CN102296085B - 一种植物表达载体及其在棉花纤维性状改良中的应用 - Google Patents

Abstract

一种植物表达载体，其至少含有由植物生长素IAA生物合成相关的基因和特异性启动子BAN基因启动子组成的表达生长素IAA合成相关基因的核苷酸；所述植物生长素IAA生物合成相关基因为iaaM基因。所述植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用，实现了生长素合成酶基因在棉花种皮和纤维中的特异表达；从而显著提高了棉花纤维品质并增加了纤维数量，为棉花产业和纺织工业提供高品质的纤维。

Description

一种植物表达载体及其在棉花纤维性状改良中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物表达载体及其应用，具体涉及表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良中的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是最重要的经济作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国,棉花产业在我国的国民经济中具有举足轻重的地位。近年来，随着人民生活水平的提高和纺织技术的革新，对棉花纤维品质的要求也相应提高；尤其是近年来以气流纺纱取代环锭纺纱的技术革命，要求更长、更强、更细和更整齐的纤维。但是，目前我国棉花推广品种大都纤维品质偏低，长度单一，纤维强度偏低，纤维较粗，缺乏纺60支以上的高档棉纱的品种，远不能满足市场的需要。这直接导致了我国原棉在国际市场上缺乏竞争力。同时也导致了我国棉花生产近年来一直处于一种结构性矛盾的困境： 一方面原棉产量逐年下降，而库存原棉仍不断增加，造成大量资金积压; 另一方面进口棉花数量却不断上升。随着我国加入世界贸易组织，我国原棉的结构性矛盾变得更为突出。能否迅速提高我国棉花品种的纤维产量和品质，直接关系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工业的生存与发展。

马克隆值是指棉花纤维成熟度和细度的综合指标，是棉纤维重要的内在质量指标之一。根据棉花使用价值的高低，将马克隆值分为A、B、C三级。A级马克隆值范围为3.7~4.2，品质最好；B级马克隆值范围为3.5~3.6和4.3~4.9；马克隆值在3.4及以下和5.0及以上的为C级。现在美国规定马克隆值在3.7~4. 2的棉花,每磅加1.1美分;马克隆值在2.5以下的,每磅扣15.6美分。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉（纤维强度）、异常棉（纤维强度与细度）以及四倍体的海岛棉（纤维强度与细度）等。这些优良性状基因的利用，却在常规育种中受到诸多限制，单靠现有的棉花遗传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量，难以满足快速发展的纺织工艺革命对纤维品质的要求。利用基因工程技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花纤维形成，以及产量和品质（强度、细度和长度等）直接相关的基因，使得利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。人们对棉花纤维发生、发育和品质形成的分子机理也知之甚少。这些都极大地阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。

现有研究表明，棉花纤维是由棉花胚珠的外珠被表皮细胞经分化起始、伸长（初生壁合成）、增厚（次生壁合成）和成熟脱水四个过程发育而成的单细胞纤维. 棉花纤维细胞的最终长度可达20-30mm，高的可达35-40mm，其长径比达1,000-3,000。这样高的径长比是纤维细胞剧烈伸长的结果，其中必然有促进细胞生长和伸长的植物激素参与。纤维细胞的起始与伸长都与生长素(Auxin，如吲哚乙酸indole-3-acetic acid，IAA)密切相关。利用离体培养的棉花胚珠，人们发现未受精的胚珠培养后不能产生纤维，但在培养基中添加GA和IAA能诱导纤维的生长；生长素拮抗剂处理表明生长素是纤维原始体伸长的关键因素(Beasley CA，1973，Science,179:1003-1005；Beasley CA 等，1973，American J Bot，60，130-139)。Giavalis等2001年报道了GA3和IAA处理对培养的未受精胚珠纤维数量的影响，研究结果表明，在开花前或开花后施用外源GA和IAA，可以使培养的未受精胚珠纤维的数量显著增加(Giavalis S等，2001，J Cotton Sci，5，252-258). Seagull 和 Giavalis 2004年进一步发现，在自然生长状态下，GA₃和IAA处理棉花的蕾或铃，可以明显增加纤维细胞的数量。而且IAA处理开花前或开花后的棉铃可使单个棉籽上的纤维细胞数量增加58%( Seagull RW等，2004，J Cotton Sci,，8，105-111)。 以上研究都表明IAA能促进棉花纤维的产生，与纤维发育生长的关系密切。

外源生长素施用虽然有很好的效果，但在生产上往往难以做到：将生长素逐一涂抹在花或蕾铃上，工作量甚大，劳动力成本高，大面积推广难以实现。而且，生长素的大量使用，既增加了生产成本，又会带来环境污染。相比之下，通过控制生长素生物合成酶基因，从内源的角度来调节特定器官中的生长素含量，促进收获器官的发育，是个十分有效的策略。这一策略至少具有下述几方面的优点：1）效率高、成本低，因为一旦将生长素生物合成酶基因导入植物，就无需外加施用生长素或其它处理。而且，外源施用生长素是通过扩散进入细胞，而内源激素则产生自细胞内。因此，用转基因内源控制生长素的效果往往比外源施用更好；2）对作物负面影响小，由于生长素的作用浓度很低，浓度过高或过低均会对植物的发育带来不良影响。而内源表达生长素合成酶基因，在表达水平和表达部位合适的情况下，就可以做到只对特定目标器官（组织）起作用，而不影响植物的其它部分的正常发育；3）与外源施用生长素和人工合成生产调节物质相比，内源调控生长素合成酶基因对环境污染小，对人类健康造成的危害也小（Li Y等，2004，Transgenics of plant hormones and their potential application in horticultural crops. In: Genetically Modified Crops: their development，uses，and risks. New York: Food Products Press,101-112）。 

  然而，利用内源植物生长素合成酶基因难以改良棉花纤维产量和品质。1999年John ME将涉及生长素IAA生物合成的两个酶基因iaaM和iaaH置于纤维特异性启动子E6下，通过农杆菌介导转入陆地棉DP50中，结果发现IAA含量在大多数转基因株系里都有2-8倍的增加，然而纤维长度，细度和强度等品质与对照野生型相比并没有显著差异(Basra AS 等，1999，Cotton Fiber，New York: Food Products Press，271-292)。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物表达载体，将本发明植物表达载体应用于棉花纤维性状的改良中，能有效地提高棉花纤维的产量与品质。

本发明的另一目的在于提供上述植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种编码表达生长素合成相关的基因，将所述基因整合到棉花基因组中，可得到高产量和品质的转基因棉花纤维。

本发明的再一目的在于提供含上述植物表达载体的转化体。

本发明的再一目的在于提供含上述植物表达载体的转基因植物的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种植物表达载体，其至少含有由植物生长素IAA生物合成相关的基因和植物纤维、种皮特异性启动子BAN基因启动子组成的表达生长素合成相关基因的核苷酸，所述植物生长素IAA生物合成相关基因为土壤根癌农杆菌tms(tumour morphology shooty)基因，也称iaaM基因。

本发明植物表达载体，其核苷酸具有如SEQ ID No. 11 所示的序列。

本发明植物表达载体，其具有如图 1（b）所示的结构。

上述植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用。

一种编码表达生长素合成相关基因的核苷酸，其具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。

一种含上述植物表达载体的转化体。

一种含上述植物表达载体的转基因植物的制备方法，包括以下步骤：

1)种皮和纤维特异表达启动子BAN的获得；

2)生长素IAA合成相关基因的获得； 

3) 将步骤1)中分离克隆到的特异启动子与步骤2)中分离克隆到的生长素合成相关基因进行融合，构建特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体；

4)将步骤3)得到的特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体整合到棉花基因组中； 

5) 将通过步骤4)获得的棉花进行进一步的培养，栽培，并获得转基因的棉花植株。

其中，步骤3中所述的特异启动子与生长素合成相关基因融合以构建特异表达生长素合成相关基因的表达载体的方法为本领域的常规方法，使用的载体可以是植物转基因领域所使用的常规载体。

其中，步骤4中所述的将表达载体整合到棉花的基因组所使用的方法为常用的植物转基因方法，比如根癌农杆菌介导法或基因枪法。 

本发明中所指的“棉花纤维性状”是指棉花纤维的数量和品质性状，包括纤维的数量多少、长度、成熟度、细度、强度、整齐度等。

本发明中所指的“转基因棉花”是指通过分子生物学、生物技术手段，将其他生物的基因转移到棉花中，从而使被改造棉花的遗传物质得到改造的棉花。用于改造的基因可以来源于植物、动物以及微生物或者人工合成改造。

本发明中所指“衣分”是指籽棉上纤维重量对籽棉重量之比，以百分率表示。也就是纤维重量占整个种子及纤维总重量的比例。

本发明中所指“纤维强度”是指拉伸一束纤维在即将断裂时所能承受的最大负荷，以厘牛/特克斯(cN/tex)表示，特克斯是1000米纤维的克重数。

本发明通过大量研究和分析以及前期实验，认为John等未能成功并不意味着利用植物激素生物合成酶基因来提高棉花产量和改善纤维品质的策略是不可行的。因为，既然外源施用IAA等植物激素对棉花纤维细胞数量的增加和纤维品质的提高有明显的作用，那么，通过控制植物激素合成酶基因，从内源角度来调节激素含量，促进棉花纤维发育，应该是可行的。而现有研究的结果未能取得预期效果的原因关键在于：未能找到合适的启动子。因此选择适当的启动子，在棉花的特定部位、发育的特定时间、以适宜的强度控制与植物激素合成相关基因的表达，精准的调控植物体内激素的作用浓度、作用时间与作用部位，才可以有效的影响棉花纤维的生长发育，获得预期的效果。但是，启动子种类极为繁多，不可能预料哪种启动子连接上生长素相关基因后就能对棉花纤维有效。本发明根据棉花纤维发育的特点，在大量筛选启动子的基础上，创造性地采用了纤维、种皮特异启动子BAN(Anthocyanidin reductase，BANYULS)基因启动子（来源于拟南芥）为主要元件构建新的基因表达载体，并建立起了一整套与之相适应的改良棉花纤维性状的方法。

本发明方法在选定了启动子和目的基因的情况下，可将本发明选用的启动子和目的基因融合成的新基因转入本领域常用的载体中构建成表达载体再转入棉花中。显然，上述表达载体可以构建成含单个基因的单价载体，也可以构建含多基因的双价或三价等类型的载体。在使用本发明方法改良棉花的过程中，既可以只在一个部位表达一个目的基因，也可以在多个部位和多个发育阶段表达多个基因，本发明方法已经提供了技术方案。

本发明改良棉花纤维性状的方法，是通过在棉花的种皮和纤维特异表达生长素合成相关基因，进而调控生长素合成酶的表达，通过内源调控棉花特定组织器官中相应激素的含量的方式，控制棉花种子发育以及纤维发育的起始和伸长，达到改良棉花纤维产量和品质(细度和成熟度)的目的。试验结果证明，经本发明改良棉花纤维性状的方法所改良的棉花纤维的数量明显增多，产量明显增加，棉花纤维品质明显改良；其种子数量增加，衣分明显提高。本发明方法简便易行,效果显著，能为纺织工业带来高产,高品质的纤维原料,产生巨大的经济效益。

附图说明

图1（A）： 特异启动子BAN调控下的生长素合成基因表达载体Ban-iaaM的构建流程图；

Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸转移酶基因；GUS，b-葡萄糖酸苷酶基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Pnos，冠瘿碱合成酶基因启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。

图 1（B）：本发明植物表达载体结构图；

图2：特异表达的植物生长素合成酶基因iaaM在转BAN::iaaM基因棉花中的RT-PCR分析；

A, BAN::iaaM转基因棉花开花当天胚珠中iaaM表达量分析图。1、31、36、39、44、45和53为不同BAN::iaaM转化子编号；WT为野生型棉花植株用作对照。结果在7个转化子中1^#，31^#，36^#，39^#和44^#株系中检测到了iaaM基因的明显表达；

B，BAN:iaaM转基因棉花39^#胚珠不同发育时期iaaM表达量分析图。iaaM的在纤维起始阶段有很高的表达，在开花后4天明显降低；

C，BAN::iaaM转基因棉花39^#纤维不同发育时期iaaM表达量分析图。在纤维发育后期，纤维中iaaM基因表达持续到开花后30。

图3：BAN::iaaM转基因棉花株系BM39与野生型棉花胚珠表面扫描电镜比较；

开花当天的胚珠直接冷冻后取相似部位用电镜放大500倍。BAN::iaaM转基因胚珠表面纤维起始分布较对照明显增多。比例尺表示100μm，点间距为10μm。

图4：BAN::iaaM转基因棉花早期纤维数量统计结果表；

转基因植株开花两天后的胚珠上纤维的数量均比野生型棉花有所增长。31^#、39^#和44^#三个转化子单胚珠纤维数分别比野生型提高21.1%、29.4%和52.4%。其中39^#和44^#比野生型达到显著差异（t-test，P<0.05）。

图5： BAN::iaaM转基因棉花种子和野生型比较；BAN::iaaM转基因棉花籽棉经皮辊轧花机轧花后，种子较野生型略小，但其上覆着的短绒明显低于野生型。比例尺为1cm；

图6：BAN::iaaM转基因棉与野生型花单株铃数对照图；

图7： BAN::iaaM转基因植株BM36和BM39不同株系衣分比较图；Null表示不同株系的非转基因分离世代。WT，野生型。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook 和Russell，2001)。

实施例一棉花基因组的制备

1. DNA的提取

选取棉花幼叶0.5-1 g,在液氮中迅速研磨成粉,加入3 mL 65℃预热的CTAB提取液(100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，20 mmol/L EDTA (pH8.0)， 1.5 mol/L NaCl，2% CTAB (W/V)，4% PVP40 (W/V)和2% 巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混匀。65℃水浴30 min，然后加入1 mL 5 mol/L KAc，冰浴20 min后，用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 r/min，4℃离心5 min)，取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀,静置约30 min，用玻棒挑出絮状沉淀,用75%的乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500 mL TE中。加入1 mL RNaseA (10 mg/mL)，37℃处理1 h。再用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 r/min，4℃离心5 min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75%的乙醇漂洗，风干,溶于200 mL TE中，-20 ℃保存备用。

2. RNA的提取

选取约3 g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，加入15 mL 65℃预热的RNA提取液(2% CTAB (W/V)，2% PVP (W/V)，100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2,0mol/L NaCl，2%巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3~10 min，期间混匀2~3次。氯仿:异戊醇（24:1）抽提2次（10,000 r/min，室温，5 min）。取上清，加入1/4体积10 mol/L LiCl溶液，4℃放置6 h，以氯仿:异戊醇（25:24:1）各抽提1次（10,000 r/min，室温，5 min）。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上。12,000 r/min，4℃离心20 min，弃上清。沉淀用200 mL的DEPC处理水溶解。酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）、氯仿:异戊醇（24:1）各抽提1次（10,000 r/min，室温，5 min）。加1/10体积3 mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上。12,000 r/min，4℃离心20 min，弃上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，风干。加200 mL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量。

3. 基因组序列的PCR扩增

扩增程序为：94°C，5 min；94°C，30 sec，56°C，30 sec，72°C，1.5 min，35个循环；72°C延伸10 min。

4. DNA 片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a

DNA片段均采用GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE公司）回收。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

回收的片段与pUCm-T (上海生工)载体建立如下连接体系:

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。 

实施例二表达生长素合成相关基因的核苷酸和植物表达载体的制备

1.   特异启动子的获得

根据拟南芥BANYULS基因 (GenBank登录号：AF092912)及其基因组序列，设计BAN启动子引物(SEQ ID No. 1，SEQ ID No.2)，从拟南芥基因组中PCR扩增获得一个300bp左右的片段。将扩增DNA片段克隆后测序分析表明为拟南芥的BAN特异性启动子，其核苷酸序列见SEQ ID No.3。

2.  土壤根癌农杆菌iaaM基因的获得

根据土壤根癌农杆菌Ti质粒tms(iaaM)基因序列(GenBank登录号：K02554)设计引物，iaaM基因引物1-KpnI (见SEQ ID No.4)和iaaM基因引物2-SacI（见SEQ ID No.5)，从土壤根癌农杆菌Ti质粒T-DNA中通过PCR扩增并克隆、测序分析后得到iaaM基因序列（见SEQ ID No.6）。

3.  特异表达植物激素合成相关基因的载体的构建载体构建流程见图1（A）。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。 

实施例三转化体和转基因植物的制备

1.   用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

2.   特异表达植物激素合成相关基因的载体整合到棉花基因组通过根癌农杆菌介导的方法进行棉花的遗传转化

 表1   根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS: Murashige & Skoog，1962

B5: Gamborg，1986

Gelrite: Sigma，货号:G1910

SH: Schenk & Hildebrandt，1972

上述的表达载体通过农杆菌介导胚性愈伤的方法导入棉花。具体方法如下：

(1) 棉花胚性愈伤组织的诱导: 棉花种子(冀棉14)剥壳，用0.1%升汞（HgCl₂）消毒10 min，无菌水漂洗6次，播种于种子萌发培养基(培养基成分见表1)上。28℃、黑暗条件下萌发5-7天，以获得无菌棉花幼苗。选取生长健壮的无菌幼苗下胚轴，切成长约0.4cm的小段，接种于棉花愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，28℃，16h光照下培养，每3-4周继代一次。选取松散的愈伤组织接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，诱导胚性愈伤组织的产生，28℃，16h光照下培养。

(2) 转化农杆菌的培养: 挑取含上述表达载体的农杆菌菌株，在含50 mg/L卡那霉素和125 mg/L 链霉素的YEB固体培养基(0.5%蔗糖（W/V），0.1%细菌用酵母提取物（W/V），1%细菌用胰化蛋白胨（W/V），0.05%MgSO₄.7H₂O（W/V），1.5%的琼脂粉（W/V）pH7.0)上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于5 mL含相同抗生素的YEB液体培养基中， 28℃、200 r/min振荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1:20的比例转接到50 mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续在28℃、200 r/min振荡培养3-5 h。6,000 r/min离心10 min后，菌体用液体MSB（含100 mmol/L 乙酰丁香酮）培养基重悬，调整OD₆₀₀值为0.3-0.5备用。

(3) 浸染和共培养: 用无菌吸水纸吸去胚性愈伤组织表面的液体，放入调整好浓度的农杆菌菌液中，浸染20-30 min。倾去菌液，将侵染过的胚性愈伤转移到共培养培养基上，于24℃黑暗条件下共培养4天。

(4) 转化子的筛选: 共培养完成后把胚性愈伤组织转移到筛选培养基上进行脱菌和选择培养，28℃，16 h光照下培养，每3周继代一次。1-2个月后大部分愈伤组织褐化死亡，少部分表现出卡那霉素抗性，生长出新鲜的胚性愈伤组织。将愈伤组织块进行继代，每块组织增殖到2.0-3.0 g时接入液体悬浮培养基中，在摇床上120 r/min振荡悬浮培养以获得大量体胚。悬浮2周后用30目筛网过滤悬浮培养组织，网下沉淀物转接入体胚成熟培养基。萌发的成熟胚转入体胚伸长诱导培养基上，于28℃黑暗条件下培养2周以诱导体胚伸长、萌发。取较大的萌发胚（>0.5 cm）转接入SH培养基成苗，28℃，16h光照下培养。待幼苗长到约2 cm高时，剪取幼苗嫁接到有3-4片真叶的棉花幼苗上。

1.       获得纤维性状改良的棉花

嫁接的棉花培养在温室中常规管理。 成熟后收集种子和纤维进行产量和品质性状分析。获得的转基因棉花在表型和生长发育上与野生型的对照没有明显区别。

实施例四用real-time PCR的方法检测导入的iaaM基因在棉花纤维中的表达

提取对照和转基因棉花不同时期的胚珠和纤维的总RNA，通过逆转录合成cDNA一链。以此为模板进行quantitative real-time PCR扩增。具体操作步骤为：用DNA一链合成试剂盒（MBI公司）合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。PCR在quantitative real-time PCR 仪上进行，在25 mL的反应体系中包括12.5mL MIX buffer（Bio-Rad公司，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，上下游引物各0.2 mmol/L和1 mL一链产物。温度循环参数为94℃预变性3mins；94℃，30 sec，56℃，30 sec，72℃，30 sec，预设循环数为40。用棉花Histone3基因作内标，上、下游引物是SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。扩增iaaM基因的上、下游引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。在运行quantitative real-time PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过琼脂糖电泳，检查并确保扩增产物是单带。quantitative real-time PCR检测结果见图2(A)、(B)、(C)。

实施例五特异表达植物激素合成酶基因iaaM的棉花纤维数量性状的考察

1 扫描电镜的观察

将采集新鲜样品，经冷冻后直接用扫描电镜进行表面观察。制备好的样品在HITACHI 日立 S-3000N SEM 扫描电镜下观察胚珠表面的纤维起始情况。结果如图3所示，转基因棉花胚珠表面的纤维原始体较野生型来说，分布更为密集，数量更多。

2．早期纤维计数

选取开花后两天的棉铃，每个株系随机选择3个单株，每株取5铃，每铃取2个种子对胚珠表面的纤维进行计数。每个样品分别计数10次，计算平均数作为单株的早期纤维数量。具体方法如下：

取开花后2天的饱满胚珠两颗，置于1.5ml离心管中，加适量FAA固定液固定一小时以上。用去离子水漂洗两次，加200mL 5mol/L HCl，室温解离一小时以上。弃HCl，用去离子水漂洗两次，加100mL Schiff试剂处理一小时以上。弃Schiff试剂，用去离子水漂洗两次，加100mL 45%乙酸并用玻璃棒研磨，使纤维从胚珠表面脱落分散。将研磨好的纤维液用移液枪混匀，置血球计数板上在显微镜下观察、计数。结果见图4，转基因棉花的早期纤维数量明显增加。

实施例八特异表达植物激素合成酶基因iaaM的棉花纤维衣分和品质的考察

1．  转基因棉花和对照的衣分含量及纤维产量对比分析

转基因T₁代棉花植株种植于西南大学转基因基地，常规田间管理。按照国家棉花品种区试方案的标准，统计了部分株系的单株铃数（图6）。BAN::iaaM转基因植株单株铃数较野生型对照相比差别不明显，仅BM39株系略有提高。说明BAN::iaaM转基因植株在单株结铃性上，有轻微的促进作用。于收获的籽棉中，随即选取100粒种子，准确称取百粒籽棉的重量，用小型皮辊轧花机轧花后，再分别称量纤维的总量和种子的总量，计算衣分的大小（图7）。从实验结果可见：非转基因对照BM36null、BM39null和野生型的衣分约为38%，而BAN::iaaM转基因株系的衣分均在44%之上，最高达到49.46%，均大于野生型和非转基因对照。表明转入BAN::iaaM基因后，可以提高棉花纤维产量。将转基因株系BM39种子与野生型比较（图5），结果可见转基因种子体积略有变小，表面短绒也略有减少。

2．  转基因棉花纤维的品质检测

将各棉纤维样品送农业部棉花品质监督检测测试中心(安阳)，依据ASTM D5867-95 《HVI900 大容量纤维测试仪试验方法》，采用HFT9000在温度20℃相对湿度65%的环境条件下，对上半部平均长度、整齐度指标、断裂比强度、伸长率、马克隆值5指标进行测试。对照材料选用转基因棉花受体野生型冀棉14品种。结果见表2。

表2  转基因棉花和对照的纤维品质比较

与表达量分析比对（图2A），转基因棉花纤维的上半部平均长度27.71~29.37mm，纤维整齐度指数在80.60%-83.40%，转基因和野生型差异不明显。与纤维强度相关的两个指标断裂比强度和断裂伸长率的结果都表明，转基因株系的纤维强度与对照相比没有明显差异。马克隆值是衡量纤维细度和成熟度的重要指标，反映了纤维的品质。根据国家棉花分级标准，按照马克隆值差异将棉花分为A、B、C三级，B为标准级。A级取值范围在3.7-4.2，品质最好；B级取值范围为3.5-3.6和4.3-4.9；C级取值范围为3.4及以下和5.0及以上，品质最差。BAN::iaaM转基因棉花的马克隆值比对照显著下降，且与纤维起始阶段不同株系iaaM表达差异相关。品质属于A和B2级范围内，属于标准级。而表达量低的45^#、53^#和野生型对照马克隆值明显偏高，但仍然属于B2级品质。BAN::iaaM转基因植纤维马克隆值的降低说明转基因植株纤维的品质得到了提高。

总之，根据纤维品质测定的结果，BAN::iaaM转基因棉花在其它纤维指标上与对照没有明显的差异，但纤维马克隆值降低，使综合品质得到了提高。

上述实例表明，经过本发明改良的棉花纤维，实现了在棉花的特定部位的特定发育阶段特异性地表达生长素合成相关基因，进而内源调控棉花特定组织器官中生长素的含量,达到改良棉花纤维产量和品质(细度和强度)的目的。试验结果证明，经本发明改良棉花纤维性状的方法所改良的棉花棉铃数量增加，种子数量增加，棉花纤维数量明显增多，衣分明显提高，纤维产量显著增加；同时棉花纤维强度不变，细度和成熟度得到了有效的改良、马克隆值可高达A级。本发明方法简便易行,效果显著，具有很好的市场前景。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

                                                            序列表

 

<110> 西南大学

 

<120> 一种植物表达载体及其在棉花纤维性状改良中的应用

 

<160> 11

 

 

<210> 1

<211> 26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(26)

<223>BAN启动子引物1

 

<400>1

aagctttaac  agaaccttac  tgtaac    26

 

 

<210> 2

<211> 26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(26)

<223>BAN启动子引物2

 

<400>2

gtcgacgatt  gtacttttga  aattac   26

 

 

<210>3

<211> 323

<212>DNA

<213>拟南芥（Thale Cress）

 

<400>3

taacagaacc  ttactgtaac   actattcgtt   actctaaagc   tgtgttatat   tgtttagaga   60

cagaaataat  caaactcttg   tgataatttg   gtagatgata  acaaatcaga  actctgaagg     120 

tcaatctttt    ttgattctta   ggtgaagaca  agttggttat  ttcaaagatc   acgtgcttac   180

cttctaaaac   agccttattg   atctactgtt   gtacctaatg  agcaaggact  atttgcaaat    240

ctttttactt    cttatataga   agtctcaaga  cgataaactc  ataacaacta   aatctctatc   300

tctgtaattt   caaaagtaca   atc                                                323

 

 

<210> 4

<211> 27

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(27)

<223>iaaM基因引物1-KpnI

 

<400>4

ggtaccatgt  caccttcacc   tctcctt     27         

 

 

      

<210> 5

<211> 27

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(27)

<223>iaaM基因引物2-SacI

 

<400>5

gagctcctaa  tttctagtgc  ggtagtt   27

 

 

<210>6

<211> 2217

<212>DNA

<213>土壤根癌农杆菌(tumour morphology shooty)

 

<400>6

atggtggatc  tgacaatggt   cgataaggcg    gatgaattgg  accgcagggt   ttccgatgcc  60

ttcttagaac  gagaagcttc   taggggaagg    aggattactc  aaatctccac   cgagtgcagc  120

gctgggttag  cttgcaaaag   gctggccgat    ggtcgcttcc  ccgagatctc   agctggtgga  180

aaggtagcag  ttctctccgc   ttatatctat      attggcaaag  aaattctggg    gcggatactt   240

gaatcgaaac  cttgggcgcg   ggcaacagtg    agtggtctcg  ttgccatcga   cttggcacca  300

ttttgcatgg  atttctccga   agcacaacta    atccaagccc  tgtttttgct      gagcggtaaa  360

agatgtgcac  cgattgatct   tagtcatttc    gtggccattt  caatctctaa      gactgccggc  420

tttcgaaccc  tgccaatgcc   gctgtacgag    aatggcacga  tgaaatgcgt   taccgggttt  480

accataaccc  ttgaaggggc   cgtgccattt    gacatggtag  cttatggtcg   aaacctgatg  540

ctgaagggtt  cggcaggttc   ctttccaaca    atcgacttgc  tctacgacta   cagaccgttt   600

tttgaccaat  gttccgatag   tggacggatc    ggcttctttc  cggaggatgt   tcctaagccg  660

aaagtggcgg  tcattggcgc   tggcatttcc    ggactcgtgg  tggcaaacga   actgcttcat  720

gctggggtag  acgatgttac   aatatatgaa    gcaagtgatc  gtgttggagg   caagctttgg  780

tcacatgctt  tcagggacgc   tcctagtgtc    gtggccgaaa  tgggggcgat   gcgatttcct  840

cctgctgcat  tctgcttgtt   tttcttcctc      gagcgttacg  gcctgtcttc    gatgaggccg  900

ttcccaaatc  ccggcacagt   cgacacttac    ttggtctacc  aaggcgtcca   atacatgtgg   960

aaagccgggc  agctgccacc   gaagctgttc    catcgcgttt  acaacggttg   gcgtgcgttc  1020

ttgaaggacg  gtttctatga   gcgagatatt    gtgttggctt  cgcctgtcgc   tattactcag  1080

gccttgaaat  caggagacat   taggtgggct    catgactcct  ggcaaatttg   gctgaaccgt  1140

ttcgggaggg  agtccttctc   ttcagggata    gagaggatct  ttctgggcac   acatcctcct  1200

ggtggtgaaa  catggagttt   tcctcatgat    tgggacctat  tcaagctaat   gggaatagga  1260

tctggcgggt  ttggtccagt   ttttgaaagc    gggtttattg  agatcctccg   cttggtcatc  1320

aacggatatg  aagaaaatca   gcggatgtgc    cctgaaggaa  tctcagaact   tccacgtcgg  1380

atcgcatctg  aagtggttaa   cggtgtgtct    gtgagccagc  gcatatgcca   tgttcaagtc  1440

agggcgattc  agaaggaaaa   gacaaaaata    aagataaggc  ttaagagcgg   gatatctgaa  1500

ctttatgata  aggtggtggt   cacatctgga    ctcgcaaata  tccaactcag   gcattgcctg  1560

acatgcgata  ccaatatttt   tcaggcacca    gtgaaccaag  cggttgataa   cagccatatg  1620

acaggatcgt  caaaactctt   cctgatgact    gaacgaaaat  tctggttaga   ccatatcctc  1680

ccgtcttgtg  tcctcatgga   cgggatcgca    aaagcagtgt  attgcctgga   ctatgagccg  1740

caggatccga  atggtaaagg   tctagtgctc    atcagttata  catgggagga   cgactcccac  1800

 aagctgttgg  cggtccccga   caaaaaagag    cgattatgtc  tgctgcggga   cgcaatttcg  1860

agatctttcc  cggcgtttgc   ccagcaccta    tttcctgccg  gcgctgatta   cgaccaaaat  1920

gttattcaac  atgattggct   tacagacgag    aatgccgggg  gagctttcaa   actcaaccgg  1980

cgtggtgagg  atttttattc   tgaagaactt    ttctttcaag  cactggacac     ggctaatgat  2040

accggagttt  acttggcggg   ttgcagttgt    tccttcacag  gtggatgggt   ggagggtgct  2100

attcagaccg  cgtgtaacgc   cgtctgtgca    attatccaca  attgtggagg    cattttggca  2160

aagggcaatc  ctctcgaaca   ctcttggaag    agatataact  accgcactag    aaattag      2217                

 

 

      

<210> 7

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(20)

<223>Histone3的上游引物

 

<400>7

gaagcctcat  cgataccgtc   20

 

 

 

<210> 8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(19)

<223>Histone3的下游引物

 

<400>8

ctaccactac  catcatggc   19

 

 

 

<210> 9

<211> 21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(21)

<223>iaaM基因的上游引物

 

<400>9

gaaaatggcc  tccgatcaga  c   21

 

 

 

<210> 10

<211> 21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(21)

<223>iaaM基因的下游引物

 

<400> 10

cataaggggc  ttggaggaag   t  21

 

 

 

<210> 11

<211> 2564

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(2564)

<223>Ban-iaaM基因序列

 

<400>11

aagctttaac  agaaccttac  tgtaacacta  ttcgttactc  taaagctgtg  ttatattgtt   60 

tagagacaga  aataatcaaa  ctcttgtgat  aatttggtag  atgataacaa  atcagaactc   120

tgaaggtcaa  tcttttttga  ttcttaggtg  aagacaagtt  ggttatttca  aagatcacgt   180

gcttaccttc  taaaacagcc  ttattgatct  actgttgtac  ctaatgagca  aggactattt   240

gcaaatcttt  ttacttctta  tatagaagtc  tcaagacgat  aaactcataa  caactaaatc   300

tctatctctg  taatttcaaa  agtacaatcg  tcgacggtac  catggtggat  ctgacaatgg   360

tcgataaggc  ggatgaattg  gaccgcaggg  tttccgatgc  cttcttagaa  cgagaagctt   420

ctaggggaag  gaggattact  caaatctcca  ccgagtgcag  cgctgggtta  gcttgcaaaa   480

ggctggccga  tggtcgcttc  cccgagatct  cagctggtgg  aaaggtagca  gttctctccg   540

cttatatcta  tattggcaaa  gaaattctgg  ggcggatact  tgaatcgaaa  ccttgggcgc   600

gggcaacagt  gagtggtctc  gttgccatcg  acttggcacc  attttgcatg  gatttctccg   660

aagcacaact  aatccaagcc  ctgtttttgc  tgagcggtaa  aagatgtgca  ccgattgatc   720

ttagtcattt  cgtggccatt  tcaatctcta  agactgccgg  ctttcgaacc  ctgccaatgc   780

cgctgtacga  gaatggcacg  atgaaatgcg  ttaccgggtt  taccataacc  cttgaagggg   840

ccgtgccatt  tgacatggta  gcttatggtc  gaaacctgat  gctgaagggt  tcggcaggtt   900

cctttccaac  aatcgacttg  ctctacgact  acagaccgtt  ttttgaccaa  tgttccgata   960

gtggacggat  cggcttcttt  ccggaggatg  ttcctaagcc  gaaagtggcg  gtcattggcg   1020

ctggcatttc  cggactcgtg  gtggcaaacg  aactgcttca  tgctggggta  gacgatgtta   1080

caatatatga  agcaagtgat  cgtgttggag  gcaagctttg  gtcacatgct  ttcagggacg   1140

ctcctagtgt  cgtggccgaa  atgggggcga  tgcgatttcc  tcctgctgca  ttctgcttgt   1200

ttttcttcct  cgagcgttac  ggcctgtctt  cgatgaggcc  gttcccaaat  cccggcacag   1260

tcgacactta  cttggtctac  caaggcgtcc  aatacatgtg  gaaagccggg  cagctgccac   1320

cgaagctgtt  ccatcgcgtt  tacaacggtt  ggcgtgcgtt  cttgaaggac  ggtttctatg   1380

agcgagatat  tgtgttggct  tcgcctgtcg  ctattactca  ggccttgaaa  tcaggagaca   1440

ttaggtgggc  tcatgactcc  tggcaaattt  ggctgaaccg  tttcgggagg  gagtccttct   1500

cttcagggat  agagaggatc  tttctgggca  cacatcctcc  tggtggtgaa  acatggagtt   1560

ttcctcatga  ttgggaccta  ttcaagctaa  tgggaatagg  atctggcggg  tttggtccag   1620

tttttgaaag  cgggtttatt  gagatcctcc  gcttggtcat  caacggatat  gaagaaaatc   1680

agcggatgtg  ccctgaagga  atctcagaac  ttccacgtcg  gatcgcatct  gaagtggtta   1740

acggtgtgtc  tgtgagccag  cgcatatgcc  atgttcaagt  cagggcgatt  cagaaggaaa   1800

agacaaaaat  aaagataagg  cttaagagcg  ggatatctga  actttatgat  aaggtggtgg   1860

tcacatctgg  actcgcaaat  atccaactca  ggcattgcct  gacatgcgat  accaatattt   1920

ttcaggcacc  agtgaaccaa  gcggttgata  acagccatat  gacaggatcg  tcaaaactct   1980

tcctgatgac  tgaacgaaaa  ttctggttag  accatatcct  cccgtcttgt  gtcctcatgg   2040

acgggatcgc  aaaagcagtg  tattgcctgg  actatgagcc  gcaggatccg  aatggtaaag   2100

gtctagtgct  catcagttat  acatgggagg  acgactccca  caagctgttg  gcggtccccg   2160

acaaaaaaga  gcgattatgt  ctgctgcggg  acgcaatttc  gagatctttc  ccggcgtttg   2220

cccagcacct  atttcctgcc  ggcgctgatt  acgaccaaaa  tgttattcaa  catgattggc   2280

ttacagacga  gaatgccggg  ggagctttca  aactcaaccg  gcgtggtgag  gatttttatt   2340 

ctgaagaact  tttctttcaa  gcactggaca  cggctaatga  taccggagtt  tacttggcgg   2400

gttgcagttg  ttccttcaca  ggtggatggg  tggagggtgc  tattcagacc  gcgtgtaacg   2460

ccgtctgtgc  aattatccac  aattgtggag  gcattttggc  aaagggcaat  cctctcgaac   2520

actcttggaa  gagatataac  taccgcacta  gaaattagga  gctc                           2564

 

 

      

Claims (5)

1.一种植物表达载体，所述植物表达载体含有由植物生长素IAA生物合成相关的基因和特异性启动子BAN基因启动子组成的表达生长素IAA合成相关基因，所述表达生长素IAA合成相关基因序列如SEQ ID No.11所示，所述表达载体具有如图1(b)所示的结构；所述植物表达载体的制备包括以下步骤：

(1核特异启动子的获得:

设计BAN启动子引物--SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，从拟南芥基因组中PCR扩增获得DNA片段，将扩增的DNA片段克隆后测序分析表明为拟南芥的BAN特异性启动子，所述DNA序列如SEQ ID No.3；

(2核土壤根癌农杆菌iaaM基因的获得：

设计iaaM基因引物1-KpnI，如SEQ ID No.4所示，和iaaM基因引物2-SacI，如SEQ ID No.5所示，从土壤根癌农杆菌Ti质粒T-DNA中通过PCR扩增并克隆、测序分析后得到iaaM基因序列，如SEQ ID No.6所示；

（3）特异表达植物激素合成相关基因的载体的构建。

2.如权利要求1所述的植物表达载体在棉花纤维性状改良中的应用。

3.一种表达生长素IAA合成相关基因，其具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。

4.含如权利要求1所述植物表达载体的转化体。

5.一种含权利要求1所述植物表达载体的转基因植物的制备方法，包括以下步骤：

1核种皮和纤维特异表达启动子BAN的获得；

2核生长素IAA合成相关基因的获得；

3核将步骤1核中分离克隆到的特异启动子与步骤2核中分离克隆到的生长素合成相关基因进行融合，构建特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体；

4核将步骤3核得到的特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体整合到棉花基因组中；

5核将通过步骤4核获得的棉花进行进一步的培养，栽培，并获得转基因的棉花植株。

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