CN101063134A - 一种水稻细胞色素p450基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻细胞色素P450基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；还公开了一种DNA质粒、细胞和水稻；细胞色素P450基因及其基因片断，在利用除草剂选择性控制转基因农作物中的应用。利用本发明，可以通过使用常用的本达松和磺酰脲类除草剂防止转基因水稻的传播、消灭混入非转基因水稻中的转基因水稻。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体的说，本发明涉及基因和利用这种基因产生可以用除草剂选择性控制的转基因农作物的方法。
背景技术
转基因农作物目前已经在世界许多国家大量推广种植。例如转基因抗虫、抗除草剂玉米已经在北美大量推广，转基因棉花也已经在中国大量种植。进一步，利用转基因农作物作为生物反应器生产药物蛋白质，工业用酶等也正在广泛研究和开发。转基因农作物应用的重要工作之一是控制它们的传播、防止它们混入到非转基因农作物之中。特别是防止作为生物反应器生产药物蛋白质、工业酶和其他可能对人和动物有不良作用的转基因品种混入粮食和饲料用品种是非常重要的。发明一种简便的方法控制转基因农作物方法具有重大价值。
本达松和磺酰脲类除草剂是常用的农业除草剂。它们对许多宽叶杂草具有良好的杀草能力。但是禾本科农作物中具有这些除草剂的解毒酶，对这些除草剂具有良好的抗性。因此在转基因植物中如果同时抑制了抗本达松和磺酰脲类除草剂的解毒酶的表达，转基因植物必要时就能够被本达松和磺酰脲类除草剂选择性地消灭。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种基因和利用这种基因产生可以用除草剂选择性控制的转基因农作物的方法。
本发明是通过这样的技术方案来实现的：提供一种水稻细胞色素P450基因，它的核苷酸序列是SEQ ID NO.1。
一种DNA质粒，含有利用上述的细胞色素P450基因或者其中的基因片断构建得到的反义RNA或RNAi的抑制表达框，并且还含有一种或者多中在农作物中表达有价值的功能基因(目的基因)。
一种细胞，含有上述质粒。
一种转基因水稻得制备方法，该方法包含有上述的反义RNA或RNAi的抑制表达框。
细胞色素P450基因及其基因片断，在利用除草剂选择性控制转基因农作物中的应用。
本发明的优点：
目的基因表达框与本达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因抑制表达框连接在同一个DNA导入片断上，从而达到在转基因水稻中目的基因与本达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的抑制表达基因紧密连锁。
在转基因水稻中表达目的基因的同时，利用反义RNA或者RNAi的方法抑制水稻中这种细胞色素P450基因的表达，从而使转基因农作物对本达松和磺酰脲类除草剂敏感，进而可以被选择性地杀灭。因此必要时可以通过使用常用的本达松和磺酰脲类除草剂防止转基因水稻的传播、消灭混入非转基因或其他转基因水稻中的本发明产生的转基因水稻。
具体实施方式
本发明中的水稻细胞色素P450基因zcb(SEQ ID NO.1)是根据水稻基因组数据库的序列，通过PCR而获得。利用RNAi的方法抑制水稻中这种细胞色素P450基因的表达，发现zcb与水稻的抗本达松、磺酰脲类除草剂能力相关。水稻中导入zcb的RNAi抑制表达框后，其抗本达松、磺酰脲类除草剂的能力大幅度降低。因此，在转基因水稻中表达目的基因的同时，利用反义RNA或者RNAi，或者其他的方法抑制水稻中这种细胞色素P450基因的表达，可以使转基因农作物对本达松和磺酰脲类除草剂敏感。利用反义RNA或者RNAi的方法抑制基因表达的技术是已经有的技术(Kusaba 2004 RNA Interference in crop plants，Current Opinionin Biotechnology，15：139-143)。
在本发明中，目的基因表达框与本达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因抑制表达框连接在同一个DNA导入片断上，从而达到在转基因水稻中目的基因与本达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的抑制表达基因紧密连锁。特别是上述目的基因包括一种抗草甘膦基因，从而使获得的转基因农作物对草甘膦除草剂具有高抗性而对本达松和磺酰脲类除草剂敏感。上述目的基因还包括抗虫等抗逆基因，工业酶基因，药物蛋白质基因以及其他有价值的适宜在植物中表达的基因。本发明中的目的基因可以是抗虫基因、抗除草剂基因，药物蛋白质基因、工业酶基因，或者其他有价值的基因，可以是其中的一个、二个或者多个。
本发明使转基因水稻对本达松和磺酰脲类除草剂敏感，并且这种对除草剂敏感性状与目的基因紧密连锁。而这种连锁是通过插入DNA的构建来实现：即本发明将目的基因表达框和本达松和磺酰脲类的解毒基因抑制表达框连接在同一个载体上的同一个DNA插入片断中。在利用农杆菌转化时，则是在连接在同一个T-DNA片断中。
本达松和磺酰脲类的解毒基因抑制表达框可以由二个部分组成：一个是启动子，它可以是水稻或者玉米泛素(Ubiqutin)启动子，或者水稻Actin启动子，或者是花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，或者是其他在禾本科农作物中有活性的启动子。另一个部分与启动子功能性相联的是本发明的细胞色素P450基因(SEQ ID NO：1)的反义RNA或者RNAi。利用反义RNA和RNAi抑制表达的机理和技术已经有完整的描述，是已经有的技术(Kusaba 2004 RNAInterference in crop plants，Current Opinion in Biotechnology，15：139-143)。产生反义RNA的DNA模板可以是全长基因，或者仅仅是其中的一个或几个片断。产生RNA干扰的序列(RNAi)可以根据SEQ ID NO：1设计。
同时具有目的基因表达框和本达松和磺酰脲类的解毒基因抑制表达框的载体可以通过转基因的方法稳定导入水稻。这个方法包括基因枪方法和农杆菌介导方法，这二种方法都是成熟的已知的方法(Hiei et al.1994 Effieienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant J.6：271-282)。
一种转基因植物可以通过花粉扩散或者直接通过种子传播到计划种植以外的地方。本发明通过使转基因植物对本达松和磺酰脲类产生敏感性而选择性地杀灭，从而保证了目的基因能够被控制。在种植非转基因品种的大田中，只要使用本达松和磺酰脲类除草剂防治杂草就可以消灭可能混入的转基因品种。
本发明的又一个方面是提供一种利用不同的除草剂对转基因植物可以进行正选择和负选择的技术。一种抗草甘膦基因，与抑制水稻细胞色素P450基因的DNA片断构建在同一个质粒上。这样，对草甘膦的抗性和对本达松和磺酰脲类的敏感性在转基因禾本科农作物中高度连锁。这种方法获得的转基因植物可以利用草甘膦进行筛选和杂草防治，同时也可以利用本达松和磺酰脲类除草剂控制和消灭转基因禾本科农作物。
利用本发明的方法获得的植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。所获得的植株能够表达目的基因，但是失去对抗本达松和磺酰脲类除草剂的能力。
以下通过实例进一步对本发明进行描述：
实施例1、水稻细胞色素P450基因zcb的克隆
根据水稻基因组数据库的序列，通过对基因组DNA进行PCR扩增而获得。PCR的引物分别为C450Bf：ggatccaatgaagtac tccacttctg taacca(SEQ ID NO：5)和C450Br：ctcgag caa catgtgtatg ctcacaagaa gcttattgc(SEQ ID NO：6)。PCR扩增的条件是：95℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 2分钟，进行30个循环。PCR产物：水稻细胞色素P450基因zcb。水稻细胞色素P450基因zcb被克隆到T载体(上海生工)中，测序说明克隆正确。
实施例2、农杆菌转化T-DNA载体的构建
水稻转化T-DNA载体pCAMB1300Rice-G6-450B的构建：水稻RNAi片断是从水稻基因组通过PCR的方法扩增获得。一个片断是Rice450B1，PCR引物分别为Rice450bF1：5’gtca ctcgag aatgaagtactccacttctgtaaccat(SEQ ID NO：7)和Rice450bR460：5’gatc ggatcc gacatgaggccgacgcggcgc gcg(SEQ ID NO：8)；另一片断是Rice450B2，PCR引物分别为Rice450bF1和Rice450bR350：5’catg agatcttgc gac tcg aac ctg ggc cgg ttc g(SEQ ID NO：9)。这二个片断分别被克隆到T载体(上海生工)中。片断是Rice450B1用XhoI和BamHI从T载体中酶切获得；Rice450B2用XhoI和BglII从T载体中酶切获得。然后，Rice450B1和Rice450B2被连接到用XhoI预先酶切切除去抗潮霉素(hyg)基因的pCambia1300载体，获得pCamb1300-450B.载体pCamb1300-450Bi包含有一个CaMVS35启动子控制下的能够产生RNAi的抑制表达框(核苷酸序列是SEQ ID NO.2)。载体pCamb1300-450Bi进一步用EcoRI和HindIII酶切，然后用含有抗草甘膦基因G6的DNA片断连接(EQ ID NO.3)，获得载体pCAMB1300-G6-450Bi，其核苷酸序列是SEQ ID NO.4。
实施例2、转基因水稻的获得
转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌 龚祖埙 1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含目的基因的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含1-4mM草甘膦的筛选培养基上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。获得LG-Rice-GlyR-450i再生水稻植株。
T-DNA的插入及其基因的表达可以通过PCR和western印迹分析检测。基因组DNA可以根据现有的方法从转化再生植株和非转化禾本科农作物中提取。
实施例3、对转基因禾本科农作物的正选择和负选择
获得的转化LG-Rice-GlyR-450i再生水稻植株和没有转化的水稻植株在温室中培养溶液中单株培养。这些再生植株分为3个处理，每个处理包括LG-Rice-GlyR-450i和非转化植株各30株。处理1：喷20mM草甘膦；处理2：喷1500mg/L本达松；处理3：4mg/L苄嘧磺隆；处理4：喷水。处理后10天记录植株的成活率。结果如下(表1)。
表1
| 草甘膦 | 本达松 | 苄嘧磺隆 | 水 | |
| LG-Rice-GlyR-450i | 100％ 成活 | 0％ 成活 | 10％ 成活 | 100％ 成活 |
| 非转化植株 | 0％ 成活 | 00％ 成活 | 100％成活 | 100％ 成活 |
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO 1：
1 aatgaagtac tccacttctg taaccatgga taaggcctac attgccgtct tctccatcgt
61 catcctcttc ttgctcgtcg actaccttcg tcgtcttcgt ggcggcggca cgagcaatgg
121 caagaacaag gggatgcggc tgccgccggg tctaccggcc gtcccgatca tcggccacct
181 ccacctcgtc aagaagccga tgcacgcgac gctgtcccgc ctcgccgcgc ggcacgggcc
241 ggtgttctcg ctgcgcctcg gctcgcggcg cgccgtggtg gtgtcgtcgc cggggtgcgc
301 cagggagtgc ttcaccgagc acgacgtggc cttcgcgaac cggcccaggt tcgagtcgca
361 gctgctcatg tcgttcgacg gcaccgcgct ggccatggcg agctacggcc cgcactggcg
421 caacctccgc cgggtcgccg cggtgcagct gctctccgcg cgccgcgtcg gcctcatgtc
481 ggggctcatc gccggcgagg tgcgcgccat ggtgcggagc ttgtgccgcc gcccagccgc
541 cgccgcgcca gtccagctga agcggaggct gttcgagctc tccctgagcg tgctcatgga
601 gaccatcgcc cagagcaagg cgacccgacc cgagacgacg gacacggaca cggacatgtc
661 catggaagcc caggagtaca agcaggtcgt cgaggagatc ctcgagcgca tcggcacggg
721 caacctgtgc gactacctgc cggcgctccg gtggttcgac gtgttcggcg tgaggaacag
781 gatcctcgcc gcggtgagcc ggagggacgc gttcctccgt cgactgatct acgcggcgcg
841 gtggaggatg gacgacggcg agaagaagag catgatcgcc gtgctgctca ctctgcagaa
901 gacacagccg gaggtgtaca ctgacaacat gatcacggct ctttgctcga acttgttagg
961 agcaggaaca gagacaacct cgacgacgat agaatgggca atgtcgctgt tgctgaacca
1021 cccagaaacg ctcaagaaag cacaagccga gatcgacgcg tccgtcggca actcccgcct
1081 gatcaccgcc gacgacgtgc cccgcatcac ctatctccag tgcatcgtca gggagacgct
1141 ccgcctctac cccgcggcgc cgatgctcat cccgcacgag tcctccgccg actgcgaggt
1201 cggcggctac agcgtcccgc gcgggacgat gctgctcgtg aacgcgtacg ccatccaccg
1261 tgacccggcg gcgtgggagg agccggagag gttcgtgccg gagaggttcg agggcggcgg
1321 gtgcgacggc aacctctcga tgccgttcgg gatggggagg cggaggtgcc ccggcgagac
1381 gctggctctg cacacggtgg ggctggtgct gggcacgctg atccagtgct tcgactggga
1441 gagggtcgat ggcgtggagg tcgacatggc tgagggtggc gggctcacca tgcccaaggt
1501 cgtgccgttg gaggccgtgt gcaggccgcg cgacgccatg ggtggtgttc ttcgcgagct
1561 ctgaacattt tggcgtcgtt tgcatctcca gggcaaactc atgtatactg atgaagtacc
1621 aaaagtaagt agcaataagc ttcttgtgag catacacatg ttg
SEQ ID NO 2：
1 ctcgagaatg aagtactcca cttctgtaac catggataag gcctacattg ccgtcttctc
61 catcgtcatc ctcttcttgc tcgtcgacta ccttcgtcgt cttcgtggcg gcggcacgag
121 caatggcaag aacaagggga tgcggctgcc gccgggtcta ccggccgtcc cgatcatcgg
181 ccacctccac ctcgtcaaga agccgatgca cgcgacgctg tcccgcctcg ccgcgcggca
241 cgggccggtg ttctcgctgc gcctcggctc gcggcgcgcc gtggtggtgt cgtcgccggg
301 gtgcgccagg gagtgcttca ccgagcacga cgtggccttc gcgaaccggc ccaggttcga
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421 ctggcgcaac ctccgccggg tcgccgcggt gcagctgctc tccgcgcgcc gcgtcggcct
481 catgtcggat cttgcgactc gaacctgggc cggttcgcga aggccacgtc gtgctcggtg
541 aagcactccc tggcgcaccc cggcgacgac accaccacgg cgcgccgcga gccgaggcgc
601 agcgagaaca ccggcccgtg ccgcgcggcg aggcgggaca gcgtcgcgtg catcggcttc
661 ttgacgaggt ggaggtggcc gatgatcggg acggccggta gacccggcgg cagccgcatc
721 cccttgttct tgccattgct cgtgccgccg ccacgaagac gacgaaggta gtcgacgagc
781 aagaagagga tgacgatgga gaagacggca atgtaggcct tatccatggt tacagaagtg
841 gagtacttca ttctcgag
SEQ ID NO 3：
1 ggatccacca tggccaccgc cgccgccgcg tctaccgcgc tcactggcgc cactaccgct
61 gcgcccaagg cgaggcgccg ggcgcacctc ctggccaccc gccgcgccct cgccgcgccc
121 atcaggtgct cagcggcgtc acccgccatg ccgatggctc ccccggccac cccgctccgg
181 ccgtggggcc ccaccgatcc ccgcaaggga tctggggcca acgacctgat cttcctggcc
241 cagccgggcg gcaggctgaa cggcaggatc agggtgccgg gcgacaagag catcagccac
301 aggagcatca tgctgggcag cctggccgag ggcaccaccg aggtggaggg cttcctggag
361 ggcgaggacg ccctggccac cctgcaggcc ttcagggaca tgggcgtggt gatcgagggc
421 ccgaaccacg gcagggtgac catccacggc gtgggcctgc acggcctgaa gccgccgccg
481 ggcccgctgt acgtgggcaa cagcggcacc agcatgaggc tgctgagcgg cctgctggcc
541 ggccagagct tcgacgtgac catgaccggc gacgccagcc tgagcaagag gccgatgaac
601 agggtggcca acccgctgag ggagatgggc gccgtggtgg agaccggccc ggagggcagg
661 ccgccgctga ccatcagggg cggccacaag ctgaagggcc tgacctacac cctgccgatg
721 gccagcgccc aggtgaagag ctgcctgctg ctggccggcc tgtacgccga gggcaagacc
781 accgtgaccg agccggcccc gaccagggac cacaccgaga ggatgctgag gggcttcggc
841 tacagcgtgg agagcaacgg cccggtggcc agcctgcaga gcggcggcaa gctgaccgcc
901 accaggatcg aggtgccggc cgacatcagc agcgccgcct tcttcctggt ggccgccagc
961 atcgccgagg gcagcgagct ggtgctggag cacgtgggca tcaacccgac caggaccggc
1021 gtgatcgaca tcctgaggct gatgggcggc gacatcaccc tggagaacca gagggaggtg
1081 ggcggcgagc cggtggccga cctgagggtg aggggcgccc agctgaaggg catcgacatc
1141 ccggaggccc tggtgccgct ggccatcgac gagttcccgg tgctgttcgt ggccgccgcc
1201 tgcgccgagg gcaggaccgt gctgaggggc gccgaggagc tgagggtgaa ggagagcgac
1261 aggattcagg tgatggccga cggcctgatc accctgggca tcaagtgcga gccgaccccg
1321 gacggcatca tcatcgacgg cggccagctg ggcggcggcg aggtgcacgg ccacggcgac
1381 cacaggatcg ccatggcctt cagcgtggcc agcctgaggg ccagcgcccc gatcagaatc
1441 cacgactgcg ccaacgtggc caccagcttc ccgaacttcc tggccctgtg cgccgaggtg
1501 ggcatcaggg tggccgagga gggcaagagc tgagagctca agatctgttc tgcacaaagt
1561 ggagtagtca gtcatcgatc aggaaccaga caccagactt ttattcacac agtgaagtga
1621 agtgaagtgc agtgcagtga gttgctggtt tttgtacaac ttagtatgta tttgtatttg
1681 taaaatactt ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt ggcgaattc
SEQ ID NO.4
1 ccactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat agaagtattt tacaaataca
6 1aatacatact aagttctgca caaagtggag tagtcagtca tcgatcagga accagacacc
121 agacttttat tcatacagtg aagtgaagtg aagtgcagtg cagtgagttg ctggtttttg
181 tacaacagat cttgagctct cagctcttgc cctcctcggc caccctgatg cccacctcgg
241 cgcacagggc caggaagttc gggaagctgg tggccacgtt ggcgcagtcg tggattctga
301 tcggggcgct ggccctcagg ctggccacgc tgaaggccat ggcgatcctg tggtcgccgt
361 ggccgtgcac ctcgccgccg cccagctggc cgccgtcgat gatgatgccg tccggggtcg
421 gctcgcactt gatgcccagg gtgatcaggc cgtcggccat cacctgaatc ctgtcgctct
481 ccttcaccct cagctcctcg gcgcccctca gcacggtcct gccctcggcg caggcggcgg
541 ccacgaacag caccgggaac tcgtcgatgg ccagcggcac cagggcctcc gggatgtcga
601 tgcccttcag ctgggcgccc ctcaccctca ggtcggccac cggctcgccg cccacctccc
661 tctggttctc cagggtgatg tcgccgccca tcagcctcag gatgtcgatc acgccggtcc
721 tggtcgggtt gatgcccacg tgctccagca ccagctcgct gccctcggcg atgctggcgg
781 ccaccaggaa gaaggcggcg ctgctgatgt cggccggcac ctcgatcctg gtggcggtca
841 gcttgccgcc gctctgcagg ctggccaccg ggccgttgct ctccacgctg tagccgaagc
901 ccctcagcat cctctcggtg tggtccctgg tcggggccgg ctcggtcacg gtggtcttgc
961 cctcggcgta caggccggcc agcagcaggc agctcttcac ctgggcgctg gccatcggca
1021 gggtgtaggt caggcccttc agcttgtggc cgcccctgat ggtcagcggc ggcctgccct
1081 ccgggccggt ctccaccacg gcgcccatct ccctcagcgg gttggccacc ctgttcatcg
1141 gcctcttgct caggctggcg tcgccggtca tggtcacgtc gaagctctgg ccggccagca
1201 ggccgctcag cagcctcatg ctggtgccgc tgttgcccac gtacagcggg cccggcggcg
1261 gcttcaggcc gtgcaggccc acgccgtgga tggtcaccct gccgtggttc gggccctcga
1321 tcaccacgcc catgtccctg aaggcctgca gggtggccag ggcgtcctcg ccctccagga
1381 agccctccac ctcggtggtg ccctcggcca ggctgcccag catgatgctc ctgtggctga
1441 tgctcttgtc gcccggcacc ctgatcctgc cgttcagcct gccgcccggc tgggccagga
1501 agatcaggtc gttggcccca gatcccttgc ggggatcggt ggggccccac ggccggagcg
1561 gggtggccgg gggagccatc ggcatggcgg gtgacgccgc tgagcacctg atgggcgcgg
1621 cgagggcgcg gcgggtggcc aggaggtgcg cccggcgcct cgccttgggc gcagcggtag
1681 tggcgccagt gagcgcggta gacgcggcgg cggcggtggc catggtagat cctctagagt
1741 cgacctgcag aagtaacacc aaacaacagg gtgagcatcg acaaaagaaa cagtaccaag
1801 caaataaata gcgtatgaag gcagggctaa aaaaatccac atatagctgc tgcatatgcc
1861 atcatccaag tatatcaaga tcaaaataat tataaaacat acttgtttat tataatagat
1921 aggtactcaa ggttagagca tatgaataga tgctgcatat gccatcatgt atatgcatca
1981 gtaaaaccca catcaacatg tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcttaaact
2041 cgtaactatg aagatgtatg acacacacat acagttccaa aattaataaa tacaccaggt
2101 agtttgaaac agtattctac tccgatctag aacgaatgaa cgaccgccca accacaccac
2161 atcatcacaa ccaagcgaac aaaaagcatc tctgtatatg catcagtaaa acccgcatca
2221 acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatcat cttcaattcg taactatgaa
2281 tatgtatggc acacacatac agatccaaaa ttaataaatc caccaggtag tttgaaacag
2341 aattctactc cgatctagaa cgaccgccca accagaccac atcatcacaa ccaagacaaa
2401 aaaaagcatg aaaagatgac ccgacaaaca agtgcacggc atatattgaa ataaaggaaa
2461 agggcaaacc aaaccctatg caacgaaaca aaaaaaatca tgaaatcgat cccgtctgcg
2521 gaacggctag agccatccca ggattcccca aagagaaaca ctggcaagtt agcaatcaga
2581 acgtgtctga cgtacaggtc gcatccgtgt acgaacgcta gcagcacgga tctaacacaa
2641 acacggatct aacacaaaca tgaacagaag tagaactacc gggccctaac catggaccgg
2701 aacgccgatc tagagaaggt agagaggggg ggggggggag gacgagcggc gtaccttgaa
2761 gcggaggtgc cgacgggtgg atttggggga gatctggttg tgtgtgtgtg cgctccgaac
2821 aacacgaggt tggggaaaga gggtgtggag ggggtgtcta tttattacgg cgggcgagga
2881 agggaaagcg aaggagcggt gggaaaggaa tcccccgtag ctgccgtgcc gtgagaggag
2941 gaggaggccg cctgccgtgc cggctcacgt ctgccgctcc gccacgcaat ttctggatgc
3001 cgacagcgga gcaagtccaa cggtggagcg gaactctcga gaggggtcca gaggcagcga
3061 cagagatgcc gtgccgtctg cttcgcttgg cccgacgcga cgctgctggt tcgctggttg
3121 gtgtccgtta gactcgtcga cggcgtttaa caggctggca ttatctactc gaaacaagaa
3181 aaatgtttcc ttagtttttt taatttctta aagggtattt gtttaatttt tagtcacttt
3241 attttattct attttatatc taaattatta aataaaaaaa ctaaaataga gttttagttt
3301 tcttaattta gaggctaaaa tagaataaaa tagatgtact aaaaaaatta gtctataaaa
3361 accattaacc ctaaacccta aatggatgta ctaataaaat ggatgaagta ttatataggt
3421 gaagctattt gcaaaaaaaa aggagaacac atgcacacta aaaagataaa actgtagagt
3481 cctgttgtca aaatactcaa ttgtccttta gaccatgtct aactgttcat ttatatgatt
3541 ctctaaaaca ctgatattat tgtagtacta tagattatat tattcgtaga gtaaagttta
3601 aatatatgta taaagataga taaactgcac ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg
3661 gtaatttttt ataacttaga catgcaatgc tcattatctc tagagagggg cacgaccggg
3721 tcacgctgca ctgtaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact
3781 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct
3841 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg
3901 gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac
3961 tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga
4021 ataacggata tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg
4081 ccaaccacag ggttcccctc gggatcaaag tactttgatc caacccctcc gctgctatag
4141 tgcagtcggc ttctgacgtt cagtgcagcc gtcttctgaa aacgacatgt cgcacaagtc
4201 ctaagttacg cgacaggctg ccgccctgcc cttttcctgg cgttttcttg tcgcgtgttt
4261 tagtcgcata aagtagaata cttgcgacta gaaccggaga cattacgcca tgaacaagag
4321 cgccgccgct ggcctgctgg gctatgcccg cgtcagcacc gacgaccagg acttgaccaa
4381 ccaacgggcc gaactgcacg cggccggctg caccaagctg ttttccgaga agatcaccgg
4441 caccaggcgc gaccgcccgg agctggccag gatgcttgac cacctacgcc ctggcgacgt
4501 tgtgacagtg accaggctag accgcctggc ccgcagcacc cgcgacctac tggacattgc
4561 cgagcgcatc caggaggccg gcgcgggcct gcgtagcctg gcagagccgt gggccgacac
4621 caccacgccg gccggccgca tggtgttgac cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg
4681 ttccctaatc atcgaccgca cccggagcgg gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa
4741 gtttggcccc cgccctaccc tcaccccggc acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga
4801 ccaggaaggc cgcaccgtga aagaggcggc tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct
4861 gtaccgcgca cttgagcgca gcgaggaagt gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc
4921 cttccgtgag gacgcattga ccgaggccga cgccctggcg gccgccgaga atgaacgcca
4981 agaggaacaa gcatgaaacc gcaccaggac ggccaggacg aaccgttttt cattaccgaa
5041 gagatcgagg cggagatgat cgcggccggg tacgtgttcg agccgcccgc gcacgtctca
5101 accgtgcggc tgcatgaaat cctggccggt ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg
5161 gccagcttgg ccgctgaaga aaccgagcgc cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag
5221 taaaacagct tgcgtcatgc ggtcgctgcg tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata
5281 cgcaagggga acgcatgaag gttatcgctg tacttaacca gaaaggcggg tcaggcaaga
5341 cgaccatcgc aacccatcta gcccgcgccc tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag
5401 tcgattccga tccccagggc agtgcccgcg attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc
5461 taaccgttgt cggcatcgac cgcccgacga ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc
5521 gcgacttcgt agtgatcgac ggagcgcccc aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca
5581 aggcagccga cttcgtgctg attccggtgc agccaagccc ttacgacata tgggccaccg
5641 ccgacctggt ggagctggtt aagcagcgca ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg
5701 cctttgtcgt gtcgcgggcg atcaaaggca cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc
5761 tggccgggta cgagctgccc attcttgagt cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag
5821 gcactgccgc cgccggcaca accgttcttg aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg
5881 aggtccaggc gctggccgct gaaattaaat caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga
5941 gaaaatgagc aaaagcacaa acacgctaag tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa
6001 ggctgcaacg ttggccagcc tggcagacac gccagccatg aagcgggtca actttcagtt
6061 gccggcggag gatcacacca agctgaagat gtacgcggta cgccaaggca agaccattac
6121 cgagctgcta tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat gaataaatga
6181 gtagatgaat tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg
6241 acgccgtgga atgccccatg tgtggaggaa cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg
6301 ttgtctgccg gccctgcaat ggcactggaa cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt
6361 cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag
6421 ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa
6481 tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt
6541 gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg
6601 ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg
6661 tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga cgggcacgta
6721 gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg
6781 gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg agacaagccc
6841 ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc
6901 ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc
6961 atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc
7021 ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc
7081 gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg
7141 gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca
7201 cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt
7261 ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat
7321 gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg
7381 cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg
7441 ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc
7501 acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca
7561 aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc
7621 gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt
7681 gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg
7741 ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa
7801 atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc
7861 gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa
7921 cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag
7981 cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac
8041 ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt
8101 gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac
8161 cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg
8221 cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat
8281 aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc
8341 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc
8401 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga
8461 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt
8521 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg
8581 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc
8641 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg
8701 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc
8761 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg
8821 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc
8881 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct
8941 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt
9001 taagggattt tggtcatgca ttctaggtac taaaacaatt catccagtaa aatataatat
9061 tttattttct cccaatcagg cttgatcccc agtaagtcaa aaaatagctc gacatactgt
9121 tcttccccga tatcctccct gatcgaccgg acgcagaagg caatgtcata ccacttgtcc
9181 gccctgccgc ttctcccaag atcaataaag ccacttactt tgccatcttt cacaaagatg
9241 ttgctgtctc ccaggtcgcc gtgggaaaag acaagttcct cttcgggctt ttccgtcttt
9301 aaaaaatcat acagctcgcg cggatcttta aatggagtgt cttcttccca gttttcgcaa
9361 tccacatcgg ccagatcgtt attcagtaag taatccaatt cggctaagcg gctgtctaag
9421 ctattcgtat agggacaatc cgatatgtcg atggagtgaa agagcctgat gcactccgca
9481 tacagctcga taatcttttc agggctttgt tcatcttcat actcttccga gcaaaggacg
9541 ccatcggcct cactcatgag cagattgctc cagccatcat gccgttcaaa gtgcaggacc
9601 tttggaacag gcagctttcc ttccagccat agcatcatgt ccttttcccg ttccacatca
9661 taggtggtcc ctttataccg gctgtccgtc atttttaaat ataggttttc attttctccc
9721 accagcttat ataccttagc aggagacatt ccttccgtat cttttacgca gcggtatttt
9781 tcgatcagtt ttttcaattc cggtgatatt ctcattttag ccatttatta tttccttcct
9841 cttttctaca gtatttaaag ataccccaag aagctaatta taacaagacg aactccaatt
9901 cactgttcct tgcattctaa aaccttaaat accagaaaac agctttttca aagttgtttt
9961 caaagttggc gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg tgatcacagg
10021 cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt
10081 caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg
10141 ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag
10201 tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata
10261 ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat
10321 gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg gatctggatt ttagtactgg attttggttt
10381 taggaattag aaattttatt gatagaagta ttttacaaat acaaatacat actaagggtt
10441 tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc tataggaacc ctaattccct tatctgggaa
10501 ctactcacac attattatgg agaaactcga gaatgaagta ctccacttct gtaaccatgg
10561 ataaggccta cattgccgtc ttctccatcg tcatcctctt cttgctcgtc gactaccttc
10621 gtcgtcttcg tggcggcggc acgagcaatg gcaagaacaa ggggatgcgg ctgccgccgg
10681 gtctaccggc cgtcccgatc atcggccacc tccacctcgt caagaagccg atgcacgcga
10741 cgctgtcccg cctcgccgcg cggcacgggc cggtgttctc gctgcgcctc ggctcgcggc
10801 gcgccgtggt ggtgtcgtcg ccggggtgcg ccagggagtg cttcaccgag cacgacgtgg
10861 ccttcgcgaa ccggcccagg ttcgagtcgc agctgctcat gtcgttcgac ggcaccgcgc
10921 tggccatggc gagctacggc ccgcactggc gcaacctccg ccgggtcgcc gcggtgcagc
10981 tgctctccgc gcgccgcgtc ggcctcatgt cggatcttgc gactcgaacc tgggccggtt
11041 cgcgaaggcc acgtcgtgct cggtgaagca ctccctggcg caccccggcg acgacaccac
11101 cacggcgcgc cgcgagccga ggcgcagcga gaacaccggc ccgtgccgcg cggcgaggcg
11161 ggacagcgtc gcgtgcatcg gcttcttgac gaggtggagg tggccgatga tcgggacggc
11221 cggtagaccc ggcggcagcc gcatcccctt gttcttgcca ttgctcgtgc cgccgccacg
11281 aagacgacga aggtagtcga cgagcaagaa gaggatgacg atggagaaga cggcaatgta
11341 ggccttatcc atggttacag aagtggagta cttcattctc gagagagata gatttgtaga
11401 gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga
11461 aggtcttgcg aaggatagtg ggattgtgcg tcatccctta cgtcagtgga gatatcacat
11521 caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg
11581 ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct
11641 ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag
11701 tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa
11761 gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga
11821 gtgtcgtgct ccaccatgtt atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg
11881 tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca
11941 gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct
12001 tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg
12061 tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta
12121 tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttggc aagctgctct
12181 agccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg
12241 acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca
12301 ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg
12361 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgagctcg
12421 gtac
SEQ ID NO：5
32 ggatccaatg aagtactcca cttctgtaac ca
SEQ ID NO：6
38 ctcgagcaac atgtgtatgc tcacaagaag cttattgc
SEQ ID NO：7
37 gtcactcgag aatgaagtac tccacttctg taaccat
SEQ ID NO：8
34 gatcggatcc gacatgaggc cgacgcggcg cgcg
SEQ ID NO：9
35 catgagatct tgcgactcga acctgggccg gttcg
Claims (5)
1、一种水稻细胞色素P450基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列为SEQ IDNO：1。
2、一种DNA质粒，其特征在于：含有权利要求1所述的细胞色素P450基因或者其中的基因片断构建得到的反义RNA或RNAi的抑制表达框，还含有一种或者多中在农作物中表达有价值的功能基因。
3、一种细胞，其特征在于：含有权利要求2所述质粒。
4、一种转基因水稻得制备方法，其特征在于，该方法包含有权利要求2所述的反义RNA或RNAi的抑制表达框。
5、权利要求1或2或3，任选一项中所述的涉及有关细胞色素P450基因及其基因片断，在利用除草剂选择性控制转基因农作物中的应用。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| CN 200710068325 CN101063134A (zh) | 2007-04-26 | 2007-04-26 | 一种水稻细胞色素p450基因及其应用 |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN 200710068325 CN101063134A (zh) | 2007-04-26 | 2007-04-26 | 一种水稻细胞色素p450基因及其应用 |
Publications (1)
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008083598A1 (fr) * | 2006-12-30 | 2008-07-17 | Zhicheng Shen | Culture transgénique sélectivement éliminée, préparation et utilisation correspondantes |
| CN101643779B (zh) * | 2008-08-06 | 2011-10-05 | 中国农业大学 | 水稻细胞色素p450基因专用引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留 |
| CN102321640A (zh) * | 2011-08-18 | 2012-01-18 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 抗除草剂基因及其在转基因农作物中的应用 |
| CN102776189A (zh) * | 2012-06-18 | 2012-11-14 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种细胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用 |
| CN102946715A (zh) * | 2010-01-07 | 2013-02-27 | 巴斯福农业有限责任公司阿纳姆(荷兰)韦登斯维尔分公司 | 耐受除草剂的植物 |
-
2007
- 2007-04-26 CN CN 200710068325 patent/CN101063134A/zh active Pending
Cited By (6)
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| CN102321640A (zh) * | 2011-08-18 | 2012-01-18 | 杭州瑞丰生物科技有限公司 | 抗除草剂基因及其在转基因农作物中的应用 |
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