CN1208437A - 农杆菌介导转化法生产稳定转化的可育小麦的方法及其相关组分 - Google Patents

农杆菌介导转化法生产稳定转化的可育小麦的方法及其相关组分 Download PDF

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Abstract

这里公开的是制备稳定转化的可育小麦的方法和经由农杆菌介导转化小麦的系统。本发明提供了多种外植体转化方法,例如新鲜分离或预培养的未成熟胚,胚发生性愈伤组织及悬浮细胞。还公开了转化时可再生的外植体,转化后在一短时期内收获转基因植物的方法。因此,体细胞克隆变异机率明显减少及较长的体外培养时间明显缩短。利用这个系统得到的转化效率可与已公开的其它转化系统,例如基因枪法相毗美,或更优于后者。

Description

农杆菌介导转化法生产稳定转化的 可育小麦的方法及其相关组分
1.1发明领域
本发明涉及分子生物学领域。更具体地说，它涉及到向单子叶植物，特别是小麦的基因组中导入外源DNA的新方法。这里提供了用于小麦遗传转化的可重复体系，从转化细胞悬浮液中筛选出稳定遗传转化体的方法，和从转化的细胞产生可育植物的方法。这些方法的实例包括使用农杆菌介导的转化向细胞中引入核酸，以及筛选和/或报告标记系统，例如抗性基因(如，抗抗生素，抗除草剂，等等)，或能产生其他可观察表型特征的基因。在其它方面，本发明涉及稳定转化的可育转基因小麦植物，及其后代和配子的生产。
1.2相关技术的描述
提交于1994年10月26日的美国专利申请SN 08/329,742全文整体引入本文作为参考文献。过去几十年里，重组DNA技术使得向农作物转移基因成为可能，而转入农作物的基因来自于各种各样范围广泛的生命体。这个进展为提高植物抗病虫害及除草剂能力，为通过调整生物合成途径来改良作物品质都提供了巨大机会。(Knutson等，1992；Piorer等，1992；Vasil等，1992)。但对于大多数单子叶作物，包括玉米，水稻，燕麦，大麦，尤其是小麦来说，导入外源基因的有效转化方法的可靠性，仍然是转基因植物技术中首要的拦路虎。
1.2.1单子叶植物遗传转化的已知方法
有许多方法曾试图应用于单子叶植物的遗传转化，但仅有少数方法得到过稳定的转化。目前用于大多数单子叶种转基因研究的主要有两种方法：向分离的原生质体直接导入DNA法和基因枪介导DNA转送法(Shimamoto等，1989,Fromm等，1990)。最近，还有些用于单子叶遗传转化的方法得以发展。下面简要描述了可生产能够遵循孟德尔定律将转基因传给子代的稳定转化的可育单子叶植物的一些方法。
1.2.1.1基因枪法(Biolistics)
“基因枪”法是应用于单子叶植物遗传转化的最广泛的方法。该法中外源DNA包被在微弹粒子外表，经机械装置加速后粒子可达到足够高的速度穿过植物细胞壁和核(国际专利申请公开号WO91/02071)、外源DNA随之进入宿主DNA中，导致细胞转化。“基因枪”法有许多种(Samford,1990；Fromm等，1990；Christon等，1988；Sautter等，1991)。该法已成功得到稳定转化的单子叶植物，包括水稻、玉米、小麦、大麦和燕麦(Christon等，1991；Gordon-Kamm等，1990；Vasil等，1992，1993；Wan等，1993；Sommers等，1992)。
基因枪法可选用未成熟胚或由未成熟胚诱发的愈伤组织作为靶组织。基因枪法应用于玉米，燕麦，大麦及小麦中都曾回收得到过转基因植物(Gordon-Kamm等，1990；Vasil等，1992，Somers等，1992；Wan等，1993)。
基因枪法获取转基因植物通常需费时10至15个月(Gordon-Kamm,1990；Vasil等，1992)。即使最近选用未成熟胚作为靶组织使得转化方法得以改进，转基因植物的恢复仍需时4至6个月(Weeks等，1993；Vasil等，1992；1993；Becker等，1994)。这些方法的转化效率高低不等，从100至1000例被轰击胚中约有一例转化发生。
1.2.1.2电穿孔
原生质体法曾广泛应用于水稻，这里DNA可通过脂质体、PEG和电穿孔转入原生质体中。好几个实验室都曾恢复出大量转基因植物(Shimamoto等，1989；Datta等，1990)，原生质体法需要建立起长期胚胎悬浮培养物。由原生质体得到的有些再生体是不育的，且长期的悬浮培养会出现不正常表型(Danvey等，1991；Rhodes等，1988)。这些方法已特别应用于水稻及一些草本植物。
电穿孔法转化运用瞬时高压电场在细胞膜上产生出“小孔”，使得外源DNA得以进入。该法曾用于生产稳定转化的单子叶植物(Pasazkowski等，1985；Shillito等，1985；Fromm等，1986)，特别是在水稻上的应用(Shimamoto等，1992；Datta等，1990，1992；Hayakawa等，1992)。
1.2.1.3原生质体化学处理法
聚乙二醇(PEG)法是原生质体与待转化DNA共存下的一种简便的化学转化法(Shillito等，1985；Rhodes等，1988)。聚乙二醇(PEG)可促进原生质体摄入DNA。
1.2.1.4其它方法
一些其它方法也曾报导应用于单子叶植物的转化。曾报导可生产可育的转基因单子叶植物的方法包括“花粉管法”(国际专利申请公开号WO93/18168；Zahir,1993；Luo和Wu,1988)，花分蘖DNA大量注入法(Du等，1989,Picard等，1988；De la Pena等，1987)和浸入DNA溶液中种子的组织温育法(Tofer等，1989)。国际专利申请公开号WO94/00583中介绍一种在胚形态发生始期向可育植物胚珠胚乳层直接注入外源DNA的新方法。除原生质体法及基因枪法之外的其它转化方法常得不到预期结果或转化结果无法重复。时常会有表达方面的证据，但很少有外源DNA可传代至子代的。
1.3现有技术的局限性
本领域中，目前仍几乎无重大突破的重要研究领域之一为在单子叶植物转化中细菌介导法的采用。尽管在双子叶植物转化中农杆菌介导转化法得以广泛应用，在有关单子叶的实验中其结果却令人失望。国际专利申请公开号WO94/0077中讨论了一些声称利用农杆菌转化单子叶植物的报告。特别是在Gould等，1991；Mooney等，1991；和Raineri等，1990的方法中宣布了玉米、水稻和小麦的农杆菌转化。这些方法中有一些基因转化证据，但缺少令人信服的有关转化效率、可重复性及转基因确认方面的证据(Potrykus,1990)，以及生产的植物中转基因不能传给子代。在Gould等人工作中给出植物转化方面的证据，但转基因不具有孟德尔遗传规律性。
De LaFonteyne等(国际专利申请公开号WO92/06205)描述了一种利用根癌农杆菌(A.tumefaciens)株系结合转座子介导整合法转化玉米细胞的途径，但该方法应用于其它种能否成功则没有显示说明。
Mooney等(1991)从与根癌农杆菌共温育的小麦胚胎中得到转化细胞，不过转化效率很低且经常无法重复。Chan等(1993)随后也尝试过利用根癌农杆菌介导生产转基因水稻植物，但他们的方法由于缺乏转基因植物生产的充足分子生物学及遗传学证据而未能被广泛接受。
最近Hiei等(1994)的尝试表明利用农杆菌转化也能得到转基因水稻植物，但是选用特别细菌株系及细胞载体对于成功获得转基因至关重要。近来Ishida等(1996)的一篇论文表明，根癌农杆菌与未成熟胚共温育使得玉米的高效转化成为可能。在有关水稻和玉米转化报道中，都选用了一带有VirB、VirC和VirG基因的超级双元载体pTOK233，以获取高效转化。Saito等(国际专利申请公开号WO95/06722)的报告公开了一种利用根癌农杆菌转化单子叶植物非去分化的未成熟胚小盾片的转化方法。
尽管小麦是全球分布最为广泛的谷类作物，遗憾的是至今尚未出现有关应用农杆菌转化法生产稳定可育转基因小麦的令人信服的方法报道。同样地，还没有发展出应用未成熟胚或愈伤组织生产稳定高效转基因小麦的方法。因此，本领域尚缺乏一种生产可育转基因小麦植物的农杆菌介导法。
2．发明概述
本发明提供了利用农杆菌介导的方法稳定转化单子叶植物尤其是小麦的新方法，力图克服本领域中这样那样的遗传学缺陷。
因此本发明的一个特别的目的是提供这样的技术，它能制备转基因可育小麦，最好是二倍体，并且该小麦已通过向其基因组中导入一或多个预期基因而获得稳定转化。
本发明由此广泛涉及到生产转基因小麦植物的方法。这里，转基因植物意指基因组中已掺入外源基因或DNA序列的植物，包括但并不仅限于给定细胞类型中那些非正常存在的基因或DNA序列，非正常转录和翻译(“表达”)的基因，或者任何其它预期要导入非转化植物的基因或DNA序列，比如可能正常也存在于非转化植物中但期望调整其表达的基因。
本发明可应用于任何植物种。对单子叶植物特别有用。更特别的，可应用于那些不能在不丧失再生能力的前提下长期保持愈伤组织状态的物种。本发明特别有用的物种之一是小麦。优选种包括小麦种Triticumaestivum、T.turgidum和T.monococum,对小麦种T.aestivum尤其有用。本发明应用于小麦的优越性在于其基因型非依赖性。也就是说，它可应用于各种类型的小麦品种，包括春小麦和冬小麦。应用本发明可以从冬小麦栽培种，如HY368、Neeley、FL302、RH91、R33、R1269和R585及春小麦栽培种，如Bobwhite和Marshall PAVOT1、UC702和Panewawa中生产转基因小麦植物。
本发明可用于导入外源DNA至可再生植物组织中。应用本发明方法，任何类型外源基因皆可被插入到植物种中。通常，“外源DNA”可定义为包括任何类型的来自于植物细胞外并被插入到该细胞中的DNA。将克隆DNA插入到合适质粒载体及适当的农杆菌转送株系操作技术已广泛为大家熟知。
外源DNA的类型可包括在该植物细胞已存在的DNA，其它植物来源DNA，不同有机体的DNA或体外产生的DNA，例如带有某一植物基因的反义基因的DNA序列，或者编码一核苷酸序列已被调整的某一基因的合成变型的DNA序列。
在优选实施方案中，选用根癌农杆菌C58 anopaline株系来介导向一小麦细胞中转化DNA。其它应用于本发明实践的优选株系包括章鱼碱株系LBA4404或agropine株系，如EHA101或EHA105。
优选方案中，外源DNA中包括一可在再生植物组织中承担筛选功能的DNA序列。该DNA携带的一个基因在可再生植物组织中发挥功能，生产一种化合物，它可以授予植物组织产生对其它某有毒化合物的抗性。本领域这些基因为大家熟知，可以提供针对某些化合物的抗性，这些化合物包括诸如卡那霉素之类抗生素(Dekeyser等，1989)，和诸如草甘膦(Della-Cioppa等，1987)和bialaphos(Vasil等，1992)之类除草剂。其它选择标记也可在本发明范围内加以应用。这些基因包括编码CP4、BAR、潮霉素、磷酸转移酶(NPT)和二氢叶酸还原酶(dhfr)的基因。
在一实施方案中，公开了一种生产转基因小麦方法，该方法一般包括建立起待转化小麦植物的培养物，利用携有包含待导入小麦基因组之遗传成分的DNA组分的农杆菌转化该培养物，确证或筛选转化细胞系，以及从该细胞系再生转基因小麦植物。
在另一重要实施方案中，该发明提供了一种生产可育的转基因小麦的方法。该方法包括从待转化小麦植物中建立可再生培养物，通过农杆菌转化导入含待转化遗传成分的DNA组分至上述小麦植物基因组中，确证或筛选转化细胞系；以及从该转化细胞系中再生出可育的转基因小麦植物。通过转基因植物完整的性循环可将转入的DNA传送给其子代，使得子代含有通过农杆菌转化导入亲本体内的一个筛选或报告基因拷贝，该拷贝整合到染色体上，能稳定遗传。
这些实施方案中，DNA构建物包括一个质粒，特别是诸如携带一个nptⅡ基因的重组质粒pMON18305之类。其它有兴趣的基因包括筛选或报告标记基因，例如下述任一基因，即编码GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(LUX)、CP4和nptⅡ的基因。转座子及相关的抗生素抗性标记基因的例子包括转座子Tns(bla),Tn5(nptⅡ)、Tn7(dhfr)、青霉素、卡那霉素(和新霉素，G418，博来霉素)；氨甲蝶呤(和三甲氧苄二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四环素。
植物体可用作筛选标记的特征在有关应用微生物报告中已被列出(新食品及工艺咨询委员会，1994年7月)。其包括：ⅰ)仅有最小数量非转化组织的严谨型选择；ⅱ)对再生无明显干扰的大量独立转化事件；ⅲ)可应用于大范围物种；ⅳ)分析识别出现标记物的组织的可靠性。如上提及，几种抗生素抗性标记能满足这些标准，这包括卡那霉素抗性基因(nptⅡ)、潮霉素B抗性基因(aphⅣ)和艮他霉素抗性基因(aacC3和aacC4)。更详细的列举和表述见表1。
表1类型                           实例氨基糖苷类抗生素1)磷酸转移酶(APH)            APH(3’)ⅡAPHⅣ2)腺苷转移酶(AAD)            ADD(3”)3)乙酰基转移酶(AAC)          AAC(3)-ⅠAAC(3)-ⅢAAC(3)-Ⅳ氯霉素氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-内酰胺类抗生素             TEM-1-β-内酰胺酶β-内酰胺酶2,4-二氨基喋啶酮二氢叶酸还原酶糖肽类                       TN5-博来霉素吡啶酮羧酸类                 萘啶酸抗性DNA促旋酶利福霉素类                   利福霉素抗性抗性RNA聚合酶大环内酯类                   红霉素抗性50S亚基甲基化四环素类                     细胞分泌抗生素结合核糖体70S亚基的S4和S18蛋白
已发展了多种可供选择的植物抗生素抗性标记(新食品及工艺咨询委员会，1994年7月)。这些还包括抗金属标记，带有营养缺陷型标记的互补系统，糖代谢标记，L-刀豆素抗性标记以及赖氨酸、苏氨酸和S-氨基乙基-L-半胱氨酸抗性标记。实例及附述见表2。
表2
标记                     实例
除草剂抗生               除草剂抗性标记可用作植物的可选择性
                         标记，例如草甘膦及溴苯腈耐受性。
金属耐受性               通过插入哺乳动物金属硫蛋白基因获得
                         金属耐受性。
赖氨酸、苏氨酸及S-       受几种反馈抑制环调节的天冬氨酸家族
氨基乙基-L-半胱氨酸      生物合成途径中的两种酶，经发展成为
抗性                     筛选标记物；毫摩尔浓度的赖氨酸和苏
                         氨酸(LT)即可抑制天冬氨酸激酶
                         (AK)活性；赖氨酸还抑制二氢吡啶
                         二羧酸合成酶(DHPS)活性，导致对
                         毒性赖氨酸类似物，S-氨基乙基-L
                         -半胱氨酸(AEC)敏感；而能表达大
                         肠杆菌的AK和DHPS酶基因的转基因
                         植物可在分别含有LT和AEC的培养基
                         上生长。
报告基因标记也可应用于植物，作为抗生素抗性标记的替代者。这类标记可用来检测已转入基因何时表达，或测量其表达水平。植物体中用报告基因来确认或标定已发生遗传修饰的细胞，只有在这种细胞修饰有效性高时才能很好发挥功能。常用的一些报告标记包括，β-葡糖醛酸酶(GUS)基因，在与5-溴-4-氯-3-吲哚-1-葡糖苷酸温育的组织中表达时会显现蓝色；细菌荧光素酶(LUX)的表达可在光照激发下检测；萤火虫荧光素酶(LUC)的表达可通过与底物荧光素温育后光激发检测，在与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷共温育组织中β-半乳糖苷酶表达可显现亮蓝色。
用于这些方法实践中的优先考虑的细胞包括未成熟胚、愈伤组织、或悬浮培养细胞。用来转化的优选农杆菌种为根癌农杆菌，尤其优选诸如C58LBA4404和EHA101株系。
待转化胚可以从未成熟颖果中新鲜分离，也可以是从未成熟颖果分离后，再经预处理的胚。从未成熟颖果中分离未成熟胚可在接种当天进行，也可在接种前1,2,5或更早进行。类似地，愈伤组织也可分离自未成熟胚或无胚胎植物细胞。在转化之前可以损伤胚组织。胚或颖果可在开花后两天或更迟时间内采集。选用悬浮细胞时，可以是单个细胞的培养物或细胞簇培养物。
这里所叙述的待转化DNA最好是个重组质粒，可以在待转化遗传成分上连有1或多个启动子区，和/或3’和/或5’-末端区。诸如CaMV35SFMV、泛素蛋白、水稻肌动蛋白或增强型CaMV35S启动子特别优选。
需要时，转化的植物可以生长，并能产生子代。这些子代可用来制备转基因种子，或者当与另一种转基因小麦植物进行有性生殖时，可制备出带有一个或更多感兴趣目的基因的可育转基因小麦。从这些子代中收获的种子可以萌发、播种，用于生产下一代转基因植物，这些后代带有最初转入亲本中的目的基因。
本发明实施方案之一，选用植物未成熟胚作为起始物，利用本领域已知方法可以制备得到未成熟胚。例如，Weeks等(1993)和Vasil等(1993)所述方法即可用于小麦未成熟胚的准备。
本发明另一实施方案中，选用愈伤组织作为可再生植物组织。在加有碳水化合物及植物生长调节剂的营养培养基中分离培养未成熟胚可以得到这些愈伤组织。在本发明优选实施方案中，如果是制备小麦胚愈伤组织，则Nehra等(1994)所述的胚轴消除并无必要。
愈伤组织培养基在本领域耳熟能详。任何一种组培培养基或制备方法皆可选用。在优选实施方案中，小麦未成熟胚在加有40g/L麦芽糖和约2mg/L 2,4一D的改良MS培养基中培养1天至1个月，优选4至7天，即可得到小麦愈伤组织。在另一实施方案中，以上所用2,4-D可以用0.5mg/L 2,4-D和2.2mg/L Pichloram(Chemservice)替代。固体培养基中另加有2g/L Gelrite(西格玛化学公司，圣·路易斯，MO)或4g/L低熔点琼脂糖。
转化后，将可再生植物组织置于生芽培养基上，该培养基还加有一种选择组分，它可以筛选出带有可选择性DNA序列的再生组织。这与现有技术不同，现有技术在可再生组织移至生芽培养基之前，一般先经历一段较长选择期。
该步骤可选用任何一种允许再生组织芽形成的培养介质。在实施方案之一中，一种生芽组分被加入培养基中。这些生芽组分在本领域众所周知(Mursahige和Skoog,1962；Kasha等，1970)。这些组分包括微量植物生长调节剂和低浓度的IAA、IBA和BA(Becker等，1994；Vasil等，1992)。本发明另一实施方案中，一种无植物生长调节剂培养基被用来诱导芽的形成(Weeks等，1993)。
在一优选实施方案中，为了再生出小麦胚愈伤组织，选用加有0.2mg/L 2,4-D的改良MS培养基(Mursashige和Skoog,1962；Wan和Lemaux,1994)。
本发明中转化后可再生植物组织一般要尽快放至这种培养基上。通常，这可以为1天至三周左右，但优选用1天至三周左右，最好是两到三周左右。更优选该组织转移至这种培养基的时间应选在转化后一周至两周左右。最好是在约5至11天之间进行转移。
用作筛选带有可选择DNA序列再生组织的组分，可以是任何一种相应的已知选择剂，例如抗生素和除草剂。优选组分包括遗传霉素(G-418)(氨基糖苷类抗生素)(Nehra等，1994)，草甘膦(Della-Cioppa等，1987)和bialaphos(Vasil等，1992；Weeks等，1993)。
在农业生物技术的商业应用上，可替代选择剂的可获得性是一种重要的需求。由于高水平的内源酶耐受，使得谷类作物中卡那霉素的应用变得不那么成功(Dekeyser等，1989)。在谷类作物转化中已广泛应用Bialaphos作选择剂(Weeks等，1993；Vasil等，1993；Becker等，1994；Nehra等，1994；War和Lemaux,1994)。然而，在所有转化研究中都选用bialaphos抗性基因作为筛选标记可能会带来潜在的灾难。其它筛选标记也是需要的，实验结果表明，这里描述的快速再生系统中，选用不同的选择剂效果同样不错。
芽形成后，这些芽转移至下一个生根培养基中，该培养基中还加有筛选组分，用于筛选带有选择DNA标记的再生组织。根据本领域已知方法，适量的芽发育完成时，就可以进行这种转移了。该转移过程，在小麦中约发生在转化后25至40天内。
这里可以选用任何已知的生根培养基。本领域中这些培养基为大家熟知(Weeks等，1993；Vasil等，1992)。可选用不带任何植物生长调节剂的改良MS培养基作为优选的生根培养基(Murashige和Skoog,1962,Zhou等，1992)。
形成根以后，植物就可以移栽至土壤里了。按照本领域已知方法培养，直至种子的收获。
本发明公开了一种利用常用于双子叶植物转化的常规双元载体，来转化单子叶植物，尤其是小麦和玉米的有效的可重复农杆菌介导法。本发明提供了快速有效的农杆菌转化及再生系统，对转化玉米和小麦尤其有用。从该系统再生出的植物表型正常且完全可育。转入的外源基因可遵循孟德尔规律转送给R1代。
本发明优选实施方案之一，提供了一种以新鲜分离的未成熟胚、预培养胚和来自未成熟胚的增殖愈伤组织作材料进行的快速有效的小麦转化系统。利用新转化系统获得转基因植物需时约三个月，这里所公开新方法的转化效率为可重复的0.3至4.3％。
从广泛的意义上来说，本发明提供了一种产生带有外源DNA的转基因单子叶植物的新方法。这个方法通常包括从植物体分离可再生组织，及用可再生组织与农杆菌共温育1至3小时和植物组织与农杆菌共培养2-3天，从而将外源DNA转入可再生组织中。待插入植物基因组的典型的外源DNA包括可选择标记的DNA序列，在再生组织中该序列可作为一种选择装置来发挥功能。然后这些细胞在愈伤组织培养基上生长约2天至5天左右，该培养基中加有可杀死农杆菌的抗生素。大约1至2周后，再生组织即被转移至生芽培养基中，这种培养基中还加有选择性组分，用来筛选带有可选择性DNA序列的再生组织；至少有一个芽形成以后，这些芽可以典型地转移至另一种培养基中，该培养基可促使芽上生根。
2.2外源基因
本发明的一个方面总体上涉及到转基因植物，它可以表达一个或多个由根癌农杆菌介导转入的外源基因。名词“转基因植物”，用在这里，是指已发生DNA序列整合的植物，包括但并不受限于，那些可能不曾正常存在的基因，不曾正常转录为RNA或翻译成蛋白(“表达”)的DNA序列，或任何期望导入非转化植物的基因或DNA序列，例如可能正常出现于非转化植物体但期望进行遗传改造或变更其表达的基因。值得注意的是，有些实例中，稳定导入转基因可使本发明涉及的转基因植物基因组增大，而另有一些实例中，导入的基因会替代内源序列。
可以导入的基因实例包括，例如来源于其它种的DNA序列或基因，或来源于或存在于相同种，但不是通过经典的有性生殖或繁育技术，而是通过遗传工程方法整合进受体细胞的基因或序列。然而，名词“外源”也可指非正常存在于待转化细胞中，或可能只是在形式、结构等等方面不是同一存在的基因，如同那些待转化DNA片段或基因，还可能是那些也正常存在但人为期望得到超量表达的基因。因此，名词“外源”基因或DNA被理解为可指任何被导入受体细胞的基因或DNA片段，无论在该细胞中是否已存在类似基因。
产生可育性转基因植物最初的一步是获取DNA组分，例如，载体、质粒、线性DNA片段，其中有待导入受体单子叶植物细胞的目标成分。用于转化这类细胞的DNA组分，当然，通常由待导入这些细胞的单基因或多基因组成。这些基因还可包括诸如启动子、增强子、多接头甚至调节基因等结构。
载体、质粒、粘性质粒，YAC(酵母人工染色体)和用于转化这些细胞的DNA片段，通常当然包括cDNA、基因、或者是待转入单子叶植物的基因序列。这些DNA组分还可进一步包括启动子、增强子、多接头、或所需的调节基因。这些DNA片段或基因可以编码，在重组细胞中表达，和/或在再生植物体中产生改良表型的天然或修饰蛋白或多肽。
为了提高转化体确认的能力，可以设计和用筛选标记或报告基因作为(或增加)可表达的目的基因。标记基因表达所显现的表型应能使表达与不表达该标记基因的细胞相互间明显区别开来。这类基因可编码一筛选或报告标记，这取决于标记物能否传达一种可以通过化学方式识别选择的特性，亦即通过某种筛选试剂的使用(例，一种除草剂，抗生素，或其类似物)。本领域已知的多种适宜标记基因实例可以用于本发明的实践。
本发明应用涉及到的筛选标记物，包括但不仅限于，nptⅡ基因；编码bialaphos抗性的bar基因；编码草甘膦抗性的突变型EPSP合成酶基因；可抗溴苯腈的腈酶基因；可传达咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变型乙酰乳酸合成酶基因(ALS)；或氨甲喋呤抗性DHFR基因。
典型的报告基因包括β-葡糖醛酸酶或UidA基因(GUS)，已知其所编码酶的多种产色底物；β-内酰胺酶基因，荧光素酶基因，xylE基因，α-淀粉酶基因，酪氨酸酶基因，α-半乳糖苷酶基因，或本领域已知的其它任何一种适合的筛选标记。
在本公开材料引导下，对于本领域技术人员来说，显而易见地会有数目众多的其它可能的筛选或报告基因可供选择。因此，下面的讨论倾向于寻求典型而非穷尽列举。尽管本公开材料是通过应用nptⅡ和GUS基因的典型作例，构建和使用任何其它筛选或报告标记基因的应用技能，在本公开材料指引下，都不会超出本领域技能的范围。
通常根据转化的目的，来选择待转至受体细胞的特定DNA片段。谷类作物转化主要目的之一在于，为植物增加一些商业上有利农艺上重要的特性。这类特性包括，但不仅限于，抗除草剂、提高农作物产量、抗病虫害、体型、可食部分比例和产量，等等。例如，能够导入农作物并掺入基因组中的一个或多个编码杀虫肽的基因，包括可抗鳞翅目及鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌的晶体毒蛋白基因。本领域技术人员对这类基因耳熟能详，它们可望用于在这里公开的单子叶植物，比如小麦的转化方法的实践中。
2.3转基因植物
本发明重要方面之一是可育可耕作的转基因小麦植物。这些植物的基因组通过导入一预选择的遗传组分而增长，并产生转基因植物。这些转基因通常包括一遗传组分，该组分包括位于一个或多个预选择遗传调控元件或启动子控制下的一个或多个外源基因。这种植物优选由本文描述的方法产生，它包括体外准备一包括待导入小麦基因组的遗传成分在内的DNA组分，利用农杆菌转化法将其导入受体小麦细胞中。典型地，该遗传成分包括一个或多个以上所述的筛选或报告标记基因。转化后，从接受了外源基因的细胞中再生出完整的小麦植株。通过遗传组分的稳定导入使其基因组增效，获得可育的转基因植物。
在该方法中，转化细胞可以已脱分化，或继续脱分化，并在分化及成长成植株前可以保持脱分化状态生长一段时间。在优选实施方案中，受体细胞可包括未成熟胚、愈伤组织、或悬浮细胞。胚可由未成熟颖果中新鲜分离，也可经未成熟颖果中分离后在接种前再处理一下。未成熟胚可在接种当天从上述未成熟颖果中分离，也可提前为接种前1或2天，或5或10天，甚至更长时间。既可选用开始开花后1或2或更多天后的胚，也可以从花落后1或2天或更多天的颖果中获得胚。
选用愈伤组织作为受体细胞时，从未成熟胚或非胚性细胞中可以分离得到愈伤组织。在某些情况下，转化前的胚损伤可以促进转化效率。
这里公开的是可育性转基因小麦植物，它的遗传背景已通过导入带有功能性预选遗传元件的DNA组分而改变。这类遗传元件包括选自下组的转基因：nptⅡ基因、bla基因、nptⅡ、dhfr、aphⅣ、aacC3、aacC4基因和GUS基因。尤其优选那些编码草甘膦抗性的基因，或诸如nptⅡ基因之类的可接受标记基因。
受体细胞可由多个外源基因共转化，在该情况下，外源基因可以位于单个DNA片段中，也可在一个或多个分别受不同调控元件所控制的质粒上。尤其优选的质粒是诸如pMON18365、pMON32614、pMON30053、pMON25457、pMON30052和pMON19450之类的重组质粒。基因可受控于诸如CaMV35S、泛素、水稻肌动蛋白启动子或增强型CaMV35S启动子。适宜时待转化DNA片段中还包括分别接在基因两端的附加5’和/或3’区。
2.4转基因子代、种子及衍生细胞系
本发明涉及其它重要方面，包括用所公开方法制得的转基因植物子代，及由其衍生的细胞和从其收获得的种子。
3．附图的简要描述
这些附图也是本说明书的一部分，并演示了本发明的某些内容。参考这些附图，结合这里列举的特定实例的详述，可能会更有利于对本发明的理解。
图1为pMON18365质粒的结构，它是本发明所用农杆菌质粒的一种。在T-DNA区，一增强型35S启动子和玉米HSP70内含子区负责驱动GUS和nptⅡ基因的转录表达。GUS基因自身也带有两个内含子。
图2显示用于构建pMON18365的pMON18364质粒的结构。
图3显示用于构建pMON18365的pMON18342质粒的结构。
图4显示用于构建pMON18365的pMON19476质粒的结构。
图5显示用于构建pMON18365的pMON18361质粒的结构。
图6显示pMON32614质粒的结构。
图7显示pMON25457质粒的结构。
图8显示pMON30053质粒的结构。
图9显示pMON30052质粒的结构。
图10显示pMON19450质粒的结构。
图17显示用这里所公开方法转化未成熟胚的一般流程。d代表天数，w代表周数。
图12显示用这里所公开方法转化悬浮细胞的一般流程。
4．说明性实例的描述
4.1本发明的某些优点
本领域技术人员会认识到本发明方法及组分的许多方面的优越性。以下列举了一些这类优越性：
4.1.1利用常规双元载体获得有效转化
本发明所用实验都选用常规双元栽体pMON18365，绝大多数实验都获得有效转化结果。该事实说明超级双元载体也可以不必需，尽管已知它对于玉米的高效转化是必需的(Ishiela等，1996)。
4.1.2可选用不同类型外植体进行转化
本发明曾选用不同类型外植体用于农杆菌的侵染，这些外植体包括未成熟胚、胚愈伤组织和悬浮细胞。从所有这些外植体都产生了稳定转化体(来自于悬浮细胞的克隆和由胚及胚愈伤组织形成的植物体)，这使得本发明优于其它已公布的经由农杆菌的转化系统，如应用于玉米的转化系统中，只有新鲜分离的未成熟胚才能用于生产转基因植物(Ishida等，1996)。
4.1.3有效快速地产生稳定转化体
表4和7显示农杆菌侵染后短暂时间内，在外植体中可观察到GUS基因的高效瞬时表达。利用悬浮细胞接种的实例表明，在含有诸如G418之类选择剂的培养基上经选择培养40-60天，由1毫升细胞可恢复得到大约200个稳定转化体(集落)。被侵染的未成熟胚和愈伤组织块培养在加有G418的选择培养基上，接种几周后即可发育出转化植物小体。从农杆菌侵染到转化体移栽至土壤中仅需约3个月的时间。这些产生转基因植物的实验中，稳定转化效率在0.3至4.3％的范围内(转基因成功数/接种的外植体数)(表5)，这相当或更高于其它已发表的转化系统(Vasil等，1992，1993；Weeks等，1993；Nehra等，1994；Becker等，1994；Zhou等，1995)。转基因植物具有正常形态学表型，且完全可育。
4.1.4转基因后代遵循孟德尔分配规律
曾对两例中4个起始转化植物体后代(R1代)的转基因表达进行过研究。R1代(表6)个体(种子和植株)中约有3/4经观察具有GUS活性，这表明基因在遗传至后代中遵循孟德尔规律。没有观察到植株出现不正常表型。
4.1.5可再生转基因植物的生产
在5项研究(7类不同处理)(表3)中，已确认发生了9例转基因事件。来自于ExpAG2和AG13的3例转基因事件中，有5棵植株进行过Southern杂交分析。结果表明所有5棵转基因植物的基因组中都整合有转基因。通过GUS组织化学分析，另有6例转基因植株(ExpAG22，AG25和AG30)也已经得到证实。它们或栽培于土壤上，或移栽在圣代(Sundae)杯中，都有适度至很高的不同强度的GUS活性。两项研究所显示转化效率分别为2.7％和2.1％。
所有实例都产生于接种的胚愈伤组织或预培养的未成熟胚(IEs)(表4)。研究中所选用的接种方法和条件有多种。结果表明，农杆菌介导的小麦转化是可重复的，胚愈伤组织和预培养IE是适于农杆菌侵染的外植体。
4.1.6 R1代中GUS活性呈3∶1分离
通过体外萌发R1代未成熟胚，已得到由ExpAG13(表3)产生的3例转基因植物R1代植株。移栽至土壤中的R1代植株具有GUS活性。除去胚的未成熟种子沿纵轴切成两瓣，用于GUS组织化学检测。从一些萌发胚中得到的小盾片组织也被用于GUS分析。每个种子的母体组织，果皮，都呈现预期阳性。然而，种子糊粉层及胚小盾片组织的GUS活性出现阳性或阴性。X2检验(表2)显示GUS阳性与GUS阴性植株比率已与3∶1分配规律无明显差异，这表明转基因极有可能以单位点掺入。
表3
农杆菌介导的转化所产生的转基因事件
Exp-Trt 外植体 #块数 接种(％)2 #事件(植株)1 转基因事件(TE)
AG2-05 3-W愈伤组织 73(大) 3h真空渗透 2(2) 2.7
AG13-03 2-W愈伤组织 47(大) 真空接种 1(3) 2.1
AG22-05 10-d愈伤组织 239(小) 3h，浸透 1 NA
AG22-06 25-d愈伤组织 308(小) 3h，浸透 1 NA
AG25-24 6-d未成熟胚(IEs) 40 3h，浸透 1 NA
AG30-02 3-d IEs 98 3h，浸透 1 NA
AG30-05 3-d IEs 104 3h，浸透 2 NA
表4
R0代值物后代种子小盾片组织或糊粉层GUS活性检测
       R0代    #R1种子分析   #GUS阳性种子数   #GUS阴性种子数   Chi方值1
AG13-03-02-01      31      22       9     0.27
AG13-03-02-02      28      22       6     0.19
Ag13-03-02-03     124      96      28     0.387
1该值是基于3∶1分配假说计算的，在α=0.05和df=1时的标准值为3.84，比上表中任一Chi方值都大。因此，所有的分离比率与3∶1假说均无明显差异。
4.1.7基于EPA和FDA认可的选择标记方法
尽管已公开方法涉及的相关农作物，许多都依赖于潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为选择标记，本发明突破了其限制，可选用nptⅡ作为筛选标记。
nptⅡ基因(编码新霉素磷酸转移酶)是本领域最为广泛接受的选择标记，环境保护委员会(EPA)已认可它作为杀虫惰性剂。其外，食品和药品管理局(FDA)也认可其为间接食品添加剂，这使得它优于其它没有被这些机构认可的诸如潮霉素之类的选择标记。
4.2与已有水稻和玉米转化系统的差别
本发明与近来用于其它农作物的转化方法有相当大的差异。与以往水稻转化方法不同的是，本方法接种时勿需高渗处理。本发明也不同于以往的玉米转化方法，因为它所选用的外植体并不受仅能选用新鲜分离未成熟胚的限制。本发明在预培养未成熟胚或愈伤组织中的应用效果也很好，并不仅限于新鲜分离的胚组织。
与前述工作的另一重要差别在于，本发明方法可应用于本领域为大家熟知的标准双元质粒，并不依赖于前人报告上所公开的“超级”双元质粒的构建和应用。这些双元质粒是应用于大多数双子叶植物转化中的最普通类型，本领域技术人员选用这里所公开方法时，这些质粒的获得肯定是不成问题的。
以下实例属于演示本发明优选实施方案的范畴。本领域技术人员肯定能从中认识到下列实例所公开的代表发明者所发现的在发明的实践中能很好地发挥功能的技术，因此可以看作为本发明实践中的优选模式。然而，本领域技术人员还应该理解，所公开的具体实例在不违背本发明精髓和范围的前提下，可以进行许多种变通，仍能获得相近或类似的结果。
5．实施例
5.1实施例1-选用未成熟胚进行转化
5.1.1外值体的准备
此研究选用春小麦Triticum aestivum cv．栽培种白喉鹑(Bobwhite)作实验材料。留种植物生长于可控生长培养室中，光周期16小时，光强800μmolm-2S-1，由Sylvania高能放光(HID)系统(GTE产品公司，曼彻斯特，NH)提供。日/夜恒温为18/16℃。未成熟颖果采集于花后14天植株，接种前经无菌操作剖开，培养于以下任一预培养介质中：1)半固体愈伤组织诱导培养基CM4或CM4C(表5)上培养1-6天；2)加有浓度各为0.25M棉子糖和甘露糖醇的液体培养基上培养1天；3)具1/10强度MS盐并另加有10g/L葡萄糖、3.9g/LMES的液体CM4培养基上培养1至3小时。所有的培养温度23-25℃范围内进行。
表5
基本培养基外的补充组分1
组分 CM4 CM4C MMS.2C MMSOC MS1WSM4 MS2WCM4
 2,4-D(mg/1) 0.5 0.5 0.2 - 1.0 2.0
 Pichloram(mg/L)2 2.2 2.2 - - - -
麦芽糖(g/L) 40 40 40 40 - -
蔗糖(g/L) - - - - 20 20
谷氨酰胺(g/L) 0.5 0.5 - - - -
氯化镁(g/L) 0.75 0.75 - - 0.75 0.75
酪蛋白水解产物(g/L) 0.1 0.1 - - - -
 MES(g/L) - 1.95 1.95 1.9S - -
抗坏血酸(mg/L)2 - 100 100 100 - -
Ⅰ-天门冬氨酸(g/l) - - - - 0.15 0.15
盐酸硫胺(mg/L) - - - - 0.5 0.5
胶凝剂(g/L)3 2(P) 2(p) 2(G) 2(G) - 2(P)
1所有培养基都含有Mruashige和Skoog(1962)培养基的基本盐分(MS基本盐分)和维生素(MS维生素)，只有特别说明的除外。每种培养基的pH皆调到pH5.8。
2过滤除菌，培养基高压灭菌后加入。
3 PhytogelTM(P)或Gelrite(G)。
4该培养基中不加MS维生素。
5.1.2农杆菌的培养
所有研究皆选用带有双元载体pMON18365(图1)的已去毒根癌农杆菌株系C58(ABI)。pMON18365 T-DNA(转移DNA)区含有带一内含子的GUS(UidA)基因和一nptⅡ基因作为选择标记。这两个基因都受增强型CaMV35S启动子调控。农杆菌培养物来源于加甘油保存的原始种，在加有终浓度皆为50mg/L的卡那霉素、链霉素、四环素，及25mg/L的氯霉素和200μM乙酰丁香酮的液体LB培养基(Miller,1972)中，于25-26℃摇荡(150rpm)培养过夜，使其生长至对数中期(OD660值为1-1.5)。离心收集农杆菌细胞，并重悬于加有1/10强度的MS盐分，并补加10g/L葡萄糖和200μM乙酰丁香酮的CM4或CM4C(表4)接种培养液中。适于接种的农杆菌细胞密度应调整至OD660值为2。
5.1.3接种与共培养
暂时培养于液体预培养介质3中的未成熟胚组织(IEs)被转移至盛有农杆菌细胞悬液的培养皿(25×100mm)中。农杆菌与IEs的比率约为30ml∶200IEs。一种表面活性剂，Silwet(孟山都，圣·路易斯，MO)被加入到接种培养液中，终浓度为0.01-0.075％。暗处23-25℃，3小时完成接种。接种以后，通过抽真空或用移液吸管除去农杆菌悬液，IEs随后放至加有10g/L葡萄糖和200μM乙酰丁香酮及1/10强度的MS盐份和1.5mg/L额外的2,4-D的共培养培养基CM4或CM4C中。胚的小盾片面朝上，暗处25℃与农杆菌共培养2-3天。以下方法曾用于预培养未成熟胚(培养基上培养1至6天)的农杆菌接种：1)浸入农杆菌细胞悬浮液中1-3 小时；2)IEs首先浸于盛在培养皿或细胞培养瓶中的农杆菌细胞悬浮液里，随后放置于干燥器内，经室内抽真空系统直空抽气3小时。有些研究中加入0.01％的Silwet于接种培养基中。接种后，用消毒滤纸浸吸未成熟胚，再转移至以下任一共培养介质中：1)加有10g/L葡萄糖和200μM乙酰丁香酮的半固体CM4或CM4C培养基(表5)；2)加有1/10强度MS盐分并补充10g/L葡萄糖和200μM乙酰丁香酮的液体成半固体CM4C培养基。有些研究中曾在培养基上放一张滤纸(Whatmanl号)；3)加有1/10强度的MS盐分和3.9g/LMES，并补充10g/L葡萄糖和200μM乙酰丁香酮的液体CM4或CM4C培养基。未成熟胚的小盾片面朝上，放置于培养基或滤纸上。在液体培养介质中进行胚的培养时，可在一盛有6片Whatmanl号滤纸(8.5cm)的培养皿(15mM×100mM)中加入8ml液体培养基，作为培养平台。外植体应在暗处与农杆菌共培养2至3天。共培养后可用加有500mg/L羧苄青霉素的CM4或CM4C液体培养液(延迟培养液)浸洗未成熟胚。已感染的未成熟胚在固体延迟培养基上共培养2-5天。图6显示这些转化方法的一般流程。
5.1.4 T-DNA的转送效率
延迟选择培养2-3天后，利用GUS瞬时表达分析法检测了T-DNA的转送效率。大部分研究中都观察到高水平的GUS瞬时表达，表明T-DNA转送是相当有效的。在多种外植体中曾观察加入表面活性剂Silwet至接种培养基中对T-DNA转送的影响。如表6所示，0.05-0.1％浓度的Silwet可明显增强新鲜分离未成熟胚中GUS的瞬时表达。在利用预培养IEs和胚性愈伤组织作接种用外植体实验中，也曾观察到类似结果。对于预培养1或2天的未成熟胚，GUS小点大多沿较少有胚愈伤组织发育的小盾片周边分布。而在预培养3天或更长时间胚中，GUS小点则位于整个愈伤组织区。
表6
接种培养基加有表面活性剂对GUS表达的影响1
Silwet(％)0.000.010.050.10.5     GUS阳性小点/外植体7.817.61491111 外植体数W/GUS阴性小点/总外植体(％)11/34(32)15/19(79)13/13(100)8/8(100)1/1(100)
1外植体选用接种前几小时分离的未成熟胚(IEs)。
5.1.5筛选与植物再生
延迟培养基上培养2至5天后，经农杆菌侵染的未成熟胚转至加有25mg/LG418和250mg/L羧苄青霉素的CM4或CM4C(表5)愈伤组织诱导培养基中。在转移至1号再生培养基，即加有25mg/L G418和250mg/L羧苄青霉素的MMS.2C(表5)培养基之前，未成熟胚在这里进行2至3周的愈伤组织诱导培养。在向再生培养基转移时，每片愈伤组织被分成几个小片(直径约2mm)。经1号再生培养基培养2周后，幼苗和活的愈伤组织被转移至2号再生培养基，即加有与1号同浓度的G418和羧苄青霉素的MMSOC(表5)培养基中继续培养。后来被证实已转化的植物小体在该培养基上茁壮生长，形成发达的根系统。这期间仍有一些植物小体显示对G418的某种程度抗性。它们也能生长良好，形成1或多条根，可转入盛有上述2号再生培养基的圣代杯(有脚座的大浅杯)中(Sweetheart制杯公司，芝加哥，IL)，进一步进行生长和筛选。这期间可从某些植物小体上取叶样，进行GUS组织化学检测。然而，具抗性表现但在该期无GUS活性的植物小体并没被清除。在杯中生长期间，大多数非转化体死亡，或出现对G418敏感的信号。具G418高度抗性植株(茁壮生长，具发达根系)在长高至杯顶前被移栽至土壤中。所有起始于同一胚的植株都认作是同一转化事件中的兄弟种。
5.1.6植物转基因特性的确认
生长于环境可调控的生长温室里的植物，其生长条件如前述。由于从接种到大多数植株移植至土壤中仅需约3个月时间，在这些植物中没有出现可见的不正常表型，而植物长期体外培养常会受该问题困扰。这些植株完全可育。每株都曾接受过以下任一或多种方法检测：
(1)选择植株不同部位进行GUS组织化学活性检测(Jefferson,1987)。
(2)生物学分析(叶片脱色分析)。去头前，从充分展开的最柔嫩叶片上取叶样(长约5-7mm)，并置于24孔细胞培养板中(Costar有限公司，剑桥，MA)。每孔中充满着加有300mg/L巴龙霉素(Sigma)和100mg/L苯菌灵(杜邦生产的一种杀菌剂)或单加100mg/L苯菌灵的0.5ml水溶液。从每一植株的同一叶片上取三个叶样，分别置于2个加有巴龙霉素和苯菌灵的培养孔和1个仅加苯菌灵的培养孔中。从非转化型白喉鹑植物种取叶样作阴性对照。将叶样放置于干燥器内，经室内抽真空系统进行真空浸润5分钟，然后用Parafilm膜封好培养板，放置光下(140μmolm-2S-1)培养。60小时后就可以看到结果。具高度抗巴龙霉素特性的叶样的除两边(＜1mm宽)外的主要区域仍保持绿色，这表明该植物体内已转入nptⅡ基因。从没有该基因或该基因无功能植物体上所取叶片作为阴性对照，会被巴龙霉素全部漂白，或仅存小块绿斑。
(3)Southern杂交杂析(Southern,1975)。基因组DNA沿用Shure等(1983)的方法从植物叶片组织中分离。用限制性核酸内切酶BamHI消化15μg基因组DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离。根据标准程序(Sambrook等，1989)将DNA转移到Hybond N膜上(Amersham,Arlington Heights,IL)。通过电泳纯化质粒pMON18365(图1)经NcoⅠ酶切得到的977bp片段，作为检测nptⅡ基因的探针。使用随机引物标记盒(Prime-ItⅡfrom Stratagene,La Jolla,CA)对该片段进行32P dCTP标记，得到比活性为2.6×109cpm/μg。将膜浸在含50％甲酰胺，5×SSC,5×Denhardt’s,0.5％SDS,100μg/ml tRNA的杂交液中，于42℃杂交14小时。终洗脱条件为60℃下于含0.1％SSC和0.1％SDS溶液中洗脱15分钟。
5.1.7稳定转化的效率
通过上述方法分析植物体，可以得出每项研究中转基因事件数。转化效率(转基因事件数/未成熟胚总数)在不同的研究及生产转基植物的不同处理条件下有所变化(表7)。然而，它们仍相当于或高于任何已公布的转化小麦效率(Vasil等，1992,1993；Weeks等1992；Nehra等，1994；Becker等1994；Zhou等，1995)。
表7
生产转基因小麦的稳定转化效率
实验编号 外植体 IEs或愈伤组织小块数(A) 转基因事件数(B)1 效率(B/A％)
AG2-0.5 21-d愈伤组织，完整 73 2 2.7
AG13 14-d愈伤，完整 47 1 2.1
AG22-05 10-d愈伤，～2mm 239 1 0.4
AG22-06 25-d愈伤，-2mm 308 1 0.3
Ag22-11 10-d愈伤，～2mm 232 1 0.4
AG25-24 6-d IEs 40 1 2.5
AG27-15 1-d IEs 23 1 4.3
AG29-04 5-d IEs 97 1 1.0
AG30-02 3-d IEs 98 1 1.0
AG30-05 3-d IEs 104 2 1.9
AG30-08 3-d IEs 36 1 2.8
9528 0-d IEs 160 1 0.6
9531 17-d愈伤完整 50 1 2.0
9602 0-d IEs 250 3 1.2
9604 0-d IEs 700 1 0.14
9608 0-d IEs 124 1 0.8
9609 0-d IEs 140 2 1.4
9614 0-d IEs 38 1 2.6
9620 15-d愈伤，完整 110 3 2.7
1每次转基因事件可以有一个或多个转基因植株。
5.1.8转基因植物子代分析
开花后约20天，从具nptⅡ和GUS活性的原始转基因植物(R0代)中收获未成熟颖果。分离出未成熟胚，并培养于MMSOC培养基(表5)中，用于植物萌发(培养皿中约需时1周，含有同样培养基的圣代杯中则还需时1周)。去胚的每一未成熟颖果皆沿纵轴切成两瓣，移至96孔细胞培养板(Costar有限公司，剑桥，MA)的单孔上，用于前述GUS组织化学活性检测。从每个萌发胚中也取出部分小盾片组织用于GUS检测。植株(R1代)萌发约2周后，移至土壤中，分别取叶和花组织进行植物体的GUS组织化学分析。
正如同所期望的那样，每个未成熟颖果的母体组织，果皮，皆具GUS活性。然而，多数而非全部颖果的糊粉层具GUS活性，少数的则没有。Chi方值检验(表8)表明具GUS阳性糊粉层的颖果数与GUS阴性糊粉层颖果数之比，与3∶1的比值无明显差别。颖果GUS分析结果与小盾片组织及后来的叶和花组织的GUS分析结果吻合得很好。尽管糊粉层及小盾片组织的GUS活性似乎要比叶和花组织要强得多。
表8
R1代种子与植株中GUS活性分配规律
R0代值物 分析的R1代种子(植株)数 GUS阳性数 GUS阴性数 Chi方值1
16612166131661416953 3128124128  222296103  962825  0.270.190.3872.04
1该值是基于3∶1分配假设计算的。在α=0.05,df=1处的标准值为3.84，比上表中任一Chi方值都大。因此，所有分离比率与3∶1假说均无明显差异。
5.2实施例2-胚愈伤组织转化
5.2.1准备外值体
从花后14天的未成熟颖果中分离得到栽培种小麦(Triticumaestivum L1)白喉鹑种的未成熟胚，小盾片面朝上，培养于愈伤组织诱导培养基CM4或CM4C(表9)中。10天或更长时间后，未成熟胚发育成为胚愈伤组织。每个愈伤组织小块直径约5mm或更大一些。通过农杆菌介导接种那些未弄破(完整)的愈伤小块，或者仅选择最大的胚愈伤组织部分，用消毒尖嘴弄成小块(直径约2mm)，用于接种。
5.2.2接种和共培养
利用已述方法准备农杆菌细胞悬浮液，任选以下方法之一来接种愈伤组织小块：
1)愈伤组织小块浸在农杆菌细胞悬液中3小时；
2)真空抽气状态下将愈伤组织小块浸在农杆菌细胞悬浮液中3小时；
3)完整愈伤组织小块放置在一块用液体接种培养基饱和的消毒滤纸上。上述方法即可完成愈伤组织小块接种，也可在接种前用消毒刀片轻压愈伤组织小块，直至“薄煎饼”状。每片放有愈伤组织小块的滤纸均转移至连有一室内抽真空系统的150毫升过滤系统(Corning,Inc.Corning,NY)中，或一通过滤瓶连着真空抽气系统的布氏漏斗中。抽真空系统开启后，即可用农杆菌细胞悬液缓缓滴向愈伤小块(每6片愈伤小块滴加量大于1ml)。细胞悬浮液滴完后，抽真空系统继续工作10分钟。经以上任一方法接种的愈伤组织小块，被移至分别容纳有6片Whatman滤纸(1号，8.5cm)的培养皿中，其内充满8ml共温育培养基(加有1/10强度MS盐组分，并补充10g/L葡萄糖和200μM乙酰丁香酮的CM4或CM4C)。用Parafilm膜封好。共温育3天后，用液体延迟培养基(补加500mg/L羧苄青霉素的CM4或CM4C)清洗愈伤组织小块，再用消毒滤纸片吸去外沾液滴。愈伤组织小块在转移至选择性愈伤组织诱导培养基之前，被培养在半固体延迟培养基中3天。
5.2.3 T-DNA转送效率
农杆菌共培养或延迟期过后，愈伤组织小块经随机取样进行GUS组织化学分析(Jefferson,1987)。如表11所示，大多数被分析的愈伤小块皆有GUS阳性小点。有些研究中(如实验AG13)，每片分析的愈伤小块都有GUS阳性小点。每片愈伤小块上GUS阳性小点的数目从几个至100左右不等。实验AG13中，在接种两周后取样进行GUS组织化学分析，所有被分析的16片愈伤组织中都有一些GUS阳性小点，其中有7片(44％)GUS阳性斑逐渐扩展，表明已转化细胞正在增殖。
表9共培养后的愈伤组织GUS组织化学分析所显示的T-DNA转送效率
实验代号 外植体 IE数w/GUS阳性小点(分析的IE总数) 每个GUS阳性IE上的斑点数
AG2-5 21-d愈伤，完整 1/19 1-5
AG13 14-d愈伤，完整 25/25 数个-～50
AG22-5 10-d愈伤，～2mm 6/15 数个
AG22-6 25-d愈伤，～2mm 7/10 一些-～100
AG22-11 10-d愈伤，～2mm 12/20 一些-一打
5.2.4筛选与植物再生
在愈伤组织筛选诱导培养基(加有25mg/L G418和250mg/L羧苄青霉素的CM4C)上培养那些在接种过程中始终保持完整的愈伤组织小块，或那些在转移至培养基时被弄碎成许多小片(～2mm)的愈伤小块。已接种的小块愈伤组织片被完好放置并培养于该培养基中。2至3周后，将愈伤组织小块转移至再生培养基上。再生程序与实施例11已述部分一样。
5.2.5转化效率
再生的植物无可观察到的不正常表型，且完全可育。所有植株皆通过实施例1所述的各种生物学分析，GUS组织化学分析，和/或Southern杂交分析。和用不同龄期愈伤组织进行的7例实验(表9)总共产生出10次转基因事件。转化效率(转化事件数/愈伤组织块数)从0.3至2.7％不等。
5.2.6转基因植物子代分析
利用实施例1所述方法分析R1代植物。
5.3实施例3-悬浮细胞转化
5.3.1准备外植体
小麦栽培种Mustang悬浮细胞在暗处28℃摇荡(250rpm)培养于液体MS1WSM(表9)培养基中。经3天亚培养后收获细胞，用于农杆菌接种。图7给出了转化悬浮细胞的一般流程。
5.3.2农杆菌培养与T-DNA转送
农杆菌培养方法与实施例1所述基本相同。在接种培养基(加有1/10强度MS盐份和3.9g/L MES并补充10g/L葡萄糖和200μM乙酰丁香酮的CM4培养基)上调整农杆菌细胞密度，使其OD660值调整至0.5-1。通过抽真空除去小麦悬浮培养物上的培养液组分。在(100×25mm)培养皿中每ml小麦细胞混入3ml农杆菌细胞悬浮液。在23至25℃下30分钟至4小时完成接种。接种完，经农杆菌侵染的小麦细胞转移至加有一片消毒Whatman滤纸的培养皿(100×15mm)内。该滤纸片已依前述方法用液体培养液浸透。共培养平板置于暗处23至25℃培养2至3天。
5.3.3转化集落的收获
共培养后的已接种细胞，移至加有500mg/L羧苄青霉素的瓶装液体MS2WCM培养液(表9)中，轻微摇荡培养1天时间，然后平铺于浸在加有用于筛选的25mg/L G418或50mg/L巴龙霉素及250mg/L羧苄青霉素的固体MS2WCM中的消毒滤纸片上。经过40至60天筛选，可收获抗性集落。根据所收获的转化集落数目可判断其转化效率相当高。1ml接种细胞中一般可收获大约200个独立的转化集落。
5.3.4影响转化效率的因素
接种及共培养过程中已知有三种因素明显影响悬浮细胞的转化效率。这些因素包括接种和共培养温度，接种和共培养时期，以及用于接种的农杆菌细胞密度。如表10所示，最佳接种和共培养温度为23至25℃，而在19℃或28℃时转化效率明显降低。最佳接种时间段为30分钟(表11)，2至3天共培养可以获得高转化效率。1天或更短的共培养时间明显降低转化效率。接种时最佳农杆菌细胞密度为OD660值0.5(表12)。更高或更低农杆菌密度皆减低转化效率。
表10
接种与共培养过程中温度对悬浮细胞稳定转化的影响
温度(℃)     GUS阳性集落数/每ml接种细胞
19232528     52.5±19.36290±70.83273±65.43132.5±22.6
表11
接种和共培养时间对悬浮细胞转化的影响
时期 持续时间(h) GUS阳性集落数/每ml接种细胞
接种共培养  0.5123414244872  351.25±29.23178.5±23.1186.75±23.10202±51.37152.25±29.684±0.8253±4.24232.5±26.29258.5±15.26
表12
农杆菌细胞密度对悬浮细胞转化的影响
农杆菌细胞密度(OD660)     GUS阳性集落数/每ml接种细胞
0.100.250.501.002.00     79±4.97174±53.67260.25±45.33172±51.04159±70.06
5.3.5转化集落的确认
通过上述GUS组织化学方法可以确认转化是否发生。51例G418抗性集落样品经过GUS活性检测。51个集落中有49个具GUS阳性活性。在这中间，有15例进行了Southern印迹分析，这些样品均有与nptⅡ探针杂交的高强度信号。这些结果表明共表达机率接近100％。
5.4实施例4-悬浮细胞转化
5.4.1农杆菌的构建
类似于来自于根癌农杆菌Ti质粒的植物转化载体，例如Herrera-Estrella等(1983)，Bevan等(1983)，Klee等(1985)和EPO公开号120,516(Sehilperoort等)所公开的那些载体，经构建用于小麦的转化。通过限制性内切酶NotI和HindⅢ完全消化pMON18342(图3)，去除P-nos/nptⅡ/nos 3’片段，分离5.7Kb片段，得到用于小麦的农杆菌双元载体pMON18364(图2)。该5.7Kb载体主骨架片段中含有可在大肠杆菌中复制的Ori-322复制启始位点和可在农杆菌中复制的Ori-V区，以及用于筛选的细菌壮观霉素和链霉素抗性标记基因。利用限制酶NotⅠ和HindⅢ完全消化pMON19476(图4)，凝胶电泳后分离2.7Kb插入片段，可以分离出P-e35s/hsp70内含子/kan/nos 3’嵌合片段。通过T4 DNA连接酶将NotⅠ、HindⅢ双切得到的2.7Kb的P-e35s/hsp 70内含子/kan/nos 3’片段与NotⅠ、HindⅢ双切得到的5.7Kb载体主骨架片段连接，即可得到上述的pMON18364双元载体。连接产物转化Novablue细胞，通过壮观霉素抗性筛选。由该单向克隆得到的转化菌落生长于液体培养基上，利用限制酶HindⅢ和EcoRⅤ酶切分析DNA是否含有P-e35s/kan/nos 3’嵌合基因。在构建报告基因时，可用HindⅢ消化pMON18361(图5)，并分离回收含有P-e35s/hsp70内含子/GUS/nos 3’嵌合体的3.8Kb片段，再连接至经HindⅢ消化的pMON18364上，即可得到带有β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的农杆菌双元载体。可选用HindⅢ酶切分析生成的转化集落，用BgⅢ和XbaⅠ双酶切验证连接方向，所得构建体为pMON18365(图6):RB＞P-e35s/hsp70内含子/GUS:ST-LS1内含子/nos 3’；P-e35s/HSP70内含子/nptⅡ/nos＞LB，LB和RB分别指代农杆菌Ti质粒转化区的左边界和右边界。
其它基因可以导入小麦；例如，可抗植物病毒的小麦条纹花叶病毒(WSMV)衣壳蛋白和大麦黄矮病毒(BYVD)复制酶基因。pMON18365或类似双元载体的衍生质粒可适于作为植物表达载体。利用标准基因操作技术，可将WSMV的衣壳蛋白(CP)基因插入到pMON18364或pMON18365质粒上。通过农杆菌介导转化法可将带有WSMV的CP基因的重组载体转入小麦植株内，预期可以使得转基因小麦抵御WSMV的侵染。类似地，编码BYVD全长复制酶基因可以导入相同或相类似的农杆菌载体盒中。利用农杆菌介导转化法将带有BYDV全长复制酶基因的重组载体转入小麦植株内，预期能够使小麦抵御BYDV的侵染。
抗真菌基因也可导入诸如pMON18364和pMON32614(图6)之类的农杆菌双元载体上。诸如那些编码苜蓿或庭荠属抗真菌蛋白的基因，如上述插入至质粒pMON18364或pMON18365上，通过农杆菌介导转化法，可以得到抗真菌转基因小麦。这种基因工程小麦预期可抵抗镰孢霉属或其它真菌或细菌病原体的侵染。
有些基因影响作物品质，这包括影响种子含糖量及营养组分的基因，诸如在种子组织特异性增强型启动子或其它组织特异性启动子调控下表达的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)基因，可以插入到双元载体pMON18365或其衍生质粒中。利用农杆菌介导转化可将该基因转入小麦体内，预期能改善种子含糖量或品质，或导致其它组织物质组成的改变。
还可以插入影响小麦特性的基因，例如能耐受除草剂毒害的除草剂抗性，耐旱耐高盐，抗寒抗高温基因等。也可将小麦增产基因，生产杂交小麦的雄性不育基因，及影响植物发育的基因导入植物双元转化载体上，通过农杆菌介导转化，生产出具预期类型及生理特性的转基因小麦。用于基因插入的有用质粒的实例包括pMON25457(图7)，pMON30053(图8)，pMON30052(图9)，和pMON19450(图10)。
6．参考文献
下列参考文献和其中所引的所有参考文献引入本文以补充、解释、提供背景、或提供方法、技术，和/或本文应用的组分。
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在本发明指引下，这里公布的所有物质及方法皆可以在不需花费过多实验条件下应用和执行。尽管在优选实施方案中本发明物质和方法已经详述，对于本领域技术人员来说，本发明物质和方法及其步骤或步骤顺序的应用很明显可在不背离发明概念、精髓及范围的情况下能够进行许多种变通。更具体地说，很明显某些化学和生理相关试剂可以替代这里所述试剂，也能获得相同或类似结果。对于本领域技术人员来说，所有这些类似替代物和变通应被理解为不超出所附权利要求所限定的本发明精神、范围和概念的范围。

Claims (20)

1．一种可育转基因小麦植物，其基因组已通过预选择的遗传组分的基因组导入而改变，所述组分包括处于一个或多个预选择的遗传调控元件控制下的外源基因，制备这种植物的方法包括：
(a)体外准备一DNA组分，包括待导入小麦基因组中的目的遗传成分；
(b)通过农杆菌转化法将该DNA组分导入受体小麦细胞中；
(c)从已接受上述遗传成分的上述细胞再生出小麦植株；及
(d)确认出可育转基因小麦植株，其基因组已通过稳定导入上述遗传成分而改变。
2．权利要求1的可育转基因小麦植物，其中步骤(a)所述遗传成分包括一筛选或报告基因。
3．权利要求1的可育转基因小麦植物，其中所述受体细胞包括未成熟胚、愈伤组织、或悬浮细胞。
4．权利要求3的可育转基因小麦植物，其中所述胚是分离自未成熟颖果，或由未成熟颖果中分离后再在接种前预培养。
5．权利要求4的可育转基因小麦植物，其中所述胚是在接种前约24小时至接种前约10天或更长时间内分离自所述未成熟颖果的。
6．权利要求3的可育转基因小麦植物，其中所述愈伤组织分离自未成熟胚，或发育自胚胎细胞。
7．权利要求3的可育转基因小麦植物，其中所述未成熟胚包括花后2天或更多天的胚，或者所述未成熟颖果包括花后2天或更多天的颖果。
8．一种可育转基因小麦植物，其遗传组成已通过一DNA组分的加入而改变，该DNA组分含有预选的功能性遗传元件，后者包括一选自下组的转基因；nptⅡ基因、bla基因、nptⅠ基因、dhfr基因、aphⅣ基因、aacC3基因、aacC4基因和GUS基因，其中所述功能性遗传元件可赋予所述小麦植物一表型特征，该表型特征在所述植物的家系中是不曾存在的。
9．权利要求1或8的可育转基因小麦植物，其中所述基因包括一nptⅡ基因。
10．权利要求1或8的可育转基因小麦植物，其中至少两个外源基因位于同一DNA片段上，且所述受体细胞由所述片段转化。
11．权利要求1或8的植物的子代。
12．从权利要求1或8的植物获得的细胞。
13．从权利要求11的植物获得的种子。
14．一种生产可育转基因小麦植物的方法，包括以下步骤：
(a)从待转化小麦植物建立起可再生培养物；
(b)通过农杆菌转化，导入含待导入上述小麦植物基因组中的遗传成分的DNA组分；
(c)确认或筛选已转化的细胞系；并
(d)从其再生出可育转基因小麦植物，其中所述DNA通过上述转基因植物的完整性循环来传递给其子代，其中所述子代中含有一筛选或报告标记基因，并且其中所说的标记基因是整合到染色体中的。
15．权利要求14的方法，其中至少两个外源基因位于同一DNA片段上，并且用该片段转化上述可再生培养物。
16．权利要求14的方法，其中所述农杆菌是根癌农杆菌C58株系。
17．权利要求14的方法，其中所述培养物包括未成熟胚，愈伤组织、或悬浮细胞。
18．一种生产转基因小麦植物的方法，包括以下步骤：
(a)建立待转化小麦植物的培养物；
(b)用内含一DNA组分的农杆菌转化上述培养物，该DNA组分中包含有待导入上述小麦植物基因组中的遗传成分；
(c)确认或筛选出已转基的细胞系；并且
(d)由此再生出转基因小麦植物。
19．权利要求14或18的方法，其中所述DNA包括一nptⅡ基因；
20．权利要求18的方法，其中所述农杆菌为根癌农杆菌C58株系。
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