CN1668752A - 包括减压/增压的使用的电穿孔方法 - Google Patents

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田部井丰
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Abstract

本发明的目的是建立一种比常规技术更简单且更快速的转化方法。该目的可通过以下方法解决，该方法包括下列步骤：a)将细胞保持在不同于大气压的压力下，并且b)将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下。本发明取消了基因转移后通常所需的培养的必要性。因此，本发明可获得不能或很难通过常规技术转化的物种的转化体。本发明的简单转化方法可很容易进行大规模的处理和大规模的分析，用于本领域的研究和发展。此外，本发明可引起研究的显著进步，潜在导致创新重组体的开发。

Description

包括减压/增压的使用的电穿孔方法
                        技术领域
本发明涉及一种使用包括减压或增压的电穿孔将所需核酸转移到细胞或组织(包括植物组织)中，从而产生核酸-转移物质(包括转化体)的方法。
                        背景技术
人类的种族主要依赖于供他们生存的主要谷类食品，如小麦、大麦、稻、玉米、大豆等。为推进食品生产以与全世界人口的增长相对应，必须开发具有比传统农作物产量更高的农作物。重组DNA技术已经作为培育具有更高产量的变种的方法而用于研制转化农作物。
蔬菜，例如，大白菜、番茄、黄瓜等是丰富我们的食物以及营养必需的农作物。然而，这些蔬菜易感染各种疾病或受到病原体损害。如果重组基因工程技术可用于产生对疾病或病原体损害的抗性，则可获得稳定的产量。为了满足这种需要，已经研究出了用于分离有效基因以及使用基因转化的方法。
为了转化植物，通常有两种方法：直接的基因转移方法，其中将基因直接转移到植物中；以及间接的基因转移方法，其中将基因间接转移到植物中。
迄今为止，已经广泛使用利用农杆菌(Agrobacterium)的间接基因转移方法。例如，培养稻的成熟种子，三周后，用农杆菌感染所得愈伤组织(Hiei等人，Plant Journal，6：271-282，1994)；或在发芽后第4-5天用农杆菌感染种子，从而快速获得转化体(Tanaka等人，日本专利号3141084)。
直接的基因转移方法的例子包括基因枪方法(Christou P.等人，Bio/Technology，9：957-962，1991)、聚乙二醇方法(Datta S.K.等人，Bio/Technology，8：736-740，1990)、电穿孔方法(Shimamoto K.等人，Nature，338：274-276，1989)等。这些技术用于生产转化体。电穿孔是一种基因转移方法，其中将细胞(例如，植物细胞)放在含有所需基因(例如，DNA)的溶液中，并通过电刺激将基因引入到细胞中。
与间接的基因转移方法相比，直接的基因转移方法具有无需组织培养和农杆菌制备等的优点。然而，基因枪方法，其是一种直接的基因转移方法，具有转化体(例如，转化的全株植物)从转化组织的再生效率普遍较低的缺点(Hagio，JARQ，32(4)：239-247，1998)。电穿孔方法具有可用的细胞及组织有限的缺点。因此，直接的基因转移方法具有有限的应用。
传统的电穿孔方法只能用于先天没有细胞壁的细胞以及细胞壁已经人工除去的细胞(例如，原生质体)。相反，相信电穿孔不能用于具有细胞壁的细胞(例如，植物(包括休眠组织，如种子等))。事实上，还没有关于通过电穿孔将核酸转移到种子中的方法。因此，为了使用传统的电穿孔方法获得核酸转移物质(特别是，全株转化植物)，在核酸已经转移到组织，如原生质体等中后，不可避免地需要原生质体培养、组织培养(例如，为了再分化)或其它步骤。因此，电穿孔并非必然是一种容易的方法，而且需要成本、时间、和劳动。
为了将基因转移到小麦中，已经使用了未成熟的胚(Weeks J.T.等人，Plant.Physiol.，102：1077-1084，1993)。然而，植物需要在田间或温室生长，以便获得未成熟的胚。在田间，需要花费6-7个月。在温室，需要花费3-5个月。
因此，还没有可行的、简单且快速的核酸转移方法(特别是，转化方法)，其中无需农杆菌的培养和制备等，且很容易制备向其中转移核酸的样品，且核酸-转移物质(特别是，转化体)很容易在核酸转移之后获得。
考虑到上述还没有建立简单且快速的核酸转移方法(特别是，植物转化方法)的情况，本发明目的是提供一种简单且快速的核酸转移方法(特别是，一种植物转化方法)，它具有下列特征：(i)无需农杆菌等的培养和制备；(ii)向其中转移核酸的样品的制备较为简单；且(iii)核酸转移-物质很容易在核酸转移后获得。
本发明简单且快速的方法可迅速获得大量核酸转移物质(特别是，全株转化植物)。因此，本发明可用于需要植物转化体的工业领域以及使用植物很容易进行大规模处理和大规模分析的研究和开发中。此外，本发明可引起研究的显著进步，潜在导致创新重组体的开发。
                        发明内容
本发明的上述目的是通过用于将核酸转移到细胞中的方法实现的，该方法包括下列步骤：
a)将细胞保持在不同于大气压的压力下；并
b)将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下。
在其中一个实施方案中，本发明的方法是通过下列步骤进行的：
1)将植物组织保持在不同于大气压的压力下；并
2)使用电穿孔将所需基因转移到植物中。
具体而言，在这里本发明人已经试验过各种用于处理细胞，从而使核酸很容易被引入到细胞中的方法，从而在植物中实现成功的电穿孔。通常，相信：(i)应用农杆菌的核酸转移方法，其中将植物放在真空中，对于除拟南芥属(Arabidopsis)之外的植物无效；且(ii)无需将植物保持在真空中，以便使用农杆菌转移核酸(Bent，PlantPhysiology，124：1540-1547，2000年12月)。相反，如下面实施例所示，本发明人发现通过电穿孔进行植物核酸转移是通过增加将植物组织保持在不同于大气压的压力下的步骤而优化的。本发明的方法可应用于除植物细胞之外的任何其它细胞，其中通过电穿孔进行的核酸转移的效率明显提高。
本发明的方法非常简单。此外，本发明的方法无需培养，而这种培养通常是核酸转移后所必需的。因此，本发明具有核酸转化物质没有体细胞克隆变异的优点。已知体细胞克隆变异不可避免地出现在常规核酸转移后所需的培养中。正如本领域那些技术人员通常所了解的那样，体细胞克隆变异是指在培养物中出现的基因突变，即培养物中核酸序列中出现的任何序列改变(例如，置换、缺失、插入、易位、倒位、重复等)，所述核酸序列是指最初由向其中转移核酸的细胞所具有的核酸序列和/或转移的核酸序列。无意的体细胞克隆变异常常为核酸转移物质带来不希望得到的特性。因此，因为所需的核酸转移物质可在不发生体细胞克隆变异的条件下获得，所以本发明的方法十分有用。
本发明进一步提供允许植物物种转化的优点，这些植物物种不能或很难通过传统的基因转移技术转化。具体而言，Norin 61(小麦变种)，其用于下列实施例中，在日本是小麦的其中一种主要变种。不能通过组织培养使这种变种再生为全株植物，即，很难通过传统技术获得转化体(Machii等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，53：67-74，1998)。此外，例如，对于实施例4中所用的大豆，还没有很好地建立再分化技术。很难获得大豆的转化体。然而，如下面实施例所述，本发明可转化通常不能或很难被制成转化体的植物物种。本发明的方法可用于通常不能或很难被制成转化体的任何其它物种。
因此，本发明提供下列内容。
1.一种用于将核酸转移到细胞中的方法，包括下列步骤：
a)细胞保持在不同于大气压的压力下；并
b)将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下。
2.根据项1所述的方法，其中将细胞保持在不同于大气压的压力下的步骤是使细胞经过减压的步骤。
3.根据项1所述的方法，其中将细胞保持在不同于大气压的压力下的步骤是使细胞经过增压的步骤。
4.根据项1所述的方法，其中将细胞保持在不同于大气压的压力下的步骤是在将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下的步骤之前进行的。
5.根据项2所述的方法，其中减压步骤是在比大气压低约0.096MPa的压力下进行的。
6.根据项1所述的方法，其中步骤b)包括在至少两个方向上向细胞及核酸施加高压脉冲。
7.根据项1所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
8.根据项7所述的方法，其中所述植物细胞是休眠植物组织的细胞。
9.根据项8所述的方法，其中所述休眠植物组织是种子。
10.根据项7所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
11.根据项10所述的方法，其中所述单子叶植物是禾本科(Gramineae)植物。
12.根据项11所述的方法，其中所述禾本科植物是小麦(Triticumaestivum L.)。
13.根据项11所述的方法，其中所述禾本科植物是稻(Oryza sativaL.)。
14.根据项11所述的方法，其中所述禾本科植物是玉米(Zea mays L.)。
15.根据项7所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
16.根据项15所述的方法，其中所述双子叶植物是十字花科(Cruciferae)植物。
17.根据项16所述的方法，其中所述十字花科植物是大白菜(Brassicarapa L.)。
18.根据项16所述的方法，其中所述十字花科植物是油菜(Brassicanapus L.)。
19.根据项15所述的方法，其中所述双子叶植物是豆科(Leguminosae)植物。
20.根据项19所述的方法，其中所述豆科植物是大豆(Glycine maxMerr)。
21.根据项15所述的方法，其中所述双子叶植物是茄科(Solanaceae)植物。
22.根据项21所述的方法，其中所述茄科植物是番茄(Lycopersicumesculentum Mill)。
23.根据项15所述的方法，其中所述双子叶植物是葫芦科(Cucurbitaceae)植物。
24.根据项23所述的方法，其中所述葫芦科植物是日本香瓜(Cucumismelo L.)。
25.根据项15所述的方法，其中所述双子叶植物是旋花科(Convolvulaceae)植物。
26.根据项25所述的方法，其中所述旋花科植物是牵牛花(Pharbitis nilChoisy)。
27.一种用于产生植物的方法，其中核酸被转移到植物细胞中，包括下列步骤：
a)细胞保持在不同于大气压的压力下；并
b)将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下。
28.根据项27所述的方法，还包括使细胞分化、生长、和/或增殖的步骤。
29.根据项27或28所述的方法，其中步骤a)包括将含有细胞的种子保持在不同于大气压的压力下的步骤，且步骤b)包括将含有细胞及核酸的种子置于能够引发电穿孔的条件下的步骤。
30.根据项29所述的方法，其中所述种子是单子叶植物的种子。
31.根据项30所述的方法，其中所述单子叶植物的种子是禾本科的种子。
32.根据项31所述的方法，其中所述禾本科的种子是小麦(Triticumaestivum L.)的种子。
33.根据项31所述的方法，其中所述禾本科的种子是稻(Oryza sativaL.)的种子。
34.根据项31所述的方法，其中所述禾本科的种子是玉米(Zea maysL.)的种子。
35.根据项29所述的方法，其中所述种子是双子叶植物的种子。
36.根据项35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是十字花科的种子。
37.根据项36所述的方法，其中所述十字花科的种子是大白菜(Brassicarapa L.)的种子。
38.根据项36所述的方法，其中所述十字花科的种子是油菜(Brassicanapas L.)种子。
39.根据项35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是豆科的种子。
40.根据项39所述的方法，其中所述豆科的种子是大豆(Glycine maxMerr)的种子。
41.根据项35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是茄科的种子。
42.根据项41所述的方法，其中所述茄科的种子是番茄(Lycopersicumesculentum Mill)的种子。
43.根据项35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是葫芦科的种子。
44.根据项43所述的方法，其中所述葫芦科的种子是日本香瓜(Cucumismelo L.)的种子。
45.根据项35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是旋花科的种子。
46.根据项45所述的方法，其中所述旋花科的种子是牵牛花(Pharbitisnil Choisy)的种子。
47.一种通过项27-46任何一项所述的方法生产的植物。
48.根据项47所述的植物，其不含体细胞克隆变异。
49.一种用于将核酸转移到细胞中的装置，包括：
a)用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分；和
b)用于电穿孔的部分。
50.根据项49所述的装置，其中用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分具有维持压力低于大气压的能力。
51.根据项49所述的装置，其中所述细胞是植物细胞。
52.根据项49所述的方法，其中b)的电穿孔部分包括：
起阳极作用的第一电极；和
起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间距离的长度足以容纳植物种子。
53.根据项52所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离为至少约5mm。
54.根据项52所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离长于约1cm。
55.根据项52所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
56.根据项49所述的装置，其中b)的电穿孔部分包括起阳极作用的第一电极；和起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间的距离可被改变，从而使植物种子可被容纳于第一和第二电极之间。
57.根据项56所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
58.一种用于将核酸转移到细胞中，并将细胞保持在不同于大气压的压力下的电穿孔装置，该装置包括：
起阳极作用的第一电极；和
起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间距离的长度足以容纳植物种子。
59.根据项58所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离为至少约5mm。
60.根据项58所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离长于约1cm。
61.根据项58所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
62.一种用于将核酸转移到细胞中，并将细胞保持在不同于大气压的压力下的电穿孔装置，该装置包括：
起阳极作用的第一电极；和
起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间的距离可被改变，从而使植物种子可被容纳于第一和第二电极之间。
63.根据项62所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
64.一种能抵抗不同于大气压的压力并具有足以容纳植物种子大小的电穿孔室。
65.根据项64所述的电穿孔室，其中与电穿孔室内壁上的至少3个点相切的最大内切圆直径为至少约5mm。
66.根据项64所述的电穿孔室，其中与电穿孔室内壁上的至少3个点相切的最大内切圆直径长于约1cm。
67.根据项64所述的电穿孔室，其中该室具有四边形的横截面，且室的内部尺寸是约1cm×2cm×2cm。
68.根据项64所述的电穿孔室，其中该室具有圆形的横截面，且室的内部尺寸是约1cm×4cm。
69.一种能够抵抗不同于大气压的压力的电穿孔室，其中该室的大小可被改变，从而使植物种子可被容纳于室中。
70.一种用于自动进行电穿孔的装置，包括：
a)用于放置含核酸及细胞的混合物的容器；
b)用于在容器a)中放置核酸的部分；
c)用于在容器a)中放置细胞的部分；
d)用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的容器，该容器能够抵抗不同于大气压的压力；
e)用于在容器d)中放置细胞的部分；
f)用于将容器d)的内部区域维持在不同于大气压的压力下的部分；
g)用于向含核酸及细胞的混合物施加高压脉冲的容器；
h)用于在容器g)中放置含核酸及细胞的混合物的部分；
i)用于向容器g)中的含核酸及细胞的混合物施加高压脉冲的部分；和
j)用于自动运行部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分，
其中部分b)和部分c)彼此相同或不同；部分e)和部分h)彼此相同或不同；且容器a)、容器d)、和容器g)彼此相同或不同。
                    附图简述
图1是pWI-H5K的限制性酶切图。
图2表示在下列条件下经过电穿孔的小麦种子(Norin 61)的结果：脉冲宽度为50μsec、脉冲次数为50、压力是低于大气压0.096MPa(减压)、施加的电压是100V(A)、50V(B)、20V(C)、或0V(D)。
图3表示1：经过减压和电穿孔的小麦种子；2：只经过电穿孔的小麦种子；和3：对照小麦种子的GUS染色结果。
图4表示用2000ppm遗传霉素筛选转化小麦种子的结果，其中A：具有质粒的样品，B：没有质粒的对照。
图5表示转化小麦植株DNA的PCR分析结果。第1-8泳道：转化小麦植物的DNA样品；M：标记；P：阳性对照，N：阴性对照。右面的箭头表示目标产物的位置(约0.75kb)。
图6表示转化小麦植株DNA的DNA印迹分析结果。第1-8泳道：转化小麦植株的DNA样品；P1：阳性对照，P2：阳性对照，N：阴性对照。右面从上面开始的箭头表示约4.0kb、约2.0kb、约1.5kb、和约1.0kb。
图7表示具有种子生育力的小麦转化体的照片。照片中的植株与在图6的DNA印迹分析中呈阳性的第1和2泳道的植株相对应。
图8表示转化小麦植株的下一代个体(T1)DNA的PCR分析结果。第1-6泳道：转化小麦植株的下一代个体(T1)的DNA样品，M：标记，P：阳性对照，N：阴性对照。右面的箭头表示目标产物的位置(约0.75kb)。
图9表示在下列条件下经过电穿孔的稻种子(日本产)的结果：脉冲宽度为50μsec、脉冲次数为99、压力是低于大气压0.096MPa(减压)、施加的电压是50V(A)、20V(B)、10V(C)、或0V(D)。
图10表示1：经过减压和电穿孔的日本产稻种子；2：只经过电穿孔的日本产稻种子；和3：对照的日本产稻种子的GUS染色结果。
图11表示用200ppm遗传霉素筛选转化的日本产稻种子的结果，其中A：具有质粒的样品，B：没有质粒的对照。
图12表示转化的日本产稻植株DNA的DNA印迹分析结果。第1-6泳道：转化的日本产稻植株的DNA样品，P：阳性对照(相当于约5个拷贝)，N：阴性对照。右面的箭头表示目标产物的位置(约0.8kb)。
图13表示具有种子生育力的日本产稻转化体的照片。照片中的植株与在图12的DNA印迹分析中呈阳性的第5泳道植株相对应。
图14表示转化的日本产稻植株下一代个体(T1)的DNA的PCR分析结果。第1-8泳道：转化的日本产稻植株下一代个体(T1)的DNA样品，M：标记，P：阳性对照，N：阴性对照。右面的箭头表示目标产物的位置(约0.75kb)。
图15表示A：经过减压和电穿孔的印度产稻种子；B：只经过电穿孔的印度产稻种子；和C：对照的印度产稻种子的GUS染色结果。
图16表示1：经过减压和电穿孔的大豆种子；和2：对照大豆种子的GUS染色结果。
图17表示A：经过减压和电穿孔的大白菜种子；和B：对照大白菜种子的GUS染色结果。
图18表示A：经过减压和电穿孔的番茄种子；B：只经过电穿孔的番茄种子；和C：对照番茄种子的GUS染色结果。
图19表示A：经过减压和电穿孔的牵牛花种子；和B：对照牵牛花种子的GUS染色结果。
图20表示经过电穿孔的小麦种子的结果，其中电压是100V，脉冲宽度是50μsec，脉冲次数是50，且A：低于大气压0.096MPa压力，B：低于大气压0.06MPa压力，C：没有减压，或D：对照(没有DNA和减压)。
图21表示经过电穿孔的日本产稻种子的结果，其中电压是50V，脉冲宽度是50μsec，脉冲次数是99，A：低于大气压0.096MPa压力，B：低于大气压0.06MPa压力，C：没有减压，或D：对照(没有DNA和减压)。
图22表示本发明电穿孔装置的实施方案。
图23表示本发明电穿孔装置的另一实施方案。
图24表示本发明电穿孔装置的另一实施方案。
图25表示本发明直角平行六面体形电穿孔室的实施方案。
图26表示本发明微管形电穿孔室的实施方案。
图27表示与本发明举例性电穿孔室内壁上的至少3个点相切的最大内切圆的例子。
图28表示本发明自动电穿孔装置的图解说明。
图29表示本发明自动电穿孔装置的实施方案。
                   进行本发明的最佳方式
以下，将参考附图通过用于说明的实施例描述本发明。
应当理解，在本说明书中，除非另有说明，单数形式的冠词包括它们复数的概念。还应当理解，除非另有说明，这里所用的术语具有本领域通常所用的定义。
本公开内容中所用的下列术语具有下面归于它们的含义。
这里所用术语“核酸转移”是指以人工方式将核酸转移到细胞或组织中。已经通过“核酸转移”向其中转移了核酸的细胞或组织的表型可以改变或不改变。这里所用术语“基因转移”是指以人工方式将含有基因的核酸转移到细胞或组织中，该基团是决定遗传性状的因子。已经通过“基因转移”向其中转移了含基因的核酸的细胞或组织的表型可以改变或不改变。这里所用术语“转化”是指通过将含基因的核酸引入到细胞或组织中而改变细胞或组织的表型。值得注意的是，在特定情况下，术语“核酸转移”、“基因转移”、和“转化”可在这里互换使用。在本说明书的上下文中，本领域那些技术人员可很清楚理解这些术语各自的含义。
术语“核酸转移物质”、“基因转移物质”、和“转化体”是指从分别经过核酸转移、基因转移、以及转化的细胞或组织产生的生物的全部或一部分。应注意的是，在特定情况下，术语“核酸转移物质”、“基因转移物质”、和“转化体”可在这里互换使用。在本说明书的上下文中，本领域那些技术人员可很清楚地理解这些术语各自的含义。核酸转移物质、基因转移物质、和转化体可以是任何生物，包括，例如，从原核生物细胞及真核生物细胞(例如，植物细胞等)或组织产生的生物。转化体还被称作转化细胞、转化组织、转化宿主等，这取决于所转化的是什么。这里所用术语“转化体”包括所有这些形式，而且可指特定环境中的特定形式。它们可用于术语“核酸转移物质”及“基因转移物质”。
术语“细胞”是指来源于任何生物(例如，任何类型的多细胞生物(例如，动物(例如，脊椎动物、无脊椎动物)、植物(例如，单子叶植物、双子叶植物等))、单细胞生物(例如，细菌等))的细胞。优选，本发明所用的细胞是具有细胞壁的细胞，特别优选植物细胞。
这里所用术语“组织”是指多细胞生物中，具有基本相同功能和/或形式的细胞聚集体。组织通常是相同来源的细胞聚集体，或如果细胞具有基本相同的功能和/或形式，可以是不同来源的细胞聚集体。通常，组织是器官的一部分。在植物中，组织可以各种方式被粗略分类，例如，可被分为分生组织和永久组织，这取决于成分细胞的发育状态；或被分为简单组织和复杂组织，这取决于成分细胞的类型。动物组织被分为上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织等，这取决于形式、功能或遗传基础。
这里所用术语“组织”是指来源于任何生物(例如，任何类型的多细胞生物(例如，动物(例如，脊椎动物、无脊椎动物)、植物(例如，单子叶植物、双子叶植物等)、真菌等)的任何组织。优选，本发明所用的组织是具有细胞壁的组织，特别优选植物组织。植物组织的例子包括，但不限于，休眠组织、种质、生长点、和花芽。休眠组织的优选例子包括，但不限于，成熟种子、未成熟种子、冬芽、和块茎。特别优选的休眠组织是成熟种子，但不限于此。
这里所用术语“器官”是指一种结构，其是个体生物的特殊部分，其中个体生物的某些功能就是在此局部进行的，而且其是形态学独立的。通常，在多细胞生物(例如，动物、植物、真菌)中，器官是由若干组织以特定的空间排列构成的，组织是由许多细胞构成的。植物器官的例子包括，但不限于，根、叶、茎、花等。动物器官的例子包括，但不限于，皮肤、心脏、血管、角膜、视网膜、肾、肝、胰、肠、胎盘、脐带、肺、脑、神经、末肢等。
这里所用术语“筛选”是指通过抗生素-抗性试验和/或基因工程技术(例如，PCR、DNA印迹、RNA印迹等)将核酸转移物质与非-核酸转移物质区别开来。具体而言，术语“筛选”是指在有药物存在的条件下，通过培养和/或使这些生物生长而将具有引入的药物抗性基因的转化生物与未转化生物区别开来的步骤，其中转化生物对所述药物具有抗性。
这里所用术语“电穿孔”是指将核酸(例如，含基因的核酸)转移到细胞(例如，植物细胞)中的技术，其中将DC高压脉冲施加于细胞上，从而将孔打开，使核酸进入细胞。进行电穿孔的条件可由本领域那些技术人员根据所用的物种、组织、细胞等适当选择。进行电穿孔所用的一般电压是10V/cm-200V/cm、优选20V/cm-150V/cm、更优选30V/cm-120V/cm、甚至更优选40V/cm-100V/cm、最优选50V/cm-100V/cm，但不限于这些值。进行电穿孔的一般脉冲宽度是lμsec-90μsec、优选10μsec-90μsec、更优选20μsec-80μsec、更优选30μsec-80μsec、甚至更优选40μsec-70μsec、最优选50μsec-60μsec，但不限于这些值。进行电穿孔的一般脉冲次数是1-200、优选10-150、更优选20-120、甚至更优选30-110、最优选40-100、但不限于这些值。
这里所用短语“将细胞(或组织)及核酸置于能够引发电穿孔的条件下”是指将细胞(或组织)及核酸置于具有引发电穿孔(即，核酸向细胞(或组织)中转移)所需的所有条件(电压、脉冲宽度、脉冲次数、细胞(或组织)与核酸之间的位置关系、电穿孔的运行时间等)的状态下。进行电穿孔所需的条件对于本领域那些技术人员而言是很清楚的，可由本领域那些技术人员适当确定。
在本发明中，电穿孔优选是通过以至少两个方向，向细胞(或组织)及核酸施加高压脉冲而进行的。这项技术可通过向细胞(或组织)及核酸施加一段预定时间的高压脉冲，之后交换阳极和阴极的位置，并再次施加高压脉冲而最简单地实现。这项技术还可使用排列于电穿孔室中不同位置上的电极对实现。通过以至少两个方向施加高压脉冲，核酸的转移效率可显著提高。例如，本发明人发现当以两个方向将高压脉冲施加于十字花科植物的种子及核酸上时，与仅以一个方向施加高压脉冲比，核酸向种子中转移的效率提高了约2倍或更多。
本发明进行电穿孔时所用的电穿孔室可具有任何尺寸，只要该室可容纳经过核酸转移的细胞和/或组织。特别优选电穿孔室的大小可容纳植物组织(例如，植物种子)。本发明的电穿孔室可以是任何形状。这种形状的例子包括，但不限于，立方体、直角平行六面体、圆柱体、管形(例如，体具有均匀或不均匀的横截面，且该体可以或不向底部渐细)等。为使本发明的电穿孔室容纳植物种子，与本发明室内壁上至少3个点相切的最大内切圆直径可以是，例如至少约5mm或更多、优选至少约6mm或更多、优选至少约7mm或更多、优选至少约8mm或更多、优选至少约9mm或更多、优选至少约1cm或更多、优选至少约2cm或更多、优选至少约3cm或更多、优选至少约4cm或更多、优选至少约5cm或更多、优选至少约6cm或更多、优选至少约7cm或更多、优选至少约8cm或更多、优选至少约9cm或更多、优选至少约10cm或更多、优选至少约15cm或更多、优选至少约20cm或更多。与本发明电穿孔室内壁上至少3个点相切的最大内切圆直径的上限可以是，但不限于，例如，约25cm、约20cm、约15cm、约10cm、约9cm、约8cm、约7cm、约6cm、约5cm、约4cm、约3cm、约2cm、约1cm、约9mm、约8mm、约7mm、或约6mm。长度可以是这些确切描述值间的中间值(如1.5cm等)。这里所用术语“内切圆”是指与室容器内壁上至少3个任意点相切的任何圆。这里，室中提供的电极也被看作是容器的一部分。因此，室容器的内壁包括电极的表面。通常，电极的厚度是可以忽略不计(例如，0.1mm等)。
按照本发明一个方面，本发明的电穿孔室具有四边形的横截面和内部尺寸，1cm×2cm×2cm(例如，长×宽×高)。按照本发明另一方面，电穿孔具有圆形的横截面和内部尺寸，1cm×4cm(例如，直径×高)。由电极占据的区不包括在室的尺寸中。通常，电极的厚度可以忽略不计。这里所用术语“横截面”是指与室的纵向垂直的横截面。这里所用术语“内部尺寸”是指室容器内壁上两个任意点之间的距离。当室具有四边形的横截面时，内部尺寸是指横截面的长或宽，或高。当室具有圆形的横截面时，内部尺寸是指横截面的直径，或高。
在其中一个实施方案中，本发明的电穿孔室可被改变成使该室可容纳植物种子的大小。室的大小可通过任何方式改变。例如，室的大小可利用螺钉等来调节至适宜的尺寸。
本发明的电穿孔室可由任何材料制成。电穿孔室的材料可以是形成固体的任何材料。这种材料的例子包括，但不限于，玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金属(包括合金)、天然及合成的聚合物(例如，聚苯乙烯、纤维素、脱乙酰壳聚糖、葡聚糖、和尼龙等)等。该室可由不同材料制成的层构成。例如，可使用无机绝缘材料，如玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、氧化硅、碳化硅、氮化硅等。可使用有机材料，如聚酰胺、聚碳酸酯、(变性)聚苯醚、聚对苯二甲酸丁二醇酯、增强的聚对苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亚胺、聚醚醚酮、聚酰亚胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、不饱和聚酯、氟树脂、聚氯乙烯、聚偏1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸类树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、酚树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、有机硅树脂、聚砜等。此外，优选，本发明的电穿孔室能够抵抗不同于大气压的压力(例如，甚至在将不同于大气压的压力施加于该室时，该室不会破碎、断裂、或变形)。特别优选，该室能够抵抗减压。特别优选，本发明的电穿孔室是由聚丙烯、有机硅树脂、和玻璃制成的，且提供有铂或不锈钢制成的电极。
优选，本发明的电穿孔室提供有温度控制部分。例如，温度控制部分可使用传感器检测温度的变化，并可人工或自动控制室的温度。温度控制部分通常是用于降低室温度的冷却部分。冷却部分可以是利用，例如，冰、冷却凝胶等的任何装置。
本发明的电穿孔室提供有至少一对(两个)电极。因此，在特定实施方案中，本发明的室可提供有多于一对(两个)的电极(例如，两对(四个)电极、三对(六个)电极、四对(八个)电极、五对(十个)电极、或多于五对电极)。例如，在室具有四边形横截面的情况下，如果电极是沿着每个相对的内侧壁提供的，则可将两对(四个)电极与该室连接。此外，在室具有六边形横截面的情况下，如果电极是沿着每个相对的内侧壁提供的，则可将三对(六个)电极与该室连接。因此，本发明的室中可提供任意对数的电极。且，电极具有任意的空间位置关系。
本发明电穿孔室中所提供电极之间的距离可具有任何长度，而且可根据进行核酸转移的细胞和/或组织的大小而改变。特别优选，电极之间的距离足以容纳植物组织(例如，植物种子)。电极之间足以容纳植物种子的距离可以是，例如，至少约5mm或更多，优选至少约6mm或更多，优选至少约7mm或更多，优选至少约8mm或更多，优选至少约9mm或更多，优选至少约1cm或更多，优选至少约2cm或更多，优选至少约3cm或更多，优选至少约4cm或更多，优选至少约5cm或更多，优选至少约6cm或更多，优选至少约7cm或更多，优选至少约8cm或更多，优选至少约9cm或更多，优选至少约10cm或更多，优选至少约15cm或更多，优选至少约20cm或更多。电极之间距离的上限可以是，但不限于，例如，约25cm、约20cm、约15cm、约10cm、约9cm、约8cm、约7cm、约6cm、约5cm、约4cm、约3cm、约2cm、约1cm、约9mm、约8mm、约7mm、或约6mm。长度可以是这些确切描述值间的中间值(例如，1.5cm等)。
在其中一个实施方案中，电极之间的距离可被改变，从而使植物种子可容纳于电极之间。电极之间的距离可通过任何方式改变。例如，可利用螺钉等将电极之间的距离调节至适宜距离。
电极可由任何材料制成，只要该材料具有导电的能力。电极材料的例子包括，但不限于，例如，铂金、金、不锈钢、碳、和导电聚合物。特别优选电极是由铂制成的。
举例性的电穿孔室是长1cm×宽2cm×高2cm的直角平行六面体形，并提供有铂电极，其中铂电极之间的距离是约1cm。该电穿孔室特别用于具有中间大小(约5-15mm)的植物种子(例如，小麦、稻、玉米等)。使用该室，可同时处理许多(例如，约10-30粒)中间大小的植物种子。
另一举例性电穿孔室为内径1cm×高4cm的微管形，并提供有不锈钢电极，其中不锈钢电极之间的距离是约1cm。这种微管形室可很容易通过使用粘合剂等将不锈钢箔(例如，约5×40mm(厚度：约0.1mm))与商业购得的微管连接而生产。该微管形室可经受离心，从而使细胞、组织和/或种子沉淀在室底部。因此，很容易进行溶液的更换。当处理较小(约0.1-5mm时)的植物种子(例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)等)时，这种微管形室特别有用。使用该室，可同时处理很多较小的植物种子。
这里所用的“将细胞/组织(包括植物组织)保持在不同于大气压的压力下”是指将细胞/组织(包括植物组织)保持在较之大气压(通常，1个大气压＝101.325kPa＝约0.1MPa)更高(增压)或更低(减压)的压力下的步骤。
尽管不希望受到任何理论的束缚，但认为通过将细胞/组织(包括植物组织)保持在不同于大气压的压力下，可改变施加于细胞/组织上的周围气压，从而使含有核酸，如DNA等的缓冲溶液渗透到组织或细胞之间的腔内；且因此，它可通过电穿孔经过核酸转移/转化，进入到具有细胞壁的细胞和组织(特别是，植物细胞和植物组织)中，而这通常被认为是不可能的。
这里所用术语“减压”是指将细胞/组织(包括植物组织(例如，种子))保持在低于大气压的压力下进行核酸转移/转化的步骤。在本发明中，可以，但不限于，在比大气压低0.02MPa的压力下，优选在比大气压低0.04MPa的压力下，更优选在比大气压低0.06MPa的压力下，更优选在比大气压低0.08MPa的压力下，最优选在比大气压低0.096MPa的压力下进行减压。减压的运行时间是，但不限于，1分钟-120分钟，优选10分钟-100分钟，更优选15分钟-90分钟，更优选30-70分钟，最优选约60分钟。
这里所用术语“增压”是指将细胞/组织(包括植物组织(例如，种子))保持在比大气压更高的压力下进行核酸转移/转化的步骤。
按照本发明其中一个方面，提供一种电穿孔装置。本发明的电穿孔装置可以明显较高的效率将核酸转移到任何细胞或组织中，且特别用于将核酸转移到具有细胞壁的细胞或组织(例如，植物细胞或植物组织)中，而这通常是利用电穿孔进行核酸转移所不能进行的。在其中一个实施方案中，本发明的电穿孔装置包括a)用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分和b)电穿孔部分。
用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分可以是能够进行减压和/或增压的任何装置。还可利用商业购得的减压装置(例如，真空干燥器等)和/或增压装置。任何电穿孔装置都可使用。可利用商业购得的电穿孔装置(例如，CUY21EDIT基因转移装置，Nepagene，Ichikawa-shi，Chiba-ken，日本)。优选如上所述，电穿孔部分中提供的两个电极(第一电极和第二电极)之间的距离足以容纳植物种子。
在本发明另一实施方案中，提供一种包括两个电极的电穿孔装置，其中两个电极之间的距离足以容纳植物种子。电穿孔装置可与将细胞/组织保持在不同于大气压的压力下的装置结合使用。在本实施方案中，电穿孔装置和将细胞/组织保持在不同于大气压的压力下的装置并非必需存在与同一室内。
常规的电穿孔装置目的在于将高压脉冲施加于非常小的细胞上。因此，室的内壁和电极之间的距离需要被尽可能地减到最小。因此，室的内部尺寸和常规电穿孔装置中电极之间的距离通常为约1mm或2mm，或至多4mm。因此，这里提出的、包括具有足以容纳植物种子的空间的室和其间距离足以容纳植物种子的电极的电穿孔装置迄今为止还是未知的。
此外，本发明的电穿孔装置还可以是自动运转的。在本发明的自动电穿孔装置中，缓冲溶液等的注入和/或更换可由自动分液机进行。作为自动分液机，例如，可使用商业购得的epMotion5070工作站(Eppendorf Co.，Ltd.，Higashi-Kanda 3，Chiyoda-ku，Tokyo，日本)等。自动分液机不限于此。特别是，自动分液机可被有利用作容器中放置核酸和/或细胞的部分，该容器用于放置含有核酸及细胞的混合物。
用于放置含核酸及细胞的混合物的第一容器、用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的第二容器、以及用于向含核酸及细胞的混合物施加高压脉冲的第三容器可以是任何容器。这些容器彼此可以相同或不同。这些容器的材料可以是能够形成固体的任何材料。这种材料的例子包括，但不限于，玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金属(包括合金)、天然及合成的聚合物(例如，聚苯乙烯、纤维素、脱乙酰壳聚糖、葡聚糖、和尼龙等)等。该容器可由不同材料制成的层构成。例如，可使用无机绝缘材料，如玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、氧化硅、碳化硅、氮化硅等。可使用有机材料，如聚酰胺、聚碳酸酯、(变性)聚苯醚、聚对苯二甲酸丁二醇酯、增强的聚对苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亚胺、聚醚醚酮、聚酰亚胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、不饱和聚酯、氟树脂、聚氯乙烯、聚偏1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸类树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、酚树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、有机硅树脂、聚砜等。
优选，本发明的第一容器是由高度透明且有利于观察样品的材料(例如，聚苯乙烯)生产的。优选，本发明的第二容器是由能够抵抗不同于大气压的压力(特别是，减压)的材料(例如，聚酰胺、聚碳酸酯、(变性)聚苯醚、聚对苯二甲酸丁二醇酯、增强的聚对苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亚胺、聚醚醚酮、聚酰亚胺、和环氧树脂)生产的，且更优选是由高度透明且有利于观察样品的材料(如丙烯酸类树脂)生产的。优选，本发明的第三容器是由对细胞具有亲和性的材料(例如，聚丙烯、有机硅树脂、和玻璃)生产的，并提供有铂、金、不锈钢、碳、或导电聚合物制成的电极。这些材料还可用任何适宜的材料覆盖，从而提供所需性质(例如，容器的绝缘，提高电极的导电性等)。
此外，优选，本发明的第一和第二容器能够抵抗不同于大气压的压力。特别优选，本发明的第一和第二容器能够抵抗减压。例如，第一容器可安装在第二和/或第三容器中。可选择性地，含有核酸及细胞的混合物是从第一容器注入到第二容器(或安装在其中的另一容器)和/或第三容器(或安装在其中的另一容器)中的。
作为将细胞放在第二容器中的部分以及将含有核酸及细胞的混合物放在第三容器中的部分，可有利地使用皮带运输机。本发明不限于此。可使用任何装置。在第一容器、第二容器、和第三容器中放置的液体可通过利用自动泵等吸出/排出而除去。
本发明的自动电穿孔装置包括用于使各种操作装置自动化的控制装置。本发明的电穿孔装置包括电源装置。控制装置和电源装置可安装在包括电穿孔装置的同一室内，或可与电穿孔装置隔开而且可与电穿孔装置相连。
当种子进行电穿孔时，优选在减压或增压前将种子浸在水(例如，自来水)中。处理前将种子浸在水中的时间为，但不限于，6h-48h，优选12h-36h，更优选18h-30h，甚至更优选20h-26h，最优选24h。
本发明用于核酸转移的举例性条件如下所述。将种子浸在自来水中，25℃过夜。第二天，将种子放在真空装置中，接着在比大气压低0.096MPa的压力下进行减压。之后，将高压脉冲(100V、50μsec、电极之间的距离：1cm)施加于通过减压进行电穿孔处理，即，核酸转移/基因转移的种子上约50次。电压和脉冲的次数可根据农作物而改变。进行电穿孔的条件可由本领域那些技术人员根据需要适当选择。之后，在含有抗生素的培养基中筛选细胞或组织，接着，装入盆中(在盆中栽培)，由此可获得标准的全株植物。
这里所用术语“植物”是包括属于植物界的生物的通称，其特征在于含有叶绿体、具有刚性细胞壁、永久产生丰富的胚组织，且没有移动的能力。例如，在“Genshoku Makino Shokubutsu Daizukan[Unabridged Makino′s Original Color Illustrated Reference Book ofPlants]，Hokuryukan(1982)，日本)等中将植物分类。其中所述的所有植物都可用于本发明。代表性地，植物是指形成细胞壁并通过叶绿体进行合成代谢的开花植物。“植物”包括任何单子叶和双子叶植物。单子叶植物的例子包括禾本科植物。优选的单子叶植物的例子包括，但不限于，玉米、小麦、稻、燕麦、大麦、高梁、黑麦、和小米，更优选玉米、小麦和稻。小麦的例子包括小麦变种Norin 61，其很难通过常规方法转化。双子叶植物的例子包括，但不限于十字花科、豆科、茄科、葫芦科和旋花科的植物。十字花科植物的例子包括，但不限于，大白菜、油菜、卷心菜、和花椰菜。优选的十字花科植物是大白菜和油菜。特别优选的十字花科植物是油菜。豆科植物的例子包括，但不限于，大豆、红豆、菜豆、和豇豆。优选的豆科植物是大豆。茄科植物的例子包括，但不限于，番茄、茄子、和马铃薯。优选的茄科植物是番茄。葫芦科植物的例子包括，但不限于，日本香瓜、黄瓜、甜瓜和西瓜。优选的葫芦科植物是日本香瓜。旋花科植物的例子包括，但不限于，牵牛花、甘薯、和bellbind。优选的旋花科植物是牵牛花。除非特别说明，植物是指任何全株植物、植物器官、植物组织、植物细胞和种子。植物器官的例子包括根、叶、茎、花等。植物细胞的例子包括愈伤组织及培养细胞的悬浮液。在特定实施方案中，植物是指全株植物。
在本发明另一实施方案中，例如，可使用茄科、禾本科、十字花科、蔷薇科(Rosaceae)、豆科、葫芦科、唇形科(Lamiacea)、百合科(Liliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、伞形科(Umbelliferae)、旋花科、菊科(Compositae)等的植物。本发明所用植物物种的例子包括任何树种，果树物种、桑科(Moraceae)植物(例如，橡树)、和锦葵科(Malvaceae)植物(例如，棉花)。
在本发明的简单方法中，植物组织(包括休眠组织(包括成熟种子、未成熟种子、冬芽、和块茎)、种质、生长点、和花芽)进行电穿孔。在最简单的方法中，种子进行电穿孔。通过将已经用本发明的电穿孔方法将核酸转移到其中的种子直接种在土壤中进行种植，该种子可很容易发育成核酸转移物质/转化体。种子通常是由3部分组成的，即，胚、胚乳、和种皮(Yakichi Noguchi and Shinichiro Kawata，supervisors，Nogaku-Daijiten[Unabridged Dictionary ofAgriculture]，Yokendo(1987)，p.896(由Hideo Chizaka准备的相应部分))。胚包括植物的所有基因信息，并生长成全株植物。所有单子叶植物和所有双子叶植物都有胚。当通过本发明的电穿孔方法进行核酸转移时，经证实所引入的核酸在胚中表达。因此，本发明的最简单方法可用于在任何具有包括胚的种子的植物中很容易获得核酸转移的全株植物/转化体。
十字花科植物的例子包括萝卜属(Raphanus)、芥属(Brassica)、拟南芥属、Wasabia、和荠属(Capsella)的植物。具体的例子包括日本白萝卜、油菜籽、拟南芥、日本辣根、和荠菜。
禾本科植物的例子包括稻属(Oryza)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)和玉米属(Zea)的植物。具体的例子包括稻、大麦、黑麦、甘蔗、高粱、和玉米。
这里所用的术语“动物”共同指动物界(Aminalia)的生物，它们需要氧气和有机食品，而且在移动能力方面不同于植物和矿物。动物分为脊椎动物和无脊椎动物。作为脊椎动物，可使用盲鳗目(Myxiniformes)、七鳃鳗目(Petromyzontiformes)、软骨鱼纲(Chondrichthyes)、硬骨鱼纲(Osteichthyes)、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物等。更优选，可使用哺乳动物(例如，单孔目(Monotremate)、有袋目(Marsupialia)、贫齿目(Edentata)、皮翼目(Dermoptera)、翼手目(Chiroptera)、食肉目(Carnivore)、食虫目(Insectivore)、长鼻目(Proboscidea)、奇蹄目(Perissodactyla)、偶蹄目(Artiodactyla)、管齿目(Tubulidentata)、鳞甲目(Pholidota)、海牛目(Sirenia)、鲸目(Cetacean)、灵长目(Primates)、啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)等)。甚至更优选使用灵长目(例如，黑猩猩、日本猕猴、人)。最优选，使用来源于人的细胞或器官。作为无脊椎动物，可使用甲壳纲(Crustacea)、倍足纲(Diplopoda)、烛蛱纲(Pauropoda)、唇足纲(Chilopoda)、综合纲(Symphyla)、昆虫纲(Insecta)等。更优选，使用昆虫(例如，鳞翅目(Lepidoptera)，包括蚕(Bombyx mori Linnaeus)等)。
这里所用术语“转基因生物”是指其中掺入特定基因的生物；术语“转基因植物”是指其中掺入特定基因的植物；术语“转基因动物”是指其中掺入特定基因的动物。
已经通过本发明方法经过核酸转移/转化的细胞和组织可利用本领域任何已知的方法分化、生长、和/或增殖。在植物物种中，使细胞或组织分化、生长、和/或增殖的步骤可通过，例如，培养植物细胞或植物组织或包括细胞或组织的全株植物而实现。植物在这里可通过本领域任何已知的方法培育。培育植物的方法在，例如“Moderu shokubutsuno Jikken Purotokoru，Ine Shiroinunazuna：Saibo kogaku BessatsuShokubutsu Saibo Kogaku Sirizu 4；Ine no Saibaiho[ExperimentalProtocol for Model Plants For Rice and Arabidopsis thaliana：CellularEngineering，Special Issue，Plant Cellular Engineering Series 4；RiceCultivating Methods]”(Kazutoshi Okuno)pp.28-32，和“Shiroinunazuna no saibaiho[Cultivating Methods forArabidopsis]”(Yasuo Niwa)pp.33-40(Supervised by Ko Shimamotoand Kiyotaka Okada)中举例说明，且本领域那些技术人员可很容易地进行。因此，这些方法没有在这里详细描述。例如，拟南芥可通过土壤培养、岩棉(rockwol)培养、或水培法培养来培育。当撒播拟南芥的种子并在连续光照条件(冷白色荧光管(约6000lux))下培育时，第一朵花在播种后约4周长出，种子在开花后约16天成熟。一个种子罐包含约40-50个种子。在播种后约2-3个月植物死亡前，可获得大约10,000个种子。在小麦的培育中，例如，已知除非小麦种子暴露于低温下并在播种后接受短日照处理，否则植物不会抽穗和开花。因此，例如，当在人工环境(例如，温室或生长室)下培育小麦时，必需使小麦植株在早期发育阶段经过低温和短日照处理(例如，光照期：20℃，8小时(约2000lux)，黑暗期：8℃，16小时等)。这种处理被称作春化。每种植物所需的培育条件通常是本领域已知的，因此，无需在这里详细描述。
在除了植物之外的物种(例如，动物物种)中，通过本发明方法经过核酸转移/转化的细胞和组织可利用本领域任何已知的方法分化、生长、和/或增殖(见，例如，Yoshiharu Izumi等人，eds.，“SeibutsuKagaku Jikken no Tebiki 4.Dobutsu Soshiki Jikkenho[Guidelines for Biochemical Experiments 4.Experimental Protocol forAnimal Tissue]，Kagaku Dojin，1987，等)。例如，已经通过电穿孔向其中转移核酸的细胞和/或组织可在室温(约25℃)下用商业购得的饲料使其生长。
如这里所用的，所转移的基因是多核苷酸形成的。
这里所用术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸”具有相同的含义，是指任何长度的核苷酸的聚合物。这些术语还包括“衍生的寡核苷酸”或“衍生的多核苷酸”。术语“衍生的寡核苷酸”和“衍生的多核苷酸”可互换用于指含有核苷酸衍生物或核苷酸之间所具有的键不同于正常键的寡核苷酸或多核苷酸。具体而言，这种寡核苷酸的例子包括2′-O-甲基-核糖核苷酸、其中的磷酸二酯键转化成硫代磷酸酯键的衍生寡核苷酸、其中的磷酸二酯键转化成N3′-P5′氨基磷酸酯键的衍生寡核苷酸、其中的核糖及磷酸二酯键转化成肽核酸键的衍生寡核苷酸、其中的尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的胞嘧啶被吩噁嗪修饰的胞嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的核糖被2′-O-丙基核糖取代的衍生寡核苷酸、和其中的核糖被2′-甲氧基乙氧基核糖取代的衍生寡核苷酸。除非另有说明，特定的核酸序列还暗含包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)及其互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子置换可通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列而实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.，19：5081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，260：2605-2608，1985；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，8：91-98，1994)。在这里术语“核酸”与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”、和“多核苷酸”互换使用。具体的核酸序列还暗含包括“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白暗含包括由该核酸剪接变体编码的任何蛋白。“剪接变体”，就像它名称所暗示的那样，是基因的选择性剪接产物。转录后，原始的核酸转录物可被剪接，这样不同(可变)的核酸剪接产物编码不同的多肽。用于生产剪接变体的机理可改变，但包括外显子的可变剪接。通过连读转录从同一核酸衍生的可变多肽也包括在该定义内。剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式也包括在该定义中。
这里所用“基因”是指确定遗传性状的因子。基因通常以预定的顺序排列在染色体上。确定蛋白一级结构的基因被称作结构基因。控制结构基因表达的基因被称作调节基因。这里所用“基因”还指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、及“核酸”。这里所用的基因“同源性”是指两个或多个基因序列之间的同一性程度。因此，两个基因之间的同源性越大，它们序列之间的同一性或相似性就越大。两个基因是否具有同源性是通过直接比较它们的序列或在核酸的情况下，通过严格条件下的杂交方法而确定的。当直接互相比较两个基因序列时，如果基因的DNA序列彼此通常具有至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，则基因具有同源性。
碱基序列之间同一性的比较和碱基序列之间同源性的计算在这里是使用具有缺省参数的序列分析工具BLAST计算的。
这里所用的基因、多核苷酸、多肽等的“表达”表示基因等在体内经过某些作用并转化成其它形式。优选，基因、多核苷酸等经过转录并翻译成多肽形式，然而，mRNA通过转录的产生可以是表达的体现。更优选，这种多肽的形式可通过翻译后的加工获得。
这里所用“核苷酸”可天然存在或非天然存在。“衍生核苷酸”或“核苷酸类似物”是指不同于天然存在的核苷酸，但具有与天然存在的核苷酸相似的功能的核苷酸。这种衍生核苷酸及核苷酸类似物是本领域熟知的。这种衍生核苷酸及核苷酸类似物的例子包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基-膦酸酯、手性甲基-膦酸酯、2-O-甲基-核糖核苷酸、及肽核酸(PNA)。
这里所用术语“片段”是指相对于全长多肽或多核苷酸(其长度为n)而言具有1-n-1序列长度的多肽或多核苷酸.根据目的不同，可适当改变片段的长度。例如，多肽长度的下限是，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50和更多氨基酸。其没有在这里明确举例说明的整数(例如，11等)也可适当作为下限。多核苷酸的下限是，例如，5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100和更多核苷酸。其没有在这里明确举例说明的整数(例如，11等)也可适当作为下限。
本发明中所用的一般分子生物学技术可通过参考Ausubel F.A.等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，New York，NY，1988；Sambrook J.等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1987等，由本领域那些技术人员很容易地进行。
在这里讨论基因时，“载体”是指能够将目标多核苷酸序列引入到靶细胞中的载体。这种载体包括能够在宿主细胞，如原核生物细胞、酵母细胞、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、个体动物和植物，优选植物细胞中自我复制，或被掺入到其染色体中，并具有位于适合本发明多核苷酸转录的位点处的启动子的载体。
这里所用术语“表达载体”是指含有结构基因和用于调节其表达的启动子的核酸序列，以及此外处于允许它们在宿主细胞内活动的状态的各种调节元件。调节元件可优选包括终止子、选择标记如药物-抗性基因、和增强子。本领域那些技术人员熟知生物(例如，植物)表达载体的类型和调节元件的类型可根据宿主细胞而改变。用于筛选的选择标记的例子包括，但不限于，药物-抗性基因，如编码产生对抗生素卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶的neo基因(Beck等，Gene，19：327，1982)；编码产生对抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶的hyg基因(Gritz和Davies，Gene，25：179，1983)；和编码产生对除草剂膦丝菌素抗性的膦丝菌素乙酰基转移酶的基因(EP 242236)；编码链霉素磷酸转移酶的spt基因；链霉素抗性基因；和壮观霉素抗性基因(例如，H.S.Chawla，Introduction to Plant Biotechnology 2nd：363，SciencePublishers，Inc.，hard cover，2002)；和选择标记基因，如编码β-葡糖醛酸糖苷酶的GUS基因(Jefferson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，6：3901，1986)、萤光素酶基因(Ow等人，Science，234：856，1986)、和GFP(绿色荧光蛋白)编码基因(例如，从Funakoshi Co.，Ltd.，Hongo，Bunkyo-ku，Tokyo，日本购得)。
用于本发明筛选的制剂的例子包括，但不限于，卡那霉素、潮霉素、遗传霉素、庆大霉素、链霉素和壮观霉素。
“重组载体”是指可将目标多核苷酸序列转移到靶细胞的载体。这种载体的例子包括能够自我复制或能够被掺入到宿主细胞(例如，植物细胞和全株植物)内的染色体中的载体，并包括位于适合本发明多核苷酸转录位点的启动子。
植物细胞“重组载体”的例子包括Ti质粒、烟草花叶病病毒(tobaccomosaic virus)载体、和双生病毒(Gemini virus)载体。
“终止子”是位于基因的蛋白-编码区下游，并在DNA被转录到mRNA中时，参与转录终止以及聚腺苷酸序列加成的序列。已知终止子有助于mRNA的稳定性，并对基因表达量产生影响。这种终止子的例子包括，但不限于，CaMV35S终止子、胭脂氨酸合酶基因的终止子(Tnos)、和烟草PR1a基因的终止子。这里所用的“启动子”是确定基因转录起始位点的碱基序列，且是直接调节转录频率的DNA区。转录是由与启动子结合的RNA聚合酶启动的。启动子区通常位于推定蛋白编码区的第一个外显子上游约2kbp内。因此，可通过使用DNA分析软件预测基因组碱基序列中的蛋白编码区而估计启动子区。推定启动子区通常位于结构基因的上游。优选，推定启动子区位于第一个外显子的翻译起始位点上游的约2kbp内。
当在本说明书中提到基因表达时，“位点特异性”通常是指基因相对于生物(例如，植物)内位点(例如，在植物的情况下；根、茎、干、叶、花、种子、胚芽、胚、果实等)的表达特异性。“时间特异性”是指基因相对于生物(例如，植物)发育阶段(例如，在植物的情况下，生长阶段，和发芽后的天数)的表达特异性。这种特异性可使用适当选择的启动子被引入到所需生物中。
这里相对于本发明启动子表达所用的术语“组成型”是指启动子的特征，即启动子以基本恒定的量在生物的所有组织中表达，而不管生物的生长阶段是幼年阶段还是成熟阶段。具体而言，当在与本说明书实施例中描述的那些相同的条件下进行RNA印迹分析时，按照本发明的定义，例如，如果在任何时间(例如，两个或多个时间点(例如，第5天和第15天))的相同或相应位点观察到基本相同量的表达，则表达被认为是组成型的。组成型启动子被认为在正常生长环境中维持生物的内环境稳定方面发挥作用。这里相对于启动子表达所用的启动子表达的“应激反应”是指启动子的特征，即当生物经过至少一次应激时，启动子的表达量发生改变。特别是，增加表达量的特征被称作“应激诱导型”。减少表达量的特征被称作“应激抑制型”。“应激抑制型”表达是以在正常情况下观察表达作为前提的。因此，这个概念与“组成型”表达重叠。这些特征可通过提取生物任何部分的RNA并通过RNA印迹分析RNA表达量或通过蛋白质印迹测定表达蛋白的量而测定。当用含有应激诱导型启动子及编码目标多肽的核酸的载体转化植物或其一部分(特别是细胞/组织等)时，具有诱导启动子活性的刺激物可用于引起特定的基因在预定条件下表达。
这里所用术语“增强子”是指用于提高目标基因表达效率的序列。作为用于植物中的增强子，含有在CaMV35S启动子内上游序列的增强子区是优选的。可使用一个或多个增强子，或不使用增强子。
这里所用术语“可操纵连接”表示所需序列位于其表达(操纵)处于转录和翻译调节序列(例如，启动子、增强子等)控制下的位置。为了使启动子与基因可操纵连接，通常，启动子直接位于基因的上游。然而，间插序列可存在于启动子和结构基因之间，因此启动子无需与结构基因邻接。
引入基因的存在可通过DNA印迹或PCR加以证实。引入基因的转录还可通过RNA印迹或PCR检测。如果需要，蛋白，其是基因产物，的表达可通过，例如，蛋白质印迹加以证实。
在下文中，将通过实施例描述本发明。下面的实施例仅用于举例说明的目的。因此，本发明的范围不限于上述说明或下面的实施例，除了通过附加的权利要求来限定之外。
                          实施例
(方法和材料)
(1)转移基因
在本发明中，主要使用含有抗生素抗性基因和/或GUS基因的质粒DNA。本发明不限于此。在下面的实施例中，使用下列3种质粒。pBI221(Clontech)含有花椰菜花叶病毒(Cauflower mosaic virus)(CMV)的35S启动子，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，和胭脂氨酸合酶基因(NOS)的终止子。该质粒主要以GUS活性为基础用于监控基因的转移。pWI-H5K(其限制性酶切图在图1中表示)是通过除去pWI-GUS中的GUS基因(Masashi Ugaki等，Nucleic Acids Res.，19：371-377，1991)并向其中插入NPT II基因而构造的。pWI-H5K含有hpt(潮霉素抗性基因)，CMV的终止子，NPT II(卡那霉素和庆大霉素抗性基因)，和CMV的35S启动子和终止子。pBC1已经由CornelUniversity(美国)的Fromm博士(现在，Fromm博士属于Monsanto公司)研究。pBC1含玉米乙醇脱氢酶基因的启动子和内含子的一部分，GUS基因，NOS的终止子，CMV的35S启动子，和hpt(潮霉素抗性基因)，NOS的终止子(Hagio等，Plant Cell Rep.，14：329-334，1995)。作为质粒DNA，可使用pWI-GUS质粒中的GUS基因被GFP(绿色荧光蛋白)基因取代的质粒，pigA3GFP质粒(Tamura，Journal ofSericultural Science of Japan，69：1-12，2000)等。
(2)种子的预处理(第1天)
实施例中所用的种于是由本发明人生产的或从种子和幼苗公司购买的。通过目测(大小不同)选择约10-30粒适宜的成熟种子，并浸在自来水中25℃过夜，使种子吸水。优选，吸水所用的自来水含有用于防止各种细菌增殖的次氯酸钠水溶液(调节至约0.01％的有效氯浓度)。在生产小麦转化体目的的实验中，优选吸水是在10℃下进行2个晚上。
(3)电穿孔装置
本发明所用的电穿孔装置可以是商业购得的电穿孔装置(例如，CUY21EDIT基因转移装置，Nepagene Co.，Ltd.，Ichikawa-shi，Chiba-ken，日本)。
在本实施例中，用于进行电穿孔的电穿孔室可以是具有任何大小的电穿孔室，这样它就可容纳被转化的植物组织。优选是能够被冷却的室。在本实施例中，使用具有铂电极和长1cm×宽2cm×高2cm尺寸的电穿孔室。
(4)缓冲溶液的制备(第2天)
在每个实验中，使用1.5ml或更少的缓冲溶液和150μg的质粒DNA。所述缓冲溶液是由250mM氯化钙、12.5mM亚精胺、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、和0.3％Tween 20组成的。
(5)减压
将缓冲溶液和已经开始发芽的种子放在直径35mm×深10mm的培养皿中，接着使用低于大气压0.096MPa或0.06MPa的压力减压1小时。
(6)电穿孔
减压后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中，室依次在冰上维持1分钟。之后，将具有50μsec脉冲宽度的100V或50V脉冲电压(即，矩形电波，其中施加电压50μsec，然后停止施加电压75μsec，重复该循环)施加于电极之间，电极之间的距离为1cm。脉冲次数是50或99。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，除去缓冲溶液，并将种子放回到原始培养皿中。将2ml 0.5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液倾注在包含种子的培养皿中。所述PVP水溶液含有次氯酸钠水溶液，其被调节至约0.01％的有效氯浓度，用于防止各种细菌增殖。
将培养皿在4℃下保存约1小时，并在25℃维持过夜。
(7)种子的后处理(第3天)
在接下来的一天，除去缓冲溶液，并向培养皿中加入2ml新的具有相同组成的缓冲溶液。使培养皿在25℃下维持过夜。
(8)GUS分析(第4天)
在接下来的一天，除去缓冲溶液，向培养皿中加入2ml X-Gluc溶液(100mM磷酸缓冲溶液，pH7.0，0.05％X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸环己基铵盐)、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.3％Triton X-100、20％甲醇)。使培养皿在25℃维持过夜。GUS基因的表达是在第5天和之后通过染色加以证实的。
(9)使用含抗生素的培养基筛选(第4天和之后)
种子是如下生长的，没有进行GUS分析。
a)将种子转移到9cm×15mm的培养皿中，其中已经铺了一片滤纸。
b)将10ml含有抗生素的蒸馏水溶液加入到培养皿中。当用遗传霉素筛选小麦种子时，其浓度为2000rpm或1200ppm。当用遗传霉素筛选稻的种子时，其浓度为200ppm。
c)种子是下列条件下，在培养室中生长的：(光照期：25℃，16h，约2000lux；黑暗期：25℃，8h)或(光照期：20℃，8h，约2000lux；黑暗期：8℃，16h)。
(10)转化体的生长(第11天和之后)
用含抗生素的培养基筛选后，将植物种在直径8.5cm×高5.5cm、含有园艺土的罐(花盆)中(New Magic Soil；Sakata Seed Corporation，Tsuzuki-ku，Yokohama-shi，日本)，它们在单独的生长室中生长，条件如下：(光照期：15℃，8h，约5000lux(钠灯)；黑暗期：15℃，16h)或(光照期：20℃，8h，约2000lux；黑暗期：8℃，16h)。
(11)DNA提取
基因转移是使用如下PCR加以证实的。收集转化植物的叶和茎，并提取叶和茎的DNA。DNA提取可通过任何熟知的技术进行。一般的DNA提取技术是CTAB技术(Hirofumi Uchimiya，“ShokubutsuIdenshi Sosa Manyuaru Toransugenikku Shokubutsu noTsukurikata[Manual of Plant Genetic Engineering；How To ProduceTransgenic Plants]”，Kodansha Scientific，pp.71-74，hardcover，1989)。
(12)PCR分析
电穿孔后，在第14天提取各植物叶子的DNA。在PCR中使用一对引物(5’-ctgcgtgcaatccatcttg-3’(SEQ ID NO.1)，5’-actcgtcaagaaggcgatagaag-3’(SEQ ID NO.2))检测NPT II基因。还可使用另一对引物(5’-catgattgaacaagatggattgcacgcaggttctc-3’(SEQ IDNO.3)，5’-cagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgat-3’(SEQ ID NO.4))。这种引物对可更优选以更特异的方式用于检测NPT II基因。作为聚合酶，按照制造商的说明(Perkin Elmer Japan Co.，Ltd.(Nishi-ku，Yokohama-shi，日本)使用AmpliTaqGold(注册商标)。用于扩增的热循环是在下列设置下使用的：
(a)95℃10分钟(循环1次)；
(b)95℃1分钟，64℃2分钟和72℃2分钟(循环50次)；
(c)72℃7分钟(循环1次)；和
(d)在4℃下保存。
(13)DNA印迹分析
电穿孔后，对来源于各植物的DNA进行DNA印迹分析，所述植物已经通过(12)中的PCR分析被证实具有引入基因。DNA印迹是本领域熟知的，因此其条件可由本领域那些技术人员根据需要适当选择。在DNA印迹分析中，使用对引入的NPT II基因特异的序列(如序列表中SEQ ID NO.5所示)作为探针。
(14)遗传分析
通过DNA印迹分析证实具有引入基因的植物进一步生长，接着自花授粉。结果，获得很多成熟的种子。在这些种子之中，随机选择约10粒种子，并在含土壤的罐中培育。提取幼株叶子的DNA。将所述DNA用作模板在(12)所述的条件下进行PCR。
(实施例1)
(小麦的转化)
对小麦(变种：Norin 61)的成熟种子进行实验。使种子吸水，在25℃下过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子以及pWI-GUS(用于GUS分析)或pWI-H5K(用于生长)的质粒DNA(200μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。在低于大气压0.096MPa的压力下减压1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。基因表达水平是使用GUS活性作为指数测定的。结果在下面表1中表示。
                        表1
    电压(V/cm)     基因表达水平 备注
    0     -
    10     -
    20     -
    50     ±
    75     ±
    100     +
    150     - 种子变成褐色或死亡
    200     - 种子变成褐色或死亡
按照上述结果，可了解到当施加100V电压时，可进行具有最高效率的转化(注意：电极之间的距离为1cm)。
类似的结果在图2中表示。图2表示在下列条件下进行电穿孔的结果：脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50，压力为低于大气压0.096MPa(减压)，且所施加的电压为100V(A)、50V(B)、20V(C)、或0V(D)。当所施加的电压为100V时，转化效率最高。
图3表示1：在(电压：100V，脉冲宽度：50μsec，脉冲次数：50；压力：低于大气压0.096MPa(减压))的条件下经过转化的小麦种子；2：在(电压：100V，脉冲宽度：50μsec，脉冲次数：50；没有减压)的条件下只经过电穿孔的小麦种子；和3：对照小麦种子的照片。从图3可以看出，只有当减压与电穿孔结合时，才能获得转化。
用于生长的种子没有经过GUS活性实验，且减压后，使种子在含有2000ppm遗传霉素的蒸馏水中生长(如(7)种子的后处理，(9)使用含抗生素的培养基筛选，和(10)转化体的生长中所述)。结果在图4中表示。提取幼苗中的DNA，接着进行PCR，以便证实引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析所述)。
SEQ ID NO.1和2用于进行PCR。结果，证实了NPT II基因被引入到全株植物中。
上述实验的再现性是通过以基本相同的方式重复实验而研究的。结果，获得基本相同的结果。该重复实验具体过程的详述在下面描述。开始，将一片7cm直径的滤纸放在90×15mm的培养皿中。将150粒小麦Norin 61的种子放在滤纸上。将10ml水加入到培养皿中，其依次被放置在黑暗的地方，10℃下共2天，使种子吸水。所加入的水含有用于防止各种细菌增殖的次氯酸钠溶液(调节至约0.01％的有效氯浓度)。在第2天，幼根和幼芽顶破种皮。因此，证实了种子已经开始发芽。在此第2天，用自来水充分洗涤种子。洗涤之后立即进行本发明的核酸转移处理。将2ml含有30粒小麦种子和pWI-H5KDNA(200μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中，其依次在冰上维持1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离为1cm；脉冲宽度为50μsec；脉冲次数为50。将该室在冰上再维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。在4℃下保存培养皿约1小时，并在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液，并将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。该过程总共进行5次，这样总共150个小麦种子经过本发明的核酸转移处理。
接下来，将10ml 0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液作为防止变成褐色的试剂放在90×15-mm培养皿中。将经过核酸转移处理的小麦种子放在培养皿中。所述PVP水溶液含有用于防止各种细菌增殖的次氯酸钠溶液(调节至约0.01％的有效氯浓度)。将培养皿放在黑暗的地方，10℃下共2天。2天后，将10ml含有1200ppm遗传霉素的水溶液放在新的90×15mm培养皿中，并将上述小麦种子转移到该培养皿中。所述遗传霉素水溶液含有用于防止各种细菌增殖的次氯酸钠溶液(调节至约0.02％的有效氯浓度)。接下来，使培养皿中的种子在春化的条件下，在培养室中生长2周(光照期：20℃、8h、约2000lux；和黑暗期：8℃，16h)。
此外，将在上述使用遗传霉素抗生素的筛选过程中发芽的存活小麦植株移植到含土壤的罐中，并生长约3-4个月。这种生长是在与上述相同的培养室中进行的，条件为(光照期：20℃、8h、约2000lux；和黑暗期：8℃，16h)。装入罐中后约1个月，收集已生长的小麦植株的叶子。提取所收集叶子的DNA。将提取的DNA用作模板进行PCR。结果，证实了引入基因的存在。该PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物对和扩增条件进行的。结果在图5表示。
约5,000粒小麦种子经过相似处理。结果，获得205株具有遗传霉素抗性的个体植株。在它们之中，87株个体在PCR分析中显示引入基因的存在。使在PCR中显示引入基因存在的87株个体生长，之后，经过DNA印迹分析。从87株个体中随机选择8株个体。提取8株个体的DNA，并经过DNA印迹分析。结果，引入的NPT II基因的存在在所有8株个体中均被证实。结果在图6表示。
在DNA印迹分析中显示引入基因存在的这8株个体进一步生长。结果，发现所有8株个体都具有种子生育力。这些具有种子生育力的小麦转化体的照片在图7中表示。将从这些小麦转化体(第一代：T0代)中获得的种子(第二代：T1代)播撒在土壤中。种子生长为幼株。提取6株幼株叶子的DNA，经过PCR分析。结果，引入基因的存在在6株幼株中均得以证实。该PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物对和扩增条件进行的。结果在图8中表示。从图8可以看出，证实了所有6株幼株都显示出引入的NPT II基因的存在。因此，证实了本发明的核酸转移方法可将目标外源性基因以适宜的方式掺入到基因组中，且所引入的外源性基因可被传递到下一代中。
(实施例2)
将日本产稻(变种：Koshihikari)的成熟种子用作原料。
使种子吸水，25℃下过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子和pWI-GUS或pWI-H5K的质粒DNA(200μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。在低于大气压0.096MPa的压力下减压1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为50V，其中电极之间的距离为1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为99。使该室进一步在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。4℃下保存培养皿约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。向培养皿中加入2ml蒸馏水，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。基因表达水平是使用GUS活性作为指数测定的。结果在下面表2表示。
                       表2
    电压(V/cm)     基因表述水平 备注
    0     -
    10     -
    20     ±
    50     +
    75     ± 种子变成褐色或生长较差
    100     - 种子变成褐色或死亡
    150     - 种子变成褐色或死亡
    200     - 种子变成褐色或死亡
根据上述结果，可了解到当施加50V的电压时，可进行具有最高效率的转化(注意：电极之间的距离为1cm)。
相似的结果在图9中表示。图9表示在下列条件下进行电穿孔的结果：脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为99，压力为低于大气压0.096MPa(减压)，且所施加的电压为50V(A)、20V(B)、10V(C)、或0V(D)。当所施加的电压为50V时，转化效率最高。
图10表示1：在(电压：50V，脉冲宽度：50μsec，脉冲次数：99；压力：低于大气压0.096MPa(减压))的条件下经过转化的稻种子；2：在(电压：50V，脉冲宽度：50μsec，脉冲次数：99；没有减压)的条件下只经过电穿孔的稻种子；和3：对照稻种子的照片。从图10可以看出，只有当减压与电穿孔结合时，才能获得转化。
用于生长的种子没有经过GUS活性实验，且减压后，使种子在含有200ppm遗传霉素的蒸馏水中生长(如(7)种子的后处理，(9)使用含抗生素的培养基筛选，和(10)转化体的生长中所述)。结果在图11中表示。
上述实验的再现性是通过以基本相同的方式重复实验而研究的。结果，获得基本相同的结果。该重复实验具体过程的详述在下面描述。开始，将一片7cm直径的滤纸放在90×15mm的培养皿中。将100粒稻(糙米)的种子放在滤纸上。将10ml水加入到培养皿中，其依次被放置在25℃下、光照期16h、共1天，使种子吸水。所加入的水含有用于防止各种细菌增殖的次氨酸钠溶液(调节至约0.01％的有效氯浓度)。在接下来的一天，用自来水充分洗涤种子。洗涤后立即进行本发明的核酸转移处理。将1ml包含20粒稻种子和pWI-H5KDNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。在低于大气压0.096MPa的压力下减压1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中，其依次在冰上维持1分钟。之后，在下列条件下通过电穿孔施加电脉冲：电压为50V，其中电极之间的距离为1cm；脉冲宽度为50μsec；脉冲次数为99。将该室在冰上再维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。在4℃下保存培养皿约1小时，并在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液，并将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。该过程总共进行5次，这样共100粒稻种子经过本发明的核酸转移处理。
接下来，将10ml 0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液作为防止变成褐色的试剂放在90×15-mm培养皿中。将经过核酸转移处理的稻种子放在培养皿中。所述PVP水溶液含有用于防止各种细菌增殖的次氯酸钠溶液(调节至约0.01％的有效氯浓度)。将培养皿放置在25℃下，光照期16h，共2天。2天后，将10ml含有200ppm遗传霉素的水溶液放在新的90×15-mm培养皿中，并将上述稻种子转移到该培养皿中。所述遗传霉素水溶液含有用于防止各种细菌增殖的次氯酸钠溶液(调节至约0.02％的有效氯浓度)。接下来，使培养皿中的种子在25℃下生长2周，光照期16h。
此外，将在上述使用遗传霉素抗生素的筛选过程中发芽的存活稻植株移植到含土壤的罐中，并生长约3-4个月。这种生长是在一般的培育条件下，在密闭的温室中，在25℃下进行的。装入罐中后约1个月，收集已生长的稻植株的叶子。提取所收集叶子的DNA。将提取的DNA用作模板进行PCR。结果，证实了引入基因的存在。该PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物对和扩增条件进行的。PCR分析证实了NPT II基因的存在。
约2,000粒稻种子经过相似处理。结果，获得55株具有遗传霉素抗性的个体植株。在它们之中，33株个体在PCR分析中显示引入基因的存在。使在PCR中显示引入基因存在的33株个体生长，之后，经过DNA印迹分析。从33株个体中随机选择6株个体。提取6株个体的DNA，经过DNA印迹分析。结果，引入的NPT II基因的存在在2株个体中被证实。结果在图12中表示。
在DNA印迹分析中显示引入基因存在的稻个体进一步生长。结果，发现稻个体具有种子生育力。这些具有种子生育力的稻转化体的照片在图13中表示。将从这些稻转化体(第一代：T0代)中获得的种子(第二代：T1代)播撒在土壤中。种子生长为幼株。提取8株幼株叶子的DNA，经过PCR分析。结果，确定了引入基因的存在。该PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物对和扩增条件进行的。结果在图14中表示。从图14可以看出，证实了所有8株幼株都显示出引入的NPT II基因的存在。因此，证实了本发明的核酸转移方法可将目标外源性基因以适宜的方式掺入到基因组中，且所引入的外源性基因可被传递到下一代中。
(实施例3)
将印度产稻(变种：IR24)的成熟种子用作原料。
使种子吸水，25℃下过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子和pWI-GUS的质粒DNA(200μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为50V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为99。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。结果在图15中表示。从图15可看出，只有当减压与电穿孔结合时，才能获得转化。
减压后，使用含有200ppm遗传霉素的蒸馏水筛选种子。
(实施例4)
将大豆(变种：Oosuzu)的成熟种子用作原料。使种子吸水，25℃过夜。
将2ml包含10粒已经开始发芽的种子和pBC1或pWI-GUS的质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为50V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。转化成功的结果在图16中表示。
(实施例5)
将玉米(变种：Petercorn)的成熟种子用作原料。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含3粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。
(实施例6)
使用大白菜(变种：Muso)的成熟种子作为原料。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。转化成功的结果在图17中表示。
用于生长的种子没有经过GUS活性实验，且减压后，使种子在含有适量遗传霉素的蒸馏水中生长(如(7)种子的后处理，(9)使用含抗生素的培养基筛选，和(10)转化体的生长中所述)。提取幼苗的DNA，接着进行PCR，从而证实引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析中所述)。在PCR中显示引入基因存在的个体进一步生长，之后，经过DNA印迹。从随机选择的某些已经生长的个体中提取DNA，接着进行DNA印迹分析。
(实施例7)
使用番茄(变种：Minicarol)的成熟种子作为原料。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。转化成功的结果在图18表示。
(实施例8)
将日本香瓜(变种：Kinsho甜瓜)的成熟种子用作原料。使种子吸水，25℃过夜。种子开始发芽。
将2ml包含40粒种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。
进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。
将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。
(实施例9)
使用牵牛花(变种：“Sun Smile”和“Youzirotairin”)的成熟种子作为原料。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含10粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。转化成功的结果在图19中表示。
(实施例10)
使用拟南芥(变种：Col-0)的成熟种子作为原料。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含1000粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1小时。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到微管形室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。
用于生长的种子没有经过GUS活性实验，且减压后，使种子在含有适量遗传霉素的蒸馏水中生长(如(7)种子的后处理，(9)使用含抗生素的培养基筛选，和(10)转化体的生长中所述)。提取幼苗的DNA，接着进行PCR，从而证实引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析中所述)。在PCR中显示引入基因存在的个体进一步生长，之后，经过DNA印迹。从随机选择的某些已经生长的个体中提取DNA，接着进行DNA印迹分析。
在DNA印迹分析中显示引入基因存在的拟南芥个体进一步生长，产生具有种子生育力的拟南芥个体。将从这些拟南芥转化体(第一代：T0代)中获得的种子(第二代：T1代)播撒在土壤中。种子长成幼株。提取幼株叶子的DNA，经过PCR分析。结果，确定了引入基因的存在。该PCR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物对和扩增条件进行的。
(实施例11)
使用日本香瓜(变种：Kinsho甜瓜)的成熟种子作为原料。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。使种子进行没有减压，在低于大气压0.06MPa下减压1小时，在低于大气压0.096MPa下减压1小时的处理。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。结果在表3中表示。
           表3
    减压(MPa)     基因表述水平
    0     -1
    0.06     -1
    0.096     +2
1-：对于经过核酸转移的种子而言，X-Gluc染色均未被证实。
2+：对于30粒经过核酸转移的种子中的15粒或更多种子而言，X-Gluc染色被证实。
在表3中，基因表达水平是以用X-Gluc溶液染色的程度为基础评价的。正如从表3结果所看到的那样，大约0.096MPa减压对于日本香瓜是优选的。
接下来，研究对于日本香瓜转化而言优选的电压。使日本香瓜在与上述相同的条件(0.096MPa减压)下经过核酸转移，区别在于下列电压条件。结果在下面的表4中表示。
             表4
    电压(V/cm)     基因表达水平
0 -1
    10     -1
    20     -1
    50     ±2
    75     ±2
    100     +3
    150     ±2
    200     ±2
1-：对于经过核酸转移的种子而言，X-Gluc染色均未被证实。
2±：对于30粒经过核酸转移的种子中的1-14粒种子而言，X-Gluc染色的微弱水平被证实。
3+：对于30粒经过核酸转移的种子中的15粒或更多种子而言，X-Gluc染色被证实。
按照上述结果，证实了当施加约100V的电压时，其中电极之间的距离是约1cm，转化可最有效地进行。
(实施例12)
对小麦(变种：Norin 61)的成熟种子进行实验，其中比较减压条件。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。将放在2ml不含质粒DNA的电穿孔缓冲溶液中的发芽种子用作对照。使种子进行没有减压，在低于大气压0.06MPa下减压1小时，或在低于大气压0.096MPa下减压1小时的处理(注意：对照种子没有经过减压)。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为100V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为50。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml的X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。结果在图20中表示。基因表达水平是通过用X-Gluc溶液染色的程度作为指数确定的。从图20可以看出，在小麦中，优选在低于大气压约0.096MPa下减压。且，在低于大气压约0.06MPa下减压的情况中，对于小麦种子证实了X-Gluc染色。
(实施例13)
对日本产稻(变种：Koshihikari)的成熟种子进行实验，其中比较减压条件。使种子吸水，25℃过夜。将2ml包含30粒已经开始发芽的种子和质粒DNA(100μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。将放在2ml不含质粒DNA的电穿孔缓冲溶液中的发芽种子用作对照。使种子进行没有减压，在低于大气压0.06MPa下减压1小时，或在低于大气压0.096MPa下减压1小时的处理(注意：对照种子没有经过减压)。之后，将种子和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压为50V，其中电极之间的距离是1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为99。进一步使该室在冰上维持2分钟。之后，将种子和缓冲溶液放回到原始培养皿中。将培养皿在4℃下保存约1小时，之后，在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去缓冲溶液。将2ml蒸馏水加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。在接下来的一天，除去蒸馏水。将2ml X-Gluc溶液加入到培养皿中，其依次在25℃维持过夜。结果在图21中表示。基因表达水平是通过用X-Gluc溶液染色的程度作为指数确定的。从图21可以看出，对于稻而言，优选在低于大气压约0.096MPa下减压。且，在低于大气压约0.06MPa下减压的情况中，对于稻种子证实了X-Gluc染色。
(实施例14)(蚕的转化)
使用蚕(节肢动物门(Arthropoda)的家蚕)卵。将2ml含有50个蚕卵和质粒DNA(200μg/2ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中，其中所述蚕卵是从在冰箱中保存的休眠卵中任意选择的或是从产卵后0-10天之间的非-休眠卵中任意选择的。作为质粒DNA，使用pWI-GUS质粒中的GUS基因被GFP(绿色荧光蛋白)编码基因取代的质粒。可选择性地，使用pigA3GFP质粒(Tamura，Journal of SericulturalScience of Japan，69：1-12，2000)。使用GFP(绿色荧光蛋白)编码基因(例如，从Funakoshi Co.，Ltd.，Hongo，Bunkyo-ku，Tokyo，日本购得)。减压在低于大气压0.096MPa的压力下进行5分钟。之后，将卵和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压是50V，其中电极之间的距离为1cm，脉冲宽度为50μsec，脉冲次数为5。进一步使该室在冰上维持2分钟。
之后，仅仅将已经过电穿孔的卵转移到具有滤纸的培养皿中。使卵在25℃下生长2-3周。作为饲料，使用商业购得的人造饲料(KatakuraKogyo，K.K.，Okufu，Sayama-shi，Saitama，日本)等。用紫外线或蓝光照射孵出的幼虫，从而证实从核酸转移物质发射出的绿色荧光。
使已经被证实发出绿色荧光的幼虫进一步生长为成虫。使成虫与其中已经转移了相同核酸的个体等配对。用紫外线或蓝光照射下一代个体，从而通过从其发射出的绿色荧光的存在证实引入核酸的遗传。
(实施例15)
(大肠杆菌(E.coli)的转化)
使用大肠杆菌(原核生物)。将2ml含有大肠杆菌(约106-108个细胞/ml)和pBC1质粒DNA(10ng/ml)的电穿孔缓冲溶液放在培养皿中。减压是在低于大气压0.096MPa的压力下进行1分钟。之后，将大肠杆菌和缓冲溶液从培养皿转移到室中。将该室在冰上放置1分钟。之后，在下列条件下施加电脉冲：电压是200V，其中电极之间的距离为1cm，脉冲宽度为2μsec，且脉冲次数为1。使该室进一步在冰上维持2分钟。
之后，将已经过电穿孔的大肠杆菌转移到补充了100ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，接着在37℃培养过夜(见，商业购得的实验指南，如Molecular Cloning，ver.2，LB琼脂培养基)。提取大肠杆菌中的质粒DNA和基因组DNA。氨苄青霉素抗性基因的存在是通过PCR等加以证实的。
(实施例16)电穿孔装置和室
在下文中，将参考附图描述本发明的电穿孔装置和电穿孔室。这里解释所用的附图仅用于举例说明。本发明的范围不受这些附图的限制。
图22表示本发明实施方案的电穿孔室。该装置包括用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分和电穿孔部分。在容器(106)中提供有至少一对彼此互相面对的电极(104，105)。值得注意的是，虽然在图22中描述了一对(两个)电极(104，105)，但是在容器(106)中可提供不止一对电极。任选地，该容器(106)提供有温度控制部分(128)。要进行核酸转移的细胞(109)以及所转移的核酸分子(110)，任选连同缓冲溶液(111)被放置在容器(106)中。在其中一个实施方案中，容器(106)被放置在另一容器(108)内。它可在容器(108)中维持不同于大气压的压力。容器(108)的内部压力可通过使用维持不同于大气压的压力的部分(126)，利用气孔(107)将空气引入到容器(108)中(增压)，或从容器(108)中排出(减压)而改变。如果容器(106)还包括能够被密封的盖子和具有用于维持不同于大气压的压力的部分的气孔，则容器(106)和容器(108)可以相同(即，容器(106)可替换容器(108))。所述装置还包括用于产生高压脉冲的部分(101)。所述高压脉冲产生部分(101)分别经由两根电线(102，103)与一对电极(104，105)相连。当高压脉冲产生部分(101)被打开产生高压脉冲时，与其相连的电极(104)和电极(105)可分别起阳极和阴极，或阴极和阳极的作用。优选，高压脉冲产生部分(101)包括用于颠倒电流方向的极性转换部分(127)，虽然它可能并不是必需的。通过打开/关闭极性转换部分(127)，可以两个方向将高压脉冲施加于细胞(109)及核酸(110)。
图23表示本发明另一实施方案的电穿孔装置。本装置包括用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分和电穿孔部分，它们分开安装在单一的容器(212)内。在该装置中，用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分包括容器(206-a)。要进行核酸转移的细胞(209)被放在容器(206-a)中。除细胞(209)之外，被转移的核酸和/或缓冲液被任选放在容器(206-a)中。在其中一个实施方案中，容器(206-a)放在另一容器(208)内。容器(208)内部可维持在不同于大气压的压力下。容器(208)的内部压力可通过使用维持不同于大气压的压力的部分(226)，利用气孔(207)将空气引入到容器(208)中(增压)，或从容器(208)中排出(减压)而改变。如果容器(206-a)还包括能够被密封的盖子和具有用于维持不同于大气压的压力的部分的气孔，则容器(206-a)和容器(208)可以相同(即，容器(206-a)可替换容器(208))。
已经通过上述部分经过减压和/或增压的细胞依次被电穿孔部分处理。所述电穿孔部分包括容器(206-b)。容器(206-b)可与容器(206-a)相同或不同。换句话说，用于减压和/或增压的容器(206-a)可被用作容器(206-b)。任选，容器(206-a，206-b)提供有温度控制部分(228-a/228-b)。容器(206-b)内提供有至少一对互相面对的电极(204，205)。值得注意的是，虽然在图23中描述了一对(两个)电极(204，205)，但是容器(206-b)中可提供不止一对电极。经过核酸转移的细胞(209)以及所转移的核酸分子(210)，任选连同缓冲溶液(211)被放在容器(206-b)中。所述装置还包括用于产生高压脉冲的部分(201)。所述高压脉冲产生部分(201)分别经由两根电线(202，203)与一对电极(204，205)相连。当打开高压脉冲产生部分(201)产生高压脉冲时，与其相连的电极(204)和电极(205)可分别起阳极和阴极，或阴极和阳极的作用。优选，高压脉冲产生部分(201)包括用于颠倒电流方向的极性转换部分(227)，虽然它可能并不是必需的。通过打开/关闭极性转换部分(227)，可以两个方向将高压脉冲施加于细胞(209)及核酸(210)上。
图24表示本发明另一实施方案的电穿孔装置。本装置仅包括用于将核酸转移到细胞中的电穿孔部分。该装置结合用于将细胞保持在不同于大气压的压力下。该装置包括容器(306)。容器(306)内提供有至少一对电极(304，305)。值得注意的是，虽然图24中描述了一对(两个)电极(304，305)，但是在容器(306)中可提供不止一对电极。任选，容器(306)提供有温度控制部分(328)。要进行核酸转移的细胞(309)以及所转移的核酸分子(310)，任选连同缓冲溶液(311)被放在容器(306)中。细胞(309)已经通过任何其它装置经过了减压和/或增压。所述装置还包括用于产生高压脉冲的部分(301)。所述高压脉冲产生部分(301)分别经由两根电线(302，303)与一对电极(304，305)相连。当打开高压脉冲产生部分(301)产生高压脉冲时，与其相连的电极(304)和电极(305)可分别起阳极和阴极，或阴极和阳极的作用。优选，高压脉冲产生部分(301)包括用于颠倒电流方向的极性转换部分(327)，虽然它可能并不是必需的。通过打开/关闭极性转化部分(327)，可以两个方向将高压脉冲施加于细胞(309)及核酸(310)上。在所述装置中，电极(304)和电极(305)之间的距离(α)足以容纳植物种子。该距离是按照上述定义的。
图25表示本发明其中一个实施方案的直角平行六面体的电穿孔室。该室是由能够抵抗不同于大气压的压力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。在电穿孔室(406)内提供有至少一对互相面对的电极(413，414)，这样电极与室内壁紧密连接。值得注意的是，虽然在图25中描述了一对(两个)电极(413，414)，但是在容器(406)中可提供不止一对电极。电极(413，414)优选是沿着彼此面对的两个内壁放置的平板形式。线(404)和线(405)，它们是由与电极(413，414)相同或不同的金属制成的，任选从电极(413)和电极(414)伸展。线(404)和线(405)与分别与和高压脉冲产生部分(401)连接的电线(402)和电线(403)相连。可以不提供线(404)和线(405)。如果不提供，则与高压脉冲产生部分(401)相连的电线(402)和电线(403)可直接与电极(413)和电极(414)连接。当打开高压脉冲产生部分(401)产生高压脉冲时，所连接的电极(413)和电极(414)可分别起阳极和阴极或阴极和阳极的作用。该室具有足够容纳植物种子的大小。室的大小可由内部尺寸，即其横截面的长(a)×宽(b)×高(c)表示。可容纳植物种子的大小是按照上面所定义的。优选，能够容纳植物种子的室的大小是长1cm×宽2cm×高2cm。要进行核酸转移的细胞和被转移的核酸分子，任选连同缓冲溶液被放在容器(406)中。任选，容器(406)提供有温度控制部分(428)。
图26表示本发明其中一个实施方案的微管形电穿孔室。该室(506-a)是由能够抵抗不同于大气压的压力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。在室(506-a)内提供有至少一对互相面对的电极(504，505)，这样电极与室内壁紧密连接。值得注意的是，虽然在图26中描述了一对(两个)电极(504，505)，但是在容器(506-a)中可提供不止一对电极。电极(504，505)优选是通过使用粘合剂将不锈钢箔(约5×40mm(厚度：约0.1mm))粘在微管内壁上制成的。在特定的实施方案中，每个电极(504，505)的末端从微管(506-a)中伸出。电极(504)和电极(505)的末端分别与和高压脉冲产生部分(501)连接的电线(502)和电线(503)相连。当打开高压脉冲产生部分(501)产生高压脉冲时，所连接的电极(504)和电极(505)可分别起阳极和阴极或阴极和阳极的作用。该室具有足够容纳植物种子的大小。室的大小可由内部尺寸，即其横截面的直径(e)×高(d)表示。可容纳植物种子的大小是按照上面所定义的。优选，能够容纳植物种子的室的大小是直径1cm×高4cm。要进行核酸转移的细胞和被转移的核酸分子，任选连同缓冲溶液被放在容器(506-a)中。微管(506-a)任选包含用于密封关闭微管的盖子(515)。任选，容器(506-a)提供有温度控制部分(528)。
在上述实施例中，如图26所示，微管(506-a)的体具有均匀的横截面，然后向底部渐细。本发明的微管形电穿孔室可以是任何其它形式。例如，微管室的体可具有不均匀的横截面和向底部渐细的形状(506-b)。在另一实施方案中，该室的体具有从顶部到底部的均匀横截面(506-c)。在另一实施方案中，该室的体具有506-d中所示的不均匀横截面。
本发明的室可以是任何形状，只要它的大小可使它容纳植物种子。该室的大小是否能够容纳植物种子可通过测量与室内壁相切的内切圆直径加以证实。该内切圆与室内壁上的至少3个任意点相切。例如，如图27所示，当室为三棱柱的形状(606)时，与图27所示三个点相切的最大内切圆(616)直径(f)是可容纳植物种子的大小。例如，如图27所示，在三棱柱室中提供了至少一对电极(604-a，605-a)。值得注意的是，虽然在图27的三棱柱室中描述了一对(两个)电极(604-a，605-a)，但是容器(606)中可提供不止一对电极。同样，如图27所示，当室的形状为五棱柱的形状(607)时，与图27所示5个点相切的最大内切圆(617)直径(g)是可容纳植物种子的大小。例如，图27所示五棱柱室中提供了至少一对电极(604-b，605-b)。值得注意的是，虽然在图27的五棱柱室中描述了一对(两个)电极(604-b，605-b)，但容器(607)中可提供不止一对电极。在室具有其它形状的情况下，最大内切圆的大小(直径)是使该室容纳植物种子的大小。
图28是表示本发明自动电穿孔装置的示意图。该装置包括：
a)用于放置含核酸分子及细胞的混合物的容器(706-a)；
b)用于在容器a)中放置核酸分子的部分(724)；
c)用于在容器a)中放置细胞的部分(725)；
d)用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的容器(708)，所述容器能够抵抗不同于大气压的压力；
e)用于在容器d)中放置细胞的部分(718-a)；
f)用于将容器d)维持在不同于大气压的压力下部分(726)；
g)用于向含核酸分子及细胞的混合物施加高压脉冲的容器(720)；
h)用于在容器g)中放置含核酸分子及细胞的混合物的部分(718-b)；
i)用于向容器g)中含核酸分子及细胞的混合物施加高压脉冲的部分(701)；和
j)用于自动操纵部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分(719)。
开始，制备容器(706-a)。将细胞从部分(725)注射到容器(706-a)中。任选，可在细胞注入之前、基本同时、或之后，将核酸分子从部分(724)注射到同一容器(706-a)中。细胞(和，任选地，核酸分子)或含有注射入细胞的容器(706-a)可通过部分(718-a)的作用被放在容器(708)中。容器(708)是由能够抵抗不同于大气压的压力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。将具有注射入细胞(和，任选地，核酸分子)的容器(706-b)安装在容器(708)中。在某些情况下，容器(708)和容器(706-b)可以是同一容器。在细胞已经被放在容器(708)中后，可启动部分(726)。使用部分(726)，将容器(708)的内部维持在不同于大气压的压力下。因此，放在容器(708)中的细胞(和，任选地，核酸分子)经过减压和/或增压。已经过减压和/或增压的细胞，或含细胞的容器是通过放置部分(718-b)从容器(708)转移到容器(720)的(含有放在容器(720)中的细胞的容器被表示为706-c(这里，容器(720)和容器(706-c)可以是同一容器))。当核酸分子不包含在容器(706-b/706-c)中时，核酸分子是在放置部分(718-b)启动之前或之后，从部分(724)注射到容器(706-b/706-c)中的。任选，缓冲溶液可与核酸分子同时或依次注射到容器(706-b/706-c)中。当含细胞及核酸分子的混合物已经被放在容器(720)中时，启动部分(701)。使用部分(701)，将高压脉冲施加于容器(720)中含细胞及核酸分子的混合物上。结果，在细胞与核酸分子之间发生电穿孔。本发明的电穿孔装置还包括用于自动控制上述部分(724、725、718-a、726、718-b、和701)的控制部分(719)。如图28所示，控制部分(719)经由电线(721-a、721-b、721-c、721-d、721-e、和721-f)与部分(724、725、718-a、726、718-b、和701)相连。控制信号是通过这些电线传输的。在本发明的自动电穿孔装置中，部分(724)和部分(725)可彼此相同或不同。部分(718-a)和部分(718-b)可彼此相同或不同。容器(706-a)、容器(706-b)、和容器(706-c)可彼此相同或不同。此外，在本发明的电穿孔装置中，容器(708)中的减压和/或增压以及容器(720)中的电穿孔可以任何顺序进行。优选，容器(720)中的电穿孔可在容器(708)中的减压和/或增压之后进行。
图29表示本发明自动电穿孔装置的更具体的实施方案。在图29的实施方案中，细胞开始从部分(825)被放到容器(806-a)中。任选，在注射入细胞时，核酸分子可从部分(824)被放到容器(806-a)中。任选，容器(806-a)包括电极(804-a，805-a)。含有注射入细胞(和，任选地，核酸分子)的容器(806-a)是通过部分(818-a)，如皮带运输机等，经过容器(808)的入口(822-a)转移到容器(808)中的。含有注射入细胞(和，任选地，核酸分子)的容器，其被放在容器(808)中，是由806-b(且，在容器(806-b)中提供的电极由804-b，805-b表示)表示的。当把细胞放在容器(808)中时，容器(808)的入口(822-a)和出口(822-b)是闭合的，这样容器(808)可密闭。在密闭容器(808)中，启动部分(826)，将容器(808)的内部维持在不同于大气压的压力下。不同于大气压的压力可通过部分(826)的作用，经由气孔(807)将空气引入到容器(808)中(增压)，或从容器(808)中排出(减压)而产生。包含已经如上所述经过减压和/或增压的细胞(和，任选地，核酸分子)的容器(806-b)是通过部分(818-b)，如皮带运输机等，经由容器(808)的出口(822-b)向容器(820)转移的。如果在此时，容器(806-b/806-c)不含核酸分子，则在此转移步骤内将核酸分子注射到容器(806-b/806-c)中。含有注射入细胞及核酸分子的容器，其已被放在容器(820)中，是由806-c(容器(806-c)中提供的电极是由804-c，805-c表示的)表示的。在细胞及核酸分子已经被放在容器(820)中后，优选闭合容器(820)的入口(823-a)和出口(823-b)。容器(820)包括用于产生高压脉冲的部分(801)。所述高压脉冲产生部分(801)经由两根电线(802，803)分别与电极(804-c)和电极(805-c)相连。当打开高压脉冲产生部分(801)产生高压脉冲时，所连接的电极(804-c)和电极(805-c)可起阳极和阴极或阴极和阳极的作用。优选，高压脉冲产生部分(801)包括用于颠倒电流的极性转换部分(827)，虽然它可能并不是必需的。通过打开/关闭极性转换部分(827)，可以两个方向将高压脉冲施加于细胞(809)及核酸分子(810)上。此外，本发明的自动电穿孔装置包括用于自动控制上述部分(824、825、818-a、826、818-b、801)的控制部分(819)。如图29所示，控制部分(819)经由各电线(821-a、821-b、821-c、821-d、821-e、821-f)与部分(824、825、818-a、826、818-b、801)相连。控制信号是通过电线传输的。值得注意的是，在图29中，用于在容器(806-a)中放置核酸分子的部分(824)和用于在容器(806-a)中放置细胞的部分(825)是作为独立部分描述的，虽然部分(824，825)可以是同一部分(即，用于在容器(806-a)中放置细胞及核酸的单个部分)。值得注意的是，虽然在图29中描述了一对(两个)电极(804-a、805-a；804-b、805-b；804-c、805-c)，但是在容器(分别是806-a；806-b；806-c)中可提供不止一对电极。此外，在图29中，放置部分(818-a、818-b)被描述为单一的皮带运输机，虽然放置部分(818-a、818-b)可以是分开的部分。此外，用于改变压力的容器(808)和/或用于进行电穿孔的容器(820)可以与含有核酸分子和/或细胞的容器(806-a、806-b、806-c)同时在皮带运输机上移动，或代替后者移动。可选择性地，放置部分可使用没有皮带运输机等的自动泵，通过吸出/排出而将放在容器(806-a)、容器(806-b)、和容器(806-c)中的材料/悬浮液转移。容器(806-a)、容器(806-b)、和容器(806-c)彼此可以相同或不同。当它们是不同的容器时，内含物(即，细胞和/或核酸分子)在每个容器之间转移，如从容器(806-a)转移到容器(806-b)和/或从容器(806-b)转移到容器(806-c)等。转移可通过，例如，简单地倾斜容器，或使用自动分液器/自动移液管/自动泵等吸出/排出而进行。任选，容器(806-a、806-b、806-c)提供有温度控制部分(828-a、828-b、828-c)。
如上所述，此前已经使用优选实施方案举例说明了本发明。应了解本发明的范围只受权利要求的限定。本说明书中引证的所有专利、专利申请、和公开出版物整体引入此处作为参考，其程度与这里详细描述的相同。
                      工业实用性
提供一种简单且快速的核酸转移方法。
本发明的简单且快速的核酸转移方法可用于本领域的研究和发展，从而很容易进行大规模的处理和大规模的分析。此外，本发明可引起研究的显著进步，潜在导致创新重组体的开发。
                                 序列表
<110>National Institute of Agrobiological Sciences
<120>包括减压/增压的使用的电穿孔方法
<130>AR034PCT
<150>JP P2002-207611
<151>2002-07-16
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
ctgcgtgcaa tccatcttg                                                   19
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
actcgtcaag aaggcgatag aag                                              23
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctc                                 35
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgat                                 35
<210>5
<211>882
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：探针
<400>5
tctagaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct    60
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc   120
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc   180
ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcccggctat cgtggctggc cacgacgggc   240
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg   300
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc   360
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caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat   480
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc    540
aaggcgcgca tgcccgacgg cgacgatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg    600
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg    660
gcggaccgct atcatgacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc    720
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc    780
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg    840
accaagcgac gatgaattcg gcggccgcgg ggatcctcta ga                       882

Claims (70)

1.一种用于将核酸转移到细胞中的方法，包括下列步骤：
a)将细胞保持在不同于大气压的压力下；并
b)将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞保持在不同于大气压的压力下的步骤是使细胞经过减压的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞保持在不同于大气压的压力下的步骤是使细胞经过增压的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞保持在不同于大气压的压力下的步骤是在将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下的步骤之前进行的。
5.根据权利要求2所述的方法，其中减压步骤是在比大气压低约0.096MPa的压力下进行的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括在至少两个方向上向细胞及核酸施加高压脉冲。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物细胞是休眠植物组织的细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述休眠植物组织是种子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述单子叶植物是禾本科植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是小麦(Triticum aestivum L.)。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是稻(Oryzasativa L.)。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是玉米(Zeamays L.)。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述双子叶植物是十字花科植物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述十字花科植物是大白菜(Brassica rapa L.)。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述十字花科植物是油菜(Brassica napus L.)。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述双于叶植物是豆科植物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述豆科植物是大豆(Glycine max Merr)。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述双子叶植物是茄科植物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述茄科植物是番茄(Lycopersicum esculentum Mill)。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述双子叶植物是葫芦科植物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述葫芦科植物是日本香瓜(Cucumis melo L.)。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述双子叶植物是旋花科植物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述旋花科植物是牵牛花(Pharbitis nil Choisy)。
27.一种用于产生植物的方法，其中核酸被转移到植物细胞中，包括下列步骤：
a)将细胞保持在不同于大气压的压力下；并
b)将细胞及核酸置于能够引发电穿孔的条件下。
28.根据权利要求27所述的方法，还包括使细胞分化、生长、和/或增殖的步骤。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中步骤a)包括将含有细胞的种子保持在不同于大气压的压力下的步骤，且步骤b)包括将含有细胞及核酸的种子置于能够引发电穿孔的条件下的步骤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述种子是单子叶植物的种子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述单子叶植物的种子是禾本科的种子。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述禾本科的种子是小麦(Triticum aestivum L.)种子。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述禾本科的种子是稻(Oryza sativa L.)的种子。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述禾本科的种子是玉米(Zea mays L.)种子。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述种子是双子叶植物的种子。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是十字花科种子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述十字花科的种子是大白菜(Brassica rapa L.)的种子。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述十字花科的种子是油菜(Brassica napus L.)的种子。
39.根据权利要求35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是豆科的种子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述豆科的种子是大豆(Glycine max Merr)的种子。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是茄科的种子。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述茄科的种子是番茄(Lycopersicum esculentum Mill)的种子。
43.根据权利要求35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是葫芦科的种子。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述葫芦科的种子是日本香瓜(Cucumis melo L.)的种子。
45.根据权利要求35所述的方法，其中所述双子叶植物的种子是旋花科的种子。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述旋花科的种子是牵牛花(Pharbitis nil Choisy)的种子。
47.一种通过权利要求27-46任何一项所述的方法生产的植物。
48.根据权利要求47所述的植物，其不含体细胞克隆变异。
49.一种用于将核酸转移到细胞中的装置，包括：
a)用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分；和
b)用于电穿孔的部分。
50.根据权利要求49所述的装置，其中用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的部分具有维持压力低于大气压的能力。
51.根据权利要求49所述的装置，其中所述细胞是植物细胞。
52.根据权利要求49所述的方法，其中b)的电穿孔部分包括：
起阳极作用的第一电极；和
起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间距离的长度足以容纳植物种子。
53.根据权利要求52所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离为至少约5mm。
54.根据权利要求52所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离长于约1cm。
55.根据权利要求52所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
56.根据权利要求49所述的装置，其中b)的电穿孔部分包括起阳极作用的第一电极；和起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间的距离可被改变，从而使植物种子可被容纳于第一和第二电极之间。
57.根据权利要求56所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
58.一种用于将核酸转移到细胞中，并将细胞保持在不同于大气压的压力下的电穿孔装置，该装置包括：
起阳极作用的第一电极；和
起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间距离的长度足以容纳植物种子。
59.根据权利要求58所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离为至少约5mm。
60.根据权利要求58所述的装置，其中第一电极与第二电极之间的距离长于约1cm。
61.根据权利要求58所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
62.一种用于将核酸转移到细胞中，并将细胞保持在不同于大气压的压力下的电穿孔装置，该装置包括：
起阳极作用的第一电极；和
起阴极作用的第二电极，
其中第一电极与第二电极之间的距离可被改变，从而使植物种子可被容纳于第一和第二电极之间。
63.根据权利要求62所述的装置，其中第一电极和第二电极是铂电极。
64.一种能抵抗不同于大气压的压力并具有足以容纳植物种子大小的电穿孔室。
65.根据权利要求64所述的电穿孔室，其中与电穿孔室内壁上的至少3个点相切的最大内切圆直径为至少约5mm。
66.根据权利要求64所述的电穿孔室，其中与电穿孔室内壁上的至少3个点相切的最大内切圆直径长于约1cm。
67.根据权利要求64所述的电穿孔室，其中该室具有四边形的横截面，且室的内部尺寸是约1cm×2cm×2cm。
68.根据权利要求64所述的电穿孔室，其中该室具有圆形的横截面，且室的内部尺寸是约1cm×4cm。
69.一种能够抵抗不同于大气压的压力的电穿孔室，其中该室的大小可被改变，从而使植物种子可被容纳于室中。
70.一种用于自动进行电穿孔的装置，包括：
a)用于放置含核酸及细胞的混合物的容器；
b)用于在容器a)中放置核酸的部分；
c)用于在容器a)中放置细胞的部分；
d)用于将细胞保持在不同于大气压的压力下的容器，该容器能够抵抗不同于大气压的压力；
e)用于在容器d)中放置细胞的部分；
f)用于将容器d)的内部区域维持在不同于大气压的压力下的部分；
g)用于向含核酸及细胞的混合物施加高压脉冲的容器；
h)用于在容器g)中放置含核酸及细胞的混合物的部分；
i)用于向容器g)中含核酸及细胞的混合物施加高压脉冲的部分；和
j)用于自动运行部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分，
其中部分b)和部分c)彼此相同或不同；部分e)和部分h)彼此相同或不同；且容器a)、容器d)、和容器g)彼此相同或不同。
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