CN102220348B - GhASN-like基因、表达载体及其在提高棉花产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明将GhASN-like基因构建超量表达载体并整合到棉花基因组中，实现了该基因在棉花中的超量表达，增加了胚珠中糖的含量，增加转基因株的单株成铃数、每铃种子等，从而增加了籽棉和皮棉产量。应用这一方法可以明显增加单位面积籽棉和皮棉产量，在提高棉纤维产量，增加棉花生产经济效益的同时，也可增加棉籽产量而提升棉花生产的附加值，提高棉花生产的综合效益。

Description

GhASN-like基因、表达载体及其在提高棉花产量中的应用

技术领域

本发明涉及棉花GhASN-like基因的用途，还涉及超量表达该基因的植物表达载体和通过基因工程技术来提高棉花纤维和棉籽产量的方法。

背景技术

棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是蛋白、油脂的重要来源。正是因为棉花纤维和种子与人类生活密切相关，成为世界上最重要的经济作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国，棉花产业在我国国民经济中具有举足轻重的地位。

棉花的产量和品质性状为多基因控制的数量性状，且产量与品质性状在遗传上存在负相关关系。常规育种方法在棉花高产、优质等育种工作中发挥了重要作用。但是，仅靠常规育种手段和现有棉花遗传种质资源，难以大幅度提高棉花产量和品质来满足快速发展纺织工艺对纤维产量与品质的要求。基因工程育种能实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质的改良提供了新的途径。但是目前人们对棉花纤维发生、发育和品质形成的分子机理知之甚少，也还未挖掘出与棉纤维产量、品质直接相关的基因，使得利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。这些都极大地阻碍了棉花纤维产量与品质的改良进程。

在棉花胚珠发育过程中，种胚和纤维发育具有同步性。纤维着生在种子表皮，是种子的表皮毛，纤维的发育需要胚珠为其提供各种营养物质(ReinerH.Kloth and Rickie B.Turley，2010)。因此，棉花胚珠发育以及种子形成对纤维发育有重要影响。研究棉花胚珠的发育，不仅对了解纤维发育调控机理、以及棉花种子与纤维发育间的关系有重要科学意义，而且可望在提高纤维产量与品质的同时也增加种子产量，在提高棉花生产的综合效益方面具有非常重要的实践意义。

GhASN-like基因编码236个氨基酸残基，预测其分子量为25.4kDa。同源性分析表明该基因编码氨基酸残基与生长素下调和铝诱导基因编码氨基酸序列同源性达75％以上，但目前这些基因功能均未知。在GhASN-like及其同源基因编码蛋白中存在的蛋白结构域有wali7、Gn AT II，和AsnB等。其中wali7结构域就是以第一个从小麦中分离的基因命名的，该结构域功能尚不清楚。Gn AT II为谷氨酰胺氨基转移酶家族II(GATase)。谷氨酰胺酶结构域催化氨态氮从谷氨酰胺中转移出来作为底物，水解谷氨酰胺后产生谷氨酸和氨。这个结构域属于Ntn水解酶超基因家族，在氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸(GLMS或GFAT)合成酶，谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸(PRPP)氨基转移酶(GPATase)，天冬酰胺合成酶B(AsnB)，β-内酰胺合成酶(β-LS)和谷氨酸合成酶(GltS)等酶的N端都存在Gn AT II结构域。AsnB(天冬酰胺合成酶B)催化天冬氨酸和谷氨酰胺合成天冬酰胺。

谷氨酸合成酶和天冬酰胺合成酶都参与合成N-转运氨基酸。谷氨酸合成酶催化氨基从谷氨酰胺到α-酮戊二酸的还原转移，形成两分子的谷氨酸。天冬酰胺合成酶催化谷氨酰胺和天冬氨酸合成天冬酰胺。植物体内有机化合物代谢释放的铵，如种子萌发时发生的氨基酸脱氨基反应以及其他合成反应等产生的铵，由于植物不分泌含氮化合物，需要将体内反应产生的铵再次同化，以供自身生长与发育(布坎南B.B等著，瞿礼嘉等译，2004)。这两个酶就负责参与植物体内自由铵的再次同化过程。GhASN-like及同源基因编码蛋白具有与谷氨酸合成酶和天冬酰胺合成酶相同的结构域，据此推测GhASN-like及同源基因可能具有与谷氨酸合成酶和天冬酰胺合成酶相类似的功能，可能在植物体内铵再次同化，碳氮平衡调节中发挥作用。

在棉花胚珠发育过程中，纤维发育需要大量碳源的提供，胚珠是纤维发育所需能源物质的最直接提供者。在纤维发育过程中，会产生极不平衡的碳氮比例，且所述GhASN-like基因在棉花胚珠中高表达，显示该基因可能参与了这种碳氮关系的协调。棉花GhASN-like(Gossypium hirsutum ASN-like，GhASN-like)基因受生长素抑制，协调胚珠中碳代谢来调控胚珠发育过程，对胚珠的正常发育具有非常重要的作用。棉花胚珠发育影响棉铃形成，棉铃性状与棉花最终生产目标和棉花主要目标性状密切相关。提高GhASN-like基因表达有利于胚珠发育，从而对单株成铃数、铃重等与棉花产量构成相关的性状产生影响。

发明内容

鉴于以上情况，为了实现棉花高产育种，利用提高棉花GhASN-like基因的表达量有利于胚珠发育，从而可对单株铃数、铃重等与棉花产量构成等相关性状产生影响的特点，本发明应用基因工程技术从棉花中分离获得GhASN-like基因，并将其与强启动子融合后构建植物表达载体，转化到棉花植株中，结果表明提高棉花植株中GhASN-like基因的表达水平，可增加棉花胚珠中糖含量，提高单株成铃数、每铃种子数。

根据本发明的一方面，本发明的一个目的在于提供棉花GhASN-like基因的新用途，即超量表达棉花GhASN-like基因在棉花高产育种中的应用。本发明通过从棉花基因组中分离棉花GhASN-like基因(SEQ ID NO.9)，构建超量表达棉花GhASN-like基因的植物表达载体，和反义抑制棉花GhASN-like基因表达的植物表达载体。用该载体转化植物，获得转基因棉花株。证明棉花GhASN-like基因表达水平增加能提高棉花的籽棉产量，为棉花的高产育种提供了新的途径。

GhASN-like基因可以是由动物、植物或微生物中分离克隆得到的天然基因，也可以是人工改造或设计的基因。优选的，上述的棉花GhASN-like基因为生长素抑制基因，参与碳代谢调控过程。更优选的，本发明GhASN-like基因为棉花胚珠中优势表达的基因。

根据本发明的另一方面，提供一种超量表达棉花GhASN-like基因的植物表达载体，应用基因工程技术将棉花GhASN-like基因与强启动子可操作地连接，构建植物表达载体。转化植株后，在强启动子的作用下超量表达棉花GhASN-like基因。其中，强启动子可以是各种提高目的基因表达的增强型启动子，优选CaMV 35S启动子。优选的植物表达载体具有如图3所示的载体结构。该优选载体以GhASN-like基因序列正向连接在p5植物表达载体CaMV35S启动子后，形成超量表达该基因的植物表达载体(pGA)。而以GhASN-like基因同源性高的部分序列反向插入到p5表达载体CaMV35S启动子之后，形成GhASN-like基因反义表达载体(pAGA)，通过反义抑制该基因表达后，从另一方面证明改变该基因表达对产量产生影响。

根据本发明的再一方面，提供制备包含超量表达棉花GhASN-like基因的转基因棉花的方法，通过从棉花基因组中分离棉花GhASN-like基因，将其与强启动子可操作地连接，构建超量表达棉花GhASN-like基因的植物表达载体，将该载体转化宿主获得转化体，再将该转化体转入棉花植株获得转基因棉花。

根据本发明的又一方面，本发明的又一个目的在于提供一种提高棉花产量的方法，通过在棉花中超量表达棉花GhASN-like基因来提高棉花产量，该方法包括将超量表达棉花GhASN-like基因的植物表达载体整合到棉花基因组中的步骤。

本发明中所指的“棉花产量”是指棉花生产中收获的籽棉与皮棉重量，其产量构成因素包括单株铃数、铃重和衣分等。

本发明中所指的“转基因棉花”是指通过分子生物学、生物技术手段，将其它生物启动子或基因转移到棉花中，从而使其遗传物质被改造的棉花。用于改造的基因可以来源于植物自身或其它植物、动物以及微生物或者人工合成改造。

本发明在选定了目的基因的情况下，在棉花中超量表达目的基因是本领域常用的方式。上述表达载体可以构建成含单个基因的单价载体，也可以构建含多基因的双价或三价等类型的载体。在使用本发明方法提高棉花产量的过程中，可以只在一个部位表达一个目的基因，也可以在多个部位和多个发育阶段表达多个基因。

本发明从超量表达GhASN-like基因和反义抑制该基因表达正反两个方面证明：超量表达GhASN-like基因可提高棉花产量。具体为，按照上述制备超量表达棉花GhASN-like基因的转基因棉花植株的方法，获得超量表达的转基因棉花株系。并按照本领域常规方法制备反义抑制GhASN-like基因表达的棉花株系；分别实现在棉花基因组中超量表达GhASN-like基因和反义抑制GhASN-like基因表达。对超量表达GhASN-like基因的转基因棉花株系分析发现，转基因株系胚珠中蔗糖和果糖的含量增加，反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株系胚珠中蔗糖和果糖含量降低。超量表达GhASN-like基因与反义抑制GhASN-like基因表达的转基因棉花在网室中的试验数据显示，与分离的非转基因株系相比，超量表达GhASN-like基因的转基因株系单株成铃数、每铃种子数明显增加，反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株系的单株成铃数、每铃种子数明显减少。最终产量比较结果显示，相对于分离的非转基因株系，超量表达GhASN-like基因的转基因株系籽棉产量增幅最高达到14.3％、皮棉产量最高达到17.9％；反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株系籽棉与皮棉产量则分别下降了23.3％和19.5％。

上述各株系收获的棉花纤维经农业部棉花品质监督检验测试中心进行纤维5项指标检测分析，结果表明：与分离的非转基因株系相比，GhASN-like基因的转基因株系的纤维品质性状改变较小。说明改变该基因表达水平，对纤维品质性状的影响不大。

本发明提高棉花产量的方法，是通过在棉花中超量表达GhASN-like基因以调控胚珠发育，增加胚珠中蔗糖和果糖含量，促进胚珠发育，从而达到提高棉花产量的目的。试验结果证明，经本发明改良的转基因棉花单株成铃数和每铃种子数有所增加，从而提高棉花籽棉和皮棉产量。本发明方法简便易行，效果显著。本发明应用后，不仅可提高棉花纤维产量，为棉花生产带来巨大效益，作为油脂和蛋白重要来源的棉籽产量增加，还可增加棉花生产的附加值，提高了棉花生产的综合效益。

附图说明

图1为在培养基中添加不同浓度IAA及其抑制剂对胚珠中GhASN-like基因表达的影响结果图。纵坐标代表基因相对表达水平。横坐标代表不同浓度的IAA和抑制剂。

在离体培养条件下，胚珠生长发育需要适量的生长素才能正常发育。参照棉花胚珠正常离体培养IAA的浓度(5μmol/L)，IAA处理浓度设置2、5、10和25μmol/L四个梯度。然后取开花当天的胚珠，在添加有不同浓度IAA的胚珠培养基中培养15d。提取胚珠RNA，反转录合成一链，然后进行定量PCR分析。数据结果显示在低浓度IAA条件下，GhASN-like基因表达水平较高，高浓度条件下，其表达水平低，并且该基因表达水平随IAA浓度的增加而逐渐下降。说明高浓度IAA抑制该基因的表达。在添加有IAA/NPA、IAA/TIBA培养条件下，GhASN-like基因表达水平比添加IAA明显增高。与只添加IAA相比，添加IAA/NPA、IAA/TIBA后GhASN-like基因表达水平提高4～5倍。说明添加IAA运输抑制剂可以解除IAA对GhASN-like表达的抑制，基因表达水平的增加。

图2为FBP::iaaM转基因棉花胚珠中iaaM和GhASN-like基因表达水平分析结果图。FM-6、FM-9、FM-20、AM-1、AM-2为不同转基因株，FM为FBP7::iaaM转基因棉花，AM为Agl5::iaaM转基因棉花，Wildtype为野生型。纵坐标代表iaaM和GhASN-like基因相对表达水平。

与野生型胚珠中的表达相比，GhASN-like基因在FBP7::iaaM转基因棉花胚珠中的表达下降，且转基因株中iaaM基因表达越强，GhASN-like基因表达就越弱，趋势明显。Agl5::iaaM转基因棉花胚珠中GhASN-like基因表达模式与FBP7::iaaM转基因棉花的结果一致，GhASN-like基因在野生型中的表达明显高于Agl5::iaaM转基因株，且iaaM基因表达量越高，GhASN-like基因表达越低，表明GhASN-like基因确实受iaaM基因表达的负调控。结果进一步证明生长素IAA抑制GhASN-like基因的表达。

图3为强启动子CaMV35S控制GhASN-like基因超量表达的植物表达载体的构建流程图

其中，Km为卡那霉素抗性基因；Amp为氨苄青霉素抗性基因；NPTII为新霉素磷酸转移酶基因；GUS为β-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S为来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；P-nos为冠瘿碱合成酶基因启动子；T-nos为冠瘿碱合成酶基因终止子；LB为T-DNA左边界；RB为T-DNA右边界。

用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。

图4为GhASN-like基因的反义表达载体pAGA构建流程图

其中，Amp为氨苄青霉素抗性基因；GUS为β-葡萄糖酸苷酶基因；NPTII为新霉素磷酸转移酶基因；CaMV 35S为来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子，P-Nos为冠瘿碱合成酶基因启动子；T-Nos为冠瘿碱合成酶基因终止子；Km为卡那霉素抗性基因；LB和RB分别为整合进入植物基因组序列的左右边界。p5载体同上。

图5为强启动子CaMV35S控制的GhASN-like基因超量表达载体结构图

图6为CaMV35S::GhASN-like基因在转基因棉花中的PCR分析图

因在野生型棉花基因组存在GhASN-like基因，为有效地鉴定转基因株，以CaMV35S::GhASN-like表达元件中CaMV35S启动子5′端序列设计上游引物，GhASN-like基因3′端序列设计下游引物进行扩增，目的片段约1.5kb。其中，M为分子量标准，P为质粒DNA为模板，1-4泳道为转基因棉花植株，5泳道为空载转基因植株，W为水。

图7为CaMV35S::GhASN-like基因在转基因棉花的Quantity Real Time-PCR分析图。

其中，M-7、N-18、N-22和O-7为转基因棉花。WT和WT2为未进行转化过的野生型棉花(冀14)，Null1、Null2为转基因棉花分离产生的非转基因植株作为对照。对超量表达载体的转基因棉花株系胚珠中目的基因表达水平进行了检测。相对表达量分析经三次重复，确定超量表达的转基因株。有3个转化子的转基因植株表达水平高于Null和野生型植株。每个转化子的不同单株在表达水平上也存在一定的差异，在编号为M、N和O等转化子中M-7、N-18和O-7单株比同株系的其它植株表达水平高。

图8为反义抑制GhASN-like基因表达的转基因棉花中GhASN-like基因的Northern杂交结果图。

其中，AC-3～-11、AG-1、AG-3为反义抑制GhASN-like基因表达的转基因棉花株系，Null为分离产生的非转基因株系，OE18、OE7为超量表达GhASN-like基因的转基因植株。rRNA为上样对照。对各反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株系胚珠(10～15dpa)中GhASN-like基因的表达水平进行Northern杂交分析。从杂交结果来看反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株AC-3、AC-8、AC-10和AG-3中目的基因表达受到抑制，其中AC-3和AG-3转基因株系目的基因表达受到抑制最为严重，转基因株胚珠中GhASN-like基因的表达水平下调明显。

具体实施方式

本发明实施例中的基因工程载体、试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

棉花基因组来源于陆地棉品种徐州142，转基因受体材料为冀棉14。

【实施例1】目的基因的制备

1.DNA的提取

选取棉花幼叶0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2％CTAB(W/V)，4％PVP40(W/V)和2％巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL 5mol/L KAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h。再用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μL TE中，-20℃保存备用。

2.总RNA的提取与cDNA合成

取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15mL 65℃预热的RNA提取液(2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2，0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/LLiCl溶液，4℃放置6h，以氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。取约1μg的总RNA，用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。

3.目的基因序列的PCR扩增

引物1和引物2序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经测序，获得目的基因序列如SEQ ID No.9所示。

【实施例2】体外和体内增加生长素含量对GhASN-like基因表达的影响

取开花当天的蕾铃，剥去花瓣、萼片等，留下子房。先将子房在75％酒精中浸润进行表面活化处理，然后加0.1％的升汞，灭菌处理10～15min，用无菌蒸馏水洗涤6次。剥取胚珠置于胚珠培养基(胚珠离体正常培养基配方为：BT培养基+18g/L葡萄糖+3.6g/L果糖+0.5μmol/L GA3+5μmol/L IAA)中，置于32℃培养箱中暗培养。具体方案如下：

(1)在培养基中分别添加2μmol/L，5μmol/L，10μmol/L和25μmol/L的IAA对0DPA的胚珠进行培养进行培养5d。

(2)在添加有5μmol/L IAA、0.5μmol/L GA3和IAA极性运输的抑制剂NPA(NPA使用浓度：50μmol/L)的培养基中，对0DPA胚珠进行培养5d。

(3)在添加有5μmol/L IAA、0.5μmol/L GA3和IAA极性运输的抑制剂TIBA培养基中(TIBA使用浓度：50μmol/L)，对0DPA胚珠进行培养5d。

将经过不同浓度IAA、以及IAA抑制剂处理后胚珠从培养基中捞出，在吸水纸上除去多余水份，立即置研钵中加液氮研磨成粉。其余操作同上述RNA提取方法，按如下方法进行基因表达分析(数据结果见图1)。

FBP7和Agl5是具有胚珠特异性的启动子，iaaM基因来自细菌，在植物中表达可提高内源IAA的生物合成水平。专利发明人在前期工作已经获得生长素含量增加的转FBP7::iaaM、Agl5::iaaM的转基因棉花植株(专利申请号：申请人：裴炎等)。为检测内源增加生长素对目的基因表达的影响，对FBP7::iaaM、Agl5::iaaM转基因棉花田间材料挂牌，取开花后～15d胚珠提取RNA，按如下方法进行基因表达分析(数据结果见图2)。

【实施例3】目的基因表达水平检测

在提取植株材料总RNA后，用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。取1μL一链产物为模板首先进行RT-PCR扩增，检测模板扩增效果。其25μL扩增体系：包括1×PCR缓冲液，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl2，上、下游引物(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(Promega)。热循环参数为：94℃预变性3min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30s，30循环；72℃延伸10min。用组蛋白Histone3基因作内标。组蛋白Histone3的引物序列为SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8(Zhu YQ等，2003，植物生理，133，580-88)。

将检测扩增效果好的模板进行定量PCR检测。具体操作步骤为：PCR在Bio-Rad公司的iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System仪器上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)，上、下游引物各0.2μmol/L和1μL一链产物。热循环参数为：94℃预变性3mins；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，30sec，预设循环数为35。用棉花Histone3基因作内标，上、下游引物序列是SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。扩增GhASN-like基因的上、下游引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。在运行quantitative real-time PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过琼脂糖电泳，检查并确保扩增产物是单带。

【实施例4】表达载体的构建

载体构建流程见图3、图4。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。

【实施例5】植物表达载体经农杆菌导入棉花基因组

1.用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

2.超量表达GhASN-like基因的载体整合到棉花基因组。通过根癌农杆菌介导的方法进行棉花的遗传转化。

表1：根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS：Murashige & Skoog，1962

B5：Gamborg，1986

Gelrite：Sigma，货号：G1910

SH：Schenk & Hildebrandt，1972

上述的表达载体通过农杆菌介导胚性愈伤的方法导入棉花。具体方法如下：

(1)棉花胚性愈伤组织的诱导：棉花种子(冀棉14)剥壳，用0.1％升汞(HgCl₂)消毒10min，无菌水漂洗6次，播种于种子萌发培养基(培养基成分见表1)上。28℃、黑暗条件下萌发5-7天，以获得无菌棉花幼苗。选取生长健壮的无菌幼苗下胚轴，切成长约0.4cm的小段，接种于棉花愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，28℃，16h光照下培养，每3-4周继代一次。选取松散的愈伤组织接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，诱导胚性愈伤组织的产生，28℃，16h光照下培养。

(2)转化农杆菌的培养：挑取含上述表达载体的农杆菌菌株，在含50mg/L卡那霉素和125mg/L链霉素的YEB固体培养基(0.5％蔗糖(W/V)，0.1％细菌用酵母提取物(W/V)，1％细菌用胰化蛋白胨(W/V)，0.05％MgSO₄.7H2O(W/V)，1.5％的琼脂粉(W/V)pH7.0)上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于5mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1∶20的比例转接到50mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续在28℃、200r/min振荡培养3-5h。6,000r/min离心10min后，菌体用液体MSB(含100μmol/L乙酰丁香酮)培养基重悬，调整OD₆₀₀值为0.3-0.5备用。

(3)浸染和共培养：用无菌吸水纸吸去胚性愈伤组织表面的液体，放入调整好浓度的农杆菌菌液中，浸染20-30min。倾去菌液，将侵染过的胚性愈伤转移到共培养培养基上，于24℃黑暗条件下共培养4天。

(4)转化子的筛选：共培养完成后把胚性愈伤组织转移到筛选培养基上进行脱菌和选择培养，28℃，16h光照下培养，每3周继代一次。1-2个月后大部分愈伤组织褐化死亡，少部分表现出卡那霉素抗性，生长出新鲜的胚性愈伤组织。将愈伤组织块进行继代，每块组织增殖到2.0-3.0g时接入液体悬浮培养基中，在摇床上120r/min振荡悬浮培养以获得大量体胚。悬浮2周后用30目筛网过滤悬浮培养组织，网下沉淀物转接入体胚成熟培养基。萌发的成熟胚转入体胚伸长诱导培养基上，于28℃黑暗条件下培养2周以诱导体胚伸长、萌发。取较大的萌发胚(＞0.5cm)转接入SH培养基成苗，28℃，16h光照下培养。待幼苗长到约2cm高时，剪取幼苗嫁接到有3-4片真叶的棉花幼苗上。嫁接的棉花培养在温室中常规管理。

【实施例6】目的基因整合的稳定性检测

本研究利用PCR扩增技术检测目的基因整合的稳定性。在本实验中转化的目的GhASN-like基因来源于陆地棉品种徐州142，转基因受体材料为冀棉14。该两个棉花品种均为栽培陆地棉品种，亲缘关系很近，在受体棉花基因组中也存在该基因。对目的基因整合稳定性检测，不能通过检测GhASN-like基因来实施，以CaMV35S::GhASN-like表达元件中35S启动子5′端序列设计上游引物，GhASN-like基因3′端序列设计下游引物进行扩增(目的片段约1.6kp)，验证转基因植株。

以转基因棉花和野生型植株幼嫩叶片为材料提取植株的总DNA，以35S启动子5′端引物为上游引物(引物3，SEQ ID NO.3)，GhASN-like基因3′端序列设计下游引物(引物4，SEQ ID NO.4)，扩增产物长约1.6kb。PCR反应25μl总体系包括1×PCR buffer，1.5mmol/L的MgCl2，0.2mmol/L的dNTPs，上下游引物均为0.2μmol/L，25ng Template DNA，1U Taq DNA聚合酶。热循环参数：94℃预扩增3min，然后94℃，30s；56℃，45s；72℃，30s；30个循环，72℃延伸10min。扩增产物1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

【实施例7】定量PCR的方法检测导入的GhASN-like基因在棉花胚珠中的表达

提取对照棉花植株和转基因棉花植株开花后10天的胚珠和纤维的总RNA，其余操作同实施例3。

【实施例8】蔗糖、果糖的提取与分析

按照《现代植物生理学实验指南》操作步骤进行蔗糖、果糖的提取与分析。具体操作为：取开花后12d大小胚珠，液氮速冻后研磨成粉，称取约1.0g鲜重的粉末装入15ml的有刻度离心管中，加入80％乙醇4ml，80℃水浴40min，期间不断搅拌。离心收集上清液，其余残渣重复抽提2次，合并上清液。定容到10ml备用。

蔗糖测定：在0.1ml反应系统中，取100μL提取液，加入0.05ml 2mol/LNaOH，沸水煮5min，冷却后加入0.7ml 30％HCl和0.2ml用95％乙醇配制的0.1％的间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴反应10min，冷却后于480nm比色测定蔗糖的生成。取相当量的蔗糖溶液，制作蔗糖标准曲线，按标准曲线计算样品中蔗糖含量。

果糖测定：在0.1ml反应系统中，取20μL提取液，加入0.2ml 0.1％的间苯二酚和0.7ml 30％HCl，摇匀后置于80℃水浴反应10min，冷却后于480nm测定其OD值。取相当量的果糖溶液，制作果糖标准曲线，按标准曲线计算样品中果糖含量。

与对照株系相比，超量表达GhASN-like基因后胚珠中的蔗糖与果糖含量上升，反义抑制GhASN-like基因表达水平株系胚珠中蔗糖和果糖含量下降。

表2转基因棉花株系和Null株系胚珠中糖含量

AG-3、AC-3：反义转基因株系；Null：分离产生的非转基因株系；M-7、O-7：超量表达转基因株系。

【实施例9】：转基因棉花小区试验与产量性状考察

转基因棉花植株种植于西南大学转基因基地网室，按照单因素随机区组设计方法，将两个超量转基因株系、两个反义抑制转基因株系和分离的非转基因株系进行3重复的小区试验。小区试验面积为18m²，每个小区3行、每行15株。行距为1.0m，小区间距为1.5m，区组间距为0.6m。4月初苗床播种，5月上旬移栽到试验区，常规栽培管理和施肥措施。

1.单株成铃数和每铃种子数的统计

单株成铃数统计截止日期为10月上旬，统计直径大于2.0cm单株铃数，按小区统计总铃数和植株数，单株成铃数＝小区总铃数/植株数。每铃种子数统计方法：收获正常暴桃的棉铃，统计每个铃的种子数，每个小区统计100铃，计算其平均数。

2.产量性状考察

分小区收获暴桃的棉铃，经自然干燥后，计算铃重和小区籽棉产量。于每小区收获的籽棉中，随即选取100粒种子，准确称取百粒籽棉的重量，手工脱纤维再分别称量纤维的总量和种子的总量，计算衣分的大小，最后取3个小区的平均值作为最终结果。单株籽棉重＝小区籽棉总重/植株数。小区皮棉重为小区籽棉经机械脱绒的纤维重量，单株皮棉重＝小区皮棉总重/植株数。

超量表达GhASN-like基因与反义抑制GhASN-like基因表达的转基因棉花在网室中的实验数据显示，超量表达GhASN-like基因的转基因株系单株成铃数明显增加，反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株系的单株成铃数明显减少，与分离的非转基因株系相比，超量表达GhASN-like基因和反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株系与分离的非转基因株系间的差异均达显著水平(P＜0.05)；而对于每铃种子数这个性状来说，非转基因株系平均为19.1，两个反义抑制GhASN-like基因表达的转基因株系平均分别为11.7和12.9，超量表达GhASN-like基因的转基因株系平均分别为22.2和21.5。与非转基因株系相比，两个反义株系每铃种子数各减少了38.7％和32.4％，而超量转基因株系则分别增加了16.5％和12.7％。在铃重性状上，反义抑制的转基因株系铃重为1.56g和2.35g，和非转基因株系相比，分别降低了63.5％和45.0％(见表3)。最终产量比较而言，相对于非转基因株系，超量表达的转基因株系单株籽棉和皮棉产量都增加，增幅最高分别达到14.3％和17.9％；反义抑制的转基因株系单株籽棉和皮棉产量则分别下降了23.3％和19.5％。转基因株系与非转基因株系在衣分、纤维纤维素含量方面无明显差异。

表3转基因株系产量性状统计结果(2010年)

AC-3、AG-3：反义转基因株系；M-7、O-7：超量表达转基因株系；Null：分离产生的非转基因株系。*表示差异均达显著水平(P＜0.05)。

表4转基因棉花衣分与纤维素含量比较

AC-3、AG-3：反义转基因株系；M-7、O-7：超量表达转基因株系；Null：分离产生的非转基因株系。

【实施例10】转基因棉花纤维的品质检测

将各棉纤维样品送农业部棉花品质监督检测测试中心(安阳)，依据ASTMD5867-95《HVI900大容量纤维测试仪试验方法》，采用HFT9000在温度20℃相对湿度65％的环境条件下，对上半部平均长度、整齐度指标、断裂比强度、伸长率、马克隆值5指标进行测试。从各株系纤维5项指标检测分析结果可看出，与分离的非转基因株系相比，转基因株系的纤维品质性状改变较小，表明改变该基因表达水平，对纤维品质性状的影响不大。

表5转基因与Null株系纤维品质检测结果(2010年)

AC-3、AG-3：反义转基因株系；M-7、O-7：超量表达转基因株系；Null：分离产生的非转基因株系。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (2)

1.超量表达棉花GhASN-like基因在棉花高产育种中的应用，其中所述GhASN-like基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

2.一种提高棉花产量的方法，其中包括将超量表达棉花GhASN-like基因的植物表达载体中的GhASN-like基因整合到棉花基因组中的步骤，所述GhASN-like基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

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