CN1230534C - 具有两种杀虫机理的融合杀虫蛋白质基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个融合杀虫蛋白质基因，该基因包含编码苏云金芽孢杆菌Cry IA活性结构域和编码链霉菌CHOAL活性结构域的DNA序列；提供了该融合杀虫蛋白质基因的重组表达载体，这种表达载体具有在普通植物中高效表达融合杀虫蛋白质的特性。所说表达载体转化植物后，可产生对害虫，尤其是鳞翅目和鞘翅目害虫有高杀虫性的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明特别提供了既抗棉铃虫又抗棉铃象甲的转基因棉花。

Description

具有两种杀虫机理的融合杀虫蛋白质基因及其应用

技术领域    本发明涉及一个编码融合蛋白质的DNA序列，即编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质和编码胆固醇氧化酶蛋白质以及将其进行连接的编码昆虫肠激酶切割序列的DNA序列，包含所说的DNA序列的植物表达载体，被所说的载体转化的植物细胞，以及由所说的细胞产生的对昆虫(特别是鳞翅目和鞘翅目昆虫)表现有高抗性且昆虫难以对之产生耐受性的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。

背景技术    利用生物技术手段可以获得对特定害虫有杀虫作用的转基因植物。其中，较为熟知的例子是应用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigiensis，以下简称Bt.)的伴胞杀虫晶体蛋白基因。Bt.可产生对多种昆虫有杀虫作用的伴胞晶体蛋白质，这些蛋白质可以在低浓度情况下各自特异地杀死包括鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等一些作物害虫(Klausner，Bio/Technology 2：408-419)。这种生物杀虫剂对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且不会污染环境。

基于Bt.杀虫蛋白质的性质，多年前就已经生产了有关在商业上出售的含有Bt.产生的孢子及结晶蛋白质的商品杀虫制剂(商品名为DIPEL和THURICIDE)。这种商品杀虫剂可有效地对抗五十种以上的鳞翅目害虫(Wilcox，et al.，Protein Engineering，Inouye and Sarmg.(Eds.)AcademicPress，NY，1968)。然而，使用Bt.杀虫制剂的一个重要限制是由于所说的杀虫蛋白质或δ-内毒素容易在环境中被降解，使生产上需要重复施用这种杀虫制剂，大大增加了成本，从而为农业生产上的实际应用带来困难。

为解决这个问题，科学家们经过了一系列关于可以表达Bt杀虫蛋白质的抗虫转基因植物的研究(Umbeck等人，Bio/Technology，5：262-266，1987；Vaeck等人，Nature 328：33-37，1987；schhoff等人，Bio/Technology 5：807-813，1987；Barton等人，PCT 89004868；郭三堆等人，CN95119563.8)。最后，Perlak等(Bio/Technology 8：939-942，1990)和郭三堆等(CN 95119563.8，1995)利用Bt.杀虫蛋白基因，按照植物优化密码子，采用人工合成的方法，获得了可以在植物中高效表达的Bt.杀虫蛋白质基因。并进一步构建了高效植物表达载体，转入棉花、玉米、水稻等作物，获得了抗虫性稳定、抗虫率达80％以上的抗虫转基因作物。

另一类可用于抗虫转基因植物研究的生物分子是胆固醇氧化酶(Cholesterol Oxidese，以下简称CHO)。CHO催化胆固醇降解为4-胆甾烯-3-酮，这是胆固醇降解反应的第一步。对CHO最敏感的昆虫是鞘翅目的棉铃象甲(Anthonomus grandis)。对于棉铃象甲的1龄幼虫，纯酶的半致死剂量是6.0μg/g(饲喂6天)、2.7μg/g(饲喂12天)或1.5μg/g(饲喂16天)(Greenplate等，Entomol.Expt.Applic 74：253-258，1995)。对于2龄幼虫，饲喂6天没有明显的杀虫效果，但12天和16天的半致死剂量与1龄幼虫的相当。饲喂棉铃象甲成虫，没有出现明显的致死效应，但经过饲喂的雌性成虫的产卵率降低83％，并且，所产虫卵的生活力也大大降低(幼虫存活率比对照降低97％)。体视显微镜检测产卵5天前的雌性成虫，发现饲喂胆固醇氧化酶的雌性成虫的卵巢明显小于对照。另外，它对鳞翅目的几种害虫也有杀虫作用。

作为生物杀虫剂，单一Bt.杀虫蛋白质的杀虫谱较窄，例如：Bt.杀虫蛋白质CryIA主要针对鳞翅目昆虫，这样，靶昆虫就较易对之产生抗性(McGaughey W.H，Science.229：193-195，1985)。而CHO主要针对鞘翅目昆虫，同时也可作用于鳞翅目的一些昆虫，其杀虫谱与Bt.CryIA存在一定的互补，而且杀虫机理不同。为获得昆虫较难以对之产生抗性的，对鳞翅目昆虫和鞘翅目昆虫均具有较强杀虫能力的转基因植物，可以通过在植物中表达这两种杀虫蛋白质或表达一种具有这两种蛋白活性的融合杀虫蛋白质来实现。

在植物中表达CryIA和CHO两种蛋白质的途径大体有如下三种：(1)杂交转育法。这种方法是将cryIA和cho基因构建在不同的表达载体上，分别转入不同的植株，通过杂交的方式将两个基因累加到一个植物体中。这种方法需要在杂交后代中筛选同时具有两个基因，并且都能稳定表达的个体，因此费时费力，是最早使用的一种方法。(2)二次转化法。将cryIA和cho基因构建在不同的表达载体上，通过二次转化导入同一植物体中。对大多数作物来说，由于转化技术本身具有一定的难度，二次转化更增加了它的技术难度，因为进行第二次转化时可能需要将第一次转化的抗生素抗性基因去除等，所以这种方法的应用范围也很有限。(3)双价载体法。将cryIA和cho基因构建在同一载体上，各自使用单独的调控序列，一次性导入受体植物中。该方法比前面两种方法节省了大量的人力物力，经一次转化就可获得具两个外源目的基因的转基因植株。但是，使用这种方法可能会出现下面两种情况：(1)因为各抗虫基因分别受各自的调控序列控制，这样就可能会造成基因间的不同步表达，所以在筛选时需要选择各基因同步表达的植株。(2)由于目前分离的高效启动子数量有限，两个抗虫基因可能使用相同的启动子，这就极有可能引起同源依赖的基因沉默(Finnegan，1990；Vauchcret，1990)。为了避免上述情况发生，本发明尝试了将CryIA和CHO两种蛋白质活性结构域编码序列用一段寡核苷酸连接起来，构建出一个自然界本不存在的融合基因，并将其转化植物，使转基因植物表达出一种具有CryIA和CHO两种蛋白质活性的融合蛋白质，这将在提高转基因植物抗虫能力、拓宽其杀虫谱的同时，使昆虫对转基因植物产生耐受性的可能性降低。

发明内容    本发明提供了一种将CryIA和CHO两种蛋白质活性结构域编码序列进行融合，使之适合于在普通植物中表达的一种方案。根据这个方案，在本发明的一个实施方案的一个方面中，我们构建出针对鳞翅目害虫和鞘翅目害虫都有毒性作用的一个融合杀虫蛋白质基因，具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该核苷酸序列所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。此外，根据本发明的将两种杀虫蛋白活性结构域进行融合的方案，也可以利用SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，将其它类型的杀虫蛋白基因进行融合。但本领域的技术人员可以理解到，为本发明的目的，其它杀虫蛋白活性结构域编码序列可用SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列或其功能等同物进行有效连接。

根据本发明的一个优选实施办法，所提供的融合杀虫蛋白质基因由三个部分组成：针对鳞翅目害虫有毒性作用的编码Bt.杀虫蛋白活性结构域的DNA序列；针对鞘翅目害虫有毒性作用的编码胆固醇氧化酶活性结构域的DNA序列；连接上述两段DNA序列的编码昆虫肠激酶(Enterokinase，EK)切割序列的寡核苷酸序列。

本发明提供的Bt.杀虫蛋白基因是编码Bt.kurstaki HD-1和HD-73杀虫蛋白质活性结构域的DNA序列，该序列中所有编码Bt.杀虫蛋白质的氨基酸密码子都是适于植物细胞表达的优化密码子及其组合。

在本发明一个特别优选实施方案中，根据本发明的一个更为具体的优选实施方案，本发明的被修饰的合成的Bt.杀虫蛋白质基因序列中，以XXC和XXG(其中X各自代表A、G、C、T)为代表的密码子的联合使用率大于53.5％，并且其G+C含量在48.1％以上。

根据本发明的一个实施方案，所采用的Bt.杀虫蛋白质基因是中国专利95119563.8中所描述的，采用植物优化密码子人工合成而获得的。根据本发明的一个实施方案，该基因具有SEQ ID NO：2中所示的核苷酸64-1824或1-1824号核苷酸。

本发明的编码Bt.杀虫蛋白质的DNA序列基本是基于上述密码子优化原则和提供相应酶切位点的需要，按照已知的DNA序列合成方法，使用适当的DNA合成装置合成的，但本领域技术人员可以理解到，为本发明的DNA，也可以基于天然苏云金芽抱杆菌杀虫蛋白质基因的野生序列，以核苷酸定点诱变技术PCR酶促合成等技术制得本发明中所涉及的编码Bt.杀虫蛋白质的DNA序列或其功能等同序列。

本发明提供的胆固醇氧化酶基因是来源于变青链霉菌TK54的胆固醇氧化酶基因choAL。

业已知道，胆固醇氧化酶在变青链霉菌中为分泌酶，其5’端有129个碱基对编码长度为43个氨基酸残基的前导肽，该序列在胆固醇氧化酶分泌到变青链霉菌细胞外的时侯被切割。因此，根据本发明的一个优选实施办法，本发明所提供的融合基因choAL片段部分不含有编码该前导肽的DNA序列。

根据本发明的一个优选实施办法，本发明所提供的choAL基因是通过PCR方法从变青链霉菌TK54中获得的。与已知的choA基因存在36个核苷酸序列差异，其编码的CHOAL蛋白质与CHOA存在16个氨基酸残基的差异。

根据本发明的一个优选实施办法，本发明所提供的choAL基因的5’及3’端带有合适的限制性酶切位点。其中，基因5’端带有NcoI位点，3’端带有XhoI位点。

根据本发明的一个实施方案，所采用choAL基因具有SEQ ID NO：1中所示的核苷酸1843-3486或1972-3486号核苷酸。

本发明所提供的寡核苷酸序列编码昆虫肠激酶切割序列。采用植物优化密码子，我们合成了两段核苷酸片段SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，通过酶促反应合成了由33bp组成的寡核苷酸连接序列，附图1所示。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及为在受体植物中有效地表达上述融合杀虫蛋白质所需之调节及控制元件。

为了使外源杀虫基因产物在植物细胞中在转录和翻译水平上获得有效表达，在包含编码区的外源DNA序列侧翼必须连接有适当的表达调节和控制元件。这些控制元件包括启动子、增强子、终止子，转录产物的末翻译部分和多聚腺苷酸化序列、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。常用的植物细胞转录启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的355启动子和根癌农杆菌T-DNA的胭脂氨酸合酶启动子。这些启动子在大多数植物细胞中都是有效的，但其插入位点和插入的拷贝数目不同，将对其下游的蛋白质编码序列的转录和翻译活性产生很大影响。

因而，本发明涉及翻译增强序列、在任何读码情况下均能正确终止的多联终止子序列、对转录过程得到的mRNA进行正确切割的加工序列，以及促使加入多聚腺苷酸化序列的多聚腺苷酸化信号序列。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的融合杀虫基因植物表达载体中，所说的5’端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个外源基因在植物细胞内翻译过程中起促进作用的短核苷酸序列组成。

在本发明的融合基因表达载体中，除了上述本发明的融合杀虫蛋白质的DNA编码序列外，其他位于所说编码序列两侧翼(即5’和3’端边界区域)的用于调节和控制该编码序列在植物细胞中转录和翻译的序列都是本领域已知的和容易得到的。例如，本发明使用的所说的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列是Ω序列。根据已知的Ω序列核苷酸顺序，我们合成了两段核苷酸片段SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，通过酶促反应合成了由68bp组成的Ω序列。该序列富集TTAAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards et al，Eur.J.Biochem.84：513-519，1987)。其中本发明使用的促进外源基因在植物细胞内翻译过程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozaket al.，Nucleic Acids Research 12：857-872，1984；Cell，44：283-292，1986)。我们所合成的Ω序列和Kozak序列如SEQ ID NO：11所示。

适于与本发明融合杀虫蛋白质基因连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性启动子。例如，它们包括但不只限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子，mannopine合成酶(MAS)启动子，胭脂氨酸合成酶和章鱼碱合成酶启动子，玉米乙醇脱氢酶启动子，以及二磷酸核酮糖羧化酶，氧化酶小亚基启动子等。其中，本发明优选的是带有加倍增强子元件的CaMV 35s启动子。该启动子全序列如SEQ ID NO：12所示。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明的融合杀虫基因植物表达载体中，所说的3’端非编码区包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。这些调节和控制序列可以是质粒载体中天然固有的，或在dNTP及适当的DNA合成酶和DNA连接酶的存在与作用下，利用各种已知的技术加入的。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码序列之5’和3’端侧翼序列是以化学方法合成的。

然而，在本发明的一个优选的实施方案中，上述这些3’端调控序列，基本上都是根据我们的预先设计而人为合成的。本领域技术人员可以理解到，建立在大量理论研究工作基础上的本发明的这一实施方案，必将更有利于提高我们所制备的融合杀虫基因在植物细胞中的表达效率及其稳定性和准确性。

例如，在本发明的一个特别优选的实施方案中，我们设计并合成了直接连接于杀虫融合基因3’端的多联终止子序列(SEQ ID NO：13)，在该核苷酸的短序列中，包括有三个分别位于不同读码框中的终止密码子。从而即使在对其左翼的结构基因序列的翻译过程出现错读，也将得以正确终止。再如，本方面所设计的3’端正确切割和加工序列进一步保证了蛋白质翻译的正确终止(SEQ ID NO：14)。

另外，适用于本发明的融合杀虫基因高效植物表达载体还可以包括衍生于花椰菜花叶病毒，Nopaline(Nos)基因及其类似物的终止子。在本发明的一个实施方案中，我们使用了Nos基因的终止子。

为了提高本发明的融合杀虫基因在单子叶禾本科植物中的表达效率，可在结构基因与启动子序列之间加入适当大小的内含子序列，例如，玉米醇脱氢酶基因的第一内含子(Gene andDevelopment 1：1183-1200，1987)、衍生于蓖麻油植物的过氧化氢酶基因的第一内含子(Tanaka et al.，Nucleic Acids Research 18：6767-6770，1990)等。

可使用本领域中已知的方法将本发明的适于在植物细胞中表达融合杀虫蛋白质的基因构建体连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Gene 103：1985)，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆酶切位点的一系列统称为pGEM的质粒载体(由Promega公司生产)。尤其是植物表达载体pBI101，pBI121以及PBI131系统(Jefferson，et al.，EMBO J.16：3901，1987)，等等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述本发明融合杀虫基因构建体的载体是pUC19、PBI121.1等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体。

当然，如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组的表达载体还进一步含有可选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有调节序列，以促使其在植物中的表达。适用的选择标记基因是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPT II)基因，包含于上述重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。

因此，根据本发明的另一个方面，本发明进一步提供适于在植物细胞中表达融合杀虫蛋白质及的植物表达载体，其中包含：

1).融合杀虫蛋白质基因表达盒；

a).5’端非编码区；

b).编码融合杀虫蛋白质的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

c).3’端非编码区。

2).来源于pBI 121.1的载体部分：

a).新霉素磷酸转移酶基因(NptII)表达盒；

b).起始复制子及与植物转化相关的左右边界序列等功能结构。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的5’端非编码区和3’端非编码区分别具有如前所述的构成元件及其功能。

根据本发明，所说的编码区域具有如SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列或其功能等同序列或突变体。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的部分编码基因序列及编码基因5’和3’端侧翼序列是以化学方法合成的。

根据布达佩斯条约的规定；申请人已于2002年8月26日将转化到大肠杆菌DH 5a宿主细胞中的本发明构建的融合杀虫基因植物表达载体(pGBI1214ABfcho)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0791。

通过本发明所提示的融合杀虫蛋白质的构建方案，所得到的符合SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其功能等同序列，都可以通过DNA重组技术链接到上面所描述的表达载体中，并使之转入并整合到植物基因组中。而且融合杀虫基因在目标植物中的表达可赋予该植物对害虫，尤其是针对鳞翅目和鞘翅目害虫的杀虫性。

应该指出，上面所描述的表达载体是本发明的一个优选实施例，并未限制本发明。凡是应用本发明所描述的杀虫融合基因所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。尤其是该融合杀虫基因还可以通过与其它任何杀虫基因重组或协同，以获得杀虫能力更强、杀虫范围更宽或这两方面都得到加强的转基因植物。包括如下的实现方式：

1.与其它一种或几种杀虫基因重组，构建多种杀虫基因的表达载体并转入植物；

2.与其它一种或几种杀虫基因以相同或不同的方式融合，构建表达载体并转入植物；

3.与其它一种或几种杀虫基因相协同，分别构建植物表达载体，同时或分步到如同一种植物受体。

用相类似的方法，本发明构建的融合杀虫基因还可以与其它目的基因进行重组或协同，以达到具有除杀虫性以外的其它优良性状的转基因植物，如抗病、抗逆基因等。也包括利用选择标记基因而获得利于筛选转基因植株的转基因植物等，例如抗除草剂基因。

为了在植物细胞中特别是整株植物中表达融合杀虫蛋白质，以赋予整株植物及其种子和后代以杀虫能力，必须使用适当的方法将按上述方法制备的携带本发明的双价杀虫蛋白质的编码序列的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。

将携带外源基因的重组载体导人宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于1)使用农杆菌(Agrobacterium)作为植物病原体所介导的农杆菌转化法(Agrobacterium Mediated transformation)、2)物理法，如基因枪法(Particle Bombardment & particle gun & Gene gun)、电击融合法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretictransfection)等。3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等。4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等。5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。

一种特别令人感兴趣的在整体植株中导入外源基因的方法是本发明人使用的所谓种质系统转化法中改进的子房注射植物受精胚囊法(参见CN 95119563.8，1995；Zhou et al，Enzymol.Method.101：433-451，1983)。

根据本发明的一个优选实施方案，我们优选棉花作为融合杀虫基因转化的受体植物。棉花作为一种经济作物，我们无需考虑其作为食品的安全性问题；其次，在世界范围内被广泛种植的棉花每年因虫害造成的经济损失是十分巨大的；另外，目前已应用的单价抗虫棉面临着将来害虫对之产生耐受性的潜在危险和由于杀虫谱窄而导致棉田次要害虫上升为主要害虫。

因而，本发明涉及的融合杀虫基因，包含所说融合杀虫基因的植物表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞、组织和整株植物的方法，以及由此产生的对植物害虫具有控制和毒杀能力的转基因植物，特别是对鳞翅目昆虫例如棉铃虫和鞘翅目昆虫例如棉铃象甲等具有显著毒杀作用的转基因棉花。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了产生对鳞翅目和鞘翅目害虫均有毒性且害虫对这种毒性较难以产生耐受性的植物的方法，该方法包括：

1).构建所说的融合杀虫基因植物表达载体；

2).用任何～种可行方法将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对多种害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括任何部分的植物组织和种子。

这里应特别指出的是，虽然在本发明下述实施例中以转基因棉花的产生举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明制备的融合杀虫基因的DNA序列及携带该DNA序列的重组表达载体只用于转化和生产具有抗虫能力的转基因棉花。

因此，使用具有本发明所描述的特征的融合杀虫基因表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的导入了外源融合杀虫基因的，具有杀伤或控制植物敏感害虫之能力的植物，其后代及其种子和植物部分，均包括在本发明之内。

附图说明    本发明给出了两张附图。

附图1说明了融合杀虫基因植物表达盒的构建过程。首先化学合成编码肠激酶酶切位点的寡核苷酸序列，并让其两端分别带不同酶切位点粘性末端；然后将其插入choAL基因的5’端，其中NcoI识别位点中包含的ATG序列即为原choAL基因的起始密码；最后使用XhoI单酶切，纯化回收fcho片段，将其克隆至经XhoI单酶切的pG4AB载体上，酶切鉴定后获得插入方向正确的重组质粒pG4Abfcho。原Bt.杀虫蛋白基因3’端的XhoI识别位点，正好编码两个氨基酸残基，因而新构建的融合杀虫基因位于正确的阅读框架中。

附图2是以pBI121.1为载体的融合杀虫基因植物表达载体质粒图谱。该图说明植物表达载体包含了融合杀虫基因的表达盒，同时还包含有选择标记基因nptII的表达盒。这两个表达盒以同向串联的方式连接在一起。

具体实施方式    给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

             实施例一：编码胆固醇氧化酶活性结构域DNA序列choAL的获得

                  及其与编码肠激酶切割序列的寡核苷酸片段的连接

1.1编码胆固醇氧化酶活性结构域DNA序列choAL的获得

以变青链霉菌(Streptomyces sp.)TK54的基因组DNA为模板，用所设计的合成引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)进行PCR扩增，结果得到约1.65kb大小的DNA片段，纯化后的PCR产物与pUCm-Tvector连接后，转化Ecoli.DH5α感受态细胞，通过α-互补现象的观察，得到重组子命名为pUCm-cho。经NcoI、XhoI双酶切鉴定，证实了1.65kb PCR产物的插入。对其进行序列分析，获得的序列如SEQ ID NO.1中所示的核苷酸1842-3486。该序列与来源于链霉菌SA-COO菌株的胆固醇氧化酶基因choA(Tomoyuki等，J.Bacteriology，171(1)：596-601，1989)相似性比较高，判断其与后者同属同一基因家族，将其命名为choAL。

1.2编码肠激酶切割序列的寡核苷酸片段与choAL的连接

化学合成所设计的单链寡核苷酸片段(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7)，将获得的两个片段等摩尔进行退火处理，退火后的双链寡核苷酸片段及其末端酶切位点如附图1所示。将该双链寡核苷酸片段与经NcoI和EcoRI双酶切后的pUCm-cho质粒进行连接，得到重组质粒pUCm-fcho。

                      实施例二：融合杀虫基因植物表达载体的构建

2.1带有融合杀虫基因表达盒的构建

本实施例所构建的融合杀虫基因表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及kozak序列，3’端的多联终止序列、切割序列、正确加工序列以及NOS终止子。这些表达调控元件除355启动子和增强子之外都是通过化学方法人工合成的(详见中国专利CN 951 19563.8，1995)。在本实验室所保存的带有人工合成的Bt.杀虫蛋白基因表达盒的质粒pG4AB中包括有这些元件。

利用质粒pG4AB，经XhoI酶切后，纯化回收片段作为载体，将pUCm-fcho中的fcho片段用XhoI酶切后连接到所回收的载体上去，得到正反两个方向插入的重组质粒pG4ABfcho和pG4ABchof。采用不同限制性内切酶经多组酶切鉴定，获得正向插入的重组质粒pG4ABfcho，在该质粒中带有融合杀虫基因表达盒。载体中原有Bt.杀虫蛋白基因的读码框与fcho片段中choAL基因中的起始密码子ATG没有发生移码突变，如附图1所示。

2.2融合杀虫基因植物表达载体的构建

用HindIII和EcoRI双酶切切下pG4ABfcho中的4.7kb融合杀虫基因，克隆到经HindIII和EcoRI双酶切后回收的pBI121.1大片段上，获得重组质粒pGBI1214ABfcho。这就是所构建的融合杀虫基因的植物表达载体。其质粒图谱如附图2所示。

         实施例三：融合杀虫基因植物表达载体向模式植物烟草中的导入及鉴定

3.1农杆菌感受态细胞的制备

挑取LBA4404单菌落接种于5ml YEB液体培养基(含链霉素100μg/ml)中，28℃，250rpm培养过夜。吸取2ml培养物转入50ml YEB液体培养基中，继续培养至OD值约为0.6。将菌液转至无菌离心管中，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用1.7ml 20mmol/L无菌CaC12重悬菌体，加入300μl无菌甘油，混匀后，按每管200μl分装于无菌1.5ml微量离心管中。

3.2重组质粒转入LBA4404细胞

在200μl LBA4404感受态细胞中加入2μg重组质粒pGBI1214ABfcho DNA，冰浴5分钟，然后转至液氮中冷冻8分钟，迅速于37℃水浴中温育5分钟后，加入800μl YEB液体培养基，28℃、250rpm预表达培育4~5小时，然后涂铺含有卡那霉素、链霉素的YEB平板，28℃培育24~48小时，出现带有相应转化质粒的菌落。

3.3烟草的转化

(1)农杆菌的准备：28℃、200rpm过夜培养含重组质粒pGBI1214ABfcho 50ml，5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀，用MS液体培养基洗涤一次后，再用MSO液体培养基重悬至OD600＝0.2～0.5

(2)浸染：取烟草无菌苗的嫩叶片，用刀切成约0.5cm的小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10分钟，然后用无菌滤纸吸干；

(3)共培养：将叶块摆放在共培养培养基中(上面铺2层滤纸)于25℃避光共培养3天；

(4)选择培养：将叶片转移到选择培养基中，于25℃光照培养箱(光照12小时，黑暗12小时)中培养至抗性芽的出现；

(5)分化培养：将2～3cm长的抗性芽移到生根培养基中，一星期后逐渐长出根来；

(6)抗性小苗的获得：待小苗长到5～8cm高时，移栽到含有营养土的小塑料钵中。

3.4转基因烟草的分子生物学鉴定

3.4.1 PCR鉴定：

取1克烟草新鲜叶片，加等量AL203，于液氮中研成粉末，装入离心管中，加入2ml DNA提取缓冲液(100mM Tris.Cl pH8.0，500mM NaCl，50mM EDTA pH8.0，临用前加入10mM β-巯基乙醇)，剧烈振荡1分钟，加入0.4ml 10％SDS，轻轻混匀，于65℃温育10～20分钟，至颜色翠绿，加入0.4ml冰冷的5M KAc，轻轻混匀，冰上放置30分钟，然后于4℃12000rpm离心15分钟，上清转移到新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇后用RNase处理，纯化备用。

以转基因烟草的基因组DNA为模板，分别用所合成的choAL基因特异引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)和Bt杀虫蛋白基因特异引物(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17)进行如下PCR反应：

在一灭菌的0.2ml微量离心管中，加入

      10×PCR buffer         5.0μl

      dNTP(10mM each)        1.0μl(终浓度200μM)

      MgCl2(25mM)            4.0μl(终浓度2mM)

      引物1(10pmol/μl)      1.5μl(终浓度300nM)

      引物2(10pmol/μl)      1.5μl

      烟草基因组DNA模板      2.0μl(1~2μg)

      Taq酶(5U/μl)          0.5μl

       H2O                   至总体积50μl；

后进入PCR反应程序；

PCR反应程序：95℃ 5分钟

             94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，

             72℃ 7分钟；

电泳检测发现分别有与预期大小相符的DNA扩增片段。

3.4.2 Southern Blot分析

(1)转膜：取适量烟草基因组DNA(约30μg)，用适量的限制性内切酶HindIII+EcoRI消化完全(约5U/μg植物DNA，酶切12～16小时)，取少量电泳确证酶切完全，酚、氯仿抽提后纯化后，0.8％琼脂糖凝胶电泳过夜，约1.5V/cm。待电泳完成后将胶转入0.25N HCl中脱嘌呤15~30分钟，至溴酚蓝完全变为黄色。蒸馏水冲洗后将胶转入0.4N NaOH中漂洗20分钟，至溴酚蓝完全恢复为蓝色，与此同时，将HybondTM-N+尼龙膜在超纯水中浸润后转入0.4N NaOH中浸泡5分钟以上，以0.4N NaOH为转膜液，利用真空转膜仪用较小的负压转膜约1小时，完成后标记尼龙膜点样孔一角，然后在2×SSC(1.75％NaCl，0.88％柠檬酸钠，pH＝7.0)溶液中浸泡10分钟，滤纸吸干尼龙膜(紫外交联3分钟或夹在两张滤纸中于80℃烘烤2小时)，用保鲜膜包裹保存备用。

(2)预杂交：

配制预杂交液：

于50ml离心管中依次加入ddH2O、5×HBS(3mol/L NaCl，0.1mol/L PIPES，20mmol/L EDTApH6.8)和Denhardt’s III(2％ Fioll 400，2％ PVP 360，2％ gelatin，10％ SDS，5％ Na2P2O7·10H2O)，混匀后置于65℃水浴中，各溶液用量视膜的多少而定，具体情况如下：

                            1-2膜   3-6膜    7-10膜

ddH2O(ml)                   6       13       20

5×HBS(ml)                  2       4        6

Denhardt’s III(ml)         1       2        3

SSDNA(ml)                   0.3     0.6      0.9

(SS DNA(Salmon Sperm DNA，10mg/ml)需用超声波打断，并在使用前于100℃变性7分钟后迅速置于冰上，待50ml离心管中的预杂交液澄清后加入)

将杂交膜放入杂交管中，倒入杂交液，使杂交液浸润杂交膜，盖紧杂交管后置于杂交炉65℃杂交5～6小时(新膜)或2小时(旧膜)；

(3)探针标记：采用Promega公司的探针标记试剂盒，取适量待标记的DNA片段，95～100℃变性5分钟，迅速置于冰上，在微量离心管中依次加入：

             5×labling buffer         10μl

             dCTP、dGTP、dTTP混合液    2μl

             待标记的DNA片段           25ng

             Marker DNA                10ng

             BSA                       2μl

             α-32P-dATP               2.5μl

             Klenow酶                  1μl

             ddH2O                     至总体积50μl

室温反应5小时或37℃ 1~2小时进行标记；

(4)杂交：探针标记完成后，于100℃变性7分钟，迅速置于冰浴5分钟，加入杂交管中，于杂交炉65℃与预杂交后的杂交膜杂交12小时以上；

(5)洗脱：用65℃预热的2×SSC，0.5％ SDS的洗脱液于65℃洗膜15分钟，重复一次；然后用65℃预热的0.2×SSC，0.5％SDS的的洗脱液于65℃洗膜15分钟，重复一次；

(6)2×SSC洗膜15分钟后晾干，(紫外交联3分钟或夹在两张滤纸中于80℃烘烤2小时)，用保鲜膜包裹；

(7)放射自显影：于暗室将X-光片放于膜上，专用夹夹好后，置-70℃冰箱中曝光1～7天后洗片。

结果表明，绝大部分转基因烟草为Southern Blot阳性。

3.5转基因烟草胆固醇氧化酶活性检测

挑取Southern Blot阳性的转基因烟草植株和未转基因对照烟草植株，分别取1g左右新鲜叶片，液氮研磨后加Tris-Cl缓冲液，混匀后离心，取20μl上清液，加入100μl胆固醇氧化酶活性检测液(1.4mmol/L 4-氨基-安替吡啉，7mmol/L苯酚，0.5mol/L磷酸钠缓冲液PH7.0，1mmol/L胆固醇，1g/L辣根过氧化物酶)，观察反应液颜色的变化。

结果在所测试的26株转基因烟草中，有7.7％(2/26)的反应液颜色暗红，有38.5％(10/26)的反应液颜色深红，有53.8％(14/26)的反应液颜色浅红或很淡，接近对照烟草的颜色。说明部分转基因烟草表达出了具有较高胆固醇氧化酶活性的杀虫融合蛋白质。

3.6转基因烟草的抗虫性测试

取转基因烟草及对照非转基因烟草叶片，放入平皿中，叶柄基部用湿润棉球包好，保持叶片青鲜。每片叶接入6～10头棉铃虫幼虫，以胶布封好平皿，防止幼虫爬走，重复3次，4日后统计分析杀虫结果。

在未转基因烟草中，棉铃虫大量取食，发育正常，生长迅速；在部分转基因烟草中，棉铃虫少两取食后即出现拒食反应，发育受到抑制，最后死亡。

         实施例四：制备转化用融合杀虫基因植物表达载体pGBI1214ABfcho

1)将30ml含有pGBI1214ABfcho的细菌培养物培养到对数晚期(OD值约0.6)；

2)在500ml LB培养基中加入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇(300rpm)培养24～36小时；

3)4℃以5000转/分离心10分钟收获菌体，弃上清；

4)将细菌沉淀用100ml冰冷的STE溶液洗涤一次；

5)将洗过的细菌沉淀物重悬于20ml溶液I中；

6)加40ml新配制的溶液II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物，于室温放置5-10分钟；

7)加30ml用冰预冷的溶液III，封住瓶口，轻轻摇动离心瓶数次以混匀内容物，出现白色絮状沉淀，冰上放置30分钟，让DNA充分复性；

8)4℃以5000rpm离心20分钟，弃沉淀，上清用擦镜纸过滤；

9)加0.6×体积的异丙酵，充分混匀，于室温放置10分钟，并于室温以8000rpm离心15分钟，弃上清；

10)核酸沉淀于室温用70％乙醇洗涤一次，并于室温风干；

11)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀；

12)加入3ml用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，4℃下以10000rpm离心10分钟，弃沉淀；

13)上清加等量的异丙醇，混勾后于室温以10000rpm离心10分钟，弃上清；

14)核酸沉淀于室温用70％乙醇洗涤一次，在真空冷冻干燥器内干燥；

15)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，于室温放置30分钟；

16)加500μl含13％(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，于4℃以12000rpm离心5分钟，弃上清；

17)用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀，用酚、酚∶氯仿、氯仿各抽提1次；

18)加100μl 10mol/L乙酸铵充分混匀，加2×体积(约1ml)无水乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12000rpm离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA；

19)吸去上请，加200μl处于4℃的70％乙醇，稍加振荡，用微量离心机于4℃以12000rpm离心2分钟；

20)吸去上清，在真空冷冻干燥器内干燥质粒DNA；

用500μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀，用紫外分光光度计测定其浓度，并将DNA贮存于-20℃备用。

                        实施例五  植物受精胚囊注射法转化棉花

编码融合杀虫蛋白质的基因在植物中的高效表达对于产生转基因植物是最为关键的，但是外源基因转化植物是否能获得成功，也是致关重要的环节。在本发明之前，本领域科技人员熟知的利用农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法等方法转化植物虽然有许多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不仅受到实验室条件和昂贵的仪器及费用极高等的限制，更重要的是上述方法都有一个不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生产上发挥着重要作用的优良植物品种，由于基因型的不同，不能通过愈伤途径再生成植株；或再生植株极为困难。在这样时情况下，本实验室通过植物受精胶囊注射转化的技术或称植物受精胶囊注射转化法(CN 95119563.8)，成功地获得了具有高抗虫能力的抗虫转基因棉花。虽然本发明优选棉花作为子房注射外源基因转化植物受精胶囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因转化植物受精胚囊技术的优点在于：1).适合于所有植物的基因型；2).方法简单，有效；3).不受实验室条件、仪器的限制，且费用低；4)速度快，一年内即可获得转基因植物种子及后代。

在本实例中，子房注射外源基因转化植物受精胚囊的方法，是在棉花开花授粉后的大约10-24小时之间。如在珠心孔道封闭之前，用微量注射系统将外源基因溶液注射到子房内，外要材料即可通过珠孔和珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。在受精卵分裂的过程中，外源基因被吸收整合到受精卵细胞的基因组中，从而完成外源基因导入和整合过程。

棉花是常异花授粉作物，为保持品种(系)的相对纯度，在开花的前一天下午，将要在第二天开花的蕾用线扣紧，使花瓣不易张开，以使其自花授粉。开花后约10小时左右，即当天开花的晚6点钟左右花粉管进人胚囊后，即可进行外源基因的注射。注射前将花瓣连同雄蕊剥去露出幼铃，抹去幼铃顶端的花柱，我们设计的微量注射系统吸取预冷的外源基因溶液，从抹掉幼铃的顶端，沿中轴垂直插入幼铃大小的2/3处，再将微量注射器向上提到1/3的地方，留下约幼铃1/3的插入空间，缓慢将注射装置内的外源溶液注射到插入空间内。此后，外源DNA溶液将沿着珠孔和珠心孔道向受精胚囊内扩散，或由于珠心孔道在逐渐封闭而被挤压进受精胚囊中而实现其整合。一般注射的外源基因溶液为10ul，总量约为0.25-0.5ug。当然，对于不同的作物可根据其子房内胚珠数目的多少，适当地增加或减少外源基因的注射量。外源基因注射后为了防止和减少幼铃的脱落，提高成铃率，在幼铃柄基部用毛笔涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夹在幼铃柄基部和茎(枝)之间，同时将所说注射外源基因的幼铃所在的枝条顶端摘掉，以保持幼铃的充分营养，从而将有利于成铃和铃内种子的发育。

           实施例6  转融合杀虫基因棉花的分子生物学检测及酶活和抗虫性测试

应用实施例3.4、3.5和3.6的方法，对所获得的转基因棉花植株分别进行了PCR、SouthernBlot分析、胆固醇氧化酶酶活检测以及抗棉铃虫实验。证实了融合杀虫基因已转入到了棉花基因组中并获得了高效表达。

                          序列表

(1)一般信息：

   (i)申请人：

      (A)名称：中国农业科学院生物技术研究所

      (B)地址：北京海淀区中南大街12号

      (C)国家：中国

      (D)邮编：100081

      (F)电话：(010)68975669

      (G)传真：(010)68975669

   (ii)发明名称：具有两种杀虫机理的融合杀虫蛋白质基因及其应用

   (iii)序列数：18

(2)SEQ ID NO：1的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：3486碱基对

      (B)类型：核苷酸

      (C)链型：双链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：DNA

   (iii)其它信息：构建的Bt cryIA/EK编码序列/choAL融合杀虫蛋白基因

   (iv)序列描述：SEQ ID NO：1

  1  ATGGACTGCA GGCCATACAA CTGCTTGAGT AACCCAGAAG TTGAAGTACT

 51  TGGTGGAGAA CGCATTGAAA CCGGTTACAC TCCCATCGAC ATCTCCTTGT

101  CCTTGACACA GTTTCTGCTC AGCGAGTTCG TGCCAGGTGC TGGGTTCGTT

151  CTCGGACTAG TTGACATCAT CTGGGGTATC TTTGGTCCAT CTCAATGGGA

201  TGCATTCCTG GTGCAAATTG AGCAGTTGAT CAACCAGAGG ATCGAAGAGT

251  TCGCCAGGAA CCAGGCCATC TCTAGGTTGG AAGGATTGAG CAATCTCTAC

301  CAAATCTATG CAGAGAGCTT CAGAGAGTGG GAAGCCGATC CTACTAACCC

351  AGCTCTCCGC GAGGAAATGC GTATTCAATT CAACGACATG AACAGCGCCT

401  TGACCACAGC TATCCCATTG TTCGCAGTCC AGAACTACCA AGTTCCTCTC

451  TTGTCCGTGT ACGTTCAAGC AGCTAATCTT CACCTCAGCG TGCTTCGAGA

501  CGTTAGCGTG TTTGGGCAAA GGTGGGGATT CGATGCTGCA ACCATCAATA

551  GCCGTTACAA CGACCTTACT AGGCTGATTG GAAACTACAC CGACCACGCT

601  GTTCGTTGGT ACAACACTGG CTTGGAGCGT GTCTGGGGTC CTGATTCTAG

651  AGATTGGATT AGATACAACC AGTTCAGGAG AGAATTGACC CTCACAGTTT

701  TGGACATTGT GTCTCTCTTC CCGAACTATG ACTCCAGAAC CTACCCTATC

751  CGTACAGTGT CCCAACTTAC CAGAGAAATC TATACTAACC CAGTTCTTGA

 801  GAACTTCGAC GGTAGCTTCC GTGGTTCTGC CCAAGGTATC GAAGGCTCCA

 851  TCAGGAGCCC ACACTTGATG GACATCTTGA ACAGCATAAC TATCTACACC

 901  GATGCTCACA GAGGAGAGTA TTACTGGTCT GGACACCAGA TCATGGCCTC

 951  TCCAGTTGGA TTCAGCGGGC CCGAGTTTAC CTTTCCTCTC TATGGAACTA

1001  TGGGAAACGC CGCTCCACAA CAACGTATCG TTGCTCAACT AGGTCAGGGT

1051  GTCTACAGAA CCTTGTCTTC CACCTTGTAC AGAAGACCCT TCAATATCGG

1101  TATCAACAAC CAGCAACTTT CCGTTCTTGA CGGAACAGAG TTCGCCTATG

1151  GAACCTCTTC TAACTTGCCC TCCGCTGTTT ACAGAAAGAG CGGAACCGTT

1201  GATTCCTTGG ACGAAATCCC ACCACAGAAC AACAATGTGC CACCCAGGCA

1251  AGGATTCTCC CACAGGTTGA GCCACGTGTC CATGTTCCGT TCCGGATTCA

1301  GCAACAGTTC CGTGAGCATC ATCAGGGCTC CTATGTTCTC TTGGATACAC

1351  CGTAGTGCTG AGTTCAACAA CATCATCGCA TCCGATAGTA TTACTCAAAT

1401  CCCTGCAGTG AAGGGAAACT TTCTCTTCAA CGGTTCTGTC ATTTCAGGAC

1451  CAGGATTCAC TGGTGGAGAC CTCGTTAGAC TCAACAGCAG TGGAAACAAC

1501  ATTCAGAATA GGAGGTATAT TGAAGTTCCA ATTCACTTCC CATCCACATC

1551  TACCAGATAT AGAGTTCGTG TGAGGTATGC TTCTGTGACC CCTATTCACC

1601  TCAACGTTAA TTGGGGTAAT TCATCCATCT TCTCCAATAC AGTTCCAGCT

1651  ACAGCTACCT CCTTGGATAA TCTCCAATCC AGCGATTTCG GTTACTTTGA

1701  AAGTGCCAAT GCTTTTACAT CTTCACTCGG TAACATCGTG GGTGTTAGAA

1751  ACTTTAGTGG GACTGCTGGA GTGATTATCG ACAGATTCGA GTTCATTCCA

1801  GTTACTGCAA CACTCGAGGC TGAAGATGAT GATGATAAGA CCATGGTGAC

1851  TGCACAACAG CACCTGTCCC GCCGCCGCAT GCTCGGCATG GCCGCCTTCG

1901  CCGCCGCCGC CCTCGCCGGG CGCACCACCA TCGCCGCCCC CCGTGCGGCC

1951  GCCGCCGCCA AGTCCGCGGC GGACAACGGC GGTTACGTCC CCGCCGTCGT

2001  GATCGGCACC GGCTACGGCG CGGCCGTCTC CGCCCTGCGC CTCGGCGAGG

2051  CGGGTGTGCA GACCCTGATG CTGGAGATGG GCCAGCTGTG GAACCAGCCC

2101  GACCCGGACG GCAACATCTT CTGCGGCATG CTCAAACCGG ACAAGCGGTC

2151  CAGCTGGTTC AAGAACCGCA CCGAGGCCCC GCTCGGCAGC TTCCTCTGGC

2201  TCGACGTCGT CAACCGGAAC ATCGACCCCT ACGCGGGAGT CCTGGACCGA

2251  GTGAACTACG ACCAGATGTC GGTCTACGTG GGCCGCGGCG TCGGCGGCGG

2301  CTCGCTCGTC AACGGCGGCA TGGCCGTGGA GCCCAAGCGC TCGTACTTCG

2351  AGGAGATCCT CCCGCGGGTC GACTCCTCCG AGATGTACGT CCGCTACTTC

2401  CCCCGCGCCA ACTCCATGCT CCGCGTCAAC CACATCGACA CCAACTGGTT

2451  CGAGGACACC GAGTGGTACA AGTTCGCCCG CGTCTGGCGC GAGCAGGCCG

2501  CCAAGGCCGG TCTCGCCACC GTCTTCGTCC CCAACGTCTA CGACTTCGGC

2551  TACATGCAGC GGGAGGCCGC GGGCGAGGTG CCCAAGTCCG CCCTAGCGAC

2601  CGAGGCCATC TACGGCAACA ACCACGGCAA GCAGAGCCTG GACAAGACCT

2651  ACCTGGCCGC CGCACTGGGC ACCGGCAAGG TCACCATCCA GACCCTGCAC

2701  CAGGTCAAGA CGATCCGTCA GACGAAGGAC GGCGGCTACG CGCTGACCGT

2751  CGAGCAGAAG GACACCGACG GCAAGCTCCT GGCCACCAAG GAGATCTCCT

2801  GCCGCTACCT GTTCCTCGGC GCGGGCAGCC TCGGCTCCAC CGAACTGCTG

2851  GTGCGCGCCC GCGATACCGG CACCCTGCCG CACCTCAACT CCGAGGTCGG

2901  CGCGGGCTGG GGCCCCAACG GCAACATCAT GACCGTCCGG GCCAACCACA

2951  TGTGGAACCC CACGGGCCCC CACCAGTCCT CGATCCCCGC CCTCGGTATC

3001  GACGCGTGGG ACAACAGCGA CTCCTCGGTC TGCGCGGAGA TAGCCCCCAT

3051  GCCGGCCGGC TTGGAGACGT GGGACAGCCT CTACCTCGCG ATCACCAAGA

3101  ACCCCCAGCG CGGCACCTTC GTGTACGACG CCGCGACGGA CCGCGCGAAG

3151  CTCAACTGGA CCCGTGACCA GAACGCCCCC GCGGTCAACG CCGCCAAGGC

3201  ACTGTTCGAC CGCATCAACA AGGCGAACGG CACGATCTAC CGGTACGACC

3251  TCTTCGGCAC CCAGCTGAAG GCCTTCGCCA ACGACTTCTG CTACCACCCG

3301  CTCGGCGGCT GCGTCCTGGG CAAGGCGACG GACGACTACG GCCGCGTCGC

3351  CGGTTACAAG AACCTCTACG TGACCGACGG TTCGCTGATC CCGGGTTCCG

3401  TCGGCGTCAA CCCGTTCGTG ACCATCACGG CGCTGGCCGA GCGGAACGTC

3451  GAGCGCATCA TCAAGCAGGA CGTCACGGCG TCGTAA

(3)SEQ ID NO：2的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：1161个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：蛋白质

   (iii)其它信息：Bt CryIA/EK/CHOAL融合杀虫蛋白

   (iv)序列描述：SEQ ID NO：2

  1  MDCRPYNCLS NPEVEVLGGE RIETGYTPID ISLSLTQFLL SEFVPGAGFV

 51  LGLVDIIWGI FGPSQWDAFL VQIEQLINQR IEEFARNQAI SRLEGLSNLY

101  QIYAESFREW EADPTNPALR EEMRIQFNDM NSALTTAIPL FAVQNYQVPL

151  LSVYVQAANL HLSVLRDVSV FGQRWGFDAA TINSRYNDLT RLIGNYTDHA

201  VRWYNTGLER VWGPDSRDWI RYNQFRRELT LTVLDIVSLF PNYDSRTYPI

251  RTVSQLTREI YTNPVLENFD GSFRGSAQGI EGSIRSPHLM DILNSITIYT

301  DAHRGEYYWS GHQIMASPVG FSGPEFTFPL YGTMGNAAPQ QRIVAQLGQG

351  VYRTLSSTLY RRPFNIGINN QQLSVLDGTE FAYGTSSNLP SAVYRKSGTV

401  DSLDEIPPQN NNVPPRQGFS HRLSHVSMFR SGFSNSSVSI IRAPMFSWIH

451  RSAEFNNIIA SDSITQIPAV KGNFLFNGSV ISGPGFTGGD LVRLNSSGNN

501  IQNRRYIEVP IHFPSTSTRY RVRVRYASVT PIHLNVNWGN SSIFSNTVPA

551  TATSLDNLQS SDFGYFESAN AFTSSLGNIV GVRNFSGTAG VIIDRFEFIP

 601  VTATLEAEDD DDKTMVTAQQ HLSRRRMLGM AAFAAAALAG RTTIAAPRAA

 651  AAAKSAADNG GYVPAVVIGT GYGAAVSALR LGEAGVQTLM LEMGQLWNQP

 701  DPDGNIFCGM LKPDKRSSWF KNRTEAPLGS FLWLDVVNRN IDPYAGVLDR

 751  VNYDQMSVYV GRGVGGGSLV NGGMAVEPKR SYFEEILPRV DSSEMYVRYF

 801  PRANSMLRVN HIDTNWFEDT EWYKFARVWR EQAAKAGLAT VFVPNVYDFG

 851  YMQREAAGEV PKSALATEAI YGNNHGKQSL DKTYLAAALG TGKVTIQTLH

 901  QVKTIRQTKD GGYALTVEQK DTDGKLLATK EISCRYLFLG AGSLGSTELL

 951  VRARDTGTLP HLNSEVGAGW GPNGNIMTVR ANHMWNPTGP HQSSIPALGI

1001  DAWDNSDSSV CAEIAPMPAG LETWDSLYLA ITKNPQRGTF VYDAATDRAK

1051  LNWTRDQNAP AVNAAKALFD RINKANGTIY RYDLFGTQLK AFANDFCYHP

1101  LGGCVLGKAT DDYGRVAGYK NLYVTDGSLI PGSVGVNPFV TITALAERNV

1151  ERIIKQDVTA S^*

(4)SEQ ID NO：3的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：31个碱基

      (B)类型：核苷酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：DNA

   (iii)其它信息：choAL基因的PCR引物-1

   (iv)序列描述：SEQ ID NO：3

    CCATGGTGACTGCACAACAGCACCTGTCCCG                31b

(5)SEQ ID NO：4的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：32个碱基

      (B)类型：核苷酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：DNA

   (iii)其它信息：choAL基因的PCR引物-2

   (iv)序列描述：SEQ ID NO：4

   CTCGAGTTACGACGCCGTGACGTCCTGCTTGA               32b

(6)SEQ ID NO：5的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：5个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：寡肽

   (iii)其它信息：昆虫肠激酶(EK)酶切位点

   (iv)序列描述：SEQ ID NO：5

      DDDDK

(7)SEQ ID NO：6的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：33个碱基

      (B)类型：核苷酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：DNA

   (iii)其它信息：寡核苷酸连接序列-1

   (iv)序列描述：SEQ ID NO：6

    AATTCTCGAGGCTGAAGATGATGATGATAAGAC              33b

(8)SEQ ID NO：7的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：32个碱基

      (B)类型：核苷酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：DNA

   (iii)其它信息：寡核苷酸连接序列-2

   (iv)序列描述：SEQ ID NO：7

   CATGGTCTTATATCATCATCTTCAGCCTCGAG               32b

(9)SEQ ID NO：8的信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：15个碱基对

      (B)类型：核苷酸

      (C)链型：双链

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：编码EK切割序列的DNA序列

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：8

       GATGATGATGATAAG  15bp

(10)SEQ ID NO：9的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：57碱基

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：单链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：Ω序列片段引物-1

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：9

CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA

ACATTAC                                                   57b

(11)SEQ ID NO：10的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：50碱基

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：单链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：Ω序列片段引物-2

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：10

GTTGTTTGTT GTAATGTTAA TGATAAATGT TATTGTTACC TGACGTCGGG    50b

(12)SEQ ID NO：11的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：91碱基对

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：双链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：合成的Ω序列和Kozack片段

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：11

CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA

ACATTACAAT TACTATTTAC AATAACAATG GACTGCAGCC C     91bp

(13)SEQ ID NO：12的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：802碱基对

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：双链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：外源基因表达盒5’端带有加倍增强子的355启动子序列

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：12

  1  CAAGCTTCAT ACAGAGCTCA ATGACAAGAA GAAAATCTTC GTCAACATGG

 51  TGGAGCTCTC TTACGAACGA CACGATTGTC TACTCCAAAA ATATCAAAGA

101  TACAGTCTCA GAAGACCAAA GGGCAATTGA GACTTTTCAA CAAAGGGTAA

151  TATCCGGAAA CCTCCTCGGA TTCCATTGCC CAGCTATCTG TCACTTTATT

201  GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TTACAATGCC ATCATTGCGA

251  TAAAGGAAAG GCCATCGTTG AAGATGCCTC TGCCGACAGT GGTCCCAAAG

301  ATGGACCCCC ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC

351  ACGTCTTCAA AGCAAGTGGA TTGATGTGAT ACTCCAAAAA TATCAAAGAT

401  ACAGTCTCAG AAGACCAAAG GGCAATTGAG ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT

451  ATCCGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC AGCTATCTGT CACTTTATTG

501  TGAAGATAGT GGAAAAGGAA GGTGGCTCCT TACAATGCCA TCATTGCGAT

551  AAAGGAAAGG CCATCGTTGA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA

601  TGGACCCCCA CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA

651  CGTCTTCAAA GCAAGTGGAT TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT

701  GACGCACAAT CCCACTATCC TTCGCAAGAC CCTTCCTCTA TATAAGGAAG

751  TTCATTTCAT TTGGAGAGGA CACGCTGAAA TCACCTCTAG AGGATCCCCG

801  GG

(14)SEQ ID NO：13的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：35碱基对

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：双链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：读码框不同的终止子编码序列(UT)

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：13

    CACTCGAGGC TGAATGAGTA AGTGAGTAGG TTAAC               35bp

(15)SEQ ID NO：14的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：95碱基对

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：双链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：正确切割和修饰以及植物多腺苷信号肽序列

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：14

    GGTTAACTTT GAGTATTATG GCATTGGAAA AGCCATTGTT CTGCTTGTAA

    TTTACTGTGT TTCTTTCAG  TTTTGTTTTC GGAAATAAAG TTAAC    95bp

(16)SEQ ID NO：15的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：137碱基对

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：双链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：多腺核苷酸序列

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：15

  1  GTTAACAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATTTAACAAA AAAAAAAAAA

 51  AAAAAAAAAA AATTTAACAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAATTTAACA

101  AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAATTTAAA AGAGCTC           137bp

(17)SEQ ID NO：16的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：251碱基对

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：双链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：3’非编码序列

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：16

  1  CACTCGAGGC TGAATGAGTA AGTGAGTAGG TAACTTTGAG TATTATGGCA

 51  TTGGAAAAGC CATTGTTCTG CTTGTAATTT ACTGTGTTCT TTCAGTTTTT

101  GTTTTCGGAA ATAAAGTTAA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATTTA

151  ACAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAATTT AACAAAAAAA AAAAAAAAAA

201  AAAAAAATTT AACAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAATT TAAAAGAGCT

251  C

(18)SEQ ID NO：17的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：27碱基

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：单链

       (D)拓扑结构：线性

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：Bt.杀虫蛋白基因的PCR检测引物-1

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：17

    GGGCCCGCTG AATCCAACTG GAGAGGC                 27b

(19)SEQ ID NO：18的信息：

    (i)序列特征：

       (A)长度：31碱基

       (B)类型：核苷酸

       (C)链型：单链

       (D)拓扑结构：线牲

    (ii)分子类型：DNA

    (iii)其它信息：Bt.杀虫蛋白基因的PCR检测引物-2

    (iv)序列描述：SEQ ID NO：18

    CCATACAACT GCTTGAGTAA CCCAGAAGTT G           31b

Claims (9)

1.编码融合杀虫蛋白质的基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2.包含权利要求1的基因的植物表达载体。

3.根据权利要求2的植物表达载体，其中包括：

a).5’端非编码区

b).权利要求1的基因

c).3’端非编码区

4.根据权利要求3的植物表达载体，其中所说的a)5’端非编码区由带有加倍增强子元件的启动子序列，其核苷酸序列是SEQ ID NO：12；和1个Ω序列及1个Kozak序列，二者的核苷酸序列是SEQ ID NO：11组成。

5.根据权利要求3的植物表达载体，其中c)中所说的3’端非编码区包含一个多联终止子序列，其核苷酸序列是SEQ ID NO：13；和一个融合基因转录产物的切割序列和一个融合基因转录产物的加工序列，二者的核苷酸序列是SEQ ID NO：14。

6.保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNO.0791的植物表达载体pGBI1214ABfcho。

7.产生对多种害虫有杀虫性且害虫对这种杀虫性较难以产生耐受性的植物的方法，该方法包括：

1).构建权利要求2-6任一项所述的植物表达载体；

2).将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得所述植物。

8.根据权利要求7的方法，其中获得的所述植物是任何部分的植物组织。

9.根据权利要求7的方法，其中所说的植物是棉花。