MX2014007861A - Uso de auxin- sintasa para mejorar rendimiento de cultivo. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para incrementar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden incrementar la expresión de un gen o secuencia codificadora de auxin-sintasa en el meristemo de brote e inflorescencia de una planta, las composiciones de la invención comprenden construcciones de ADN que comprenden una secuencia codificadora de auxin-sintasa operablemente enlazada a un promotor que activa preferencialmente la expresión en el meristemo de brote e inflorescencia de una planta. También se abarcan plantas, células vegetables, tejidos vegetales y semillas que se han transformado con la construcción de ADN. La invención reconoce que la mejora de la expresión de auxina en el meristemo de brote e inflorescencia a una planta da por resultado la mejora en el rendimiento y crecimiento vegetal, dando por resultado un incremento en el rendimiento de cultivo en un campo plantado con estas plantas.

Description

USO DE AUXIN-SINTASA PARA MEJORAR RENDIMIENTO DE CULTIVO Campo de la Invención Esta invención está en el campo de ingeniería genética vegetal. Esta invención comprende un método para obtener plantas transgénicas de alto rendimiento al expresar el gen de sintasa de ácido indolacético (IAA) . Está invención se puede aplicar en el campo de reproducción de cultivos.

Antecedentes de la Invención La auxina es un importante químico de señal que controla el desarrollo y crecimiento vegetal. Controla la división, expansión y diferenciación de células vegetales, así como la floración y formación de raíces laterales. (Davies P.J. (2004) The Plant Hormone: Their Nature, Kluwer, Dordrecht, los países bajos) . La ruta biosintética de la axina a nivel genético ha permanecido no claro. Se ha propuesto dos rutas principales: las rutas independientes de triptofano (Try) y dependientes de Trp. Ver Mashiguchi et al. (2011) PNAS 108:18512-18517). También existen genes de auxin-sintasa en microorganismos (Thomashow et al. (1984) PNAS 81:5071-5075; Van Onckelen et al. (1986) FEBS Lett 198:357-360. Aunque es extensa la investigación con respecto a auxina, las rutas de síntesis y la función de la auxina permanecen no claras en plantas.

En años recientes, el gen de auxina-sintasa se ha usado como una herramienta para mejora de cultivos. El gen de auxina-sintasa se ha expresado en las células epiteliales del óvulo de algodón que da por resultado algodón transgénico con rasgos de alta calidad y alto rendimiento. (Zhang et al. (2011) Nature Biotechnology 29: 453-458) . El gen de auxina-sintasa también se expresó en uva activado por el promotor especifico del óvulo dando por resultado el incremento en la fecundidad de la uva. (Costantini et al. (2007) PlantPhysiol 143:1689-1694). Sin embargo, aún no han métodos efectivos para mejorar el rendimiento de cultivos principales, tal como arroz, maíz, soya, trigo, cebad, sorgo y girasol. El impacto de la auxina en las plantas es complicado. En realidad, un exceso de auxina puede ser bastante dañino a la planta. Por lo tanto, se necesitan métodos para utilizar la auxina para mejorar el rendimiento de cultivo.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan composiciones y métodos para incrementar el rendimiento vegetal. Los métodos de la invención comprenden incrementar la expresión de un gen de auxina-sintasa o secuencia codificadora en el meristemo de brote y la inflorescencia de una planta. Las composiciones de la invención comprenden construcciones de ADN que comprenden una secuencia codificadora de auxina-sintasa operablemente enlazada a un promotor que activa la expresión en el meristemo de brote y la inflorescencia de una planta. También se abarcan plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas que se han transformado con la construcción de ADN. La invención reconoce que la mejora de la expresión de auxina en el meristemo de brote y la inflorescencia en una planta da por resultado la mejora en el rendimiento vegetal, dando por resultado un incremento en el rendimiento de cultivo en un campo plantado con estas plantas.

De esta manera, la presente invención se refiere en general al campo de biología molecular y se refiere a un método para incrementar el rendimiento vegetal con relación a plantas de control. De manera más específica, la presente invención se refiere a un método para incrementar el rendimiento vegetal, el cual comprende modular la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica para un gen de auxina-sintasa o un homólogo del mismo en el meristemo de brote y la inflorescencia de una planta. La presente invención también se refieren a plantas que tienen expresión elevada de un ácido nucleico que codifica para el gen de auxina-sintasa en los meristemos de brote y la inflorescencia, plantas que tienen crecimiento y rendimiento incrementados con relación a plantas de control. La invención también proporciona construcciones útiles en los métodos de la invención.

La presente invención abarca las siguientes modalidades : 1. Un método para incrementar el rendimiento vegetal en una planta de interés, el método que comprende transformar la planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en un meristemo de brote vegetal y en la inflorescencia, operablemente enlazada a una secuencia codificadora de auxina-sintasa, y seleccionar plantas que tienen un fenotipo de alto rendimiento . 2. El método de la modalidad 1, en donde el promotor es un promotor de un gen tipo Mei2 vegetal. 3. El método de la modalidad 2, en donde el promotor comprende una secuencia seleccionada de las secuencias expuestas en SEQ ID N0:1 - SEQ ID NO: 10. 4. El método de cualquiera de las modalidades 1-3, en donde la secuencia codificadora de auxina-sintasa es una secuencia codificadora de sintasa de ácido indolacético (IAA) de un microorganismo. 5. El método de cualquiera de las modalidades 1-3, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia codificadora de auxin-sintasa vegetal. 6. El método de cualquiera de las modalidades 4 o 5, en donde la secuencia codificadora de auxina-sintasa es una secuencia sintética. 7. El método de cualquiera de las modalidades 1-3 y 5, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa se selecciona del grupo que consiste de: i) la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; ii) una secuencia que tiene al menos 60% de identidad de secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19; y, iv) una secuencia e nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19. 8. El método de cualquiera de las modalidades 1-7, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de arroz, maiz, algodón, trigo, cebada, soya, girasol, cañóla y sorgo . 9. Un cásete de expresión que comprende una construcción de ADN, la construcción que comprende un promotor que activa la expresión en un meristemo de brote vegetal e inflorescencia, operablemente enlazada a una secuencia codificadora de auxin-sintasa. 10. El cásete de expresión de la modalidad 9, en donde el promotor es un promotor de un gen tipo Mei2 vegetal. 11. El cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-10, en donde el promotor comprende una secuencia seleccionada de las secuencias expuestas en SEQ ID NO:l - SEQ ID NO:10. 12. El cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-11, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia codificadora de sintasa de ácido indolacético (IAA) de un microorganismo. 13. El cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-11, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia codificadora de auxin-sintasa vegetal . 14. El cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 12 o 13, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia sintética. 15. El cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-11 y 13, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa se selecciona del grupo que consiste de: i) la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; ii) una secuencia que tiene al menos 60% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:ll, 12, o 13; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs:14-19; y, iv) una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19. 16. Una planta transformada con el cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-12. 17. Una semilla transformada de la planta de la modalidad 16. 18. El método de cualquiera de la modalidad 5, en donde la secuencia de auxin-sintasa es una secuencia endógena. 19. Una planta transformada que exhibe expresión incrementada de auxina-sintasa en su meristemo de brote e inflorescencia en comparación a una planta de control. 20. La planta transformada de la modalidad 19, en donde la planta se ha transformado con una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en un meristema de brote e inflorescencia de planta, operablemente enlazada a una secuencia codificadora de auxin-sintasa. 21. La planta transformada de la modalidad 19 o 20, en donde la planta en donde el promotor es un promotor de un gen tipo Mei2 vegetal. 22. La planta transformada de la modalidad 21, en donde el promotor comprende una secuencia seleccionada de las secuencias expuestas en SEQ ID NO:l - SEQ ID NO: 10. 23. La planta transformada de cualquiera de las modalidades 19-22 en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia codificadora de sintasa de ácido indolacético (IAA) de un microorganismo. 24. La planta transformada de cualquiera de las modalidades 19-22, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia codificadora de auxin-sintasa vegetal . 25. La planta transformada de cualquiera de las modalidades 19-24, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia sintética. 26. La planta transformada de cualquiera de las modalidades 19-22 y 24-25, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa se selecciona del grupo que consiste de: i) la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; ii) una secuencia que tiene al menos 60% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:ll, 12, o 13; iii) un secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs:14-19; y, iv) una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NO : 14-19. 27. La planta transformada de la modalidad 24, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa es una secuencia endógena. 28. Semilla transformada de la planta de cualquiera de las modalidades 19-27. 29. La planta transgénica de cualquiera de las modalidades 19-27, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de arroz, maíz, algodón, trigo, cebada, soya, girasol, cañóla, y sorgo. 30. La planta de cualquiera de las modalidades 19-27, en donde la planta es una monocotiledónea . 31. La planta de cualquiera de las modalidades 19-27, en donde es una planta es una dicotiledónea. 32. Una planta transformada que tiene expresión incrementada de auxin-sintasa en el meristemo de brote o inflorescencia y que tiene adicionalmente expresión incrementada de una secuencia TEL.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a métodos para incrementar la expresión de una secuencia codificadora o gen de auxin-sintasa en el meristema de brote e inflorescencia de plantas o células vegetales. Al incrementar o mejorar la expresión de una auxin-sintasa en el meristema de brote e inflorescencia, la planta exhibe una mejora en el rendimiento vegetal. La expresión en la planta se incrementa al transformar la planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en el meristema de brote e inflorescencia de una planta operablemente enlazada a una secuencia codificadora de auxin-sintasa .

Un incremento en la expresión de una secuencia de auxina-sintasa en el meristema de brote e inflorescencia de una planta da por resultado un incremento en el rendimiento y crecimiento vegetal. La planta transformada tiene un incremento en el rendimiento sin reducción en el índice de recolección. Las plantas transformadas tienen producción incrementada de semillas y semillas más grandes. Algunas plantas pueden exhibir crecimiento incrementado con plantas más grandes resultantes. La plantación de un campo de plantas transformadas de la invención dará por resultado rendimiento incrementado de cultivo. Por "rendimiento de cultivo" se propone la cantidad de un cultivo que se recolecta por unidad de área de tierra. El rendimiento de cultivo es la medición frecuentemente usada para un serial, grano o legumbre y normalmente se mide en toneladas métricas por hectárea (o kilogramos por hectárea) . El rendimiento de cultivo también se refiere a la generación real de semillas de la planta.

Por "mejorar o incrementar la expresión de un gen o secuencia codificadora de auxin-sintasa" se propone que la expresión como se mide por la producción de ARNm o proteína de auxin-sintasa se incrementa en la planta de interés en comparación a una planta de control. La auxin-sintasa se incrementa al menos aproximadamente 0.25 veces, al menos aproximadamente 0.3 veces, al menos aproximadamente 0.5 veces, al menos aproximadamente una vez, al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cuatro veces, al menos aproximadamente cinco veces, al menos aproximadamente seis veces, al menos aproximadamente siete veces, al menos aproximadamente ocho veces, al menos aproximadamente nueve veces, al menos aproximadamente 10 veces o más.

Por "planta de control" se propone una planta donde no se ha alterado ni mejorado la expresión de la secuencia de auxin-sintasa, es decir, una planta o célula vegetal genéticamente idéntica a la planta o célula vegetal pero que no se ha expuesto a condiciones o estímulos que incrementarán la expresión de una secuencia de auxina-sintasa .

En tanto que no se une por ninguna teoría, se cree que la sobreproducción extrema de la secuencia codificadora de auxin-sintasa pueda dar por resultado plantas con fenotipos indeseables. Por lo tanto, se puede controlar la expresión por la selección de los promotores usados para activar la expresión de una secuencia de auxin-sintasa en una planta transformada. Los promotores preferidos de tejido, particularmente, aquellos promotores que se expresan preferencialmente en la etapa temprana del desarrollo de la flor se prefieren en la invención. Estos promotores no deben ser promotores fuertes. Los promotores que activan la expresión en el meristemo de brote e inflorescencia son útiles en la práctica de la invención. Estos promotores incluyen Mei2. Los promotores ei2 proporcionan buenos resultados en la expresión del gen recombinante a niveles deseados y en tejidos deseados. Como se analiza más adelante, cualquier promotor que activa la expresión en el meristemo de brote e inflorescencia de una planta se puede usar. Una vez que se ha transformado una planta, se puede seleccionar la planta deseada con base al fenotipo. De esta manera, los métodos de la invención comprenden adicionalmente la selección del fenotipo deseado de la planta transformada. Estas plantas deseadas exhibirán crecimiento y rendimiento incrementado del grano o biomasa.

Estas plantas deseadas se pueden cultivar y cruzar con plantas adecuadas para producir semillas que tienen el fenotipo deseado. Es decir, el gen recombinante de auxin-sintasa que se ha insertado en el genoma de una planta se puede cruzar en otras plantas. Estas plantas se cultivarán y usarán para producir un cultivo con rendimiento mejorado.

Por "gen de auxin-sintasa" o "secuencia de auxin-sintasa" se propone una secuencia que codifica para la secuencia completa de aminoácidos de la proteina de auxin-sintasa o variantes o truncamientos de la proteina de auxin- sintasa. En la técnica se conocen varios genes de auxin-sintasa y cualquiera se puede usar en la práctica de la invención, incluyendo fragmentos y variantes de genes conocidos de auxin-sintasa en tanto que los fragmentos y variantes retienen la actividad deseada de promover el crecimiento vegetal e incrementar el rendimiento. En la práctica de la invención se puede usar cualquier secuencia codificadora de auxin-sintasa. El gen de auxin-sintasa puede venir de ya sea un microorganismo o una planta. Por ejemplo, los genes microbianos de auxin-sintasa incluyen pero no se limitan a: auxin-sintasas de Agrobacterium turnefaciens (AAF77123, AAB41874), auxin-sintasas de Pseudomonas sycingae 20 (AAR06971, EF100478, y AAA17678), auxin-sintasa de Dickeya dadantii (ADM96599) , auxin-sintasa de Pantoea agglomerans (AAC17187), etc. También se pueden usar auxin-sintasas de planta en la práctica de la invención. Estas secuencias de auxin-sintasa incluyen, pero no se limitan a, auxin-sintasa (C/AB79971) de Arabidopsis thaliana y sus genes homólogos en otras plantas. Se pueden aislar o clonar otras auxin-sintasas de otras plantas y microorganismo usando las secuencias identificadas anteriormente. Igualmente, se pueden sintetizar de manera sustancial secuencias de auxin-sintasa. La ventaja del fragmento sintético de ADN es que el uso de codones de aminoácidos se puede optimizar para diferentes plantas diana. Los métodos de la invención no se limitan a ninguna auxin- sintasa particular. De esta manera, también se pueden utilizar otras auxin-sintasa de otros organismos para el propósito de esta invención.

Las proteínas de auxina-sintasa o tipo auxina-sintasa incluyen aquellas que tienen al menos 40%, al menos 50%, al menos 58% al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad de secuencia a una secuencia conocida de auxina-sintasa.

Se describen en la presente varios genes de auxin-sintasa y se conocen en la técnica y en cualquier planta de interés se puede usar cualquiera de esta secuencias de auxin-sintasa, así como variantes y truncamientos de las mismas. Como se analiza más adelante, las secuencias de la presente se pueden usar para aislar otros genes de auxin-sintasa que son útiles en la práctica de la invención. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas de auxin-sintasa de la presente invención incluyen las secuencias expuestas en SEQ ID NOs: 11-13, y variantes, fragmentos, y complementos de estos .

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas de auxin-sintasa también se abarcan por la presente invención. Por "fragmento" se propone una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina de auxin-sintasa . Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar para una porción biológicamente activa de una proteina de auxin-sintasa, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación o cebador de PCR útil para aislar otras secuencias tipo auxin-sintasa. Típicamente, los fragmentos de truncamientos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán para fragmentos de proteína que retengan la actividad biológica de la proteína de auxin-sintasa, y por lo tanto, retengan la actividad de auxin-sintasa. Por "retener la actividad" se propone que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad de auxin-sintasa de la proteína de auxin-sintasa. Por "actividad de la proteína de auxin-sintasa" se propone la producción de etileno y rendimiento o crecimiento vegetal incrementado. Se pueden seleccionar aquellas plantas que exhiban los niveles deseados de producción incrementada de auxin-sintasa con base al fenotipo de la planta regenerada. De esta manera, las variantes y truncamientos de la secuencia de auxina-sintasa se pueden probar para la actividad por transformación de la secuencia en una planta de interés y seleccionar para plantas que tengan el fenotipo deseado.

Se pueden hacer variantes de las moléculas de ácido nucleico de auxin-sintasa por varios métodos. Estas alteraciones pueden dar por resultado proteínas codificadoras de secuencias de ADN con secuencias de aminoácidos diferentes de las codificadas por una proteína de auxina-sintasa de la presente invención. De esta manera, la proteína se puede alterar de varias maneras incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos. En la técnica se conocen en general los métodos para estas manipulaciones.

Las proteínas preferidas de auxin-sintasa de la presente invención se codifican por una secuencia de nucleótidos idéntica o que tiene identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias de auxin-sintasa listadas en la presente o contenidas dentro del listado de secuencias. Las secuencias variantes de aminoácidos o de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% o 85% de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor de identidad de secuencia en comparación a una secuencia de auxin-sintasa de referencia usando uno de los programas de alineación descritos en la presente usando parámetros normales se abarcan por la invención. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar de manera apropiada para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la colocación del cuadro de lectura y similares.

Usando un algoritmo matemático se puede lograr la determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Este algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácido nucleico tipo auxin-sintasa de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteína de auxin-sintasa de la invención. Para obtener alineaciones separadas para propósitos de comparación, se puede utilizar BLAST con separación (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. De manera alternativa se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda con iteración que detecta las relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra . Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con separación y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN) . También se puede realizar manualmente la alineación mediante inspección.

Se pueden usar otros algoritmos matemáticos para la comparación de secuencias incluyendo el algoritmo Clustal (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:46735 4680). A menos que se señale de otro modo, GAP Versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 (3) : 443-453, se usará para determinar la identidad de secuencia o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y por ciento de similitud para una secuencia de nucleótidos usando Peso GAP de 50 y Peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna . cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando peso GAP de 8 y longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden usar programas equivalentes. Por "programa equivalente" se propone cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene correspondencias idénticas de residuos de nucleótidos y un por ciento idéntico de identidad de secuencia en comparación a la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

Como se indica, en la práctica de la invención se pueden usar moléculas variantes de ácido nucleico de auxin-sintasa. "Variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas de auxina-sintasa incluyen aquellas secuencias que codifican para las proteínas de auxin-sintasa descritas en al presente pero que difieren de manera conservadora debido a la degeneración del código genético así como aquellas que son suficientemente idénticas como se analiza anteriormente. Las variantes alélicas que se presentan de forma natural se puede identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se resume más adelante. Las secuencias variantes de nucleótidos también incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas que se han generado, por ejemplo, al usar mutagénesis dirigida al sitio pero que aun codifican para las proteínas de auxin-sintasa descritas en la presente invención como se analiza más adelante. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, actividad de auxin-sintasa.

El experto apreciará adicionalmente que se pueden introducir cambios por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención, conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas de auxin-sintasa, sin alterar la actividad biológica de proteínas. De esta manera, las moléculas aisladas, variantes de ácido nucleico se pueden crear al introducir una o más sustituciones, adiciones o supresiones de ácido nucleico en la correspondiente secuencia de nucleótidos descrita en la presente, tal que en la proteína codificada se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido. Se pueden introducir mutaciones por técnicas normales, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Estas secuencias variantes de nucleótidos también se abarcan por la presente invención.

Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se pueden hacer en uno o más residuos previstos, no esenciales de aminoácido. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia tipo silvestre de una proteína de auxin-sintasa sin alterar la actividad biológica, en tanto que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

Se pueden elaborar sustituciones de aminoácido en regiones no conservadas que retienen la función. En general, estas sustituciones no serán para residuos conservados de aminoácido, o para residuos de aminoácido que residen dentro de un motivo conservado, donde estos residuos son esenciales para la actividad de la proteina. Los ejemplos de residuos que están conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteina incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de proteínas similares o relacionadas a la secuencia de la invención (por ejemplo, residuos que son idénticos en una alineación de proteínas homologas) . Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados. En una modalidad, en los motivos conservados no se harán cambios en las secuencias de aminoácidos o en la región que circunda los motivos como se expone en la Figura 2.

También se abarcan anticuerpos a los polipéptidos de la presente invención, o a variantes o fragmentos de estos. En la técnica son bien conocidos los métodos para producir anticuerpos (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente de los Estados Unidos No. 4, 196,265) .

Además de las proteínas de auxin-sintasa listadas en esta solicitud, esta invención también proporciona métodos para clonar y utilizar nuevos genes de auxin-sintasa de otros organismos, incluyendo plantas, musgos, microorganismos y hongos. Por ejemplo, al usar las secuencias proporcionadas en la presente, se pueden clonar nuevas secuencias de auxina-sintasa usando métodos tal como PCR e hibridación de ácido nucleico. Los cebadores de PCR se pueden diseñar de acuerdo a las reacciones conservadoras de las secuencias de ADN de genes de auxin-sintasa. Adicionalmente, las secuencias conservadoras de aminoácidos se pueden usar para diseñar cebadores degenerados para PCR. Se puede usar un gen parcialmente conocido de PCR para clonar un gen de longitud completa usando varios métodos conocidos, tal como Tail-PCR, 5' RACE, 3' RACE, etc. Ver, por ejemplo, Singer y Burke (2003) Methods Mol Biol 236:241-272; y equipos comercialmente disponibles. Como se describe más adelante, los genes proporcionados en esta invención y en otras publicaciones se pueden usar para preparar sondas para hibridar bibliotecas genómicas o de ADNc para clonar genes de auxin-sintasa.

Con el rápido avance de varios proyectos de secuenciacíón, se pueden identificar nuevos genes de auxin-sintasa al buscar varias bases de datos usando las secuencias de aminoácidos de auxin-sintasa y/o secuencias nucleicas proporcionadas por esta invención. Estas bases de datos incluyen pero no se limitan a bases de datos de secuencias de genoma, secuencias de ETS, y secuencias de ADNc. Se usa ampliamente el método BLAST (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol.215, 403-410).

En un método de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos de auxin-sintasa descrita en la presente se puede usar para examinar ADNc o bibliotecas genómicas para secuencias adicionales de auxin-sintasa para uso en la invención. En la técnica se conocen en general métodos para la construcción de estas bibliotecas genómicas y de ADN y se describen en Sambrook y Russell, 2001, supra. Las llamadas ondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ADN, u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar como un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor enzimático. En la técnicas se conocen en general métodos para la preparación de sondas para hibridación y se describen en Sambrook y Russell, 2001, incorporado en la presente supra por referencia.

La hibridación de estas secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Por "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" se propone condiciones bajo las cuales una sonada hibridará su secuencia diana a un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al fondo) . Las condiciones severas son dependiente de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o condiciones de lavado, las secuencias diana que son 100% complementarias a las sondas se pueden identificar (sondeo homólogo) . De manera alternativa, se pueden ajusfar las condiciones de severidad para permitir algunas malas correspondencias en las secuencias de modo que se detectan menores grados de similitud (sondeo heterólogo) . En general, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, de manera preferente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones de severidad serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menos de aproximadamente ión Na 1.5 M, típicamente cerca de una concentración de ión Na de 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayor de 50 nucleótidos) . También se pueden lograr condiciones severas con la adición de agentes desestabilizadores tal como formamida. Las condiciones de baja severidad de ejemplo incluyen hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, 1% de SDS (dodecil-sulfato de sodio) a 37 °C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) de 50 a 55 °C. Las condiciones de severidad moderada de ejemplo incluyen hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1.0 M, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad de ejemplo incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en 0. IX SSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, los amortiguadores de lavado pueden comprender de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1% de SDS. La duración de la hibridación en general es menos de aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de lavados de pos-hibridación, los factores críticos que son la concentración iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm se puede aproximar de la ecuación de Meinkotha y Walhl (1984) Anal. Biochem. 138:276-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC)- 0-61 (% forma) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanocina y citocina en el ADN, por ciento de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en los pares de base. La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica y pH definido) a la cual 50% de una secuencia diana complementaria híbrida a una sonda perfectamente correspondida. Tm se reduce por aproximadamente 1°C por cada 1% de mal correspondencia. De esta manera, Tm, hibridación y/o condiciones de lavado, se pueden ajustar para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con =90% de identidad, la Tm se puede disminuir 10°C. En general, se seleccionan condiciones severas para que sean aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia especifica y su complemento a una concentración y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas se pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm) . Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, aquellos expertos en la técnica entenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de lavado y/o hibridación. Si el grado deseado de mal correspondencia da por resultado una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , se prefiere incrementar la concentración de SSC de modo que se pueda usar una mayor temperatura. Se encuentra una guia extensa de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capitulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds. (1995) CurrentProtocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) .

Como se señala anteriormente, los métodos de la invención comprenden transformar una planta de interés con una construcción de ADN o cásete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una secuencia de auxin-sintasa de la invención. El cásete de expresión incluirá en la dirección 5 '-3 ' de transcripción, una región de inicio de transcripción y traducción (es decir, un promotor) , una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación de traducción y transcripción es decir, región de terminación) funcional en plantas. Están actualmente disponibles métodos generales para introducir y expresar un gen de auxin-sintasa en una planta y por lo tanto en cultivos. Como se indica, se puede proporcionar una secuencia de auxin-sintasa de la invención en una construcción de ADN o un cásete de expresión para la expresión en una panta de interés. "Casetes de expresión vegetal" se propone una construcción de ADN que sea capaz de dar por resultado la expresión de una proteína de un cuadro de lectura abierto en una célula vegetal. Típicamente, estos contienen un promotor y una secuencia codificadora. Frecuentemente, estas construcciones también contendrán una región no traducida 3'.

Por "vector de transformación vegetal" se propone una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Esta molécula puede consistir de uno o más casetes de expresión vegetal, y se puede organizar en más de una molécula de ADN de "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetal que utilizan dos vectores no contiguos de ADN para codificar todas las funciones necesarias cis- y trans-actuantes para la transformación de células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferencia entre diferentes células hospedadoras . El "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad para incorporar, integrar y expresar secuencias heterólogas de ADN o fragmentos en una célula extraña. El cásete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' operablemente enlazadas so las secuencias de la invención. Por "operablemente enlazadas" se propone un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlaza están contiguas y donde es necesario unen dos regiones codificadoras de proteina, contiguas y en el mismo cuadro de lectura. El cásete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que se va a co-transformar en el organismo. De manera alternativa, los genes adicionales se pueden proporcionar en múltiples casetes de expresión.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificadora en la dirección 5' . El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y transduccionales (también llamadas "secuencias de control") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés. Los promotores para el uso en la práctica de la invención incluyen aquellos que activan la expresión en el miristemo de brote e inflorescencia de una planta. Los promotores son de importancia critica para esta invención. Los promotores usados por esta invención para controlar el gen de auxin-sintasa son aquellos que pueden regular la expresión génica preferencialmente en el miristema de brote e inflorescencia de planta, y en bajos o muy bajos niveles de expresión. Un ejemplo de un promotor para el uso en la invención incluye el promotor del gen TEL vegetal. Este tipo de promotor tiene las siguientes caracteristicas: a) son los promotores del gen TEL vegetal (por ejemplo, 30 NP_594609 y CAA15822); y, b) regulan la expresión específicamente en el meristema de brote e inflorescencia de planta. Estos promotores incluyen el promotor de arroz (SEQ ID NO: 1) ; de maíz (Zea mays) (SEQ ID NO: 2) ; de soya (Glycine max) (SEQ ID NOs:3 y 4); y de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOs : 5-7). Puesto que la función y especificidad de expresión de un promotor en diferentes plantas normalmente es conservadora, el promotor de una planta tiene frecuentemente la misma o similar función en otra planta. De esta manea, los promotores proporcionados por esta invención se pueden usar en diferentes plantas. Los promotores para regular los genes de auxin-sintasa para mayor rendimiento pueden ser otros promotores, tal como los promotores del gen FCA de Arabidopsis thaliana y sus promotores homólogos de otras plantas .

Otros promotores específicos de miristemo e inflorescencia se pueden obtener por métodos generales de biología molecular. Por ejemplo, al secuenciar el ARN de una inflorescencia vegetal, se pueden obtener los genes expresados en la inflorescencia. Las especificidades de expresión de estos genes se pueden determinar por transferencia Northern o chip génico. Mediante técnicas generales de biología molecular se pueden obtener genes expresados en la inflorescencia, especialmente en la inflorescencia temprana. Después de que se secuenció el genoma de una planta, se pueden determinar las regiones de los promotores por métodos informáticos moleculares y clonar. Normalmente, el promotor de un gen se localiza frecuentemente en el extremo 5' de la región codificadora de la proteina en el genoma, que tiene una longitud dentro de aproximadamente 2-3kb.

Las construcciones de ADN de la invención pueden comprender adicionalmente un terminador. Los terminadores frecuentemente usados incluyen el terminador de octopina-sintasa y el terminador de nopalina-sintasa de Agrobacterium. Ver, por ejemplo, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. Además, también se pueden usar otros terminadores en el cásete de expresión vegetal. Esta invención proporciona un ejemplo (Ejemplo 2) en el cual se sintetizaron de manera simultánea el gen de auxina-sintasa y el terminador, que simplificaron el procedimiento de construcción del cásete de expresión.

La construcción de ADN o cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de auxin-sintasa para que esté bajo el regulamiento transcripcional de las regiones reguladoras .

Los métodos de la invención comprenden introducir una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se propone presentar a la planta la construcción de nucleótidos de una manera tal que la construcción obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir una construcción de nucleótidos a una planta, solo que la construcción de nucleótidos obtenga acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en planta se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transciente y métodos mediados por virus.

Por "planta" se propone plantas enteras, órganos vegetales, (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de las mismas. Las células vegetales pueden estar diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos , células de hojas, células de raíz, células de líber, polen) .

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejido "establemente transformados" se refieren a plantas que tienen incorporadas o integradas secuencias exógenas de ácido nucleico o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, asi como aquellas que pueden ser endógenas, o estar presentes en la célula vegetal no transformada. "Heterólogo" se refiere en general a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes y se han adicionado a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares.

En general, los métodos de transformación vegetales comprenden transferir ADN heterólogo en células vegetales diana (por ejemplo, embriones maduros o inmaduros, cultivos en suspensión, callo no diferenciado, protoplastos , etc.), seguido por la aplicación de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Típicamente los explantes se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan por rutina. Subsiguientemente, las células transformadas se diferencian en brotes después de la colocación en el medio de regeneración complementado con un nivel de umbral máximo de agente selector, los brotes entonces se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar el brote enraizado o la plántula enraizada. La plántula transgénica entonces crece a una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750) . Típicamente los explantes se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan por rutina. Se encuentra una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas en Ayres y Park (1994) CriticalReviews in Plant Science 13:219-239 and Bommineni and Jauhar ( 1997 ) Maydica 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células; las células tanto transformadas como no transformadas están presentes en cualquier pieza de callo o tejido diana o grupo de células diana. La capacidad para aniquilar las células no transformadas y para permitir que proliferen las células transformadas da por resultado cultivos vegetales transformados. Frecuentemente, la capacidad para remover células no transformadas es una limitación a la recuperación rápida de células vegetales transformadas y a la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de plantas a célula vegetal, es decir, monocotiledónea y dicotiledónea, dirigida para transformación. Se puede realizar la generación de plantas transgénicas por uno de varios métodos, que incluyen, pero no se limitan a, microinyección (Crossway et al. 15 (1986) Biotechniques 4:320 334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602 5606, transformación mediadas por Agrobacterium (Patente de los Estados Unidos No. 5,563,055 y Patente de los Estados Unidos No. 5,981,840), transferencia génica directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717 2722), y aceleración de partículas balísticas (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,945,050; Patente de los Estados Unidos No. 5,879,918; Patente de los Estados Unidos No. 5,886,244; y 5,932,782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923 926); and Lecl transíormation (WO 00/28058). Ver también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 477; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 674; Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 25 85:4305 4309; Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559 563. Ver, también, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,240,855; 5,322,783; 4,945,050; 5,324,646; solicitud publicada U.S. No. 20010026941; 2002015066; y, Publicación Internacional No. WO 91/00915.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo McCormick et al. (1986) Plant CellReports 5:8130 84. Estas plantas entonces se pueden cultivar y ya sea polinizar con la misma cepa transformada o diferente cepas, y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada se identifica, se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurarse que se mantenga de manera estable y se herede la expresión de la característica fenotípica deseada y entonces se han logrado semillas recolectadas para asegurar la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también como "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma.

Después de la introducción del ADN extraño heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma vegetal se confirma por varios métodos tal como análisis de ácidos nucleicos y proteínas asociadas con el gen integrado. Las técnicas moleculares incluyen PCR (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) , análisis por transferencia Southern de ADN genómico, análisis por transferencia Northern y transferencia Western (Sambrook y Russell, 2001, supra) .

Se han desarrollado varios marcadores selecciónateles para el uso con células vegetales, tal como resistencia a cloranfenicol, el aminoglicósido G418, higromicina, o similares. Como marcadores seleccionables también se pueden usar otros genes que codifican para un producto comprendido en el metabolismo de los cloroplastos . Por ejemplo, pueden encontrar uso particular los genes que proporcionan resistencia a herbicidas vegetales tal como glifosato, bromoxinil, o imidazolinona . Estos genes se han reportado (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa de resistencia a bromoxinilo) ; y Sathasivan et al. (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a AHAS- imidazolinona) . En la técnicas son bien conocidos los métodos para detectar la presencia de un transgen en una plana, órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas, células vegetales, propágulo, embriones o progenie de los mismos.

Las plantas fértiles que expresan una proteina de auxin-sintasa se pueden probar para la actividad de auxin-sintasa, y las plantas que muestran el fenotipo deseado se seleccionan para la reproducción adicional.

Los métodos de la invención se pueden usar con otros genes y métodos para incrementar el rendimiento. En una modalidad, los métodos de la invención se pueden usar en combinación con métodos para incrementar una secuencia TEL para rendimiento mejorado en las plantas modificadas. Los métodos para incrementar el rendimiento y crecimiento vegetal al incrementar la expresión de una secuencia TEL se exponen en la solicitud PCT No. PCT/CN2012/087069, presentada el 20 de Diciembre de 2012, titulada "Métodos para Mejorar el Rendimiento de Cultivo". La descripción de la cual se incorpora en la presente como referencia. Se puede usar cualquier método para incrementar la expresión de una secuencia TEL en la planta y para incrementar la expresión de auxina-sintasa en el meristemo de brote e inflorescencia. En una modalidad una planta que se ha modificado para tener expresión incrementada de una secuencia de TEL se puede transformar con una construcción que comprende una secuencia codificadora de auxin-sintasa operablemente enlazada a un promotor que activa la expresión en el meristemo de brote e inflorescencia y plantas con el fenotipo deseado seleccionadas después de la transformación y selección.

En otra modalidad, una planta que tiene la expresión incrementada de auxin-sintasa en el meristemo de brote e inflorescencia se puede modificar para incrementar la expresión de una secuencia TEL. Se puede incrementar la expresión de la secuencia TEL al transformar la planta con una construcción que comprende una secuencia codificadora de TEL operablemente enlazada con un promotor que activa la expresión en una célula vegetal, o al transformar la planta con un intensificador que incrementa la expresión de la secuencia codificadora de TEL endógeno. En otra modalidad, una plana que tiene la expresión incrementada de auxin-sintasa en el meristemo de brote e inflorescencia se puede cruzar con una plana que tiene expresión incrementada de una secuencia de TEL y plantas seleccionadas que retienen la expresión incrementada de una secuencia de TEL y la expresión incrementada de auxina-sintasa en el meristemo de brote inflorescencia .

Los métodos de la invención se pueden usar en cualquier especie vegetal, incluyendo pero no limitado a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (grano de maíz) , sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientas, patata, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y semilla de colsa, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo , cártamo, cacahuates, camote, yuca, café, coco, piña, árboles cítricos, cocoa, te, banana, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendras, avena, vegetales, ornamentales y coniferas.

Los vegetales incluyen pero no se limitan a, tomates, lechuga, frijoles verdes, judias, chícharos, y miembros del género Curcumis tal como pepino, melón y melón de castilla. Los ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, flor de pascua y crisantemo. De manera preferente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientas, patata, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, semilla de colsa, Miscanthus, césped de pradera, Jatropha, etc.) y coniferas .

Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y de ninguna manera de limitación Parte Experimental Ejemplo 1 Clonación de los promotores de genes tipo Mei2 de arroz, maíz, soya, cañóla y Arabidopsis thaliana (1) clonación del promotor pOsTEl del gen tipo Mei2 de arroz.

La secuencia del extremo 5' de OsTEl se amplificó por PCR usando los cebadores designados pOsTEl-F (5'-AAGCTTGAAACTAGTACTAGACATTACTCTTCCAATGCA) y pOsTEl-R (5'-AGAGGATCCTGCAGCAGCACTTACCTACCCTACCA) . Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 5 min, luego 30 ciclos a 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, luego se extiende a 72 °C durante 5 min. El producto de PCR resultante de aproximadamente 2 Kb en longitud se clonó en el vector T pMD19 (TaKaRa) . Adicionalmente, el sitio BamHI dentro del promotor se removió por mutación puntual usando los cebadores OsTE-PRO-DELF (5' -AGATCCGAGCAAAAAACAGGGCC) y OsTE-PRO-DEL ( 5 ' -TCTATAGCGATAGAACTGTTTGATCTGG-GTAGC ) .

Entonces, el promotor resultante se digirió usando HindIII y BamHI del vector T y sus secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) se confirmó por procedimientos de secuenciación normal. (2) Clonación del promotor pZmTEl de gen tipo ei2 de maiz La secuencia del extremo 5' de ZmTEl se amplificó por PCR usando los cebadores designados pZmTEl-F (5'-AG AAGCTTAGTGCCAATCACTGCGTGAGAACCGA) y pZmTEl-R (5' AGGGGATCCTCCACTCCCTCCCCCACCCTCCA) . Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 5 min, luego 30 ciclos de 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, luego se extiende a 72°C durante 5 min. El producto de PCR resultante de aproximadamente 2 Kb de longitud se clonó en el vector T pMD19 (TaKaRa). Puesto que hay un sitio BamHI en ese fragmento de ADN, el promotor de 1.4 kb se obtuvo por una digestión con HindIII siguiendo una digestión parcial de BamHI. La secuencia de nucleótidos de promotor (SEQ ID NO: 2) se confirmó por secuenciación de ADN usando procedimientos normales. (3) Clonación de promotor pGmTEl de gen tipo Mei2 de soya La secuencia del extremo 5' de GmTEl se amplificó por PCR usando los cebadores designados pGmTEl-F (5' -AGGAAGCTTGAAAGAACGTAGTCCCTTCTTAAAAATGGTG) y 10 pGmTEl-R (5' -AGGGGATCCTCAAATCTCACTCACTCGCCTCTTTTCCTCA) . Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 5 min, luego 30 ciclos de 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, luego se extiende a 72 °C durante 5 min. El producto de PCR resultante de aproximadamente 2.5 Kb de tamaño se clonó en el vector T pMD19 (TaKaRa) . El promotor de 2.5 kb se digirió por HindIII y BamHI del vector T, y su secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) se confirmó por secuenciación usando procedimientos normales. (4) Clonación de promotor pAtTEl de gen tipo ei2 de Arabidopsis thaliana La secuencia del extremo 5' de AtTEl se amplificó por PCR usando los cebadores designados pAtTEl-F (5'-AGGAAGCTTACTTCGTGTTTAACAAACA) y pAtTEl-R (5'- AGGGGATCCTAATACCAGAGTTGATAGGGGCC) . Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 5 min, luego 30 ciclos de 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, luego se extiende a 72 °C durante 5 min. El producto de PCR resultante de aproximadamente 1.7 Kb de amaño se clonó en el vector pMDl9 (TaKaRa). El promotor de 1.7 kb se digirió por HindIII y BamHI del vector T, y su secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) se confirmó por secuenciación usando procedimientos normales . (5) Clonación de promotor pAt Ll de gen tipo Mei2 de Arabidopsis thaliana La secuencia del extremo 5' de AtMLl se amplificó por PCR usando los cebadores designados pAtMLl-F (5' AGAAAGCTTACTTAGCCCTATGAGCTTAAC) y pAtMLl- R (5'- AGAGGATCCAAACCCAAATTGCCTCTGCC). Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 5 min, luego 30 ciclos de 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, luego se extiende a 72 °C durante 5 min. El producto de PCR resultante de aproximadamente 3.2 Kb de tamaño se clonó en el vector T pMDl9 (TaKaRa) . El promotor de 3.2 kb se digirió por HindIII y BamHI del vector T y sus secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) se confirmó por secuenciación usando procedimientos normales . (6) Clonación del promotor pBrTEl de gen tipo Mei2 de Brassica rupa La secuencia del extremo 5' de BrTEl se amplificó por PCR usando los cebadores designados pBrTEl-F (5'-AAGCTTCCCAAATTTAATCGAACC) y pBrTEl-R (5'- GGATCCTTTAATTATTTTCTTACGGGA) . Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 5 min, luego 30 ciclos de 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, luego se extiende a 72°C durante 5 min. El producto de PCR resultante del fragmento de aproximadamente 2.2 Kb se clonó en el vector T pMD19 (TaKaRa) . El promotor de 2.2 kb se digirió por HindIII y BamHI del vector T, y su secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 8) se confirmó por secuenciación usando procedimientos normales, (7) Clonación de promotor pOsFCA de g en homólogo FCA de arroz La secuencia del extremo 5' de OsFCA se amplificó por PCR usando los cebadores designados pOsFCA-F (5'-AAGCTTTGAGGGATGTTAGGTCTCGA) y pOsFCA-R (5'- GGATCCGTGGGTGGAGGGGGAGGTGGG) . Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 5 min, luego 30 ciclos de 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, 72°C durante 1 min, luego se extiende a 72 °C durante 5 min. El producto de PCR resultante del fragmento de aproximadamente 2.2 Kb se clonó en el vector pMD19 (TaKaRa) . Puesto que hay un sitio HindIII en este fragmento de ADN, el promotor de 2.2 Kb se obtuvo por digestión con BamHI siguiendo con una digestión parcial de HindIII. La secuencia de nucleótidos del promotor (SEQ ID NO: 9) se confirmó por secuenciación de ADN usando procedimientos normales .

Ejemplo 2 Síntesis artificial de genes de auxina-sintasa Las secuencias codificadoras y los terminadores de los genes de auxina-sintasa se sintetizaron de manera artificial por Shanghai Sangon Limited, China. Los genes de auxina-sintasa de Agrobacterium turnefaciens y Peudomonas syringae son Ag-iaaM(SEQ ID NO: 11) y Ps-iaaM(SEQ ID NO: 12 ) . Los sitios de restricción de BamHI y Hindlll se adicionaron a su extremo 5' y 3' del gen, respectivamente. Los dos genes designados (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12) entonces se sintetizaron de manera artificial. De manera similar, el gen Os-YC de la enzima clave de la síntesis de auxina también se obtuvo por síntesis génica, y tiene un sitio BamHI en el extremo 5' y un sitio Kpnl y Hindlll en el extremo 3'. La secuencia de nucleótidos de Os-YC s es SEQ ID NO: 13 (incluyendo el terminador) .

Ejemplo 3 Construcción de vectores que tienen ADN-T con los casetes de expresión de los genes de auxin-sintasa Se usó pCambia 1300 para construir vectores de transformación mediados por Agrobacterium para plantas. El promotor se digirió con Hindlll y BamHI, y luego se ligó usando una reacción de ligación tridireccional con los genes de auxina-sintasa genes predigeridos con BamHI y Kpnl, y el pCambia 1300 predigerido con Hindlll ynd Kpnl. Los fragmentos de los promotores son pOsTEl, pZmTEl, pGmTEl, pAtTEl, pAtMLl y pBrTEl. Los fragmentos de los genes de auxina-sintasa son Ag-iaaM y Ps-iaaM. Las construcciones de ADN- resultantes se nombraron de manera separadas como: 1) pCambial300-pOsTEl-Ag-iaaM 2) pCambial300-pOsTEl-Ps-iaaM 3) pCambial300-pZmTEl-Ps-iaaM 4) pCambial300-pZmTEl-Ag-iaaM 5) pCambial300-pGmTEl-Ag-iaaM 6) pCambial300-pAtMLEl-Ag-iaaM 7) pCambial300-pArTEl-Ps-iaaM 8) pCambial300-pArTEl-Ag-iaaM 9) pCambial300-pAtMLl-Ag-iaaM 10) pCambial300-pAtMLl-Ps-iaaM 11) pCambial300-pBrTEl-Ag-iaaM 12) pCambial300-pBrTEl-Ps-iaaM Ejemplo 4 Transformación de Arroz Está bien establecida en la técnica la transformación de arroz mediante el método mediado por Agrobacterium (Lu & Gong (1998) Chínese Bulletin of Life Sciences 10: 125-131 y Liu et al. (2003) Molecular Plant Breeding 1: 108-115). La variedad vegetal Oryza sativa (japónica) "Xiushui 134" se usó en la transformación. Los clones individuales de la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contienen los vectores binarios de pCambial300-pOsTEl-Ag-iaaM, pCambial300-pOsTEl-Ps-iaaM, pCambial300-pZmTEl-Ag-iaaM y pCambial300-pZmTEl-Ps-iaaM, respectivamente, se cultivaron de manera separada para infectar callos. Los callos preparados se sumergieron en la suspensión de células bacterianas (OD595 » 0.4, que contiene 20mg/L de acetosiringona) durante 25 min. Entonces, los callos se transfirieron al medio de co-cultivo (que contiene 20 mg/L de acetosiringona) y se incubaron durante 2~3 dias en la oscuridad a 28 °C. Después de co-cultivo, los tejidos del callo se lavaron con agua estéril y luego se transfirieron a medio selectivo con una concentración apropiada de higromicina durante (cultivados sucesivamente una vez en el tiempo intermedio de ese marco de tiempo) . Después de la selección, los callos transgénicos cultivados de manera vigorosa se transfirieron al medio de pre-diferenciación para una incubación de aproximadamente 20 días. Entonces, los callos pre-diferenciados se transfirieron al medio de diferenciación y se incubaron para diferenciar y para el brote con un fotoperíodo de 14 horas por día. Después de 2-3 semanas, las plántulas regeneradoras resistentes se transfirieron al medio de enraizamiento . Las plántulas regeneradas bien cultivadas se lavaron del exceso de agar y se trasplantaron al suelo en un invernadero. Se generaron aproximadamente 100 transformantes de arroz independientes T0 para cada construcción. Los eventos con alto rendimiento, semillas grandes o rasgos de alto biomasa, que pueden incrementar el rendimiento de arroz se eligieron para reproducir nuevas variedades.

Ejemplo 5 Transformación de Maíz En la técnica es un procedimiento bien establecido la transformación de maíz con Agrobacterium (Vladimir Sidorov & David Duncan, in M. Paul Scot, ed., Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize, vol : 526; Ishida et al. (2007) Wature Protocols 2: 1614-1622). De forma breve, la cepa LBA4404 de Agrobacterium que tiene la construcción de ADN-T pCambial300-pOsTEl-Ag-iaaM, pCambial300-pOsTEl-Ps-iaaM, pCambial300-pZmTEl-Ag-iaaM y pCambial300-pZmTEl-Ps-iaaM, respectivamente, se preparó para infectar los embriones inmaduros de maíz Hi-II de 8-10 días después de la fertilización (1.0—1.5 mm) . Los embriones inmaduros se incubaron con el Agrobacterium durante 2-3 días a 22 °C en el medio de co-cultivo (MS, 2 mg/L 2,4-D, 30 g/L sacarosa, 8 g/L agar de sigma 7921, 40 mg/L 10 acetosiringona ) , y luego se movieron al medio de inducción de callo (MS, 2 mg/L 2,4-D, 30 g/L sacarosa, 2.5 g/L gelrite, 5 mg/L AgN03, 200 mg/L timentina) para una incubación de 10—14 días a 28 °C en la oscuridad. Para la selección de células transformadas, los callos se movieron al medio de selección (los mismos ingredientes con el medio de inducción de callo) que contiene 50 mg/L de higromicina. Después de una selección de 2-3 semanas, todos los tejidos se transfirieron al medio de selección fresco durante otras 2-3 semanas. Los tejidos embriogénicos sobrevivientes se movieron al medio de regeneración (MS, 30 g/L sacarosa, 0.5 mg/L KT, 2.5 g/L gelrite, 200 mg/L timentina) y se cultivaron mediante 10-14 días a 28 °C en la oscuridad. Entonces se transfirieron al medio de regeneración fresco durante otros 10-14 días a 26°C en la luz. Las plantas completamente desarrolladas entonces se movieron al medio de enraizamiento (1/2 MS, 20 g/L sacarosa, 2.5 g/L 20 gelrite, 200 mg/L timentina) y se cultivaron a 26°C en la luz hasta que crecieron bien las raices. Las plántulas supervivientes se movieron al invernadero para crecimiento para producir semillas .

Ejemplo 6 Evaluación de plantas transgénicas Se obtuvo un total de 55 eventos independientes de maíz transgénico a partir de la transformación de pCambial300-pZmTEl-Ps-iaaM. En estos eventos transgénicos, la sintasa IAA de Pseudomonas syringae estuvo bajo el control del promotor TE1 de Zea mays . Se evaluaron cuatro eventos para su potencial de mejora de rendimiento. El peso de las mazorcas de las plantas transgénicas fue 5%, 8%, 10%, y 11% más que los segregantes nulos, respectivamente. La altura de la planta también fue aproximadamente 5, 15, 24 y 28 cm más alta que los segregantes nulos.

Se obtuvieron un total de 40 eventos independientes de maiz transgénico de la transformación de pCambial300-pOsTEl-Ps-iaaM. En estos eventos transgénicos , la sintasa IAA de Pseudomonas syringae estuvo bajo el control del promotor TE1 de Oryza sativa. Se evaluaron los eventos OA-3, OA-19, y OA-26 para su potencial de mejora de rendimiento. El peso de las mazorcas de las plantas transgénicas fue 9%, 12%, y 8% más que los segregantes nulos, respectivamente. La altura de las plantas también fue de aproximadamente 5, 11 y 14 cm más alta que los segregantes nulos.

Se obtuvieron un total de 51 eventos independientes de arroz transgénico de la transformación de pCambial300-pOsTEl-Ps-iaaM. En estos eventos transgénicos, la sintasa IAA de Pseudomonas syringae estuvo bajo el control del promotor TE1 de Oryza sativa. Entre los 51 eventos, el evento OsA-29 fue el único que mostró el fenotipo de mejora de rendimiento. OsA-29 tiene semillas significativamente más grandes, promedio de 31 mg, en comparación a 26 mg del arroz de control no transgénico.

Ejemplo 7 Transformación de Cañóla Están bien establecidos los métodos para la transformación de cañóla (Gopalan Selvaraj y Igor Kovalchukl, 2011, New Biotechnology 29: 144-155; Wang, 2006, Agrobacterium transformation Protocols Second Edition Volume 1. Humana Press). El método es como sigue: semillas de cañóla invernal o cañóla primaveral esterilizadas con NaClO al 20% se germinaron en el medio MS (30 g/L de sacarosa y 6 g/L de agar) durante 8 días. Los hipocotilos de las plantas de semillero de 8 días de edad se cortaron en piezas de aproximadamente 0.5-1.0 cm y se pre-acondicionaron durante tres días en el medio de inducción de callo (MS, 1 mg/L 2,4-D) a 25°C. Una colonia individual de la cepa LBA4404 de Agrobacterium que tiene el vector binario pCambial300-pAtTEl-Ag-iaaM, pCambial300-pAtTEl-Ps-iaaM, pCambial300-pAtMLl-Ag-iaaM, pCambial300-pAtMLl-Ps-iaaM, pCambial300-pBrTEl-Ag-iaaM y pCambial300-pBrTEl-Ps-iaaM se cultivó de manera separadas en el medio liquido YEP con antibióticos hasta que la concentración de la suspensión celular alcanzó OD6oo=l · 0. El Agrobacterium entonces se sedimentó por centrifugación y se resuspendió el medio liquido MS (que contiene 10 mg/L de acetosiringona) a una concentración final de OD6oo=0.2. Entonces, los hipocotilos pre-acondicionados se sumergieron en la suspensión celular preparada de Agrobacterium durante 5 min, se transfirieron sobre papel filtro estéril y se transfirieron al medio de inducción de callo (MS, 1 mg/L 2,4-D, 10 mg/L acetosiringona) para co-cultivo durante 3 dias a 22°C. Después de esto, se transfirieron al medio de selección (MS, 3 mg/L 6-BA, 5 mg/L AgN03, 400 mg/L timentina, 50 mg/L higromicina) y se cultivaron durante 15 dias. Los explantes seleccionados se transfirieron al medio de diferenciación (MS, 5 mg/L BAP, 5 mg/L AgN03, 200 mg/L timentina, 10 mg/L higromicina) hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes eran de 5-10 mm de longitud, se cortaron y transfirieron al medio de alargamiento de brote (medio MS que contiene 0.05mg/L de BAP). Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud se transfirieron al medio MS de enraizamiento para inducción de las raices. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero.

Ejemplo 7 Transformación de Trigo Hubo diferentes métodos para la transformación de trigo descritos específicamente en varios artículos de investigación, que incluyen pero no se limitan a Wang et al., 2002, Acta Genética Sínica 29: 15 260-265; Cheng et al., 1997, Plant Physiol 115: 971-980; Supartana et al., 2006, Journal of Bioscience and Bioengineering, The Society for Biotechnology, Japan 102: 162-170. Lo siguiente es una breve descripción del método de transformación de trigo mediante Agrobacterium.

Las variedades de cultivo ordinarias de trigo invernal {Triticum aestivum L. ) , BAU170 y BAU146, se usaron en la transformación. Los cariópsides inmaduros de 12-15 días después de la antesis se recolectaron y esterilizaron usando HgCl 0.1% durante 10 min. Después del lavado en a gua estéril durante 3-4 veces, los embriones inmaduros se desprendieron de las semillas en una sobremesa se colocaron en el medio S inductor de callos con los escutelos hacia arriba para incubación a 25°C en la oscuridad para inducción de callos que se sub-cultivaron en el mismo medio durante 20 días.

Las colonias individuales de la cepa LBA4404 de Agrobacterium que tiene pCambial300-pOsTEl-Ag-iaaM, pCambial300-pOsTEl-Ps-iaaM, pCambial300-pZmTEl-Ag-iaaM, y pCambial300-pZmTEl-Ps-iaaM, respectivamente, se cultivaron de manera separada en el medio 5ml de medio liquido YEB que contiene los antibióticos selectivos y se agitaron en un agitador orbital con 200 rpm a 28 °C durante la noche. Se adicionaron 0.5ml de la solución bacteriana anterior a 50ml del medio YEB que contiene los mismos antibióticos. Cuando las bacterias crecieron a ??ß?? = 0.6, los cultivos se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 min. Las células bacterianas se recolectaron y resuspendxeron en medio liquido MS (MS con 3% de sacarosa, pH 5.4) después de que se lavan por el medio dos veces. La concentración/bacteria se ajustó a OD6oo= 0.1~1.0. Antes de la infección, parte de los embriones inmaduros desprendidos o los cayos derivados de los embriones se remojaron en medio MS altamente osmótico que contiene 0.4 mol/L de mannitol para pre-incubación durante 12 h o se colocaron en el medio MS que contiene 200 mmol/L de acetosiringona (AS) para una pre-incubación de 3d. Entonces, los embriones inmaduros o los callos se infectaron con el Agrobacterium en la suspensión celular durante 0.5-3.5 h. Después de que se descarga el liquido bacteriano, los explantes se secaron usando papel filtro estéril y se transfirieron al medio de co-cultivo (que contiene 200 mmol/L de AS) para una incubación de 3 dias a 26-28 °C en la oscuridad. Entonces, los explantes se transfirieron al medio de selección que contiene 50 mg/L de higromicina . Después de que se selecciona adicionalmente en el medio de selección que contiene 350 mg/L de Cef y 50 mg/L de higromicina durante 4-8 semanas a 26-28°C en la oscuridad, los callos resistentes se transfirieron al medio de diferenciación (MS, 10 mg/L de ácido indolacético (IAA), 1.0 mg/L de ZT, 3% de sacarosa, 0.7% de agar, pH 5.8) que contiene 350mg/L de Cef y 3-5 mg/L de higromicina y se indujo para diferenciación en luz. Las plántulas derivadas de diferenciación se trasplantaron al medio de enraizamiento para el desarrollo de raices.

Ejemplo 8 Transformación de Soya El método de transformación genética para soya está bien establecido en la técnica (Kan Wang, 2006, Agrobacterium transformation Protocols, Second Edition, Volume 1, Humana Press; Ma et al. (2008) Scientia Agricultura Sínica 41(3): 661-668) . La descripción detallada del método de transformación de soya es como sigue. La soya saludables, regordetas y maduras se esterilizaron superficialmente con gas cloro dentro de una campana de cristal bajo un extractor de humos. Las semillas se mantuvieron en cajas de Petri con gas cloro producido al vertir 100 mL de hipoclorito de sodio al 4% en un vaso de laboratorio y al adicionar 5mL de ácido clorhídrico 12N. Las soyas estériles se sembraron en medio B5 y se incubaron a 25 °C con un fotoperíodo de 18 h de luz y 6 h de oscuridad para la pre-germinación . Cuando el cotiledón se volvió verde y no ha crecido completamente la primera eufilia, la semilla se descascara, la raíz y el profilo se remueven. El cotiledón restante con 3-5 cm de hipocotilio se cortó a la mitad verticalmente . Las dos piezas resultantes de los materiales de explante con un cotiledón, medio cotiledón y medio epicotilio de cada uno se plantaron en el medio de co-cultivo (B5 elementos traza y principales 1/1Om sales de Fe Ms 1/10, vitaminas B5, 3% de sacarosa, 1 mg/L de BA, 200 5 mol/L de acetosiringona, pH 5.4) para una pre-incubación con el citiledon y la punta embrionica hacia arriba.

Las colonias individuales de la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector pCambial300-pGmTEl-Ag-iaaM, pCambial300-pGmTEl-Ps-iaaM, pCambial300-pGmFCA-Ag-iaaM y pCambial300-pGmFCA-Ps-iaaM, respectivamente, se cultivaron de manera separada hasta que la suspensión celular alcanzó una concentración de ??d0?=0.8-1.0. Después de la centrifugación durante 10 min, las células se recolectaron y resuspendieron en el medio de co-cultivo. Los explantes se pre-incubados durante 24 horas se transfirieron a la suspensión preparada de Agrobacterium durante aproximadamente 30 minutos. Los explantes infectados se colocaron de manera adaxial o se enrollaron lado abajo en el papel filtro que cubre el medio de co-cultivo y se incubó a 25°C durante 3 días. Entonces, los explantes se lavaron de las bacterias en exceso y se transfirieron al medio inductor de raíz (elementos traza y principales B5, sales de Fe MS, 3% de sacarosa, 1.68 mg/L de BAP, 400 mg/L de timentina, 50mg/L de higromicina, 2.5g/L de gelrite, pH 5.6) para una incubación de 14 días a 25 °C. Después de otra incubación de 14 días en el medio inductor de raíz que contiene 50mg/L de higromicina, se cortaron el cotiledón y el tejido muerto de los explantes y los explantes se transfirieron al medio de alargamiento de brote (elementos traza y principales MS y sales de Fe, vitaminas B5, 3% de sacarosa, 0.1 mg/L de IAA, 0.5 mg/L de GA3, lmg/L de ZR, 200 mg/L de timentina, 2.5g/L de gelrite, pH 5.6) para una incubación de 14 días. Finalmente, los brotes saludables con al menos 3 hojas se transfirieron al medio de enraizamiento (1/2 B5, sales de Fe MS, 2% de sacarosa, 1 mg/L de IBA, pH 5.6) para el desarrollo de raices .

La invención usó muchas técnicas de biología molecular, bioquímica y cultivo de tejido. Esas técnicas están disponibles. Los métodos detallados de las técnicas se pueden referenciar en Current Protocols in Molecular Biology (editado por Ausubel, John iley y Sons Press) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ED (editado por J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) .

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de habilidad de aquellos expertos en la técnica a la cual corresponde esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud individual de patente se indicara de manera específica e individualmente para que se incorpore por referencia .

Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y de ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar el rendimiento vegetal en una planta de interés, el método está caracterizado porque comprende transformar la planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en un meristemo de brote inflorescencia de planta operablemente enlazada a una secuencia codificadora de auxina-sintasa en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa se selecciona del grupo que consiste de: i) La secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; ii) una secuencia que tiene al menos 60% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID N0:11, 12, o 13; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la sescuncia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs:14-19; y, iv) una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19, en donde el promotor es un promotor de un gen tipo Mei2 vegetal.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor comprende una secuencia seleccionada de las secuencias expuestas en SEQ ID NO:l - SEQ ID NO: 10.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la secuencia codificadora de auxina-sintasa es de un microorganismo o de planta.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste de arroz, maíz, algodón, trigo, cebada, soya, girasol, cañóla, y sorgo.

5. Un cásete de expresión que comprende una construcción de ADN, la construcción que comprende un promotor que activa la expresión en un meristemo de brote e inflorescencia de plata operablemente enlazada a una secuencia codificadora de auxina-sintasa, caracterizado porque la secuencia codificadora de auxin-sintasa se selecciona del grupo que consiste de: i) la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; ii) una secuencia que tiene al menos 60% de identidad de secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19; y , iv) una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19, en donde el promotor es un promotor de un gen tipo Mei2 vegetal.

6. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el promotor comprende una secuencia seleccionada de las secuencias expuestas en SEQ ID NO:l - SEQ ID NO: 10.

7. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque la secuencia codificadora de auxin-sintasa es de un microorganismo o de una planta.

8. Una planta transformada con el cásete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

9. Una semilla transformada de la planta de la reivindicación 8.

10. Una planta transformada que exhibe expresión incrementada de auxina-sintasa en su meristemo de brote e inflorescencia en comparación a una planta de control, la planta está caracterizada porque se ha transformado con una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en un meristemo de brote e inflorescencia de planta operablemente enlazada a una secuencia codificadora de auxina-sintasa, en donde la secuencia codificadora de auxin-sintasa se selecciona del grupo que consiste de: i) la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 11, 12, o 13; ii) una secuencia que tiene al menos 60% de identidad de secuencia a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:ll, 12, o 13; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19; y, iv) una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOs: 14-19, en donde el promotor es un promotor de un gen tipo Mei2 vegetal.

11. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el promotor comprende una secuencia seleccionada de las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10.

12. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque la secuencia codificadora de auxina-sintasa es de un microorganismo o de una planta.

13. Semilla transformada de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 10-12.

14. La planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de arroz, maíz, algodón, trigo, cebada, soya, girasol, cañóla, y sorgo.