CN1668744A - 转化大豆的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了农杆菌(Agrobacterium)介导的转化大豆细胞或组织以及将转化细胞和组织再生为转化植物的方法。这些方法可用于转化许多种大豆栽培品种。

Description

转化大豆的方法
                 相关申请的交叉参考
本申请要求2002年6月22日提交的序列号NO.60/390,562的美国临时申请的利益，该申请的全部内容以参考文献的方式并入本文。
                      发明领域
本发明一般涉及植物转化的方法，更具体地，涉及转化大豆细胞和组织的方法。本发明还涉及从转化的大豆细胞和组织再生转基因大豆植物的方法。本发明还涉及这些方法获得的转基因大豆植物和种子。
                      发明背景
大豆是一种主要的食物和饲料来源，其在全球种植的土地比任何其它的双子叶作物都多。据报导大豆种植超过5000万公顷面积。遗憾地是，在美国仅仅少数的植物引进产生了大豆主要的栽培变种，因而，这一窄的种质基础限制了大豆育种的潜能。栽培的大豆品种中这一有限的遗传基础限制了用传统育种方法开发具有改良或价值增值性状的变种的能力。
因此采用遗传工程技术修饰大豆可以以传统育种方法或组织培养诱导变异难以达到的方式促进新品种的开发，例如具有抗除草剂、抗病(例如抗病毒)和种子质量改良特性的新品种。
开发有效的转化系统对于植物中基因表达的分析是必须的。这种系统的要求包括合适的靶植物组织以允许有效的植物再生，基因传输工具以有效地传送外源DNA进入靶植物细胞，以及有效的方法以选择转化的细胞。在双子叶种类的遗传转化中，经常使用利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化系统作为基因传输工具。目前，用于农杆菌介导转化的优选靶组织包括子叶、叶组织和下胚轴。高速微粒轰击为基因传输入双子叶植物提供了可供选择的方法。
大豆中农杆菌介导的基因传输远非是常规的。在公众可获得的报告中，经常提到分生组织和子叶组织作为用于农杆菌介导基因传输的靶子。不过，经常不能从这两个外植体资源达到可靠和有效的转化和再生。
Chee等的美国专利号NO.5,169,770和5,376,543讨论了转化大豆产生转基因植物的非组织培养方法，其中培养种子发芽，然后用细菌细胞特别是农杆菌菌株接种分生组织或中胚层的细胞组织，细菌细胞通过感染将DNA转移到外植体中。该方法依赖于预先形成的新芽的生长。
Parrot W.A.等(1989)，“大豆初级转化体的回收，”PlantCell Reports 7：615-617，报导了与农杆菌共培养后从未成熟的子叶组织中回收大豆转化体。不过，这些再生的植物是嵌合的，转移基因不能遗传给子代。
美国专利号NO.5,416,011(Hinchee等)讨论了利用要求去除下胚轴、保留并分开子叶的子叶外植体，并用含有目的基因的根癌农杆菌载体接种该子叶外植体以插入嵌合基因。
Yan B.等(2000)，“利用未成熟合子子叶外植体根癌农杆菌介导的大豆转化，”Plant Cell Reports 19：1090-1097，报导用未成熟子叶农杆菌介导的大豆转化中总的转化频率为0.03％。
Martinell等的美国专利号NO.6,384,301描述了农杆菌介导基因传输入分离的大豆胚轴分生组织细胞中。这些方法不包括愈伤组织期组织培养。
从以上描述的工作来看，显然地，当利用分生组织和子叶组织作为用于农杆菌介导的基因传输的资源外植体时，相关的工作者很少实现建立一个可靠的大豆转化系统的目标。因此，为了开发更有效的大豆转化系统，需要继续探索新的方法，包括新的资源外植体。
已经证明，在大豆组织培养中可以从上胚轴组织和初生叶组织获得植物再生。不过，至今为止，在大豆中用这两种外植体源作为基因传输的靶子还没有成功转化的报导。
Wright M.S.等(1987)“Glycine max L.Merr.的起始和繁殖：来自组织培养的上胚轴的植物，”Plant Cell Reports 8：83-90，描述了芽从大豆上胚轴组织成功的起始和增殖。在含有20μM细胞分裂素的Schenk和Hildebrandt培养基中培养5周诱导外植体上胚轴形成芽。在含有2.1nM picloram和0.1μM苄基腺嘌呤的培养基中芽保持增殖。
Wright M.S.等(1987)“大豆(Glycine max L.Merr.)从培养的初生叶组织中再生，”Plant Cell Reports 6：83-89，描述了从27种大豆的初生叶组织中再生植物的可重复的方法。他们发现尽管已证明2，4，5-三氯苯氧基乙酸对于再生是必须的，但发现苄基腺嘌呤(BA)能增强再生。
Rajasekaren K.等(1997)“培养的大豆(Glycine max L.Merr)上胚轴和初生叶的体细胞胚胎发生，”In Vitro Cellular &Developmental Biology 33(2)：88-91，描述了几种大豆通过体细胞胚胎发生从温室栽培植物的未成熟种子的培养上胚轴和初生叶组织的再生。他们发现当具有完整合子胚胎轴的半子叶在补充了46.2μM2，4-D的Murashige和Skoog(MS)培养基上培养时，可从上胚轴和初生叶诱导体细胞胚胎发生。在没有与半子叶培养的情况下，从提取的胚轴、上胚轴或初生叶中没有观察到胚胎发生。在含有11.3μM苄基腺嘌呤的Cheng氏基础培养基上，可从发芽体细胞胚胎获得芽尖的快速增殖。
                    发明概述
本发明提供了转化大豆细胞和将转化细胞再生为转化植物的方法。所述方法可用于转化多种大豆栽培品种。
本发明提供了一种新的大豆外植体，其使根癌农杆菌能高效地介导基因传输至大豆细胞中。
具体地，本发明提供了转化大豆细胞或组织的方法，所述方法包括：
(a)通过以下步骤从大豆种子制备外植体：
(i)从所说的种子中去除全部或部分下胚轴；
(ii)从所说的种子中去除一个子叶及其邻近的腋芽(axillary bud)，并且保留一个其上附有上胚轴和初生叶的子叶；
(iii)去除保留子叶的部分初生叶，由此产生初生叶基部；以及
(b)将该外植体和含有待掺入到大豆细胞基因组中的目的核酸的农杆菌共培养。
在另外的实施方案中，所述方法还包括一个或多个下述内容：从初生叶基部及其邻近的上胚轴诱导芽形成；在含有选择剂的培养基中培养该芽；选择转化的芽；以及从转化的芽再生转化的植物。
在进一步的实施方案中，本发明提供了生产稳定转化的大豆植物的方法，所述方法包括：
(a)通过以下步骤从大豆种子制备外植体：
(i)从所说的种子中去除全部或部分下胚轴；
(ii)从所说的种子中去除一个子叶及其邻近的腋芽，并且保留一个其上附有上胚轴和初生叶的子叶；
(iii)从上胚轴中去除部分初生叶，由此产生至少一个初生叶基部；
(b)共培养该外植体和含有待掺入到大豆细胞基因组的目的核酸的农杆菌；
(c)从初生叶基部区诱导芽形成；
(d)在含有选择剂的培养基中培养形成的芽；
(e)选择转化的芽；以及
(f)再生已选择的转化芽为大豆植物。
在另一个实施方案中，去除(a)(ii)中产生的外植体每个初生叶的一部分，从而产生一对初生叶基部。
本发明的方法可用于将任何目的核酸导入大豆细胞中。在本发明的一个实施方案中，所述核酸含有在大豆中表达所需农艺学性状的基因。
在本发明的另一实施方案中，所述核酸含有用作选择标记基因的磷酸甘露糖异构酶基因。
在本发明的另一实施方案中，外植体和农杆菌共转染是在有甘露糖存在的情况下进行的。
成熟和未成熟种子都可用于产生本发明所用的外植体。
                   附图简述
图1显示质粒pNOV2105的图谱。
图2显示质粒pNOV2145的图谱。
图3显示质粒pNOV2147的图谱。
图4显示制备大豆外植体的示范方法。图A描述了大豆种子胚胎，其中去除一部分下胚轴。图B描述了来自图A的大豆外植体，其中去除了一个子叶及其邻近的腋芽。图C描述了去除两个初生叶的图B的大豆外植体，在每个初生叶的基部产生断裂点。
图5显示质粒pBSC11234的图谱。
图6显示质粒pBSC11369的图谱。
                     发明详述
现在，将参考附图在下文中更加全面地描述本发明，其中描述了本发明的多种实施方案。不过，本发明可以以不同的方式体现，而不应该解释为限于这里所示的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开更全面和完整，向本领域的技术人员全面地表达本发明的范围。这里用于本发明描述的术语仅仅是为了说明具体的实施方案而没有限制本发明之意。在本发明说明书和所附的权利要求中，除非文中另外清楚地指明外，单数形式“一个”和“这个”旨在也包括复数形式。
除非另外定义，本文所用技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同。
除非另外说明，可使用标准方法生产根据本发明的克隆基因、表达盒子、载体(例如质粒)、蛋白和蛋白片段、以及转化的细胞和植物。除非另有说明，可使用标准方法生产根据本发明的克隆基因、表达盒子、载体(例如质粒)、蛋白和蛋白片段。这些技术对本领域技术人员是公知的，参见例如，J.Sambrook等，分子克隆：实验室手册第二版(冷泉港实验室，Cold Spring Habor，New York，1989)，和F.M.Ausubel等，当前分子生物学实验方案(Green PublishingAssociates，Inc.和Wiley-Interscienee，New York，1991)；J.Draper等编辑，植物遗传转化和基因表达：实验室手册，(BlackwellScientific Publications，1988)；和S.B.Gelvin & R.A.Schilperoort编辑，植物中基因产物的导入、表达和分析。
本发明描述了用目的核酸序列稳定转化大豆和再生转基因大豆植物的方法和组合物。
本发明的方法可用于在大豆植物中表达任何目的核酸。目的基因可以是，例如，除草剂性基因、抗病基因、或抗昆虫/害虫基因，或者是选择或评价标记，并含有植物可操作的启动子、编码区和3’终止子区。除草剂性基因包括对咪唑啉酮或磺酰脲除草剂耐药的AHAS基因、对bialaphos或glufosinate耐药的pat或bar基因、对glyphosate耐药的EPSP合酶基因等。抗病基因包括抗生素合成酶基因，例如硝吡咯菌素合成酶基因，植物来源的抗性基因等等。昆虫抗性基因包括苏云金菌芽孢杆菌杀虫蛋白基因。目的基因也可以编码与生物化学途径有关的酶，该酶的表达可改变食物、饲料、营养药和/或药物生产中重要的性状。目的基因可以位于质粒上。适合本发明使用的质粒可以含有一个以上目的基因和/或农杆菌可含有带有不同目的基因的不同质粒。
本发明提供了大豆属各种类包括Glycine max(大豆种)的转化方法。所述方法是以农杆菌介导的目的基因传输入大豆细胞、之后转化的细胞再生为转化的大豆植物为基础的。本发明的方法独立于栽培品种。
在本发明的一个实施方案中，外植体是通过将从温室栽培植物收集的大豆成熟种子或未成熟种子在种子发芽培养基中萌发一段时间，从所说的成熟种子或未成熟种子去除种皮，之后去除子叶而制备的。在本发明一个优选实施方案中，然后去除一部分暴露的初生叶，从而在初生叶基部(primary leaf base)产生断裂点(图4)。将农杆菌介导的基因传输在初生叶基部或初生叶断裂点区的细胞上进行。从上胚轴的初生叶基部区诱导不定芽(shoots)形成。该诱导是通过去除先存在的分生组织(即初生、次生和腋生的分生组织)，并将外植体在含有合适生长调节剂的芽诱导培养基中培养获得的。所述的芽诱导方法促进了来自靶向的初生叶基部细胞的转化芽的发育或再生。
在选择剂存在的情况下培养转化的大豆细胞。优选地，这些细胞用磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因转化，并且转化的基因在甘露糖存在的情况下培养。在含有甘露糖为选择剂的培养基中，PMI基因转化的大豆细胞比没有如此转化的大豆细胞有生长优势。
与文献报导的其它农杆菌介导的转化方法相比，用本发明所述方法再生转化的大豆植物所需时间显著地缩短了。从转化实验开始8到12周生根的转化大豆芽可以生成。待插入大豆基因组中的外源遗传构建体或转基因可通过常规的重组DNA操作技术在体外构建。该构建体可由任何异源核酸组成。该遗传构建体转化入农杆菌株中以便传输到大豆细胞中。所述农杆菌是非致癌的，几个这样的菌株目前可广泛地获得。所述农杆菌优选选自根癌农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)。
优选地，外源基因构建体含有选择标记基因。优选的选择标记基因是磷酸甘露糖异构酶基因。其它合适的选择标记基因包括，但不限于，编码下述物质的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley等，CRCCritical Reviews in Plant Science 4，1(1986))；氰氨水合酶(Maier-Greiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4250(1991))；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(Perl等，BioTechnology 11，715(1993))；bar基因(Toki等，Plant Physiol.100，1503(1992)；Meagher等，Crop Sci.36，1367(1996))；色氨酸脱羧酶(Goddijn等，Plant Mol.Biol.22，907(1993))；新霉素磷酸转移酶(NEO；Southern等，J.Mol.Appl Gen.1，327(1982))；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG；Shimizu等，Mol.Cell.Biol.6，1074(1986))；二氢叶酸还原酶(DHFR)；膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock等，EMBO J.6，2513(1987))；2，2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron等，J.Cell.Biochem.13D，330(1989))；乙酰羟基酸合酶(Anderson等，美国专利号No.4,761,373；Haughn等，Mol.Gen.Genet.221，266(1988))；5-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸(5-enolpyruvyl-shikimate-phosphate)合酶(aroA；Comai等，Nature 317，741(1985))；卤芳基腈水解酶(Stalker等，WO87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker等，Plant Physiol.92，1220(1990))；二氢蝶酸合酶(sul I；Guerineau等，Plant Mol.Biol.15，127(1990))；以及32kDa的光系统II多肽(psbA；Hirschberg等，Science 222，1346(1983))。
还包括的基因有编码对以下药物耐药的基因：氯霉素(Herrera-Estrell等，EMBO J.2，987(1983))；氨甲蝶呤(Herrera-Estrella等，Nature 303，209(1983)；Meijer等，PlantMol.Biol.16，807(1991))；潮霉素(Waldron等，Plant Mol.Biol.5，103(1985)；Zhijian等，Plant Science 108，219(1995)；Meijer等，Plant Mol.Bio.16，807(1991))；链霉素(Jones等，Mol.Gen.Genet.210，86(1987))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等，TransgenicRes.5，131(1996))；博来霉素(Hille等，Plant Mol.Biol.7，171(1986))；磺胺(Guerineau等，Plant Mol.Bio.15，127(1990))；bromoxynil(Stalker等，Science 242，419(1988))；2，4-D(Streber等，Bio/Technology 7，811(1989))；膦丝菌素(DeBlock等，EMBOJ.6，2513(1987))；壮观霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research 5，131(1996))。
在一个实施方案中，用于转化方法的起始材料是大豆成熟种子。在另一个实施方案中，起始材料可以是栽培大豆植物的大豆未成熟种子。所述种子置于发芽培养基中，允许其发芽6-24小时，优选地发芽大约6-14小时，更优选地大约8-12小时。如果需要的话，还可以允许种子发芽更长时间，例如2到5天。
去除发芽种子的种皮和下胚轴。再去除一个子叶及其邻近的腋芽。然后，将初生叶实质性地去除，从而产生一个含有初生叶基部、该初生叶基部附着的上胚轴以及该上胚轴附着的子叶的外植体。实质性地去除意思是去除了初生叶组织的主要部分。
对于农杆菌介导的基因转移，已知植物组织的创伤能促进基因转移。因此，优选但不是必需的，可在初生叶基部区域造成伤口。
然后，将如上文所述方法制备的外植体浸入农杆菌细胞悬浮液中几分钟到几小时，典型地大约0.5-3小时，优选地1-2小时。去除过多的农杆菌细胞悬浮液，允许剩下的农杆菌和外植体在大约22℃±2℃的温度、16小时光照/8小时黑暗条件下在共培养培养基上共培养几天，典型地2到5天，优选地3到4天。
共培养后，将外植体转移到一个培养基(或一系列培养基)中培养8-12周，所述培养基有利于芽发育和转化细胞的选择。这样的培养基(或这些培养基)一般含有芽诱导激素以及选择剂。下面实施例中使用的再生培养基含有甘露糖作为选择剂，以及苄氨基嘌呤作为芽诱导激素。术语激素还包括诱导芽形成的细胞生长调节化合物，包括但不限于植物生长素(例如IAA、NAA和吲哚丁酸(IBA))、细胞分裂素(cytokinins)(如thidiazuron、激动素(kinetin)和玉米素)，和/或赤霉素(GA3)。
当芽长到大约2cm并有完全三叶形成时，将芽从外植体分出，并置于生根培养基上诱导根的形成。优选地，生根培养基也包括选择剂以进一步有助于鉴定可能转化的芽。根形成大约需要1-2周，之后可将该植物转移到土壤中并培养到完全成熟。
含有异源核酸(即含有按照本文描述方法转化的细胞或组织)的转基因植物以及通过该转基因植物产生的种子和后代是本发明的另一方面。将转化细胞培养成有用栽培品种的方法是本领域技术人员公知的。植物组织体外培养技术和许多情况中整体植物再生技术是公知的。本发明的另一方面是含有上述核酸的转基因植物组织、植物或种子。在优选的实施方案中，使用本文所述方法产生的转化植物不是嵌合的，或仅仅有一小部分转化的植物是嵌合的。优选地，这通过延长高浓度细胞分裂素处理的时间或增加甘露糖选择的严紧性或两者皆用而实现。
因此，通过选择或筛选鉴定并在如本文所提供的支持再生的合适培养基中培养后，可以允许本发明的转化细胞成熟为植物。优选地，植物在栽培间或者温室中成熟。转化子鉴定后大约2-6周(依赖于初始的组织)，植物得以再生。在再生期间，细胞可在组织培养容器中的固体培养基上培养。这些培养容器的示例实施方案是培养皿和植物Cons。再生中的植物长到芽和根发育阶段后，为进一步生长和试验可以将它们转移到温室中。如上文所提供的，再生植物的种子和后代植物是本发明的一个方面。相应地，术语“种子”意指包括这些转化植物的种子以及转化植物后代产生的种子。本发明的植物不仅包括转化和再生的植物，还包括通过本文所述方法产生的转化和再生植物的后代。
通过上文所描述的标准方法可以从所述方法产生的植物中筛选成功的转化植物。为了开发改良的植物和种子品系(这也是本发明的另一方面)，可以持续地筛选和选择本发明再生植物的种子和子代植物以使转基因和整合的核酸序列持续存在。因此，可以将所需要的转基因核酸序列移入(即渐渗或近亲交配)其它的遗传品系如某些原种或商业上有用的品系或品种中。渐渗目的核苷酸序列进入遗传植物品系的方法可通过本领域公知的多种技术来实现，这些技术包括通过传统的育种、原生质体融合、细胞核转移以及染色体转移。育种方法和技术是本领域公知的，例如下列文献中所示的，J.R.Welsh，植物遗传和育种基础(John Wiley和Sons，New York，(1981))；农作物育种(D.R.Wood，编辑，American Society of Agronomy，Madison，Wisconsin，(1983))；O.Mayo，植物育种理论，第二版(ClarendonPress，Oxford，England(1987)；以及Wricke和Weber，数量遗传学和选择植物育种(Walter de Gruyter和Co.，Berlin(1986))。使用这些以及本领域的其它技术，根据本发明获得的转基因植物和近交系可用于生产商业上有价值的杂交植物和农作物，杂交的品种也是本发明的一个方面。
上述内容是本发明各种实施方案的举例说明，而不应看作是对其限制。
通过下面的实施例进一步描述本发明，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。
                        实施例1
转化载体
质粒pNOV2105(图1)是对WO 97/04112公开和描述的pVictor的修改，其中35S启动子由SMAS启动子代替，35S终止子由Nos终止子代替，另一SMAS启动子插入到GUS内含子GUS序列的上游，GUS内含子GUS序列3’末端侧翼是Nos终止子。用于本文所述方法中的pNOV2105不含有在pVictor中发现的多克隆位点。不过，如果需要的话，增加这样的克隆位点完全在本领域的技术之内。
pNOV2105(图1)是用于农杆菌介导的植物转化的载体，并含有来源于胭脂氨酸型pTiT37质粒(Yadav等，1982 Proc Natl Acad Sci79：6322-6326)的Ti右和左边界序列，其位于磷酸甘露糖异构酶(PMI)和β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的侧翼。
为在大肠杆菌(E.coli)中复制和保持，该质粒含有大肠杆菌质粒pUC19的复制原点(pUC19ori)(Yanish-Perron等，1985 Gene33：103-119)，并且为了在根癌农杆菌中复制和保持，该质粒还含有假单胞菌(Pseudomonas)质粒pVS1的复制原点(pVS1ori)(Itoh等1984 Plasmid 11：206-220；Itoh和Hass 1985 Gene 36：27-36)。为在大肠杆菌和根癌农杆菌中筛选，该质粒含有编码3″(9)-O-核苷酸转移酶的来自转座子Tn7的壮观霉素/链霉素抗性基因(spec/strep)(Fling等1985 Nucleic Acids Res 19：7095-7106)。为在细菌中有效的表达，spec/strep抗性基因与tac启动子(参见如Amann等1983 Gene 25(203)：167-78)融合。
在右和左边界之间的T-DNA片段含有下述基因，这些基因是通过根癌农杆菌介导的转化转移到大豆植物中的仅有基因。
GUS内含子GUS
β-葡糖醛酸酶(GUS)：该片段挨着右边界，含有大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶基因，在该编码区内有一内含子以阻止融合SMAS启动子和Nos终止子的农杆菌进行翻译。GUS内含子GUS基因是从质粒pBISN1(Narasimhulu等1986烟草和玉米中农杆菌DNA的早期转录，PlantCell 8：873-866)分离的。
磷酸甘露糖异构酶(PMI)：该片段挨着左边界，是来自大肠杆菌的甘露糖-6-磷酸异构酶基因(Miles和Guest 1984，Gene 32：41-48)，与SMAS启动子(NiM，Cui D，Einstein J，NarasimhuluS，Vergara CE，Gelvin SB(1995))和Nos终止子融合。磷酸甘露糖异构酶基因作为选择标记以在含有D-甘露糖为碳源的培养基上筛选转基因芽。
pNOV2145(图2)的组成和序列如SEQ ID NO：1所示。pNOV2147(图3)的组成和序列如SEQ ID NO：2所示。
                       实施例2
转化和再生
通过在干燥器中释放氯气对成熟干燥的大豆种子(Var.S42 H1)进行表面消毒。种子保存在petri培养皿中，氯气通过在烧杯中倒入100ml Clorox并慢慢加入8ml浓HCL产生。种子至少用两次氯气释放处理来消毒，每次持续8-18小时。
然后，将消毒的种子(每皿大约15-20个种子)置于含有0.6％琼脂凝固的MS基础培养基(Murashige和Skoog(1962)烟草愈伤组织培养物快速生长和生化鉴定的修改培养基。Physiol Plant 15：473-479)和2％蔗糖的发芽培养基上。pH值保持5.8。petri培养皿置于37℃房间使种子过夜生长或吸涨。去除种皮，然后去除部分下胚轴，保留大约0.5cm的下胚轴。去除一个子叶连同其邻近的腋芽并丢弃。在剩下的子叶上，用手术刀断开初生叶，保留上胚轴上的初生叶基部(图4)。
将冻存的甘油储备液中保存的含有质粒pNOV2145(ZsGreen1和PMI，如实施例1所述)的农杆菌菌株(LBA 4404)划线在含有合适抗生素(100mg/L壮观霉素)的YEP(酵母提取物10g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，细菌培养用琼脂15g/L)培养皿上。然后，将农杆菌27℃温育1-2天。从培养皿上取一勺农杆菌放入100ml含有抗生素(100mg/L壮观霉素)的YEP液体培养基中在摇床上27℃培养过夜。细菌悬液在大约1500g离心15分钟，然后重悬在共培养液体培养基中达密度OD660＝0.2或0.65，该培养基的组成为：B5盐0.05×(Sigma)、B5维生素(0.05×)(B5维生素组合物(1×)：肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、盐酸硫胺素10mg/L)、乙酰丁香酮40mg/L、蔗糖20g/L、BAP 2mg/L、GA3 0.25mg/L、MES(吗啉代乙烷磺酸)3.9g/L及pH5.4。
将含有靶组织的外植体浸入农杆菌悬浮液中，并孵育1-2小时。倒掉农杆菌悬液，然后将处理的外植体置于共培养培养皿中的滤纸上。保持该外植体的近轴侧和滤纸接触。共培养固体培养基由B5盐(Sigma，0.05×)、B5维生素(0.05×)、40mg/L乙酰丁香酮、蔗糖20g/L、BAP 2mg/L、GA3 0.25mg/L、MES 3.9g/L及pH5.4组成。该培养基用0.5％精制琼脂(Sigma)固化。
将外植体和农杆菌在16小时光照/8小时黑暗条件下在20-30℃共培养2-5天。共培养后，在含有250mg/L氨噻肟头孢霉素的无菌水中漂洗外植体，去除初生和次生分生组织，然后将外植体转移到再生培养基(即REG-1培养基)中。在再生过程中，还去除邻近子叶的腋生芽以促进初生叶基部区的生长。
REG-1培养基含有MS盐(1×)、B5维生素(1×)、KNO3 1g/L、BAP 1mg/L、替卡西林(ticarcillin)300mg/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、谷氨酰胺250mg/L、天冬酰胺50mg/L、甘露糖15-30g/L、蔗糖0、0.25和1g/L、pH5.6以及精制琼脂10g/L。在每个petri培养皿中以直立姿势放置五个外植体，以便外植体的上胚轴末端插入培养基中。将培养皿置于塑料容器内，并放在22-25℃的培养间里，在每18-20小时光照/4-6小时黑暗的周期、光强度60-100μEm-2S-1的条件下培养。在REG-1培养基上生长2周后，将外植体转移到REG-2培养基上，REG-2培养基含有MS盐(1×)以及B5维生素(1×)、KNO31g/L、BAP 0.5mg/L、替卡西林300mg/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、谷氨酰胺250mg/L、天冬酰胺50mg/L、甘露糖15g/L和蔗糖1g/L。培养基的pH值保持在5.6，培养基用精制琼脂10g/L固化。
在4-6周，将大豆培养物转移到REG-3培养基上继续选择和芽形成。REG-3培养基含有MS盐(1×)、B5维生素(1×)、KNO3 1g/L、BAP 0.2mg/L、GA3 0.5mg/L、IBA 0.1mg/L、替卡西林300mg/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、谷氨酰胺250mg/L、天冬酰胺50mg/L、甘露糖15g/L、蔗糖1g/L，pH5.6，培养基用精制琼脂10g/L固化。去除死的组织，带有再生芽的外植体每两周用新鲜REG-3培养基传代培养。当芽长到大约2-4cm长的时候，连续从培养物上收获伸长的芽。同时，将芽转移到生根培养基中，生根培养基含有MS盐(0.5×)、B5维生素(0.5×)、谷氨酰胺250mg/L、天冬酰胺50mg/L、KNO3 1g/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、替卡西林300mg/L、蔗糖15g/L、IBA 0.5mg/L，pH5.6以及精制琼脂10g/L。
将表达荧光蛋白基因(ZsGreen1)的生根转基因芽转移到含有湿润的Fafard发芽混合物(Conrad Fadard Inc.，MA，USA)的211培养罐中，并用塑料杯覆盖保湿继续培养大约2周。植物在白天温度27-29℃、夜间温度21℃、16小时光照周期(光强度20-40μEm-2S-1)的条件下驯化。当新叶开始长出，将植物转入含有土壤混合物的一加仑培养罐中，该土壤混合物由50-55％松树树皮堆肥、40-45％泥炭、5-10％珍珠岩(Sungrow Horticultural Supply，Pine Bluff，Arkansas)组成。驯化的大豆植物在温室中白天温度27-29℃、夜间温度21℃、光强度400-600μEm-2S-1、相对湿度70-95％和16小时光照周期的条件下生长。这些植物在生长期间用osmocote(Scotts-SierraHorticultural Products Company，Ohio；17-6-12)施肥两次(5-8g/加仑土壤)。通过Taqman分析在温室栽培植物叶子中有荧光蛋白基因以及PMI基因的存在证实有转化发生。通过使用荧光显微镜显现表达也证实了在转化的大豆组织中荧光蛋白基因的表达。
通过Southern印迹分析证实了用基因构建体pNOV2145获得了六个转基因植物。对一个事件的后代分析PMI基因或ZsGreen1基因揭示在转化大豆的基因组中有一个T-DNA整合位点。该子代在T1代中以3：1比例分离。
表1  转化的表达荧光蛋白基因(ZsGreen1)的芽
 实验编号  基因构建体    转化的芽/外植体   转化芽百分比
    75   pNOV2145       5/45       11
    89   pNOV2145       5/75       7
                       实施例3
将大豆种子(Var.S42 H1)表面消毒，并如实施例2所述制备外植体。
如实施例1所述制备含有质粒pNOV2147的农杆菌菌株(LBA4404)。用共培养液体培养基将细菌终浓度调整为OD660＝0.60。外植体制备、农杆菌接种以及共培养的条件与实施例2所述的相同。
在固体共培养培养基中共培养三天之后，将过多的农杆菌漂洗掉，去除初生和次生分生组织，并将外植体转移到REG-1培养基中。将它们在28-30℃16小时光/8小时黑暗条件下培养。在REG-1培养基上培养2周后，将培养物转移到REG-2培养基中。在该再生过程中，仅保留从初生叶基部生出的芽。在大约第四周，将芽培养物转移到REG-3培养基中。然后，每10-14天转移到新鲜的REG-3培养基中。如在REG-1和REG-2培养基中一样，仅保留从初生叶基部产生的芽而去除其余芽。当延伸的芽长度达到约2-4cm时，将它们与芽培养物的其它部分分开，并转移到生根培养基中。
从35个外植体中鉴定出五个表达蓝荧光蛋白基因的转基因芽(表2)。
表2  转化的表达蓝荧光蛋白(cyano fluorescent protein)基因的芽。
 实验编号   基因构建体  转化的芽/外植体   ％转化的芽
    92    pNOV2147       5/35      14
                      实施例4
共培养期间的甘露糖处理
在本实施例中所用的基因构建体是pNOV2145(其含有ZsGreen1和PMI基因，如实施例1中所述)。制备外植体、农杆菌悬液以及细菌悬液接种外植体的方法如实施例2中所述的进行。细菌终浓度调整为OD660＝0.55或0.85。
接种步骤之后，将外植体转移到含有20g/L蔗糖或15g/L甘露糖的共培养培养基中，并保持在20-23℃16小时光/8小时黑暗条件下培养。
共培养3-5天后，使用荧光显微镜观察荧光蛋白基因的表达。在含有甘露糖的共培养培养基中接种农杆菌的外植体，与含有蔗糖的共培养培养基中共培养的农杆菌接种的外植体相比，显示至少两倍的荧光斑点数。之后的芽再生和选择步骤如实施例2中所述方法进行。
在共培养培养基含有甘露糖的实验中发现转化芽的产量显著地增加了(表3)。从含有甘露糖的共培养培养基中有五个转化的芽生根，并转移到了土壤中。之后Taqman和Southern印迹分析证实有转基因的整合。在T1子代中转基因的表达证实了这些转移基因的种系传递。
表3  表达ZsGreen1荧光蛋白基因的转化芽，其中外植体和农杆菌在甘露糖或蔗糖中共培养
 实验编号  基因构建体   在甘露糖或蔗糖中共培养  转化的芽/外植体   ％转化
    87   pNOV2145     蔗糖甘露糖       0/606/80     07.5
    102   pNOV2145     蔗糖甘露糖       1/208/40     520
                          实施例5
在本实施例中，使用含有质粒pNOV2105(SMAS-PMI SMAS-GUS，如实施例1中所述)的农杆菌EHA101用于大豆转化。外植体的制备、农杆菌悬液以及农杆菌接种外植体与实施例2中所述的相同。细菌终浓度调整为OD660＝0.45或0.6。
农杆菌接种后，将外植体转移到含有20g/L蔗糖或15g/L甘露糖的共培养培养基中。在20-23℃16小时光/8小时黑暗条件下进行共培养。共培养3-5天后，用组织化学gus测定方法观察GUS基因的表达。在含有甘露糖的共培养培养基中共培养的外植体，与在含有蔗糖的共培养培养基中共培养的外植体相比，显示至少两倍的GUS斑点数。芽再生和选择如实施例2中所述方法进行。在共培养培养基中加入甘露糖的实验中观察到转化芽的产量显著增加(表4)。
表4  表达GUS基因的转化芽
 实验编号  基因构建体   在甘露糖或蔗糖中共培养    转化的芽/外植体  ％转化
    63   pNOV2105     蔗糖      5/60     8
    81   pNOV2105     蔗糖甘露糖      2/305/30     717
                         实施例6
在本实施例中，使用含有质粒pBSC11234(图5)的农杆菌EHA101用于大豆转化。pBSC11234的组成和序列如SEQ ID NO：3所示。pBSC11234含有CMP-PMI：β-伴大豆球蛋白(conglycinin)-半乳糖苷酶基因构建体。外植体的制备、农杆菌悬液以及农杆菌接种外植体与实施例2中所述的相同。细菌终浓度调整为OD660＝0.6。该共培养液体培养基含有B5盐(0.1×)、B5维生素(1×)、乙酰丁香酮80mg/L、蔗糖20g/L、BAP 2mg/L、GA3 0.25mg/L、MES 3.9g/L以及pH5.4。通过在液体共培养培养基中掺入5g/L精制琼脂制备固体共培养培养基。
农杆菌接种后，将外植体转移到固体共培养培养基上，在20-24℃16小时光/8小时黑暗条件下培养。共培养3-5天后，去掉初生和次生芽分生组织并丢弃，将所得到的外植体转移到REG-4培养基中。REG-4培养基含有B5盐(1×)、B5维生素(1×)、BAP 1mg/L、谷氨酰胺50mg/L、天冬酰胺50mg/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、替卡西林300mg/L、甘露糖15-20g/L、蔗糖0、0.25或1g/L、精制琼脂10g/L以及pH5.6。5-7天期间之后，去除从接近子叶的腋生分生组织长出的任何芽，然后将外植体转移到REG-5培养基中，REG-5培养基含有B5盐(1×)、B5维生素(1×)、BAP 0.5mg/L、谷氨酰胺50mg/L、天冬酰胺50mg/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、替卡西林300mg/L、甘露糖15-20g/L、蔗糖1g/L、精制琼脂10g/L以及pH5.6。在四周时，将外植体转移到REG-6培养基中以便芽伸长。REG-6培养基含有MS盐(1×)、MS维生素(1×)(MS维生素组合物：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L)、肌醇200mg/L、BAP 0.2mg/L、玉米素核糖核苷0.5mg/L、IBA 0.1mg/L、GA3 1mg/L、谷氨酰胺50mg/L、天冬酰胺50mg/L、替卡西林300mg/L、甘露糖15g/L、蔗糖5g/L、硝酸银0.8mg/L、精制琼脂10g/L、以及pH5.6。每两周将外植体转移到新鲜的REG-6培养基中。将伸长的芽(2-4cm长)移出，并在生根培养基中生根，然后转移到土壤中。生根培养基含有MS盐(1×)、B5维生素(1×)、谷氨酰胺100mg/L、天冬酰胺100mg/L、IBA 0.7mg/L、timentin 100mg/L、以及蔗糖15g/L。Taqman分析证实在两个事件的叶子样本中有转基因(α半乳糖苷酶和磷酸甘露糖异构酶)的存在。
                      实施例7
在本实施例中，使用含有质粒pBSC11369(图6)的农杆菌EHA101用于大豆转化。pBSC11369的组成和序列如SEQ ID NO：4所示。pBSC11369含有CMP-HPT：CMP-ZsGreen1基因构建体。外植体的制备、农杆菌悬液以及农杆菌接种外植体与实施例2中所述的相同。细菌终浓度调整为OD660＝0.6。所述共培养液体培养基含有B5盐(0.1×)、B5维生素(1×)、乙酰丁香酮80mg/L、蔗糖20g/L、BAP 2mg/L、GA3 0.25mg/L、MES 3.9g/L以及pH5.4。通过在液体共培养培养基中掺入5g/L精制琼脂制备固体共培养培养基。
农杆菌接种后，将外植体转移到固体共培养培养基上，在20-24℃16小时光/8小时黑暗条件下培养。共培养3-5天后，为促进芽从初生叶基部区生长，从外植体上去除初生和次生分生组织，之后将外植体转移到REG-7培养基中。REG-7培养基含有B5盐(1×)、B5维生素(1×)、BAP 1mg/L、谷氨酰胺50mg/L、天冬酰胺50mg/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、替卡西林300mg/L、蔗糖30g/L、潮霉素2-5mg/L、精制琼脂10g/L以及pH5.6。将外植体直立放置以便将外植体的上胚轴端插入培养基中。7-10天期间之后，去除从靠近子叶的腋生分生组织长出的所有芽。将外植体转移到新鲜REG-8培养基中，REG-8培养基含有B5盐(1×)、B5维生素(1×)、BAP 0.5mg/L、谷氨酰胺50mg/L、天冬酰胺50mg/L、氨噻肟头孢霉素100mg/L、替卡西林300mg/L、蔗糖30g/L、精制琼脂10g/L以及pH在5.6。再两周之后，将外植体转移到REG-9培养基中，然后每两周传代培养。REG-9培养基含有MS盐(1×)、MS维生素(1×)、肌醇200mg/L、BAP 0.2mg/L、玉米素核糖核苷0.5mg/L、IBA 0.1mg/L、GA3 1mg/L、谷氨酰胺50mg/L、天冬酰胺50mg/L、硝酸银0.8mg/L、替卡西林300mg/L、蔗糖30g/L、潮霉素0.1-0.2mg/L、精制琼脂10g/L以及pH5.6。将伸长的芽(2-4cm长)移出，在生根培养基中生根，然后转移到土壤中。生根培养基含有MS盐(1×)、B5维生素(1×)、谷氨酰胺100mg/L、天冬酰胺100mg/L、IBA 0.7mg/L、timentin 100mg/L、以及蔗糖15g/L。Taqman分析证实从五个事件获得的叶子样本中有转移基因(HPT以及ZsGreen1)的存在。通过在荧光显微镜下观察证实了在植物部分中有ZsGreen1基因的表达。
本文引用的所有出版物、专利及专利申请作为参考文献并入本文。尽管在前面的说明书中，描述了本发明有关的某些优选实施方案以及为了举例说明陈述了许多细节，但对于本领域的技术人员显而易见的是本发明可以有另外的实施方案以及本文所描述的某些细节可以有相当大的变化而不偏离本发明的基本原则。
                             序列表
<110>Syngenta Participations AG
<120>转化大豆的方法
<130>70094 USPS
<160>4
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>9555
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>pNOV2145
<400>1
gatccaccgg tcgccaccat ggcccagtcc aagcacggcc tgaccaagga gatgaccatg     60
aagtaccgca tggagggctg cgtggacggc cacaagttcg tgatcaccgg cgagggcatc    120
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gctgcgtgga tggcatgcgc atcggcccgg acaccgcccc gttctgggga gagcacatcg    9780
aggacaacgg cgccccggcg gcccgctggg ccctccgcaa cgccatcacc cgctacttca    9840
tgcacgaccg cttctggctc aacgacccgg actgcctcat cctccgcgag gagaagaccg   9900
acctcaccca gaaggagaag gagctgtact cctacacctg cggcgttcta gacaacatga   9960
tcatcgagtc cgacgacctc tccctcgtgc gcgaccacgg caagaaggtg ctcaaggaga  10020
ccctcgagct gctcgggggc aggccgcgcg tgcagaacat catgtccgag gacctccgct  10080
acgagatcgt gtcctcgggc accctctccg gcaacgtgaa gatcgtggtg gacctcaact  10140
cccgcgagta ccacctcgag aaggagggca agtcctccct caagaagcgc gtggtgaagc  10200
gggaggacgg caggaacttc tacttctacg aggagggcga gcgcgagtga aagcttgacg  10260
tcactagtgc gatcgcgcta gccatggccg gcctaggcgc ccgggagatc cccgaatttc  10320
cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt  10380
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa  10440
tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa  10500
tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca  10560
tctatgttac tagatcggga attcctcgag tctagacctg cagg                   10604
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aagcttctgg cagacaaagt ggcagacata ctgtcccaca aatgaagatg gaatctgtaa     60
aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca aaggttaggt cggctgcctt taatcaatac    120
caaagtggtc cctaccacga tggaaaaact gtgcagtcgg tttggctttt tctgacgaac    180
aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt ccaccatgtg aaggcatctt cagactccaa    240
taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa ataagtaagg gtagtttggg aaatgtccac    300
tcacccgtca gtctataaat acttagcccc tccctcattg ttaagggagc aaggatccac    360
cggtcgccac catggcccag tccaagcacg gcctgaccaa ggagatgacc atgaagtacc    420
gcatggaggg ctgcgtggac ggccacaagt tcgtgatcac cggcgagggc atcggctacc    480
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ccgaggacat cttgtccgcc gccttcatgt acggcaaccg cgtgttcacc gagtaccccc    600
aggacatcgt cgactacttc aagaactcct gccccgccgg ctacacctgg gaccgctcct    660
tcctgttcga ggacggcgcc gtgtgcatct gcaacgccga catcaccgtg agcgtggagg    720
agaactgcat gtaccacgag tccaagttct acggcgtgaa cttccccgcc gacggccccg    780
tgatgaagaa gatgaccgac aactgggagc cctcctgcga gaagatcatc cccgtgccca     840
agcagggcat cttgaagggc gacgtgagca tgtacctgct gctgaaggac ggtggccgct     900
tgcgctgcca gttcgacacc gtgtacaagg ccaagtccgt gccccgcaag atgcccgact     960
ggcacttcat ccagcacaag ctgacccgcg aggaccgcag cgacgccaag aaccagaagt    1020
ggcacctgac cgagcacgcc atcgcctccg gctccgcctt gccctgctct agatcccgaa    1080
tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg    1140
tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat    1200
gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat    1260
ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt    1320
gtcatctatg ttactagatc gggaattggg gaaatttacc ggtgccgaat ttccccgatc    1380
cagcttctgg cagacaaagt ggcagacata ctgtcccaca aatgaagatg gaatctgtaa    1440
aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca aaggttaggt cggctgcctt taatcaatac    1500
caaagtggtc cctaccacga tggaaaaact gtgcagtcgg tttggctttt tctgacgaac    1560
aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt ccaccatgtg aaggcatctt cagactccaa    1620
taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa ataagtaagg gtagtttggg aaatgtccac    1680
tcacccgtca gtctataaat acttagcccc tccctcattg ttaagggagc aaggatccat    1740
gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag    1800
cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt    1860
aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg    1920
ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg    1980
ggaattcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca    2040
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gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat    2160
cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca    2220
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gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc    2340
caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat    2400
gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg    2460
tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg    2520
gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg    2580
caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc    2640
cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg    2700
tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga    2760
atagggatcc cccgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat    2820
tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc    2880
atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag    2940
tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata    3000
aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attagcggcc cgaattcact    3060
ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct    3120
tgcagcacat ccccctttcg ccaggggcgg ccagcatggc cgtatccgca atgtgttatt    3180
aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca    3240
gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat acaggcagcc catcagaatt    3300
aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag    3360
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc    3420
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg    3480
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt    3540
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag    3600
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc    3660
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg    3720
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg    3780
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca    3840
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ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag    4020
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cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct    4680
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caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt    4800
cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgaga tcgttcgtaa    4860
tctggcggca aagtctgata ttccaatcat aattatcagt ggcgaccgcc ttgaggagac    4920
ggataaagtt gttgcactcg agctaggagc aagtgatttt atcgctaagc cgttcagtat    4980
cagagagttt ctagcacgca ttcgggttgc cttgcgcgtg cgccccaacg ttgtccgctc    5040
caaagaccga cggtcttttt gttttactga ctggacactt aatctcaggc aacgtcgctt    5100
gatgtccgaa gctggcggtg aggtgaaact tacggcaggt gagttcaatc ttctcctcgc    5160
gtttttagag aaaccccgcg acgttctatc gcgcgagcaa cttctcattg ccagtcgagt    5220
acgcgacgag gaggtttatg acaggagtat agatgttctc attttgaggc tgcgccgcaa    5280
acttgaggca gatccgtcaa gccctcaact gataaaaaca gcaagaggtg ccggttattt    5340
ctttgacgcg gacgtgcagg tttcgcacgg ggggacgatg gcagcctgag ccaattccca    5400
gatccccgag gaatcggcgt gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg    5460
gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc    5520
atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa    5580
gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac    5640
gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc    5700
atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc    5760
cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt    5820
gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga    5880
taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta    5940
ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc    6000
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gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc    6240
atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg    6300
ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc    6360
accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg    6420
gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc    6480
gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt    6540
cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg    6600
aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa    6660
gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt    6720
aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag    6780
ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg    6840
cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg    6900
cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa    6960
ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag    7020
ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt    7080
gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa    7140
gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt    7200
acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt    7260
tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag    7320
aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga    7380
ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg    7440
agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagctct gcattaatga    7500
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc    7560
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cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc    8040
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ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag    8280
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg    8340
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa    8400
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aaatggacga acggataaac cttttcacgc ccttttaaat atccgattat tctaataaac    8520
gctcttttct cttaggttta cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactg    8580
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cgccgatgac gcgggacaag ccgttttacg tttggaactg acagaaccgc aacgctgcag    8700
gaattggccg cagcggccat ttaaatcaat tgggcgcgcc gaattcgagc tcggtac       8757

Claims (22)

1.一种转化大豆细胞或组织的方法，包括：
(a)通过以下步骤从大豆种子制备外植体：
(i)从所说的大豆种子中去除下胚轴；
(ii)去除一个子叶及其邻近的腋芽，保留附于剩下子叶上的初生叶；以及
(iii)从所说的保留子叶上去除一部分初生叶，由此产生初生叶基部；以及
(b)将所说的外植体和含有至少一个待掺入到一个或多个大豆细胞的基因组中的目的核酸的农杆菌共培养。
2.权利要求1的方法，还包括在含有选择剂的培养基中培养至少一个形成的芽。
3.权利要求2的方法，其中所说的至少一个目的核酸包括选择标记基因。
4.权利要求3的方法，其中所说的选择标记基因是磷酸甘露糖异构酶基因。
5.权利要求4的方法，其中所说的选择剂是甘露糖。
6.权利要求4的方法，其中与所说的农杆菌共培养是在甘露糖存在的情况下进行的。
7.权利要求2的方法，还包括从所说的初生叶基部诱导芽形成。
8.权利要求7的方法，其中芽形成是通过在含有芽诱导激素的培养基中培养所说的初生叶基部诱导的。
9.权利要求8的方法，其中所说的芽诱导激素包括生长素、细胞分裂素和赤霉素中的至少一种。
10.权利要求9的方法，其中所说的生长素选自由IAA、NAA和IBA组成的组。
11.权利要求9的方法，其中所说的细胞分裂素选自由苄氨基嘌呤(BAP)、thidiazuron、激动素和异戊烯基腺嘌呤组成的组。
12.权利要求7的方法，其中芽形成诱导包括去除个或多个附着于子叶上的初生分生组织、次生分生组织和腋生分生组织。
13.权利要求7的方法，还包括选择转化的芽。
14.权利要求13的方法，还包括将选择的转化芽再生为大豆植物。
15.权利要求1的方法，其中所说的大豆种子是成熟种子。
16.权利要求1的方法，其中所说的大豆种子是未成熟种子。
17.权利要求1的方法，其中所说的大豆种子是已发芽种子。
18.一种生产稳定转化的大豆植物的方法，包括：
(a)通过以下步骤从大豆种子制备外植体：
(i)从所说的大豆种子中去除下胚轴；
(ii)去除一个子叶及其邻近的腋芽，保留附着在剩下子叶上的初生叶；以及
(iii)从所说的保留子叶上去除每一个初生叶的一部分，从而产生一对初生叶基部；
(b)将所说的外植体和含有待掺入到大豆细胞基因组中的目的核酸的农杆菌共培养；
(c)从每个初生叶基部诱导芽的形成；
(d)在含有选择剂的培养基中至少培养一个形成的芽。
(e)选择转化的芽；以及
(f)将选择的转化芽再生为大豆植物。
19.从按照权利要求1的方法转化的大豆细胞或组织再生的转基因大豆植物。
20.权利要求19的转基因植物生产的转基因种子。
21.从按照权利要求18方法转化的大豆细胞或组织再生的转基因大豆植物。
22.权利要求21的转基因植物生产的转基因种子。
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