CN101633934B

CN101633934B - 表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良的应用

Info

Publication number: CN101633934B
Application number: CN2008101425183A
Authority: CN
Inventors: 裴炎; 侯磊; 李德谋; 宋水清; 李先碧; 罗明; 肖月华; 郑雪莲; 曾其伟; 张觅; 邱坤; 罗凤涛
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: WO2010009601A1; CN101633934A; US20110145947A1

Abstract

本发明通过将特异启动子与生长素合成酶基因融合，构建特异表达生长素合成酶基因的植物表达载体，将该植物表达载体整合到棉花基因组中，实现了生长素合成酶基因在棉花种皮和纤维中的特异表达；该方法可以显著的增加棉花纤维的产量，改良棉花纤维的品质，为棉花产业和纺织工业提供高品质的纤维。

Description

表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良的应用

技术领域

本发明涉及一种植物表达载体及其应用，尤其涉及表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其棉花纤维性状改良的应用。

背景技术

棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是最重要的经济作物。我国是世界上最大的纺织品生产国和消费国，棉花产业在我国的国民经济中具有举足轻重的地位。近年来，随着人民生活水平的提高和纺织技术的革新，对棉花纤维品质的要求也相应提高；尤其是近年来以气流纺纱取代环锭纺纱的技术革命，要求更长、更强、更细和更整齐的纤维。但是，目前我国棉花推广品种大都纤维品质偏低，长度单一，纤维强度偏低，纤维较粗，缺乏纺60支以上的高档棉纱的品种，远不能满足市场的需要。这直接导致了我国原棉在国际市场上缺乏竞争力。同时也导致了我国棉花生产近年来一直处于一种结构性矛盾的困境：一方面原棉产量逐年下降，而库存原棉仍不断增加，造成大量资金积压；另一方面进口棉花数量却不断上升。随着我国加入世界贸易组织，我国原棉的结构性矛盾变得更为突出。能否迅速提高我国棉花品种的纤维产量和品质，直接关系到我国棉花产业的兴衰和纺织品生产加工业的生存与发展。

棉花的产量和品质性状为多基因控制的数量性状，且产量与品质性状之间存在遗传上的负相关。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二倍体的瑟伯氏棉(纤维强度)、异常棉(纤维强度与细度)以及四倍体的海岛棉(纤维强度与细度)等。这些优良性状基因的利用，却在常规育种中受到诸多限制，单靠现有的棉花遗传种质资源和常规育种手段已经难以大幅度提高棉花产量，难以满足快速发展的纺织工艺革命对纤维品质的要求。利用基因工程技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，这为棉花纤维产量和品质的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花纤维形成，以及产量和品质(强度、细度和长度等)直接相关的基因，使得利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。人们对棉花纤维发生、发育和品质形成的分子机理也知之甚少。这些都极大的阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。

现有研究表明，棉花纤维是由棉花胚珠的外珠被表皮细胞经分化起始、伸长(初生壁合成)、增厚(次生壁合成)和成熟脱水四个过程发育而成的单细胞纤维.棉花纤维细胞的最终长度可达20-30mm，高的可达35-40mm，其长径比达1,000-3,000。这样高的径长比是纤维细胞剧烈伸长的结果，其中必然有促进细胞生长和伸长的植物激素参与。纤维细胞的起始与伸长都与生长素(Auxin，如吲哚乙酸indole-3-acetic acid，IAA)密切相关。利用离体培养的棉花胚珠，人们发现未受精的胚珠培养后不能产生纤维，但在培养基中添加GA和IAA能诱导纤维的生长；生长素拮抗剂处理表明生长素是纤维原始体伸长的关键因素(Beasley CA，1973，Science，179：1003-1005；Beasley CA等，1973，American J Bot，60，130-139)。Giavalis等2001年报道了GA3和IAA处理对培养的未受精胚珠纤维数量的影响，研究结果表明，在开花前或开花后施用外源GA和IAA，可以使培养的未受精胚珠纤维的数量显著增加(Giavalis S等，2001，J Cotton Sci，5，252-258).Seagull和Giavalis 2004年进一步发现，在自然生长状态下，GA3和IAA处理棉花的蕾或铃，可以明显增加纤维细胞的数量。而且IAA处理开花前或开花后的棉铃可使单个棉籽上的纤维细胞数量增加58％(Seagull RW等，2004，J Cotton Sci，，8，105-111)。以上研究都表明IAA能促进棉花纤维的产生，与纤维发育生长的关系密切。

外源生长素施用虽然有很好的效果，但在生产上往往难以做到：将生长素逐一涂抹在花或蕾铃上，工作量甚大，劳动力成本高，大面积推广难以实现。而且，生长素的大量使用，既增加了生产成本，又会带来环境污染。相比之下，通过控制生长素生物合成酶基因，从内源的角度来调节特定器官中的生长素含量，促进收获器官的发育，是个十分有效的策略。这一策略至少具有下述几方面的优点：1)效率高、成本低，因为一旦将生长素生物合成酶基因导入植物，就无需外加施用生长素或其它处理。而且，外源施用生长素是通过扩散进入细胞，而内源激素则产生自细胞内。因此，用转基因内源控制生长素的效果往往比外源施用更好；2)对作物负面影响小，由于生长素的作用浓度很低，浓度过高或过低均会对植物的发育带来不良影响。而内源表达生长素合成酶基因，在表达水平和表达部位合适的情况下，就可以做到只对特定目标器官(组织)起作用，而不影响植物的其它部分的正常发育；3)与外源施用生长素和人工合成生产调节物质相比，内源调控生长素合成酶基因对环境污染小，对人类健康造成的危害也小(Li Y等，2004，Transgenics of plant hormones and theirpotential application in horticultural crops.In：Genetically Modified Crops：theirdevelopment，uses，and risks.New York：Food Products Press，101-112)。

然而，利用生长素合成酶基因提高产量和改善品质这一策略在棉花育种上却未获成功。1999年John ME将涉及生长素IAA生物合成的两个酶基因iaaM和iaaH置于纤维特异性启动子E6下，通过农杆菌介导转入陆地棉DP50中，结果发现IAA含量在大多数转基因株系里都有2-8倍的增加，然而纤维长度，细度和强度与对照野生型相比并没有显著差异(Basra AS等，1999，Cotton Fiber，NewYork：Food Products Press，271-292)。迄今为止还未见有通过内源表达激素生物合成酶基因改良棉花纤维品质的成功的报道。人们对能否应用激素生物合成酶基因改良棉花纤维品质也普遍持有疑义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达生长素合成相关基因的植物表达载体，将所述的植物表达载体应用于棉花纤维性状的改良，以解决现有的内源表达植物生长素生物合成酶基因的方法难以改良棉花纤维产量和品质的问题。

本发明进一步提供本发明所述的植物表达载体在棉花纤维性状改良上的应用。

本发明还提供基于本发明植物表达载体的转基因植物的制备方法。

根据本发明的一方面，本发明的植物表达载体至少含有由植物生长素合成酶基因和植物种皮特异启动子组成的表达生长素合成相关基因的核苷酸，所述核苷酸通过将编码植物生长素合成酶的基因与编码植物种皮特异启动子的基因可操作的连接而构建，优选的植物生长素合成酶基因为土壤根癌农杆菌tms(tumour morphology shooty)基因(常称iaaM基因)；优选的植物种皮特异启动子为FBP7(Floral Binding Protein 7)基因启动子。因此，优选的编码表达生长素合成相关基因的核苷酸为具有SEQ ID NO.13所示序列的核苷酸。获得表达生长素合成相关基因的核苷酸后，将该核苷酸插入表达载体从而构建本发明表达生长素合成相关基因的植物表达载体，优选的植物表达载体具有如图2所示的载体结构。由于在植物表达载体构建过程中，基于基因操作上的便利，在FBP7启动子和iaaM基因之间，存在一部分可变的非编码序列。而且，在将FBP7启动子通过基因操作的手段，置于iaaM基因5’上游过程中，采用不同的克隆手段，会产生不同的非编码序列，但这些都不影响FBP7启动子和iaaM基因的连接以及FBP7启动子和iaaM基因在一起时所起的生物学功能。故，只要FBP7启动子置于iaaM基因5’上游，启动了iaaM基因的表达，不管它们之间存在什么非编码序列，均在本专利的保护范围之内。

根据本发明的另一方面，提供一种转化体，将本发明的植物表达载体转染宿主而获得转化体，该转化体可用于转化植物获得转基因植物。

根据本发明的再一方面，提供本发明的植物表达载体在棉花纤维性状改良的应用。通过在植物体内表达本发明构建的生长素合成相关基因，而调控生长素合成酶的表达，达到改良棉花纤维性状的目的。

根据本发明的再一方面，提供转基因植物的制备方法，将上述本发明转化体转化植物(棉花)，获得转基因植物。

具体地说，棉花纤维性状改良的方法包括以下几个步骤：1)获得种皮和纤维特异表达启动子；2)获得生长素合成相关基因；3)将步骤1)中分离克隆到的特异启动子与步骤2)中分离克隆到的生长素合成相关基因进行融合，构建特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体；4)将步骤3)得到的特异表达生长素合成相关基因的植物表达载体整合到棉花基因组中；5)将通过步骤4)获得的棉花进行进一步的培养，栽培，并获得转基因的棉花植株。

其中，步骤1中所述的特异表达启动子可以是由动物、植物或微生物中分离克隆得到的天然启动子，也可以是人工改造或设计合成的启动子。

其中，步骤2中所述的植物生长素合成相关基因可以是由动物、植物或微生物中分离克隆得到的天然基因，也可以是人工改造或设计的基因。

其中，步骤3)中所述的特异启动子与生长素合成相关基因融合以构建特异表达生长素合成相关基因的表达载体的方法为本领域的常规方法，使用的载体可以是植物转基因领域所使用的常规载体。

其中，步骤4)中所述的将表达载体整合到棉花的基因组所使用的方法为常用的植物转基因方法，比如根癌农杆菌介导法或基因枪法。

优选的，上述特异启动子为子房特异启动子或种皮特异启动子或种皮和纤维特异启动子。更优选的，上述种皮和纤维特异启动子为FBP7(Floral BindingProtein 7)基因启动子，上述子房特异启动子为AGL5(Agamous Like protein 5)基因启动子，上述纤维特异启动子为E6基因启动子。

优选的，上述植物激素合成相关基因为生长素合成相关基因。更优选的，本发明植物激素合成相关基因为土壤根癌农杆菌tms(tumour morphologyshooty)基因(常称iaaM基因)。

本发明中所指的“棉花纤维性状”是指棉花纤维的数量和品质性状，包括纤维的数量多少、长度、细度、强度、整齐度等。

本发明中所指的“转基因棉花”是指通过分子生物学、生物技术手段，将其他生物的基因转移到棉花中，从而使被改造棉花的遗传物质得到改造的棉花。用于改造的基因可以来源于植物、动物以及微生物或者人工合成改造。

本发明中所指“衣分”是指籽棉上纤维重量对籽棉重量之比，以百分率表示。也就是纤维重量占整个种子及纤维总重量的比例。

本发明中所指“纤维强度”是指拉伸一束纤维在即将断裂时所能承受的最大负荷，以厘牛/特克斯(cN/tex)表示，特克斯是1000米纤维的克重数。

本发明通过大量研究和分析以及前期实验，认为John等未能成功并不意味着利用植物激素生物合成酶基因来提高棉花产量和改善纤维品质的策略是不可行的。因为，既然外源施用IAA等植物激素对棉花纤维细胞数量的增加和纤维品质的提高有明显的作用，那么，通过控制植物激素合成酶基因，从内源角度来调节激素含量，促进棉花纤维发育，应该是可行的。而现有研究的结果未能取得预期效果的原因关键在于：未能找到合适的启动子。因此选择适当的启动子，在棉花的特定部位、发育的特定时间、以适宜的强度控制与植物激素合成相关基因的表达，精准的调控植物体内激素的作用浓度、作用时间与作用部位，才可以有效的影响棉花纤维的生长发育，获得预期的效果。但是，启动子种类极为繁多，不可能预料哪种启动子连接上生长素相关基因后就能对棉花纤维有效。本发明根据棉花纤维发育的特点，在大量筛选启动子的基础上，创造性地采用了种皮特异启动子FBP7(Floral Binding Protein 7)基因启动子(来源于矮牵牛)，子房特异启动子AGL5(Agamous Like protein 5)基因启动子(来源于拟南芥)和纤维特异启动子E6基因启动子(来源于陆地棉)为主要元件构建新的基因表达载体，并建立起了一整套与之相适应的改良棉花纤维性状的方法。

本发明方法在选定了启动子和目的基因的情况下，本发明的启动子和目的基因融合成新的基因的方式可以采用本领域常用的方式，并可以将融合成的新的基因转入本领域常用的载体中构建成表达载体再转入棉花中。显然，上述表达载体可以构建成含单个基因的单价载体，也可以构建含多基因的双价或三价等类型的载体。在使用本发明方法改良棉花的过程中，既可以只在一个部位表达一个目的基因，也可以在多个部位和多个发育阶段表达多个基因，本发明方法已经提供了技术方案。

本发明改良棉花纤维性状的方法，是通过在棉花的种皮和纤维特异表达生长素合成相关基因，进而调控生长素合成酶的表达，通过内源调控棉花特定组织器官中相应激素的含量的方式，控制棉花种子发育以及纤维发育的起始和伸长，达到改良棉花纤维产量和品质(长度，细度和强度)的目的。试验结果证明，经本发明改良棉花纤维性状的方法所改良的棉花纤维的数量明显增多，产量明显增加，棉花纤维品质明显改良；其种子数量增加，衣分明显提高。本发明方法简便易行，效果显著，能为纺织工业带来高产，高品质的纤维原料，产生巨大的经济效益。

附图说明

图1：特异启动子(包括FBP7、AGL5和E6)调控下的生长素合成基因表达载体的构建流程图

Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸转移酶基因；GUS，β-葡萄糖酸苷酶基因；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；Pnos，冠瘿碱合成酶基因启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121基础上改造的p5载体，具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。

图2：本发明的植物表达载体结构图

图3：生长素合成酶基因iaaM在转基因棉花中的southern分析

A，p5-FBP7:iaaM转基因棉花的11个株系的基因组DNA经XbaI酶切后，用iaaM基因片段进行southern杂交。在不同的株系中得到了不同大小的杂交片段。野生型对照中没有杂交信号。1、2、6......20为p5-FBP7:iaaM的不同转基因株系；WT为野生型对照。

B，p5-E6:iaaM转基因棉花的6个株系的基因组DNA经XbaI酶切后，用iaaM基因片段进行southern杂交。在不同的株系中得到了大小不同的杂交片段。野生型对照中没有杂交信号。1、2、5、8、10和11分别为p5-E6-iaaM的不同转基因株系(IE1-1、IE1-2、IE1-5、IE1-8、IE1-10和IE1-11)；WT为野生型对照。

C，p5-AGL5-iaaM转基因棉花的8个株系的基因组DNA经XbaI酶切后，用iaaM基因片段进行southern杂交。3、4、6、7、10、11、12和14分别为p5-AGL5-iaaM的不同转基因株系(IG1-3、IG1-4、IG1-6、IG1-7、IG1-10、IG1-11、IG1-12和IG1-14)；WT为野生型对照，野生型对照中没有杂交信号。

图4：特异表达的植物生长素合成酶基因iaaM在转FBP7:iaaM基因棉花中的RT-PCR分析

A，FBP7:iaaM转基因棉花11个株系与野生型进行iaaM的表达分析，结果在9^#，14^#，20^#三个株系中检测到了iaaM的表达。其中9^#的表达最强，14^#居中，20^#最弱；1、2、6、7、9、10、11、14、15、18、20：不同的株系编号。B，在FBP7:iaaM转基因棉花9^#胚珠和纤维的不同发育时期，iaaM的表达随着时间增长逐渐减弱，在15天之后基本检测不到iaaM的表达；-2：-2dpa，开花前两天的材料；0、1、2、3、5、10、15、20、30：0dap，1dpa......30dpa，开花后的不同天数的材料。上：iaaM基因RT-PCR的结果，iaaM基因特异引物(序列9和10)的扩增产物，扩增进行35个循环。中：GhHis基因RT-PCR的结果；组蛋白Histone特异引物(序列7和序列8)的扩增产物，扩增35个循环。下：以RNA为模板进行的iaaM的RT-PCR结果，结果显示所用RNA中没有可被检测的DNA污染。control：分离的阴性植株作为对照；P：以pUC-iaaM质粒为模板的阳性对照。

图5：特异表达的植物生长素合成酶基因iaaM在转E6:iaaM基因棉花中的RT-PCR分析

E6:iaaM转基因棉花11个不同转基因株系与野生型进行iaaM的表达分析，结果在11^#株系中检测到iaaM有较高的表达水平1^#，2^#，8^#，10^#，14^#，17^#株系中也检测到了iaaM基因的表达。1、2、5、8、10、11、13、14、17、19、21：不同的转基因株系编号。上：iaaM基因RT-PCR的结果，iaaM基因特异引物(序列9和10)的扩增产物，扩增进行35个循环。中：GhHis基因RT-PCR的结果，组蛋白Histone特异引物(序列7和序列8)的扩增产物，扩增35个循环。下：以RNA为模板进行的iaaM的RT-PCR结果，结果显示所用RNA中没有可被检测的DNA污染。control：分离的阴性植株作为对照。

图6：特异表达的植物生长素合成酶基因iaaM在转Agl5:iaaM基因棉花中的RT-PCR分析

Agl5:iaaM转基因棉花11个株系与野生型进行iaaM的表达分析，结果在6^#，7^#，10^#三个株系中检测到了iaaM基因的较高水平的表达。其次是15^#和23^#转基因株系，2^#、3^#、4^#、16^#、17^#和21^#中也有iaaM基因的表达。2、3、4、6、7、10、15、16、17、21、23：不同的株系编号。上：iaaM基因RT-PCR的结果，iaaM基因特异引物(序列9和10)的扩增产物，扩增进行35个循环。中：GhHis基因RT-PCR的结果，组蛋白Histone特异引物(序列7和序列8)的扩增产物，扩增35个循环。下：以RNA为模板进行的iaaM的RT-PCR结果，结果显示所用RNA中没有可被检测的DNA污染。control：分离的阴性植株作为对照。

图7：FBP7:iaaM转基因棉花胚珠中iaaM基因的Real-time PCR分析

iaaM基因在11个转基因株系中表达程度不同，9^#、14^#的表达量高(A)；iaaM基因在棉花胚珠和纤维中的表达水平从开花前两天到10dpa逐渐降低，0dap为峰值，15天及之后检测不到iaaM基因的表达(B)。Control，分离的阴性植株作为对照。

图8：FBP7/E6/AGL5:iaaM转基因棉花与对照胚珠和纤维中游离IAA的含量比较

通过测定开花前1d至开花后5d棉花胚珠中游离的IAA含量，结果发现转E6:iaaM和AGL5:iaaM基因棉花胚珠中游离IAA，与对照相比无明显改变，而转FBP7:iaaM基因植株中的游离IAA含量比对照明显增加，约是对照的2-8倍。其中检测样品为胚珠和纤维的混合提取物。Control，分离的阴性植株作为对照。所有时间点重复取材测定3次，取平均值进行作图分析。

图9：FBP7:iaaM转基因棉花与野生型棉花胚珠表面扫描电镜比较图

A，开花当天的野生型胚珠表面，显示起始的纤维，放大70倍；B，特异启动子FBP7控制的iaaM转基因棉花胚珠表面，显示起始的纤维，放大70倍；C，图A的进一步放大，示起始纤维的形状和数量，放大500倍；D，图B的进一步放大，示起始纤维形状和数量，放大500倍；D中的起始纤维分布明显比C中密集，数量更多。C，D中Bar＝10μm。

图10：E6:iaaM转基因棉花与野生型棉花胚珠表面扫描电镜比较图

A，开花当天的野生型胚珠表面，显示起始的纤维，放大80倍；B，图A的进一步放大，示起始纤维的形状和数量，放大500倍；C，特异启动子E6控制的iaaM转基因棉花胚珠表面，显示起始的纤维，放大80倍；D，图C的进一步放大，示起始纤维形状和数量，放大500倍。

图11：AGL5:iaaM转基因棉花与野生型棉花胚珠表面扫描电镜比较图

A，开花当天的野生型胚珠表面，显示起始的纤维，放大80倍；B，图A的进一步放大，示起始纤维的形状和数量，放大500倍；C，特异启动子AGL5控制的iaaM转基因棉花胚珠表面，显示起始的纤维，放大80倍；D，图C的进一步放大，示起始纤维形状和数量，放大500倍。

图12：FBP7:iaaM转基因棉花胚珠及纤维组织切片的显微观察

FBP7:iaaM转基因棉花在0dpa的胚珠表面纤维原始体的突起明显可见；在1dpa的转基因棉花胚珠表面纤维原始体的增长也比对照明显；到2dpa的转基因胚珠表面，纤维已经显著增长，且数量上比对照多。Control，分离的阴性植株作为对照；FBP7:iaaM，FBP7:iaaM转基因棉花；0dpa，开花当天的胚珠；1dpa，开花后一天的胚珠；2dpa，开花后两天的胚珠；A、D、E、H、I、J，放大倍率10×，Bar＝5μm；B、C、F、G，放大倍率40×，Bar＝2μm。

图13：FBP7:iaaM转基因棉花早期纤维数量统计结果

转基因植株开花两天后的胚珠上纤维的数量明显比对照增长。在9^#、14^#FBP7:iaaM转基因棉花株系2dpa的胚珠表面纤维的数量在6000左右，对照的数量为平均5940左右，9^#、14^#两个株系都比野生型明显增多。其中9^#大约增加了11.3％，14^#增加了15.1％。

图14：FBP7:iaaM转基因棉花与对照种子大小和短绒含量的比较

A，转基因棉花的种子明显比对照的减小；短绒变少。B，硫酸脱绒分析短绒含量，结果显示转基因棉花的短绒较对照减少了约10％。Control，分离的阴性植株作为对照；FBP7:iaaM，FBP7:iaaM转基因棉花。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

【实施例一】棉花基因组的制备

1.DNA的提取

选取棉花幼叶0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2％CTAB(W/V)，4％PVP40(W/V)和2％巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL 5mol/L KAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，用75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h。再用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μL TE中，-20℃保存备用。

2.RNA的提取

选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15mL 65℃预热的RNA提取液(2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2,0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3～10min，期间混匀2～3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h，以氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。

3.基因组序列的PCR扩增

10×Ex PCR buffer(Mg²⁺free) 2.5μL

2.5mmol/L dNTPs 2μL

25mmol/L MgCl₂ 2μL

引物1(5μmol/L) 1μL

引物2(5μmol/L) 1μL

Ex Taq DNA聚合酶 1U

基因组DNA 约60ng

25μL的扩增体系

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

4.DNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5α

长度在2.0kb以下的片段采用离心法回收。紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块。用5号缝衣针在0.5mL的离心管底部钻一小孔并填入大小合适的玻璃棉。将含目的片段的琼脂糖块放入填有玻璃棉的0.5mL离心管中，液N2速冻，将速冻的0.5mL离心管套入到一1.5mL的离心管中，13,000r/min离心3min。向流出液(含DNA)中加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，3倍体积的无水乙醇，混匀后于-70℃放置30min。13,000r/min、4℃离心15min收集DNA沉淀，用预冷的75％的乙醇洗涤沉淀。室温干燥，用适量的TE溶解沉淀即得到目的片段。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。长度大于2.0kb以上的片段用试剂盒(Roche公司)回收。

回收的片段与pUCm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：

10×T4DNA连接缓冲液 1μL

载体DNA片段 1μL

外源连接产物DNA片段 1μL

T4DNA连接酶 1μL

用双蒸水补足体积至10μL的连接体系

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1∶3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。

【实施例二】表达生长素合成相关基因的核苷酸和植物表达载体的制备

1.特异启动子的获得

根据矮牵牛种皮特异启动子FBP7(GenBank登录号：U90137)，设计引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，从矮牵牛基因组中PCR扩增获得一个500bp左右的片段。将扩增DNA片段克隆到pUCm-T(上海生工生物工程公司产品)后，测序分析表明为矮牵牛的FBP7特异启动子，见SEQ ID NO.3，克隆载体为pUC-FBP7。

根据棉花纤维特异启动子E6，设计E6特异引物(SEQ ID NO.4，5)，从陆地棉基因组中扩增获得一个1.4kb左右的片段。将扩增DNA片段克隆到pUCm-T(上海生工生物工程公司产品)后，测序分析表明为陆地棉E6纤维特异启动子，见SEQ ID NO.6，克隆载体为pUC-E6。

根据拟南芥种子特异启动子AGL5(GenBank登录号：AC006931.6)，设计AGL5特异引物(SEQ ID NO.7，8)，从拟南芥基因组中扩增获得一个2kb左右的片段。将扩增DNA片段克隆到pUCm-T(上海生工生物工程公司产品)后，测序分析表明为拟南芥的AGL5特异启动子，见SEQ ID NO.9，克隆载体为pUC-AGL5。

2.土壤根癌农杆菌iaaM基因的获得

根据土壤根癌农杆菌Ti质粒tms(iaaM)基因序列(GenBank登录号：K02554)设计引物(见SEQ ID NO.10和11)，从土壤根癌农杆菌Ti质粒T-DNA中通过PCR扩增并克隆到pUCm-T(上海生工生物工程公司产品)、测序分析后得到SEQ ID NO.12，克隆载体为pUC-iaaM。

3.特异表达植物激素合成相关基因的载体的构建

载体构建流程见图1。起始的质粒载体分别来自上述的1和2，p5为在pBI121(Clontech公司)的基础上，采用《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)中的方法改造而来。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。

构建的植物表达载体结构见图2，其包括表达生长素合成相关基因的核苷酸(SEQ ID NO.13)以及表达筛选所需的各元件

【实施例三】转化体和转基因植物的制备

1.用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

2.特异表达植物激素合成相关基因的载体整合到棉花基因组

通过根癌农杆菌介导的方法进行棉花的遗传转化

表1：根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS：Murashige & Skoog，1962

B5：Gamborg，1986

Gelrite：Sigma，货号：G1910

SH：Schenk&Hildebrandt，1972

上述的表达载体通过农杆菌介导胚性愈伤的方法导入棉花。具体方法如下：

(1)棉花胚性愈伤组织的诱导：棉花种子(冀棉14)剥壳，用0.1％升汞(HgCl₂)消毒10min，无菌水漂洗6次，播种于种子萌发培养基(培养基成分见表1)上。28℃、黑暗条件下萌发5-7天，以获得无菌棉花幼苗。选取生长健壮的无菌幼苗下胚轴，切成长约0.4cm的小段，接种于棉花愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，28℃，16h光照下培养，每3-4周继代一次。选取松散的愈伤组织接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，诱导胚性愈伤组织的产生，28℃，16h光照下培养。

(2)转化农杆菌的培养：挑取含上述表达载体的农杆菌菌株，在含50mg/L卡那霉素和125mg/L链霉素的YEB固体培养基(0.5％蔗糖(W/V)，0.1％细菌用酵母提取物(W/V)，1％细菌用胰化蛋白胨(W/V)，0.05％MgSO₄.7H₂O(W/V)，1.5％的琼脂粉(W/V)pH7.0)上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于5mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1∶20的比例转接到50mL含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续在28℃、200r/min振荡培养3-5h。6,000r/min离心10min后，菌体用液体MSB(含100μmol/L乙酰丁香酮)培养基重悬，调整OD₆₀₀值为0.3-0.5备用。

(3)浸染和共培养：用无菌吸水纸吸去胚性愈伤组织表面的液体，放入调整好浓度的农杆菌菌液中，浸染20-30min。倾去菌液，将侵染过的胚性愈伤转移到共培养培养基上，于24℃黑暗条件下共培养4天。

(4)转化子的筛选：共培养完成后把胚性愈伤组织转移到筛选培养基上进行脱菌和选择培养，28℃，16h光照下培养，每3周继代一次。1-2个月后大部分愈伤组织褐化死亡，少部分表现出卡那霉素抗性，生长出新鲜的胚性愈伤组织。将愈伤组织块进行继代，每块组织增殖到2.0-3.0g时接入液体悬浮培养基中，在摇床上120r/min振荡悬浮培养以获得大量体胚。悬浮2周后用30目筛网过滤悬浮培养组织，网下沉淀物转接入体胚成熟培养基。萌发的成熟胚转入体胚伸长诱导培养基上，于28℃黑暗条件下培养2周以诱导体胚伸长、萌发。取较大的萌发胚(＞0.5cm)转接入SH培养基成苗，28℃，16h光照下培养。待幼苗长到约2cm高时，剪取幼苗嫁接到有3-4片真叶的棉花幼苗上。

3.获得纤维性状改良的棉花

嫁接的棉花培养在温室中常规管理。成熟后收集种子和纤维进行产量和品质性状分析。获得的转基因棉花在表型和生长发育上与野生型的对照没有明显区别。

【实施例四】用RT-PCR的方法检测导入的生长素合成酶基因iaaM在棉花中的表达

用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。取1μL一链产物为模板进行PCR扩增，25μL体系中包括1×PCR缓冲液，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCl₂，iaaM基因的上下游引物(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(Promega)。温度循环参数为94℃预变性5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，30循环；72℃延伸5min。用组蛋白Histone3基因作内标。组蛋白Histone3的引物为序列13和14(Zhu YQ等，2003，植物生理，133，580-88)。RT-PCR的结果见图4-6。

【实施例五】用real-time PCR方法检测导入的iaaM基因在棉花纤维中的表达

提取对照和转基因棉花开花后10天的胚珠和纤维的总RNA，通过逆转录合成cDNA一链。以此为模板进行quantitative real-time PCR扩增。具体操作步骤为：用DNA一链合成试剂盒(MBI公司)合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。PCR在quantitative real-time PCR仪上进行，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX buffer(Bio-Rad公司，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl₂)，上下游引物各0.2μmol/L和1μL一链产物。温度循环参数为94℃预变性3mins；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，0.5min，预设循环数为35。用棉花Histone3基因作内标，上、下游引物是SEQ ID NO.16和17。扩增iaaM基因的上、下游引物为SEQ ID NO.14和序列15。在运行quantitative real-time PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过琼脂糖电泳，检查并确保扩增产物是单带。结果如图7.

【实施例六】特异表达植物激素合成酶基因iaaM的棉花纤维数量性状的考察

1、扫描电镜的观察

参照常规电镜制样方法(《电子显微镜生物标本制备技术》，黄立，南京：江苏科学技术出版社，1982)，选取开花当天的胚珠经戊二醛，锇酸，单宁酸系列固定，乙醇系列梯度脱水，置换，干燥，离子镀膜后做扫描电镜表面观察。制备好的样品在HITACHI日立S-3000N SEM扫描电镜下观察胚珠表面的纤维起始情况。结果如图9所示，转基因棉花胚珠表面的纤维原始体较野生型来说，分布更为密集，数量更多。

2、早期纤维计数

选取开花后两天的棉铃，每个株系随机选择3个单株，每株取5铃，每铃取2个种子对胚珠表面的纤维进行计数。每个样品分别计数10次，计算平均数作为单株的早期纤维数量。具体方法如下：

取开花后2天的饱满胚珠两颗，置于1.5ml离心管中，加适量FAA固定液固定一小时以上。用去离子水漂洗两次，加200μL 5mol/L HCl，室温解离一小时以上。弃HCl，用去离子水漂洗两次，加100μL Schiff试剂处理一小时以上。弃Schiff试剂，用去离子水漂洗两次，加100μL 45％乙酸并用玻璃棒研磨，使纤维从胚珠表面脱落分散。将研磨好的纤维液用移液枪混匀，置血球计数板上在显微镜下观察、计数。结果见图13，转基因棉花的早期纤维数量明显增加。

3、早期胚珠的显微切片观察

选取开花不同时期的胚珠进行石蜡切片，以从组织水平观察iaaM基因在胚珠中特异表达对棉花纤维生长和发育的影响。采取开花后不同时期的子房(含胚珠)从植株上取下后立即切去顶端，分割成约0.5cm的小块或小段，采用常规的组织切片方法进行切片，切片在OLYMPUS BX41TF型显微镜上观察并照相。结果如图12所示，在转基因棉花0dpa的胚珠表面可以明显的观察到纤维原始体的突起；而对照的表面相对光滑，突起不明显，数量很少。在1dpa的胚珠表面，无论是对照还是转基因棉花都可以明显的观察到突起的纤维细胞，转基因棉花胚珠表面的纤维细胞数量明显多于对照。2dpa的胚珠表面观察结果也表明，纤维细胞都明显的增长，转基因棉花的纤维明显长于对照。

【实施例七】特异表达植物激素合成酶基因iaaM的棉花胚珠和纤维中IAA含量的考察

以[¹³C₆]IAA为内标，采用高压液相色谱-质谱联用分析法，

1.内标的配制：[¹³C₆]IAA内标溶解于适量体积的100％甲醇，配制终浓度为500ng/μL的母液。

2.激素提取和纯化：取棉花胚珠/纤维，液氮速冻，研磨成粉。准确称取样品粉末(差减法称取)约0.5g，加入7ml提取液(80％预冷甲醇)，和10ng13C6-IAA(溶解于100％甲醇，终浓度500ng/μL)内标。混匀后于玻璃管中密闭，避光-20℃浸提过夜。浸提样品转入离心管中，10,000g，4℃，离心20min。吸取上清至蒸馏瓶中，并加入一滴氨水，使溶液pH显碱性，40℃，于100mL蒸馏瓶中减压旋转蒸发浓缩至干。样品以5mL 0.1M HAC复溶。溶解后再次检测pH值，保持与复溶液(0.1M HAC)一致。过柱纯化：以5mL100％甲醇过柱，活化提取柱(Sep-Cartridges，Waters)；10mL 0.1M HAC分2次过柱，洗去甲醇，平衡提取柱；上样，缓慢过柱样品；4mL 17％甲醇(0.1MHAC稀释)缓慢过柱进行漂洗；6mL 40％甲醇(0.1M HAC稀释)洗脱样品，并收集滤过液。40℃，于50mL蒸馏瓶中减压旋转蒸发浓缩至干。1.5mL 80％甲醇复溶样品，转入1.5mL离心管中，真空干燥浓缩。干燥样品密闭、低温、避光保存。

3.激素的检测：使用的检测仪器为岛津公司(shimazu)高压液相色谱-质谱联用仪(LCMS-2010A)。将干燥的样品以10％甲醇复溶，通过微量上样器上样，10％甲醇，5min，85％甲醇，30min，100％甲醇，31min，100％甲醇，39min；10％甲醇，40min；10％甲醇，60min。

记录内标[¹³C₆]IAA的色谱峰保留时间、峰面积和质谱图。根据保留时间和质谱图鉴定各样品中IAA，并计算内标和内源IAA的色谱峰面积。重复三次，取峰面积的平均值。通过内标法计算样品中的IAA含量。结果见图8。

【实施例八】特异表达植物激素合成酶基因iaaM的棉花纤维衣分和品质的考察

1.转基因棉花和对照的衣分含量及纤维产量对比分析

转基因T₁代棉花植株种植于西南大学转基因基地，随机区组设计，每个株系设置3个小区，常规田间管理。分小区收获成熟的棉花，准确称取籽棉产量。于每小区收获的籽棉中，随即选取100粒种子，准确称取百粒籽棉的重量，手工脱纤维再分别称量纤维的总量和种子的总量，计算衣分的大小。最后取3个小区的平均值作为最终结果(表2)，从实验结果可见：非转基因对照的小区籽棉产量、衣分分别为3.37Kg和42.19％，而FBP7-iaaM转基因株系的衣分均在43％之上，最高达到49.67％显著大于对照，而E6-iaaM和AGL5-iaaM转基因植株的衣分均较低。FBP7-iaaM转基因株系的皮棉产量均大于对照，表明转入FBP7-iaaM基因后，可以提高棉花纤维产量。E6::iaaM和AGL5::iaaM转基因植株的皮棉产量低于对照，所有转基因株系的百粒重，和对照相比差异不明显。

表2转基因棉花与对照的纤维产量比较

对照：以子代中分离出的GUS染色阴性植株为对照

2.FBP7:iaaM转基因棉花的种子短绒减少

将棉花种子经脱绒机脱绒，在20℃相对湿度65％的环境条件下放置两天以上，称量经脱绒后的棉籽重量。再将种子用浓硫酸脱绒法脱绒，脱绒后的种子燥后在20℃相对湿度65％的环境条件下放置24hr以上再次称量，计算差值为短绒的重量。短绒的含量以百分数表示。结果如图14所示，经过对种子脱绒前后的重量比较，对照短绒重量占种子总重量的34％左右，转基因9^#、14^#为24％-27％，比对照明显减少。

3.转基因棉花纤维的品质检测

将各棉纤维样品送农业部棉花品质监督检测测试中心(安阳)，依据ASTMD5867-95《HVI900大容量纤维测试仪试验方法》，采用HFT9000在温度20℃相对湿度65％的环境条件下，对上半部平均长度、整齐度指标、断裂比强度、伸长率、马克隆值5指标进行测试。对照材料选用T1代分离的GUS阴性植株，这些植株中不含有转基因成分。结果见表3。

表3转基因棉花和对照的纤维品质比较

转基因棉花纤维的上半部平均长度与对照没有明显差异，转基因纤维的整齐度指数在85.70％-86.95％，t检测结果表明与对照差异不显著。与纤维强度相关的两个指标断裂比强度和断裂伸长率的结果都表明，转基因株系的纤维强度与对照相比没有明显差异。与纤维细度和成熟度相关的马克隆值指标检测的结果显示FBP7-iaaM转基因棉花的马克隆值比对照显著下降。根据国家棉花分级标准，按照马克隆值差异将棉花分为A、B、C三级，B为标准级。A级取值范围在3.7-4.2，品质最好；B级取值范围为3.5-3.6和4.3-4.9；C级取值范围为3.4及以下和5.0及以上，品质最差。转基因棉纤维的马克隆值在B1和B2级范围内，属于标准级。而对照和E6-iaaM以及AGL5-iaaM转基因棉纤维马克隆值明显偏高，属于C级，品质较差。对照纤维马克隆值偏离正常范围与进行田间试验的受试地区(重庆)栽培年份(2007年)的气候条件有关。高温少雨，日照时间长，日照强度大，昼夜温差小的气候条件影响了棉纤维的成熟度和细度。但是在相同栽培条件下，FBP7-iaaM转基因植株的纤维细度和成熟度指标马克隆值仍然显著优于对照，说明转基因植株纤维的品质得到了提高。而E6::iaaM和AGL5::iaaM转基因植株的马克隆值与非转基因的对照相比，无明显的差异。

总之，根据纤维品质测定的结果，FBP7:iaaM转基因棉花在纤维长度和强度上与对照没有明显的差异，而纤维细度比对照细，品质得到了提高。

上述实例表明，本发明改良棉花纤维性状的方法，能够实现在棉花的特定部位的特定发育阶段特异性地表达生长素合成相关基因，进而内源调控棉花特定组织器官中生长素的含量，达到改良棉花纤维产量和品质(细度和强度)的目的。试验结果证明，经本发明改良棉花纤维性状的方法所改良的棉花棉铃数量增加，种子数量增加，棉花纤维数量明显增多，衣分明显提高，纤维产量显著增加，同时棉花纤维强度不变，细度和成熟度得到了改良。本发明方法简便易行，效果显著，具有很好的市场前景。

SEQUENCE LISTING

<110>西南大学

<120>表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良的应用

<130>08P103384

<160>17

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

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<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

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<223>FBP7启动子引物1

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<212>DNA

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catggaccat tacttctaac attttctcaa atatcacaca cctaattctt ttaattaaat 240

tctatatgca tacatttaga ttgaaatttg aaattgattg gaattaagtg gtagaaaata 300

tcaaattaga aagaagaaaa aagaaagaaa gaagacagtt gggtttggat tgggtgggga 360

gagagcattg aaggaggacc atccaatttt tctttcatgt ttagaggaaa aaagagaggt 420

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attctcaata tatagtatat gctttgaaag ttgaatatgc actagttctt gttgtgttaa 1320

gagttaatta gcgtgaagta atataattct catatcgagt gtttaattta ctagctttat 1380

gacaaaataa tcataatcaa atagaatact aatgaagaaa aaggtaatat atatatgtaa 1440

gaaagatgaa ttatgtaaag attgctttta ctagccctgt gacaaaaaat gttaaatctt 1500

tatcaaattg aacgatgatt gataattgaa atttaatttt aatgaaaaga agtagtatat 1560

aaatgggtaa gaaagagaga tttccaaatt aaaggacagg tgatttttac tcaagtatca 1620

taatcaaatt gtgtatacgt ccaatctcat taattagtgc ataagttatt gatcactaac 1680

tcttgtgaaa aagaaaagaa tcttttgttt tgacgaaaac atattccaaa taccattcat 1740

agggatacta aacccaagac tttggatttc ccttcatcag aaattttcca acgtttactt 1800

tgagatattt ttttcttctt agaacatata ataaataggt tcatgaaaac gtaacaatgc 1860

gttggagatt ctttacctgg cttgttgcct taactcccac aaagattctt ttgcttgaag 1920

aaatttcaag cttttgtgta tatatccaac gtcacagtgc taaagacgtt tgagaaagtt 1980

tctgttgaaa gaagagtaaa aactcaaaaa gaaaatgggt ttcattattg cgattgcaaa 2040

acgttttgat gctctagttg ggtag 2065

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>iaaM基因引物1-KpnI

<400>10

ggtaccatgt caccttcacc tctcctt

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>iaaM基因引物2-EcoRI

<400>11

gaattctaat ttctagtgcg gtagtt

<210>12

<211>2279

<212>DNA

<213>土壤根癌农杆菌

<400>12

ggtaccatgt caccttcacc tctccttgat aaccagtgcg atcatctccc aaccaaaatg 60

gtggatctga caatggtcga taaggcggat gaattggacc gcagggtttc cgatgccttc 120

ttagaacgag aagcttctag gggaaggagg attactcaaa tctccaccga gtgcagcgct 180

gggttagctt gcaaaaggct ggccgatggt cgcttccccg agatctcagc tggtggaaag 240

gtagcagttc tctccgctta tatctatatt ggcaaagaaa ttctggggcg gatacttgaa 300

tcgaaacctt gggcgcgggc aacagtgagt ggtctcgttg ccatcgactt ggcaccattt 360

tgcatggatt tctccgaagc acaactaatc caagccctgt ttttgctgag cggtaaaaga 420

tgtgcaccga ttgatcttag tcatttcgtg gccatttcaa tctctaagac tgccggcttt 480

cgaaccctgc caatgccgct gtacgagaat ggcacgatga aatgcgttac cgggtttacc 540

ataacccttg aaggggccgt gccatttgac atggtagctt atggtcgaaa cctgatgctg 600

aagggttcgg caggttcctt tccaacaatc gacttgctct acgactacag accgtttttt 660

gaccaatgtt ccgatagtgg acggatcggc ttctttccgg aggatgttcc taagccgaaa 720

gtggcggtca ttggcgctgg catttccgga ctcgtggtgg caaacgaact gcttcatgct 780

ggggtagacg atgttacaat atatgaagca agtgatcgtg ttggaggcaa gctttggtca 840

catgctttca gggacgctcc tagtgtcgtg gccgaaatgg gggcgatgcg atttcctcct 900

gctgcattct gcttgttttt cttcctcgag cgttacggcc tgtcttcgat gaggccgttc 960

ccaaatcccg gcacagtcga cacttacttg gtctaccaag gcgtccaata catgtggaaa 1020

gccgggcagc tgccaccgaa gctgttccat cgcgtttaca acggttggcg tgcgttcttg 1080

aaggacggtt tctatgagcg agatattgtg ttggcttcgc ctgtcgctat tactcaggcc 1140

ttgaaatcag gagacattag gtgggctcat gactcctggc aaatttggct gaaccgtttc 1200

gggagggagt ccttctcttc agggatagag aggatctttc tgggcacaca tcctcctggt 1260

ggtgaaacat ggagttttcc tcatgattgg gacctattca agctaatggg aataggatct 1320

ggcgggtttg gtccagtttt tgaaagcggg tttattgaga tcctccgctt ggtcatcaac 1380

ggatatgaag aaaatcagcg gatgtgccct gaaggaatct cagaacttcc acgtcggatc 1440

gcatctgaag tggttaacgg tgtgtctgtg agccagcgca tatgccatgt tcaagtcagg 1500

gcgattcaga aggaaaagac aaaaataaag ataaggctta agagcgggat atctgaactt 1560

tatgataagg tggtggtcac atctggactc gcaaatatcc aactcaggca ttgcctgaca 1620

tgcgatacca atatttttca ggcaccagtg aaccaagcgg ttgataacag ccatatgaca 1680

ggatcgtcaa aactcttcct gatgactgaa cgaaaattct ggttagacca tatcctcccg 1740

tcttgtgtcc tcatggacgg gatcgcaaaa gcagtgtatt gcctggacta tgagccgcag 1800

gatccgaatg gtaaaggtct agtgctcatc agttatacat gggaggacga ctcccacaag 1860

ctgttggcgg tccccgacaa aaaagagcga ttatgtctgc tgcgggacgc aatttcgaga 1920

tctttcccgg cgtttgccca gcacctattt cctgccggcg ctgattacga ccaaaatgtt 1980

attcaacatg attggcttac agacgagaat gccgggggag ctttcaaact caaccggcgt 2040

ggtgaggatt tttattctga agaacttttc tttcaagcac tggacacggc taatgatacc 2100

ggagtttact tggcgggttg cagttgttcc ttcacaggtg gatgggtgga gggtgctatt 2160

cagaccgcgt gtaacgccgt ctgtgcaatt atccacaatt gtggaggcat tttggcaaag 2220

ggcaatcctc tcgaacactc ttggaagaga tataactacc gcactagaaa ttagaattc 2279

<210>13

<211>2789

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2789)

<223>FBP7:iaaM基因序列

<400>13

cgaagcttca tcaaactaaa ttaatactct ggaatattag catgcgtgaa tgtcgtcgtt 60

tgtcaattga acttcactaa tagtgttaaa caatagatac agtgataaag aatagataca 120

gtgatacaaa atcaggtcat cctgctaatc acactacact aatagtgtaa ataattaaac 180

taaagattta aatagaagag ggggcatatt agtcaagttg aaagcaagta acacgctttg 240

caatttttgg tgaaattctg gtctgcagta aagcagcgta caaggccacg tctggtttat 300

atctggaaaa aggccatttc aatgtcattt tcttggccag ctctttcttt cctttaattt 360

taagtgatag ttaaagctag ggtaggtatt tataaggaaa gaaagacatt ttaagtattg 420

agtttttcct cattcattag tgttgtaatt ccaagactac aaagtctttg gaagtacgtg 480

tgaggtttct gaaaggcttt gaagtcgacg ggtaccatgt caccttcacc tctccttgat 540

aaccagtgcg atcatctccc aaccaaaatg gtggatctga caatggtcga taaggcggat 600

gaattggacc gcagggtttc cgatgccttc ttagaacgag aagcttctag gggaaggagg 660

attactcaaa tctccaccga gtgcagcgct gggttagctt gcaaaaggct ggccgatggt 720

cgcttccccg agatctcagc tggtggaaag gtagcagttc tctccgctta tatctatatt 780

ggcaaagaaa ttctggggcg gatacttgaa tcgaaacctt gggcgcgggc aacagtgagt 840

ggtctcgttg ccatcgactt ggcaccattt tgcatggatt tctccgaagc acaactaatc 900

caagccctgt ttttgctgag cggtaaaaga tgtgcaccga ttgatcttag tcatttcgtg 960

gccatttcaa tctctaagac tgccggcttt cgaaccctgc caatgccgct gtacgagaat 1020

ggcacgatga aatgcgttac cgggtttacc ataacccttg aaggggccgt gccatttgac 1080

atggtagctt atggtcgaaa cctgatgctg aagggttcgg caggttcctt tccaacaatc 1140

gacttgctct acgactacag accgtttttt gaccaatgtt ccgatagtgg acggatcggc 1200

ttctttccgg aggatgttcc taagccgaaa gtggcggtca ttggcgctgg catttccgga 1260

ctcgtggtgg caaacgaact gcttcatgct ggggtagacg atgttacaat atatgaagca 1320

agtgatcgtg ttggaggcaa gctttggtca catgctttca gggacgctcc tagtgtcgtg 1380

gccgaaatgg gggcgatgcg atttcctcct gctgcattct gcttgttttt cttcctcgag 1440

cgttacggcc tgtcttcgat gaggccgttc ccaaatcccg gcacagtcga cacttacttg 1500

gtctaccaag gcgtccaata catgtggaaa gccgggcagc tgccaccgaa gctgttccat 1560

cgcgtttaca acggttggcg tgcgttcttg aaggacggtt tctatgagcg agatattgtg 1620

ttggcttcgc ctgtcgctat tactcaggcc ttgaaatcag gagacattag gtgggctcat 1680

gactcctggc aaatttggct gaaccgtttc gggagggagt ccttctcttc agggatagag 1740

aggatctttc tgggcacaca tcctcctggt ggtgaaacat ggagttttcc tcatgattgg 1800

gacctattca agctaatggg aataggatct ggcgggtttg gtccagtttt tgaaagcggg 1860

tttattgaga tcctccgctt ggtcatcaac ggatatgaag aaaatcagcg gatgtgccct 1920

gaaggaatct cagaacttcc acgtcggatc gcatctgaag tggttaacgg tgtgtctgtg 1980

agccagcgca tatgccatgt tcaagtcagg gcgattcaga aggaaaagac aaaaataaag 2040

ataaggctta agagcgggat atctgaactt tatgataagg tggtggtcac atctggactc 2100

gcaaatatcc aactcaggca ttgcctgaca tgcgatacca atatttttca ggcaccagtg 2160

aaccaagcgg ttgataacag ccatatgaca ggatcgtcaa aactcttcct gatgactgaa 2220

cgaaaattct ggttagacca tatcctcccg tcttgtgtcc tcatggacgg gatcgcaaaa 2280

gcagtgtatt gcctggacta tgagccgcag gatccgaatg gtaaaggtct agtgctcatc 2340

agttatacat gggaggacga ctcccacaag ctgttggcgg tccccgacaa aaaagagcga 2400

ttatgtctgc tgcgggacgc aatttcgaga tctttcccgg cgtttgccca gcacctattt 2460

cctgccggcg ctgattacga ccaaaatgtt attcaacatg attggcttac agacgagaat 2520

gccgggggag ctttcaaact caaccggcgt ggtgaggatt tttattctga agaacttttc 2580

tttcaagcac tggacacggc taatgatacc ggagtttact tggcgggttg cagttgttcc 2640

ttcacaggtg gatgggtgga gggtgctatt cagaccgcgt gtaacgccgt ctgtgcaatt 2700

atccacaatt gtggaggcat tttggcaaag ggcaatcctc tcgaacactc ttggaagaga 2760

tataactacc gcactagaaa ttagaattc 2789

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213> Artificial

<400> 14

gaaaatggcc tccgatcaga c 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 15

cataaggggc ttggaggaag t 21

<21O> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 16

gaagcctcat cgataccgtc 20

<21O> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 17

ctaccactac catcatggc 19

Claims

1.一种表达生长素合成相关基因的植物表达载体，其特征在于：

所述植物表达载体含有由植物生长素合成酶基因iaaM和植物种皮特异启动子FBP7基因启动子组成的表达生长素合成相关基因的核苷酸，且所述FBP7基因启动子位于植物生长素合成酶基因iaaM的5’上游，所述核苷酸的序列如SEQ ID No.13所示；

所述植物表达载体用于改良棉花纤维性状，所述棉花纤维性状改良指，与不含所述植物表达载体的非转基因棉花相比，含有所述植物表达载体的转基因棉花的棉花衣分提高、棉花种子短绒减少并且棉花纤维细度更细。

2.权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体具有如图2所示的结构。

3.一种转化体，以权利要求1所述的植物表达载体转化农杆菌LBA4404获得。

4.权利要求1～2任一所述的植物表达载体在棉花纤维性状改良的应用。

5.一种含有权利要求1所述的植物表达载体的转基因植物的制备方法，包含下述步骤：

1)将植物生长素合成酶基因与植物种皮特异启动子可操作地连接；

2)构建权利要求1所述的植物表达载体；

3)用所述植物表达载体转化农杆菌LBA4404，获得转化体；

4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。