4. 【請求項4】 植物がトリコテセン、好ましくはC−3ヒドロキシル基を含
    むトリコテセン、を生産する真菌に抵抗性を有する、請求項1記載の植物。
  5. 【請求項5】 植物がフザリウム(Fusarium)、好ましくはFusarium gramine
    arumに抵抗性を有する、請求項4記載の植物。
  6. 【請求項6】 異種ポリヌクレオチドが微生物のポリヌクレオチド、好まし
    くは酵母もしくは真菌のポリヌクレオチドである、請求項2記載の植物。
  7. 【請求項7】 真菌のポリヌクレオチドがフザリウム(Fusarium)のポリヌク
    レオチド、好ましくはFusarium graminearumもしくはFusarium sporotrichioide
    sのポリヌクレオチドである、請求項6記載の植物。
  8. 【請求項8】 異種ポリヌクレオチドが配列番号1、5もしくは7と実質的
    に類似している配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の植物。
  9. 【請求項9】 異種ポリヌクレオチドが配列番号1、5もしくは7の核酸配
    列を含む、請求項8記載の植物。
  10. 【請求項10】 配列番号1、5もしくは7に示された連続的80塩基対部
    分と配列が同一である連続的な少なくとも80塩基対部分、好ましくは配列番号
    1、5もしくは7に示された連続的50塩基対部分と配列が同一である連続的な
    少なくとも50塩基対部分、更に好ましくは配列番号1、5もしくは7に示され
    た連続的21塩基対部分と配列が同一である連続的な少なくとも21塩基対部分
    、および最も好ましくは配列番号1、5もしくは7に示された連続的18塩基対
    部分と配列が同一である連続的な18塩基対部分を含む、異種ポリヌクレオチド
    を含む請求項8記載の植物。
  11. 【請求項11】 異種ポリヌクレオチドが配列番号1、5もしくは7に示さ
    れた連続的18塩基対部分と配列が同一である連続的な18塩基対部分を含む、
    請求項10記載の植物。
  12. 【請求項12】 トリコテセンがT−2毒素、TH−2毒素、イソトリコデ
    ルモール、DAS、3−デアセチルカロネクトリン、3、15−ジデアセチルカ
    ロネクトリン、シルペントリオール、ネオソラニオール;タイプB:15−アセ
    チルデオキシニバレノール、ニバレノール、4−アセチルニバレノール(フサレ
    ノン‐X)、4、15−ジアセチルニバレノール、4、7、15−アセチルニバ
    レノール、およびDONからなるグループから選択されたものである、ただし好
    ましくはDONもしくはDASである、請求項1〜11のいずれか1項記載の植
    物。
  13. 【請求項13】 遺伝子産物が請求項1および6〜9のいずれか1項記載の
    ポリヌクレオチドによってコード化される、請求項2記載の植物。
  14. 【請求項14】 遺伝子産物が、植物にトリコテセン抵抗性を付与するタン
    パク質、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ、ただし特に3−O−アセチル
    トランスフェラーゼである、請求項13記載の植物。
  15. 【請求項15】 遺伝子産物が配列番号2、6もしくは8に実質的に類似し
    た配列を含むポリペプチドである、請求項14記載の植物。
  16. 【請求項16】 植物がコムギ、トウモロコシ、オオムギ、もしくはイネで
    ある、請求項2〜15のいずれか1項記載の植物。
  17. 【請求項17】 請求項2〜15のいずれか1項記載の植物の種子。
  18. 【請求項18】 トリコテセン抵抗性を有する植物を生産する方法であって
    、 a)遺伝子産物をコード化する異種遺伝子で植物細胞を形質転換させ、そこでは
    遺伝子産物がトリコテセン抵抗性を増強しており; b)遺伝子産物を生物学的に有意なレベルで発現させ; c)植物細胞を植物に再生させ;および d)トリコテセンに対する抵抗性が増強した植物を選抜する というステップより成る方法。
  19. 【請求項19】 そこで真菌がトリコテセン毒性因子を生産する、真菌の増
    殖が低減された植物を選抜するステップを更に含む、請求項18記載の方法。
  20. 【請求項20】 真菌がフザリウム(Fusarium)属である、請求項19記載の
    方法。
  21. 【請求項21】 請求項2〜16のいずれか1項記載の植物、もしくは請求
    項18〜20記載の方法によって生産した植物を、好ましくは中等度から重度の
    真菌侵襲のある地域において生育させることより成る、植物(植物の種子を含む)
    のマイコトキシン汚染を防止する方法。
  22. 【請求項22】 植物が作物である、請求項20記載の方法。
  23. 【請求項23】 請求項2〜16のいずれか1項記載の植物、もしくは請求
    項18〜20記載の方法によって生産した植物を、好ましくは中等度から重度の
    真菌侵襲のある地域において生育させることより成る、トリコテセン、好ましく
    はC−3ヒドロキシル基を有するトリコテセンを生産する植物上で、真菌、好ま
    しくはフザリウム(Fusarium)属の真菌の増殖を低減および/もしくは阻止する方
    法。
  24. 【請求項24】 植物が作物である、請求項18〜24のいずれか1項記載
    の方法。
  25. 【請求項25】 真菌に抵抗性を有する植物を生産する方法であって、 (a)遺伝子産物をコード化する異種遺伝子で植物細胞を形質転換させ、そこでは
    遺伝子産物がトリコテセン抵抗性を増強しており; (b)遺伝子産物を生物学的に有意なレベルで発現させ; (c)植物細胞を植物に再生させ; (d)トリコテセンに対する抵抗性が増強した植物を選抜し;および (e)任意に、ステップ(d)で得られた植物を自家受精もしくは異系交配させる というステップより成る方法。
  26. 【請求項26】 真菌がフザリウム(Fusarium)属である、請求項25記載の
    方法。
  27. 【請求項27】 請求項2〜16のいずれか1項記載の植物もしくは請求項
    25〜26記載の方法で生産した植物を自家受精もしくは異系交配させ種子を採
    取することより成る、種子から成育した植物が真菌に抵抗性を有する、種子を生
    産する方法。
  28. 【請求項28】 種子がフザリウム(Fusarium)属の真菌に抵抗性を有する、
    請求項27記載の方法。
  29. 【請求項29】 その方法が、トリコテセン3−O−アセチルトランスフェ
    ラーゼをコード化する核酸構築物で宿主を形質転換し、形質転換宿主細胞をトリ
    コテセン存在下で生育させることより成る、形質転換宿主細胞を選抜する方法。
  30. 【請求項30】 宿主細胞が植物細胞である、請求項29記載の方法。
  31. 【請求項31】 宿主細胞が微生物宿主細胞である、請求項30記載の方法
  32. 【請求項32】 微生物宿主細胞が真菌宿主細胞である、請求項31記載の
    方法。
  33. 【請求項33】 トリコテセンがT−2毒素、TH−2毒素、イソトリコデ
    ルモール、DAS、3−デアセチルカロネクトリン、3、15−ジデアセチルカ
    ロネクトリン、シルペントリオール、ネオソラニオール;タイプB:15−アセ
    チルデオキシニバレノール、ニバレノール、4−アセチルニバレノール(フサレ
    ノン‐X)、4、15−ジアセチルニバレノール、4、7、15−アセチルニバ
    レノール、およびDONからなるグループから選択されたものである、請求項2
    9記載の方法。
  34. 【請求項34】 請求項18〜20のいずれか1項記載の方法により得られ
    るトリコテセン抵抗性を有する植物。
  35. 【請求項35】 請求項25〜26のいずれか1項記載の方法により得られ
    る真菌抵抗性を有する植物。
  36. 【請求項36】 請求項27〜28のいずれか1項記載の方法により得られ
    る植物種子。
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