CN102348802B - 突变体羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

在此提供了用于向植物赋予羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂抗性或耐受性的组合物和方法。这些组合物包括对于突变体HPPD多肽的氨基酸序列、以及它们的变体和片段。还提供了编码这些突变体HPPD多肽的核酸。进一步提供了用于向植物赋予除草剂抗性或耐受性、特别是对某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性的方法。还提供了用于在作物场所的大田中选择性地控制杂草以及用于测定、表征、鉴定和选择提供了除草剂耐受性的本发明的突变体HPPD的方法。

Description

突变体羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法
相关申请
在此要求对于2009年7月10日提交的美国临时申请号61/224,661的优先权，并且还要求对于2009年1月22号提交的美国临时申请号61/146,513的优先权，将它们通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明涉及向植物赋予除草剂抗性或耐受性的突变体羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多肽以及编码它们的核酸序列。本发明的方法涉及表达这些突变体HPPD多肽并且对于HPPD除草剂具有抗性的植物的产生和用途。
发明背景
羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)是催化对羟基苯丙酮酸(HPP)被转化成尿黑酸盐/尿黑酸(homogentisate)的反应的酶。这个反应在酶结合的铁(Fe2+)和氧的存在下发生。通过抑制HPPD而起作用的除草剂是所熟知的，并且包括异噁唑类、二酮腈类、三酮类、以及吡唑啉盐类(pyrazolinates)(Hawkes“Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD)-The HerbicideTarget.”In Modern Crop Protection Compounds.Eds.and Schirmer.Weinheim,Germany:Wiley-VCH,2007.Ch.4.2,pp.211-220)。HPPD的抑制作用阻断了从酪氨酸生物合成质体醌(PQ)。PQ在类胡萝卜素色素的生物合成中是一种必需的辅因子，这些类胡萝卜素色素对于光合中心的光防护是必需的。抑制HPPD的除草剂是韧皮部可移动的漂白剂，它们引起暴露于光的新的分生组织和叶子显现出白色。在缺乏类胡萝卜素下，叶绿素是光破坏性的并且通过单线态氧的光生作用而自身变成一种光化裂解剂。
用于提供耐受HPPD除草剂的植物的方法同样是已知的并且包括：1)将HPPD酶过量表达从而在植物中产生大量的HPPD酶，这些HPPD酶与一种给定的除草剂是充分有关的从而具有足够的可供使用的功能性酶(尽管存在它的抑制剂)；并且2)将目标HPPD酶突变成一种功能性HPPD，该功能性HPPD对于除草剂是较不敏感的。关于突变体HPPD类，虽然一种给定的突变体HPPD酶可以提供一个有用水平的对于一些HPPD抑制剂除草剂的耐受性，相同的突变体HPPD可能不足以提供商业水平的对于一种不同的、更希望的HPPD抑制剂除草剂的耐受性(参见例如美国申请公开号2004/0058427；以及PCT申请公开号WO 98/20144和WO 02/46387；还参见美国申请公开号2005/0246800，它涉及作为相对耐受HPPD的大豆品种的鉴定和标记)。例如，HPPD抑制剂除草剂可以在它们控制的杂草范围、它们的制造成本、以及它们的环境益处方面是不同的。
因此，需要用于向不同的作物和作物品种赋予HPPD除草剂耐受性的新的方法和组合物。
发明概述
在此提供了用于向植物赋予羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂抗性或耐受性的组合物和方法。这些组合物包括对于突变体HPPD多肽的核苷酸和氨基酸序列。本发明的这些多肽是突变体HPPD，这些突变体HPPD具有HPPD酶活性并且在植物中赋予对于某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性。在一个实施方案中，本发明的这些组合物包括一种突变体HPPD多肽，该多肽具有与SEQ ID NO:27至少80％的序列同一性，其中该多肽具有HPPD酶活性，并且其中该多肽包含选自下组的一个或多个氨基酸添加、置换、或缺失，该组由以下各项组成：
1)R(K,A,R)SQI(Q,E)T(SEQ ID NO:28)，其中第一个Q被任何其它的氨基酸、特别是被A、G、M、T、S、C、R、F并且更特别是被P所代替；
2)R(K,A,R)SQI(Q,E)T(SEQ ID NO:28)，其中I被任何其它的氨基酸、特别是被V、S、A、P、T、L或G所代替；
3)(P，A,S)G(V，L)QH(I,L,M)(SEQ ID NO:29)，其中Q被任何其它的氨基酸、特别是被N、R、G、A、S、T、E或C并且更特别是被A或H所代替；
4)G(I,V)LVD(R,K)D(SEQ ID NO:30)，其中L被任何其它的氨基酸、特别是被M或A所代替；
5)ESGLN(S,G)(SEQ ID NO:31)，其中L被任何其它的氨基酸、特别是被M、H、G、F、C或I并且更特别是被M所代替；
6)F(A,S)EF(T,V)(SEQ ID NO:32)，其中(A,S)被任何氨基酸、特别是被W、G、M、F、Y或H所代替；
7)G(I,V)LVD(R,K)D(SEQ ID NO:30)和ESGLN(S,G)(SEQ IDNO:31)，其中L在两个序列中都被M所代替；
8)EVELYGDVV(SEQ ID NO:37)，其中Y被任何其它的氨基酸、特别是被D、V、E、K、或A所代替；
9)RFDHVVGNV(SEQ ID NO:38)，其中第一个V被任何其它的氨基酸如I、A、M、或C所代替；
10)DHVVGNVPE(SEQ ID NO:39)，其中G被任何其它的氨基酸如H或C所代替；
11)HVVGNVPEM(SEQ ID NO:40)，其中N被任何其它的氨基酸如C所代替；
12)NVPEMAPVI(SEQ ID NO:41)，其中M被任何其它的氨基酸如L所代替；
13)GFHEFAEFT(SEQ ID NO:42)，其中F被任何其它的氨基酸如M、I、或L所代替；
14)GTTESGLNS(SEQ ID NO:43)，其中S被任何其它的氨基酸如T所代替；
15)TTESGLNSV(SEQ ID NO:44)，其中G被任何其它的氨基酸如R、S、或A所代替；
16)ESGLNSVVL(SEQ ID NO:45)，其中N被任何其它的氨基酸如R或M所代替；
17)GLNSVVLAN(SEQ ID NO:46)，其中第一个V被任何其它的氨基酸如M、I、A、或K所代替；
18)LNSVVLANN(SEQ ID NO:47)，其中V被任何其它的氨基酸如I所代替；
19)SEAVLLPLN(SEQ ID NO:48)，其中L被任何其它的氨基酸如V或K所代替；
20)EAVLLPLNE(SEQ ID NO:49)，其中L被任何其它的氨基酸如M或F所代替；
21)VLLPLNEPV(SEQ ID NO:50)，其中第三个L被任何其它的氨基酸如I、M、或V所代替；
22)LLPLNEPVH(SEQ ID NO:51)，其中N被任何其它的氨基酸如A所代替；
23)HGTKRRSQI(SEQ ID NO:52)，其中R被任何其它的氨基酸如G所代替；
24)SQIQTYLEY(SEQ ID NO:53)，其中T被任何其它的氨基酸如E所代替；
25)QIQTYLEYH(SEQ ID NO:54)，其中Y被任何其它的氨基酸如F所代替；
26)GVQHIALAS(SEQ ID NO:55)，其中I被任何其它的氨基酸如M、L、或V所代替；
27)GFEFMAPPQ(SEQ ID NO:57)，其中M被任何其它的氨基酸如Q或L所代替；
28)FEFMAPPQA(SEQ ID NO:58)，其中第一个A被任何其它的氨基酸如S、P、D、R、N、Y、K、或H所代替；
29)FMAPPQAKY(SEQ ID NO:59)，其中P被任何其它的氨基酸如A或R所代替；
30)QAKYYEGVR(SEQ ID NO:60)，其中Y被任何其它的氨基酸如K、R、D、Q、或E所代替；
31)GVRRIAGDV(SEQ ID NO:61)，其中I被任何其它的氨基酸如R或L所代替；
32)VLLQIFTKP(SEQ ID NO:62)，其中I被任何其它的氨基酸如V所代替；
33)LLQIFTKPV(SEQ ID NO:63)，其中F被任何其它的氨基酸如L所代替；
34)LQIFTKPVG(SEQ ID NO:64)，其中T被任何其它的氨基酸如S、P、D、R、N、Y、或H所代替；
35)IFTKPVGDR(SEQ ID NO:65)，其中P被任何其它的氨基酸如N所代替；
36)RPTFFLEMI(SEQ ID NO:66)，其中F被任何其它的氨基酸如L所代替；
37)FLEMIQRIG(SEQ ID NO:67)，其中I被任何其它的氨基酸如V或C所代替；
38)GGCGGFGKG(SEQ ID NO:68)，其中第四个G被任何其它的氨基酸如A、S、或T所代替；
39)GGFGKGNFS(SEQ ID NO:69)，其中K被任何其它的氨基酸如L、A、E、或V所代替；
40)GFGKGNFSE(SEQ ID NO:70)，其中G被任何其它的氨基酸如I所代替；
41)FGKGNFSEL(SEQ ID NO:71)，其中N被任何其它的氨基酸如I所代替；
42)KGNFSELFK(SEQ ID NO:72)，其中S被任何其它的氨基酸如N、G、K、或Q所代替；
43)GNFSELFKS(SEQ ID NO:73)，其中E被任何其它的氨基酸如Q所代替；
44)ELFKSIEDY(SEQ ID NO:74)，其中S被任何其它的氨基酸如A所代替；
45)LFKSIEDYE(SEQ ID NO:75)，其中I被任何其它的氨基酸如L或F所代替；
46)HVVGNVPEM(SEQ ID NO:40)，其中N被任何其它的氨基酸、特别是被C所代替，以及氨基酸序列ELGVLVDRD(SEQ ID NO:76)，其中第二个L被任何其它的氨基酸特别是M所代替；
47)LNSVVLANN(SEQ ID NO:47)，其中第二个V被任何其它的氨基酸、特别是被I所代替，以及氨基酸序列ELGVLVDRD(SEQ ID NO:76)，其中第二个L被任何其它的氨基酸、特别是被M所代替；
48)VLLPLNEPV(SEQ ID NO:50)，其中第三个L被任何其它的氨基酸、特别是被M所代替，以及氨基酸序列VLLQIFTKP(SEQ ID NO:62)，其中I被任何其它的氨基酸、特别是被V所代替；
49)GGCGGFGKG(SEQ ID NO:68)，其中第四个G被任何其它的氨基酸、特别是T所代替，以及氨基酸序列ELGVLVDRD(SEQ ID NO:76)，其中第二个L被任何其它的氨基酸、特别是被M所代替；
50)FHEFAEFTAED(SEQ ID NO:76)，其中第一个A、第二个E、以及第二个F被任何其它的氨基酸所代替，特别是其中A被S或W所代替，E被T所代替、和/或F被A或V所代替；
51)HGTKRRSQIQ(SEQ ID NO:77)，其中第R被任何其它的氨基酸、特别是被K所代替，并且第二个R是缺失的；
52)GTKRRSQIQ(SEQ ID NO:78)，其中第二个R是缺失的；
53)FMAPPQAKY(SEQ ID NO:59)，其中第二个P是缺失的；
54)GNFSELFKS(SEQ ID NO:73)，其中E是缺失的；
55)GVRRIAGDV(SEQ ID NO:61)，其中I是缺失的；
56)DQGVLLQIFTKP(SEQ ID NO:79)，其中第一个L和I被任何其它的氨基酸所代替，特别是其中A被M所代替和/或I被L所代替；
57)GKGNFSELFK(SEQ ID NO:80)，其中F和S被任何其它的氨基酸所代替，特别是其中F被G所代替和/或S被A所代替；
58)KGNFSELFKS(SEQ ID NO:56)，其中第一个S和E被任何其它的氨基酸所代替，特别地其中S被N、G、或K所代替和/或E被S或A所代替；
59)GGCGGFGKG(SEQ ID NO:68)，其中K被任何其它的氨基酸如T、S、Q、L、A、I、H、E、G、M、C或V、优选T所代替；
60)GGCGGFGKG(SEQ ID NO:68)，其中第六个G被任何其它的氨基酸如R、E、D、H、M、F、W、N、或C、优选H或C所代替；
61)ESGLN(S,G)(SEQ ID NO:31)，其中第一个G被任何其它的氨基酸、特别是被R、S、或A所代替；以及
62)VLLPLNEPV(SEQ ID NO:50)，其中第二个L被任何其它的氨基酸，如M、F、或V所代替；
在另一个实施方案中，本发明的组合物包括突变体HPPD多肽，该多肽具有与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:27至少80％的序列同一性，其中该多肽具有HPPD酶活性，并且其中该多肽包含选自下组的一个或多个氨基酸置换，该组由以下各项组成：
1)R(K,A,R)SQI(Q,E)T(SEQ ID NO:28)，其中I被任何其它的氨基酸、特别是被V、S、A、P、T、L或G所代替；
2)(P，A,S)G(V，L)QH(I,L,M)(SEQ ID NO:29)，其中Q被任何其它的氨基酸、特别是被N、R、G、A、S、T、E或C并且更特别被A或H所代替；
3)G(I,V)LVD(R,K)D(SEQ ID NO:30)，其中L被任何其它的氨基酸、特别是被M或A所代替；
4)ESGLN(S,G)(SEQ ID NO:31)，其中L被任何其它的氨基酸、特别是被M、H、G、F、C或I并且更特别是被M所代替；
5)F(A,S)EF(T,V)(SEQ ID NO:32)，其中(A,S)被任何氨基酸、特别是被W、G、M、F、Y或H所代替；
6)RFDHVVGNV(SEQ ID NO:38)，其中第一个V被任何其它的氨基酸，如I、A、M、或C所代替；
7)GLNSVVLAN(SEQ ID NO:46)，其中第一个V被任何其它的氨基酸，如M、I、A、或K所代替；
8)VLLPLNEPV(SEQ ID NO:50)，其中第三个L被任何其它的氨基酸，如I、M、或V所代替；
9)GFEFMAPPQ(SEQ ID NO:57)，其中M被任何其它的氨基酸，如Q或L所代替；
10)FEFMAPPQA(SEQ ID NO:58)，其中第一个A被任何其它的氨基酸，如S、P、D、R、N、Y、K、或H所代替；
11)GGCGGFGKG(SEQ ID NO:68)，其中第四个G被任何其它的氨基酸，如A、S、或T所代替；
12)GGCGGFGKG(SEQ ID NO:68)，其中K被任何其它的氨基酸，如T、S、Q、L、A、I、H、E、G、M、C或V、优选T所代替；
13)GGCGGFGKG(SEQ ID NO:68)，其中第六个G被任何其它的氨基酸，如R、E、D、H、M、F、W、N、或C、优选H或C所代替；
14)ESGLN(S,G)(SEQ ID NO:31)，其中第一个G被任何其它的氨基酸、特别是被R、S、或A所代替；以及
15)VLLPLNEPV(SEQ ID NO:50)，其中第二个L被任何其它的氨基酸，如M、F、或V所代替；
根据本发明的示例性突变体HPPD多肽相应于SEQ ID NOS:14-26中所列出的氨基酸序列，及其变体和片段。进一步提供了包括编码本发明的突变体HPPD多肽的多核苷酸序列的核酸分子，例如SEQ ID NOS:1-13。组合物还包括表达盒，该表达盒包括可操作地连接到编码本发明的突变体HPPD多肽的核苷酸序列上的启动子，该表达盒是单独的或与一种或多种另外的编码赋予所希望的性状的多肽的核酸分子进行组合。进一步提供了包括本发明的一种表达盒的转化的植物、植物细胞、以及种子。
在针对向植物赋予除草剂抗性或耐受性、特别是对某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性的方法中，本发明的这些组合物是有用的。在具体实施方案中，这些方法包括向一种植物中引入至少一种表达盒，该表达盒包括可操作地连接到编码本发明的突变体HPPD多肽的核苷酸序列上的启动子。其结果是，该突变体HPPD多肽被表达于该植物中，并且该突变体HPPD对于抑制HPPD的除草剂是较不敏感的，由此导致了对于抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性。
本发明的方法还包括选择性地控制在作物场所的大田中的杂草。在一个实施方案中，此类方法涉及在作物场所的大田中过多的苗前或苗后(over-the-top pre-or postemergence)施用杂草控制量的HPPD除草剂，该作物场所含有表达本发明的突变体HPPD多肽的植物。在其他实施方案中，还提供了用于测定、表征、鉴定、以及选择本发明的突变体HPPD的方法。
附图简要说明
图1显示了来自燕麦属的HPPD多肽(对应于在SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列)的Km和Vmax值。
图2A-2B显示了结构B与该HPPD多肽(对应于SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列)的一种络合物的结合速率(on rate)(图2A)和解离速率(off rate)(图2B)的测定。
图3显示了结构D与该HPPD多肽(对应于SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列)的一种络合物的的解离速率的测定。
图4A-4C显示了结构B与HPPD多肽(对应于SEQ ID NO:14(图4A)、24(图4B)、以及26(图4C)中列出的氨基酸序列)的络合物在冰温下的解离速率的测定。
图5显示了通过表达HPPD的不同变体的大肠杆菌BL21，甲基磺草酮(mesotrione)抑制了黑脓素(pyomelanin)形成。左条=(误差范围对于n=3)平均A 430nm，其中没有甲基磺草酮存在于培养基中，并且右条=(n=3)平均A 430nm，其中12.5ppm甲基磺草酮存在于培养基中。对照物是pET24空载体，其中没有表达HPPD。
图6显示了用于大豆转化的二元载体17146的图示，用编码SEQ ID NO:24的一种大豆密码子优化的燕麦HPPD基因赋予了HPPD抗性。对于草丁膦(glufosinate)选择，这种二元载体还包含双重PAT选择标记。
图7显示了用于大豆转化的二元载体17147的图示，用编码SEQ ID NO:24的一种大豆密码子优化的燕麦HPPD基因赋予了HPPD抗性，并且还赋予了对草甘磷(glyphosate)的耐受性(选择标记)。
图8显示了含有大豆密码子优化的燕麦HPPD基因(编码SEQ ID NO:14)的二元载体15764的图示，该基因由TMVΩ增强子和TATA盒所驱动。
图9显示了用于赋予对于HPPD除草剂和草丁膦的耐受性的大豆转化的二元载体17149的图示，该二元载体含有表达HPPD变体(SEQ ID NO:26)的表达盒连同两个PAT基因盒。
图10A-10D描述了通过除草剂化合物B(图10A-10B)和C(图10C-10D)抑制HPPD的突变体(G408A)的时间依赖性。
发明详细说明
本发明提供了针对向植物赋予羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂抗性和耐受性的组合物和方法。组合物包括对于具有HPPD酶活性的突变体HPPD多肽的氨基酸序列，及其变体和片段。还提供了编码本发明的突变体HPPD多肽的核酸。进一步提供了用于向植物赋予除草剂抗性或耐受性、特别是对某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性的方法。还提供了用于在作物场所的大田中选择性地控制杂草以及用于测定、表征、鉴定和选择提供了除草剂耐受性的本发明的突变体HPPD的方法。
在本发明的上下文中，术语羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-HPPD)以及对羟基苯丙酮酸双加氧酶(p-HPPD)是同义的。
“HPPD除草剂”是漂白剂的除草剂，并且它们的主要作用位点是HPPD。许多是熟知的并且在此别处被描述并且在文献(Hawkes“Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD)-The Herbicide Target.”InModern Crop Protection Compounds.Eds.and Schirmer.Weinheim,Germany:Wiley-VCH,2007.Ch.4.2,pp.211-220；Edmunds“Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(HPPD)Inhibitors:Triketones.”InModern Crop Protection Compounds.Eds.and Schirmer.Weinheim,Germany:Wiley-VCH,2007.Ch.4.2,pp.221-242)中。如在此所使用的，术语“HPPD除草剂”是指直接或间接地抑制HPPD的除草剂，其中这些除草剂是漂白剂，并且其中HPPD的抑制是除草剂的对于植物的作用模式的至少一部分。
如在此所使用的，当与由类似经受的非耐受样植物所展示的进行比较时，实质上(基本上)“耐受”除草剂的植物当用所述除草剂进行处理时展示出一个移到右边(right)的剂量/反应曲线。此类剂量/反应曲线具有标绘在x轴上的“剂量”以及标绘在y轴上的“杀死或破坏百分比”、“除草效果”等。为了产生一种给定的除草效果，耐受性植物典型地需要非耐受样植物的差不多至少两倍的除草剂。当经受典型地被农业社会采用的为了杀死大田中的杂草的浓度和速率的除草剂时，基本上“抵抗”除草剂的植物展示出很少的(如果有的话)坏死、溶解、萎黄病或其他损伤或至少没有一个在产量上有显著影响。
如在此所使用的，“非转基因样植物”是与转基因植物类似或相同的但是不包含一种赋予除草剂抗性的转基因的植物。
如在此所使用的，术语“赋予”是指向植物提供特征或性状，如除草剂耐受性或抗性和/或其他所希望的性状。
如在此别处所使用的，术语“异源的”是指来自另一个来源。在DNA的背景下，“异源的”是指任何外来的“非自身”DNA，包括来自相同种类的另一个植物的DNA。例如，在本申请中，转基因地表达回到大豆植物中的大豆HPPD基因将仍被描述为“异源的”DNA。
在此使用的冠词“一种”和“一个”是指一个(一种)或多于一个(一种)(即，至少一个)的该冠词的合乎语法的对象。作为举例，“一种要素”表示一种或多种要素(元件)。贯穿本说明书，单词“包括”或其变体例如“包括了”或“包括”应被理解为是指包括一种所述要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤，但是不排除任何其他要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤。
在此定义了或另外表征了许多种额外的术语。
HPPD序列
本发明的这些组合物包括分离的或实质上纯化的突变体HPPD多核苷酸和多肽连同包括突变体HPPD多核苷酸的宿主细胞。具体地，本发明提供了突变体HPPD多肽，这些突变体HPPD多肽具有HPPD酶活性并且在植物中赋予对于某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性和耐受性，以及它们变体和片段。还提供了编码本发明的突变体HPPD多肽的核酸。
本发明的突变体HPPD多肽相对于它们从其衍生的初始野生型序列在一个或多个位置处具有氨基酸变化，并且展示出对于一种或多种HPPD抑制剂除草剂的增强的耐受性。相对于同样的未突变的初始酶，展示出对于一种HPPD除草剂的增强的耐受性的HPPD酶可以如此实行，因为这些HPPD酶展示出：
a)对于自然底物(4-羟基苯丙酮酸)较低的Km值；
b)对于将4-羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸盐的较高的kcat值；
c)较低的速率常数值kon，它管理形成一种酶:HPPD抑制剂除草剂复合体；
(d)增加的速率常数值koff，它管理解离一种酶:HPPD抑制剂除草剂复合体；和/或
e)由于c)和d)中的一个或两者的变化，增加的平衡常数值Ki(也称为Kd)，它管理解离一种酶:HPPD抑制剂除草剂复合体。编码此类改进的突变的HPPD的DNA序列用于提供本发明的HPPD植物、作物、植物细胞以及种子，它们相比于同样表达未突变的初始酶的同样的植物提供了对于一种或多种HPPD除草剂的增强的耐受性或抗性。
在koff值方面的增加是在改进HPPD的赋予对于一种HPPD除草剂的耐受性的能力方面的特定值。作为一个实例，化合物B和C相对于SEQ ID NO:14的HPPD变体展示出相似的Kd值，但是不同之处在于化合物B的koff值相比于化合物C的koff值约大10倍，并且表达了SEQ ID NO:14的植物对化合物B显示出比对化合物C更优越的抗性。
选择了编码植物衍生的HPPD的基因的定点突变从而编码选自以下列表的氨基酸变化(单独地或组合地)。编码此类突变形式的植物HPPD的基因对于制造抵抗抑制HPPD的除草剂的作物植物是有用的。如此修饰的植物HPPD基因特别适合用在转基因植物中，以便向作物植物赋予除草剂耐受性或抗性。
许多HPPD序列在本领域中是已知的并且通过进行在此所述的相应的氨基酸置换、缺失和添加可以用来产生突变体HPPD序列。在SEQ ID NO:27中列出了燕麦(Avena sativa)的HPPD氨基酸序列。在SEQ ID NO:14中列出了燕麦HPPD的单一缺失变体。因此，一种已知的或怀疑的HPPD序列可以使用标准的序列比对工具与例如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:27进行比对，并且在此所述的相对于SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:27的相应的氨基酸置换、缺失、和/或添加可以在参比序列中进行。
在一个实施方案中，本发明的这些组合物包括一种突变体HPPD多肽，该突变体HPPD多肽具有与SEQ ID NO:27(燕麦的HPPD氨基酸序列)至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性或其中该HPPD氨基酸序列来自植物，其中该多肽具有HPPD酶活性，并且其中该多肽包含相应于在表1的第1栏中列出的氨基酸位置的一个或多个氨基酸序列添加、置换、或缺失，任选地进一步与已知的突变进行组合(参见例如WO2009/144079)。在不同的实施方案中，在表1的第1栏中列出的一个或多个位置处的氨基酸被任何其它的氨基酸所代替。在另一个实施方案中，该多肽包括一个或多个氨基酸置换、添加、或缺失，相应于表1的第2栏中列出的氨基酸置换或添加。在又一个实施方案中，该多肽包括一个或多个置换，相应于在表1的第2栏中列出的氨基酸的保守性变体。例如，该多肽可以包括相应于SEQ ID NO:14的氨基酸位置217(SEQ ID NO:27的氨基酸位置218)的一种突变，其中该氨基酸被丙氨酸或丙氨酸的保守置换所代替；或该多肽可以包括相应于SEQ ID NO:14的氨基酸位置241(SEQ ID NO:27的氨基酸位置242)的突变，其中该氨基酸被色氨酸或一种色氨酸的保守置换所代替；或该多肽可以包括相应于SEQ ID NO:14的氨基酸位置408(SEQ ID NO:27的氨基酸位置409)的突变，其中该氨基酸被丙氨酸或丙氨酸的保守置换所代替。在具体的实施方案中，本发明的突变体HPPD多肽的氨基酸序列是选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、以及26。
表1.示例性的HPPD突变
*除非另外指明，在这栏中列出的这些氨基酸表示在指示位置处的可能的置换。在另一个实施方案中，本发明的这些组合物包括突变体HPPD多肽，该突变体HPPD多肽具有与SEQ ID NO:27(燕麦的HPPD氨基酸序列)至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性或其中该HPPD氨基酸序列来自一种植物，其中该多肽具有HPPD酶活性，并且其中该多肽包含相应于在表2的第1栏中列出的氨基酸位置的一个或多个氨基酸序列置换，任选地进一步与已知的突变进行组合(参见例如WO2009/144079)。在不同的实施方案中，在表2的第1栏中列出的一个或多个位置处的氨基酸被任何其它的氨基酸所代替。在另一个实施方案中，该多肽包括一个或多个氨基酸置换，相应于在表2的第2栏中列出的氨基酸置换。在又另一个实施方案中，该多肽包括一个或多个置换，相应于在表2的第2栏中列出的氨基酸的保守性变体。例如，该多肽可以包括相应于SEQ ID NO:14的氨基酸位置217(SEQ IDNO:27的氨基酸位置218)的一种突变，其中该氨基酸被丙氨酸或丙氨酸的保守置换所代替；或该多肽可以包括相应于SEQ ID NO:14的氨基酸位置241(SEQ ID NO:27的氨基酸位置242)的一种突变，其中该氨基酸被色氨酸或色氨酸的保守置换所代替；或该多肽可以包括相应于SEQ ID NO:14的氨基酸位置408(SEQ ID NO:27的氨基酸位置409)的一种突变，其中该氨基酸被丙氨酸或丙氨酸的保守置换所代替。在具体的实施方案中，本发明的突变体HPPD多肽的氨基酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、以及26。
表2.示例性的HPPD突变
术语“多肽”、“肽”、以及“蛋白”在此可互换地使用，指的是氨基酸残基的聚合物。这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然发生的氨基酸以及天然发生的氨基酸聚合物的一种人工化学类似物。本发明的多肽可以从一种在此披露的核酸或通过使用标准分子生物学技术来产生。例如，本发明的一种截短的蛋白可以通过在一种适当的宿主细胞中表达本发明的一种重组核酸或可替代地通过组合体外步骤(如蛋白酶消化和纯化)来产生。
因此，本发明还提供了包括编码突变体HPPD多肽的多核苷酸序列的核酸分子，这些突变体HPPD多肽具有HPPD酶活性并且在植物中赋予对于某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性和耐受性，以及它们的变体和片段。总体上，本发明包括编码在此所述的任何突变体HPPD多肽的任何多核苷酸序列，连同编码相对于在此所述的突变体HHPD多肽具有一个或多个保守性氨基酸置换的HPPD多肽的任何多核苷酸序列。提供功能上相似的氨基酸的保守性置换表在本领域中是所熟知的。以下五组各自包含彼此保守性置换的氨基酸：脂肪族的：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳香族的：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性的：精氨酸I、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码一种具有与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:27至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列或其中该HPPD氨基酸序列来自一种植物，其中该多肽具有HPPD酶活性，并且其中该多肽包含如在此所述的一个或多个氨基酸序列添加、置换、或缺失。在具体的实施方案中，该多核苷酸序列编码一种具有选自下组的氨基酸序列的突变体HPPD多肽：SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、以及26。在另一个实施方案中，本发明提供了选自下组的一种多核苷酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、以及13。
如在此所使用的，“核酸”包括引用一种处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非被另外限制，包括了已知的具有天然核苷酸的重要性质的类似物(例如肽核酸)，因为它们以一种类似于天然发生的核苷酸的方式杂交到单链核酸上。
如在此所述的，术语“编码”或“编码的”当用在一种指定的核酸的背景下时是指该核酸包括必需的信息从而将该核苷酸序列直接翻译成一种特定的蛋白质。用来编码一种蛋白质的信息通过密码子的使用而详细说明。一种编码蛋白质的核酸在该核酸的翻译区域之内可以包括非翻译序列(例如内含子)或可以缺乏此类插入的非翻译序列(例如在cDNA中)。
本发明包括分离的或实质上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。一种“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质、或它的生物学活性部分是实质上或基本上不含通常与该多核苷酸或蛋白质相伴随的或相互作用的组分(如在它的天然发生环境中所发现的)。因此，一种分离或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术产生时是基本上不含其他细胞物质或培养基的，或当用化学方法合成时是实质上不含化学前体或其他化学品的。最佳地，一种“分离的”多核苷酸不含天然地在多核苷酸从其衍生的生物的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼(即位于多核苷酸的5′和3′端)的序列(最佳地蛋白质编码序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的多核苷酸可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的天然地在多核苷酸从其衍生的细胞的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼的核苷酸序列。实质上不含干涉酶活性的并且能够关于其催化、动力学的和分子特性进行表征的一种蛋白质包括：具有小于大约98％、95％、90％、80％、70％、60％或50％(按干重计)的污染蛋白的相当粗制的蛋白制品(例如重组地产生在细胞提取物中)以及通过本领域中已知的方法进一步进行纯化以具有40％、30％、20％、10％、5％、或1％(按干重计)的污染蛋白的制品。
本发明的这些蛋白质能够以不同的方式进行改变，包括氨基酸置换、缺失、平截、以及插入。用于这样的操作的方法在本领域中是通常是已知的。例如，突变体HPPD蛋白的氨基酸序列变体和片段可以通过在DNA中的突变来制备。用于诱变和多核苷酸修改的方法在本领域中是熟知的。参见，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan出版公司，纽约)以及其中引用的参考文献。关于通常不影响感兴趣的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸置换的指导可以发现于Dayhoff et al.(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,华盛顿)的模型中，将其通过引用结合在此。保守置换(如将一个氨基酸用具有相似特性的另一个氨基酸进行代换)可能是最佳的。
本发明的这些多核苷酸还可以用来从其他生物特别是其他植物中分离出相应的序列。以这种方式，如PCR、杂交等方法可以用来鉴定此类序列(基于它们与在此列出的序列的序列同源性)。
在一种PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于在PCR反应中从感兴趣的任何植物提取出的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中通常是已知的。参见例如Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview，New York)。还参见Innis et al.,eds.(1990)PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,New York)；Innis and Gelfand,eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York)；以及Innis and Gelfand,eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,NewYork)。
在杂交技术中，一种已知的多核苷酸的全部或部分被用作一种探针，该探针选择性地杂交到存在于来自一种选择的生物的一组克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)中的其他相应的多核苷酸上。这些杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以被标记有一种可检出的基团如32P或任何其他可检出的标记。用于制备用于杂交作用的探针以及用于构建cDNA和基因组文库的方法在本领域中通常是已知的并且披露于Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview，New York)。
对于“杂交到”或“特异性杂交到”是指一种分子在严谨条件下仅可与特定的核苷酸序列结合、双链化(duplexing)或杂交，这是在该序列存在于一种复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时进行的。“实质上结合”是指在探针核酸与靶标核酸之间的互补性杂交，并且包含了少量错配，这些错配可以通过降低该杂交介质的严谨性来调节，从而实现所希望的目标核酸序列的检测。
在核酸杂交实验的背景下(例如，Southern及Northern杂交)的“严谨杂交条件”和“严谨杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异地杂交。对核酸杂交的一种广泛指导发现于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays″Elsevier,New York。通常，对于在限定的离子强度和pH下的特异序列，高严谨杂交和洗涤条件被选择为比热融点(Tm)大约低5°C。典型地，在“严谨条件”下，一种探针将会与它的目标亚序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
Tm是50％的目标序列与一种完全匹配的探针进行杂交所处的温度(在限定的离子强度及pH下)。极度严谨条件被选择为等于对于一种特定探针的Tm。对于互补核酸(它们在Southern或Northern印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严谨杂交条件的一个实例是在42°C下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将杂交进行过夜。高严谨性洗涤条件的一个实例是0.15MNaCl，在72°C下持续约15分钟。严谨洗涤条件的一个实例是在65°C下，0.2xSSC洗涤持续15分钟(参见Sambrook，以下，对于SSC缓冲剂的说明)。通常，一种高严谨洗涤之前会先进行一种低严谨洗涤，以便去除背景探针信号。对于一个例如多于100个核苷酸的双链体的实例性中等严谨性洗涤是1X SSC，在45°C持续15分钟。对于一种例如超过100个核苷酸的双链体(duplex)的低严谨洗涤的一个实例是在40°C下的4-6X SSC持续15分钟。对于短探针(例如，大约10至50个核苷酸)，严谨条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下，大约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且该温度典型地是至少约30°C。通过加入去稳定剂例如甲酰胺也可以实现严谨条件。通常，在特定的杂交测定中对于不相关探针观察到高2倍(或更高)的信噪比，表明检测到特异杂交。如果它们所编码的蛋白是基本上完全相同的，这些在严谨条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上完全相同的。例如，当使用该遗传密码允许的最大程度的密码简并而生成一个核酸的拷贝时，则发生这种情况。
以下是可以用来克隆核苷酸序列(这些序列与本发明的参比核苷酸序列是同源的)的杂交/洗涤条件的设置的例子：一种参比核苷酸序列优选地与在以下条件下的参比核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中在50°C下，并且在2X SSC、0.1％SDS中在50°C下洗涤；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50°C下，并且在1X SSC、0.1％SDS中在50°C下洗涤；仍然更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50°C下，并且在0.5X SSC、0.1％SDS中在50°C下洗涤；优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50°C下，并且在0.1x SSC、0.1％SDS中在50°C下洗涤；更优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中在50°C下，并且在0.1x SSC、0.1％SDS中在65°C下洗涤。
所披露的核苷酸序列的片段和变体以及由此所编码的蛋白质也被涵盖在本发明中。“片段”意指一部分的核苷酸序列或一部分的氨基酸序列以及因此由此编码的蛋白。一种核苷酸序列的片段可以编码保留了突变体HPPD蛋白的生物活性并且因此具有HPPD酶活性的蛋白片段。可替代地，作为杂交探针或在诱变以及改组反应(为了产生仍进一步的HPPD变体)中有用的一种核苷酸序列的片段通常并不编码保留了生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可以范围从编码本发明的多肽的至少大约20个核苷酸、大约50个核苷酸、大约100个核苷酸、以及高达全长核苷酸序列。
编码本发明的突变体HPPD蛋白的生物活性部分的核苷酸序列的片段将编码至少15、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、180、200、250、300、或350个连续的氨基酸，或高达存在于本发明的全长突变体HPPD多肽中的总数目的氨基酸。作为杂交探针或PCR引物有用的核苷酸序列的片段通常不需要编码HPPD蛋白的生物活性部分。
如在此所使用的，在引用一种特定的多核苷酸时，“全长序列”是指具有一种天然或突变的HPPD序列的整个核酸序列。“天然序列”意指一种内源序列，即在生物体基因组中发现的一种非工程化的序列。
因此，本发明的核苷酸序列的片段可以编码突变体HPPD的生物活性部分，或它可以是片段，该片段可以用作杂交探针等或PCR引物(使用以下披露的方法)。突变体HPPD多肽的生物活性部分可以通过分离本发明的这些核苷酸序列之一的部分、表达所编码的突变体HPPD蛋白的部分(例如，通过体外重组表达)、并且评价所编码的突变体HPPD蛋白的部分的活性来制备。是本发明的一种核苷酸序列的片段的核酸分子包括至少15、20、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、或1300个连续的核苷酸，或高达存在于在此披露的全长核苷酸序列中的数目的核苷酸。
“变体”意指实质上类似的序列。对于多核苷酸，一种变体包括在参比多核苷酸之内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在突变体HPPD多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如在此所使用的，“参比”多核苷酸或多肽对应地包括突变体HPPD核苷酸序列或氨基酸序列。如在此所使用的，“天然”多核苷酸或多肽对应地包括天然发生的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域的普通技术人员将认识到本发明的这些核酸的变体将被如此构建从而使得开放阅读框得以维持。对于多核苷酸，保守性变体包括编码本发明的这些突变体HPPD多肽之一的氨基酸序列的那些序列(由于遗传密码的简并性)。如这些天然发生的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术、例如使用以下概述的聚合酶链式反应(PCR)以及杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，像例如通过使用定点诱变产生的但是仍然编码本发明的一种突变体HPPD蛋白的那些。通常，本发明的一种特定的多核苷酸的变体将具有与该特定的多核苷酸至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过在此别处所述的序列比对程序和参数所确定的。
本发明的特定多核苷酸(即参比多核苷酸)的变体还可以通过比较由一个变体多核苷酸编码的多肽与由该参比多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来评价。因此，例如，在此披露了编码一种与SEQ ID NOS:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26的多肽具有一个给定的百分比序列同一性的多肽的多核苷酸。在任何两个多肽之间的百分比序列同一性可以使用在此别处描述的序列比对程序和参数来计算。其中本发明的任何给定的多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽共有的百分比序列同一性来评价的，即当与在此所述的全长HPPD序列相比时，在两个被编码的多肽之间的百分比序列同一性是跨过在此所述的HPPD序列的全部的至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
“变体”蛋白意指从一种参比蛋白通过在该突变体HPPD蛋白中的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失或添加和/或在该突变体HPPD蛋白中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的置换而衍生的一种蛋白质。由本发明涵盖的变体蛋白是生物学活性的，即它们继续具有突变体HPPD蛋白的所希望的生物活性，即，如在此所述的HPPD酶活性和/或除草剂耐受性。此类变体可以产生于例如遗传多态性或产生于人的操作。本发明的一种突变体HPPD蛋白的生物活性变体将具有与该突变体HPPD蛋白跨过该突变体HPPD蛋白的氨基酸序列的全部的至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过在此别处所述的序列比对程序和参数所确定的。本发明的一种蛋白质的一种生物活性变体可能不同于以少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(如6-10个)、少至5个(如4、3、2个、或甚至1个)氨基酸残基的蛋白质。
用于比较的序列比对方法在本领域中是所熟知的并且可以使用数学算法来完成，这些数学算法如Myers and Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比对算法；Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比对算法；以及Karlin andAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如在Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中的修改。对于序列比较可以利用这些数学算法的电脑实现方式以确定序列同一性。此类实现方式包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(从Intelligenetics,Mountain View,California可获得)；ALIGN程序(版本2.0)以及GCG Wisconsin GeneticsSoftware Package版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA(从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,California,USA可获得)。
基因叠加
在某些实施方案中，编码突变体HPPD多肽或它们的保留了HPPD酶活性的变体的这些多核苷酸(例如编码了选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、以及26)可以与任何感兴趣的多核苷酸序列的组合进行叠加从而产生具有一种所希望的性状的植物。如在此所使用的一种性状是指从特定的序列或序列组得到的表型。例如，编码突变体HPPD多肽或它们的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸可以与任何其它的编码赋予一种所希望的性状的多肽的多核苷酸进行叠加，这些性状包括但不局限于：对于疾病、昆虫、以及除草剂的抗性，对于热和干旱的耐受性，缩短的作物成熟时间，改进的工业加工(例如，用于将淀粉或生物质转化为可发酵的糖类)、以及改进的农艺学品质(例如，高油含量和高蛋白含量)。
可以与本发明的编码突变体HPPD多肽或它们的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸进行叠加的示例性多核苷酸包括编码了赋予对于害虫/病原体如病毒、线虫、昆虫或真菌等等的抗性的多肽的多核苷酸。可以与本发明的多核苷酸进行叠加的示例性多核苷酸包括编码以下多肽的多核苷酸，这些多肽是：具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽，如其他苏芸金芽胞杆菌毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiser et al.(1986)Gene 48:109中)、凝集素(Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24:825)、五邻体(pentin)(描述于美国专利号5,981,722)，等等；用于疾病或除草剂耐受性所希望的性状(例如伏马菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)的多核苷酸；无毒力以及疾病抗性基因(Jones et al.(1994)Science 266:789；Martin et al.(1993)Science 262:1432；Mindrinos et al.(1994)Cell 78:1089)；导致除草剂耐受性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；草甘磷抗性(例如5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因，描述于美国专利号4,940,935和5,188,642中；或草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)基因，描述于Castle et al.(2004)Science,304:1151-1154；并且于美国专利申请公开号20070004912、20050246798、以及20050060767))；草丁膦抗性(例如草丁膦乙酰基转移酶基因PAT和BAR，描述于美国专利号5,561,236和5,276,268中)；对于除草剂的抗性，这些除草剂包括：磺酰脲、DHT(2,4D)、以及PPO除草剂(例如草甘磷乙酰基转移酶，芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxy alkanoate dioxygenase)、乙酰乳酸合成酶、以及原卟啉原氧化酶)；一种细胞色素P450或它的赋予对于尤其HPPD除草剂的除草剂抗性或耐受性的变体(美国专利申请序列号12/156,247；美国专利号6,380,465；6,121,512；5,349,127；6,649,814；以及6,300,544；以及PCT专利申请公开号WO2007000077)；以及对于以下的加工或过程产物所希望的性状：如高油(例如美国专利号6,232,529)；改性的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、以及淀粉脱支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合成酶、以及乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170:5837-5847)，有助于聚羟基烷酸酯(PHA)的表达)；将它们所披露的内容通过引用结合在此。
因此，在一个实施方案中，将编码一种突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸与一个或多个编码赋予对于一种除草剂的抗性或耐受性的多肽的多核苷酸进行叠加。在一个实施方案中，所希望的性状是对于一种HPPD抑制剂的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，所希望的性状是对于草甘磷的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，所希望的性状是对于草丁膦的抗性或耐受性。
这些叠加的组合可以通过任何方法来产生，这些方法包括但不局限于：通过常规的或顶交方法的杂交育种植物、或遗传转化。如果这些序列是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，所感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包括一个或多个所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。这些性状可以在一个共转化方案中与由转化盒的任何组合提供的感兴趣的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入两个序列，这两个序列可以包含在分开的转化盒(反式)中或包含在相同的转化盒(顺式)中。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。在某些情况下，可能希望的是引入一个抑制所感兴趣的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其它的抑制盒或过量表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所希望的性状组合。进一步认识到的是，多核苷酸序列可以在一个所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。参见例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855、以及WO99/25853，将所有文献都通过引用结合在此。
植物表达盒
本发明的组合物可以额外地包含用于在感兴趣的植物中转化和表达的核酸序列。这些核酸序列可能存在于DNA构建体或表达盒中。如此处使用的“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指引一种特定核苷酸序列的表达的一种核酸分子，包含可操作连接到感兴趣的核苷酸序列(即，一种单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合而编码一种突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸)的启动子，该感兴趣的核苷酸序列可操作地连接到终止信号。它还典型地包含正确翻译该核苷酸序列所需要的序列。该编码区通常对一种感兴趣的蛋白质进行编码，但是还可以对一种感兴趣的功能性RNA进行编码，例如在正义或反义方向上的反义RNA或一种非翻译RNA。包含该感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但已经是以在对异源表达有用的重组体形式而获得的。然而，典型地，该表达盒对于宿主是异源的，即，该表达盒的特定DNA序列并不天然发生于该宿主细胞中，并且必须已通过转化事件而被引入该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特殊的外界刺激时才引发转录。另外，该启动子对于一种特定的组织或器官或发育阶段也可以是特异性的。
本发明涵盖了用能够表达一种感兴趣的多核苷酸(即一种单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合而编码一种突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸)的表达盒来转化植物。该表达盒在5′-3′的转录方向上包括转录和翻译的起始区(即，启动子)和多核苷酸开放阅读框。该表达盒可以任选地包括在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。在一些实施方案中，该表达盒包括一种选择标记基因从而允许选择稳定的转化体。本发明的表达构建体还可以包括前导序列和/或允许感兴趣的多核苷酸的诱导型表达的序列。对于允许诱导型表达的序列的实例参见Guo et al.(2003)Plant J.34:383-92和Chen et al.(2003)Plant J.36:731-40。
该表达构建体的调节序列可操作地连接到感兴趣的多核苷酸。对于“可操作地连接”意指在启动子与第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列引发和介导了对应于该第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作地连接表示被连接的核苷酸序列是邻近的。
在本发明的实践中可以使用任何能够在感兴趣的植物中驱动表达的启动子。该启动子可以是天然的或模拟的或外来的或与该宿主植物是异源的。当在此用来提及核酸序列(例如，DNA或RNA序列)或基因时，术语“异源的”和“外源的”是指源自对于特定的宿主细胞是外来的来源的、或者如果源自相同的来源则是自其原始形式进行修饰的一种序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于该特定宿主细胞是内源性的但是已经通过例如使用DNA改组而修饰的一种基因。这些术语还包括一种天然发生的DNA序列的非天然发生的多份拷贝。因此，这些术语是指一种DNA节段，它对于该细胞是外来的或异源的或与该细胞是同源的但是处于在其中通常找不到该元件的该宿主细胞核酸之内的位置。表达了外源DNA节段以产生外源性多肽。
“同源的”核酸(例如DNA)序列是与它被引入其中的宿主细胞天然相关联的一种核酸(例如DNA或RNA)序列。
有待包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：效率、可选择性、诱导性、所希望的表达水平、以及细胞优先表达或组织优先表达。对于本领域的技术人员而言，通过相对于序列来适当地选择并且定位启动子以及其它的调节区而调整该序列的表达是一种惯例。用于表达一个或多个转基因的启动子可以是强的植物启动子、一种病毒启动子、或一种嵌合启动子，组成这些启动子的元件如：来自任何基因的(或合成的，基于植物基因TATA盒的分析)TATA盒，其任选地融合到对于植物启动子的TATA盒的5’上(这指向组织以及暂时适当的基因表达)，任选地融合到1个或多个增强子上(如35S增强子、FMV增强子、CMP增强子、RUBISCO SMALL SUBUNIT增强子、PLASTOCYANIN增强子)。
示例性的组成型启动子包括例如：Rsyn7启动子的核心启动子以及其它的披露于WO 99/43838和美国专利号6,072,050中的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)，等等。其他组成型启动子包括例如：美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；以及6,177,611。
适当的植物和嵌合启动子对于如在某些组织中的转基因的表达的应用是有用的，同时将其他组织如种子或生殖组织中的表达最小化。示例性的细胞类型启动子或组织优先启动子优选在靶组织中驱动表达、但也可以在其他细胞类型或组织中导致某种表达。用于在植物基因组DNA中鉴定并表征启动子区的方法包括例如在以下参考文献中所说明的那些：Jordano,et al.,PlantCell,1:855-866(1989)；Bustos,et al.,Plant Cell,1:839-854(1989)；Green,et al.,EMBO J.7,4035-4044(1988)；Meier,et al.,Plant Cell,3,309-316(1991)；以及Zhang,et al.,Plant Physiology 110:1069-1079(1996)。
在本发明的其他实施方案中，诱导型启动子可能是所希望的。诱导型启动子驱动响应于外部刺激(如化学试剂或环境刺激)的转录。例如，诱导型启动子可以响应于激素(如赤霉酸或乙烯)、或响应于光或干旱而赋予转录。
许多种用于表达盒中的转录终止子是可获得的。这些转录终止子负责超过该转基因的转录终止以及正确的mRNA多聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以是与感兴趣的可操作地连接的DNA序列天然在一起的、可以是与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该宿主植物、或它们的任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用基因的天然转录终止子。
一般地，该表达盒将包括一种选择标记基因用于选择转化的细胞。利用选择标记基因来选择转化的细胞或组织。
已经发现众多序列增强了来自转录单位之内的基因表达并且这些序列可以与本发明的基因结合使用以增加它们在转基因植物中的表达。
已经显示不同的内含子序列增强了特别是在单子叶植物的细胞中的表达。例如，已经发现玉米Adhl基因的内含子当引入玉米细胞中时显著增强了在其同源启动子下野生型基因的表达。已经发现内含子1是特别有效的并且增强了在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis et al.,Genes Develop.1:1183-1200(1987))。在同一个实验体系中，来自玉米青铜色1基因(maize bronze 1gene)的内含子在增强表达方面具有相似的效果。常规地已经将内含子序列结合到植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列中。
也已知许多源自病毒的未翻译的前导序列增强了表达，并且这些在双子叶植物的细胞中是特别有效的。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)、以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面是有效的(例如，Gallie et al.Nucl.AcidsRes.15:8693-8711(1987)；Skuzeski et al.Plant Molec.Biol.15:65-79(1990))。本领域中已知的其他前导序列包括但不限于：细小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein,O.,Fuerst,T.R.,and Moss,B.PNAS USA 86:6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒属前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison et al.,1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；病毒学154:9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak,D.G.,and Samow,P.,Nature 353:90-94(1991))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4)(Jobling,S.A.,and Gehrke,L.,Nature 325:622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie,D.R.et al.,Molecular Biology of RNA,pages 237-256(1989))；以及玉米萎黄病斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel,S.A.et al.,Virology81:382-385(1991)。还参见Della-Cioppa et al.,Plant Physiology 84:965-968(1987)。
本发明还涉及包括一个或多个以上所述的表达盒的核酸构建体。该构建体可以是一种载体，如一种植物转化载体。在一个实施方案中，该载体是一种包括多核苷酸的植物转化载体，该多核苷酸包括在SEQ ID NO:34、35、36、或37中列出的序列。
植物
如在此使用的，术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物簇(plant clumps)、以及在植物或以下植物的部分中完整的植物细胞，这些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药，等等。
在本发明中有用的植物包括对于至少一种多核苷酸是转基因的植物，该多核苷酸单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子进行组合而编码一种突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体所选择的植物的类型取决于多种因素，包括例如：收获的植物原料的下游使用、植物物种对转化的适应性、以及植物将要生长、收割、和/或加工的所处条件。普通技术人员将进一步认识到用于选择用于本发明适当的植物种类的另外的因素包括：高产量潜力、良好的茎强度、对特殊病的抵抗力、耐旱性、快速干燥以及足以允许储存和输送至市场而具有最小损失的谷物质量。
根据本发明的植物包括出于生产人类或动物所寻求的、用作口服消费的、或者是在一个工业、药学、或商业过程中加以利用的植物材料的目的而种植的任何植物。本发明可以应用于多种植物的任何品种，包括但不仅限于：玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、高粱、一般的豆类、油菜(rape)/低芥酸菜籽、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、粟、黑麦、甘蔗、糖甜菜、可可、茶树、芸苔属、棉花、咖啡、甘薯、亚麻、花生、以及三叶草；蔬菜(例如，莴苣、番茄、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、滨豆、甘蓝、花椰菜、西兰花、孢子甘蓝、胡椒(pepper)、以及菠萝)；果树(例如，柑橘属的树、苹果树、梨树、桃树、杏树、胡桃树、鳄梨树、香蕉树、以及椰子树)；以及花卉(例如，兰花、康乃馨、以及玫瑰)(tree fruits such as citrus,apples,pears,peaches,apricots,walnuts,avocado,banana,and coconut；and flowerssuch as orchids,carnations and roses)。在本发明的实践中有用的其他植物包括多年生的禾本科植物，如柳枝稷、草原草(prairie grasses)、印度草(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)等等。认识到可以使用多种植物的混合物。
此外，术语“作物”应当理解为还包括由于常规育种方法或遗传工程方法而赋予了对多种除草剂或多种除草剂类别(例如像ALS抑制剂，如氟嘧磺隆、氟丙磺隆和三氟啶磺隆(primisulfuron,prosulfuron and trifloxysulfuron)、EPSPS(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合成酶)抑制剂、GS(谷氨酰胺合成酶)抑制剂)的耐受性的作物。由于常规育种方法或遗传工程方法而被赋予了对多种除草剂或多种除草剂类别的耐受性的作物的实例包括草甘膦和草丁膦耐受性作物变体，它在和商标名下是可商购的。根据本发明的方法对于保护大豆作物是特别适合的，这些大豆植物被赋予了对草甘磷和/或草丁膦的耐受性，并且其中HPPD除草剂与其他此类除草剂(草丁膦和/或草甘磷)一起被用在除草程序中用于除草。
进一步考虑到本发明的构建体可以被引入具有改进的对于具体的下游使用是适合的或最佳的特性的植物种类中。例如，在植物中天然发生的遗传变异性导致了植物具有对于HPPD抑制剂或其他除草剂的抗性或耐受性，并且此类植物在本发明的方法中同样是有用的。根据本发明的方法可以通过将提供了一个水平的耐受性的转基因与大豆栽培品种进行杂交来进一步优化，其中大豆栽培品种展示了增强水平的发现于小百分比的大豆系中的对于HPPD抑制剂的耐受性。
植物转化
一旦已经将一种抗或耐受除草剂突变体HPPD多核苷酸单独地或与编码赋予所希望的性状的多肽的一种或多种额外的核酸分子结合而克隆到一个表达系统中，它就是被转化到了一种植物细胞中。本发明的受体和目标表达盒可以以多种技术公认的方式被引入到植物细胞中。在多核苷酸的背景下，术语“引入”(例如，感兴趣的核苷酸构建体)旨在表示以这样一种方式将该多核苷酸提供给该植物，使得该多核苷酸获得对一种植物细胞的内部的接近。其中有待引入一个以上的多核苷酸，这些多核苷酸可以作为单个核苷酸构建体的部分而进行组装，或者作为分开的核苷酸构建体，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，或作为育种方案的一部分，例如在植物中的在一个单一的转化事件中、在分开的转化事件中可以将这些多核苷酸引入到感兴趣的宿主细胞中。本发明的这些方法并不取决于一种用于引入一个或多个多核苷酸到植物中的具体方法，仅仅是获得这个或这些多核苷酸对于植物的至少一个细胞的内部的接近。在本领域中已知的用于将多个多核苷酸引入到植物中的方法包括但不限于瞬时转化方法、稳定转化方法、已经病毒介导的方法。
在一个多核苷酸的背景下的“瞬时转化”旨在表示多核苷酸被引入到植物中，并且并没有整合到该植物的基因组中。
在被引入到植物中的多核苷酸的背景下，对于“稳定地引入”或“被稳定地引入”旨在表示该引入的多核苷酸被稳定地结合到植物基因组中，并且因此该植物被该多核苷酸稳定地转化。
“稳定转化”或“被稳定地转化”旨在表示一种多核苷酸，例如一种这里描述的被引入到植物中的核苷酸构建体整合到该植物的基因组中并且能够被它的后代更具体地多个连续世代的后代继承。
对于那些在植物转化领域的普通技术人员而言，用于植物转化的可获得的众多转化载体是已知的，并且与本发明有关的基因可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标种类。对于某些目标种类，可以优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括赋予对卡那霉素以及相关抗生素的抗性的nptll基因(Messing & Vierra Gene 19:259-268(1982)；Bevan et al.,Nature 304:184-187(1983))、赋予对除草剂草丁膦(还被称作草胺膦；参见White et al.,Nucl.AcidsRes 18:1062(1990),Spencer et al.Theor.Appl.Genet 79:625-631(1990)以及美国专利号5,561,236以及5,276,268)的抗性的pat和bar基因、赋予对抗生素潮霉素的抗性的hph基因(Blochinger & Diggelmann,Mol.Cell Biol.4:2929-2931)、以及赋予对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(Bourouis et al.,EMBO J.2(7):1099-1104(1983))、赋予对草甘膦的抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)、也赋予对草甘膦的抗性的草甘膦N-乙酰基转移酶(GAT)基因(Castle et al.(2004)Science,304:1151-1154；美国专利申请公开号20070004912,20050246798和20050060767)、以及提供代谢甘露糖的能力的6-磷酸甘露糖异构酶基因(美国专利号5,767,378和5,994,629)。可替代地，以及在一个优选的实施方案中，本发明的HPPD基因与作为选择剂的一种HPPD除草剂的使用结合，它自身被用作选择标记。
用于再生植物的方法在本领域也是熟知的。例如，已经利用Ti质粒载体用于递送外源DNA，以及直接DNA摄入、脂质体、电穿孔、显微注射、以及微弹。此外，可以利用来自农杆菌属的细菌来转化植物细胞。以下是用于转化双子叶和单子叶植物二者的代表性技术连同代表性质体转化技术的说明。
对于使用根癌农杆菌的转化而言，很多载体是可获得的。这些载体典型地携带至少一个T-DNA边界序列并且包括例如pBIN19(Bevan,Nucl.AcidsRes.(1984))的载体。对于在农杆菌转化中有用的载体的构建，参见，例如，美国专利申请公开号2006/0260011，通过引用结合在此。
没有使用根癌农杆菌的转化避免了在选择的转化载体中对于T-DNA序列的需要，并且因此除了例如以上描述的包含T-DNA序列的那些载体以外，可以利用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括经由基因枪法、原生质体摄入(例如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择很大程度上取决于对于被转化的种类的优先选择。对于这些载体的构建，参见，例如美国申请号20060260011，通过引用结合在此。
为了在植物质体中表达本发明的核苷酸序列，使用了质体转化载体pPH143(WO 97/32011，参见实例36)。该核苷酸序列被插入到pPH143中，由此取代PROTOX编码序列。这种载体接下来用于质体转化以及对于壮观霉素抗性的转化体的选择。可替代地，该核苷酸序列被插入到pPH143中，这样它取代了aadH基因。在这种情况下，对PROTOX抑制剂具有抗性的转化体进行了选择。
用于双子叶植物的转化技术在本领域也是熟知的，并且包括基于农杆菌的技术以及不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及直接通过原生质体或细胞的外源基因材料的摄入。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄入、基因枪介导的递送、或显微注射来完成。由Paszkowski et al.,EMBO J.3:2717-2722(1984)，Potrykus et al.,Mol.Gen.Genet.199:169-177(1985)，Reich et al.,Biotechnology 4:1001-1004(1986)，以及Klein et al.,Nature 327:70-73(1987)描述了这些技术的实例。在每一情况下，使用本领域已知的标准技术将这些转化的细胞再生为完整的植物。
对于双子叶植物的转化，农杆菌介导的转化是一种优选的技术，因为它的高转化效率以及它的对于许多不同的种类的广泛实用。农杆菌转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA的二元载体(例如，pCIB200或pCIB2001)转移到一个适当的农杆菌菌株中，该二元载体可以依赖于由该宿主农杆菌菌株(例如用于pCIB200以及pCIB2001的CIB542菌株(Uknes et al.Plant Cell 5:159-169(1993)))或者在一个共驻留Ti质粒上亦或在染色体上携带的vir基因的互补物。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌以及携带一种质粒(例如pRK2013)并且能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株中的辅助大肠杆菌菌株的三亲本杂交方法来实现该重组二元载体到农杆菌的转移。可替代地，可以通过DNA转化将该重组二元载体转移到农杆菌中(Hofgen &Willmitzer,Nucl.Acids Res.16:9877(1988))。
通过重组农杆菌转化目标植物物种通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的科学试验计划。将转化的组织在存在于二元质粒T-DNA边界之间的携带有抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上再生。
另一种用基因转化植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上注入惰性的或生物学活性的粒子。美国专利号4,945,050、5,036,006、以及5,100,792(都是授予Sanford等人)中披露了这种技术。通常，这种方法涉及在细胞上在有效穿透该细胞的外表面并提供掺入在其内部中的条件下注入惰性的或生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有所希望的基因的载体包被这些粒子以将该载体引入细胞中。可替代地，可以用载体围绕目标细胞使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含被试图引入的DNA)注入到植物细胞组织中。
多数单子叶植物种类的转化现在也已经变成了常规操作。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术的直接基因转移进入原生质体、以及粒子轰击进入愈伤组织。可以用单一DNA种类或多种DNA种类(即，共转化)进行转化，并且这两种技术都适合用于本发明中。共转化可能具有避免完全型载体构建以及生成对于感兴趣的基因与选择标记具有非伴性基因座的转基因植物的优点，使得能够在随后的世代中去除该选择标记(如果这被认为是所希望的话)。然而，使用共转化的一个缺点是小于100％的频率，分离的DNA种类以该频率被整合到基因组中(Schocher et al.Biotechnology 4:1093-1096(1986))。
专利申请EP 0 292 435、EP 0 392 225、以及WO 93/07278描述了用于从良种近交系玉米制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、以及从转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等人(PlantCell 2:603-618(1990))和Fromm等人(Biotechnology 8:833-839(1990))已经公开了使用粒子轰击用于转化源于A188的玉米系的技术。此外，WO93/07278和Koziel等人(Biotechnology 11:194-200(1993))描述了通过粒子轰击用于转化良种近交系玉米的技术。这种技术利用了从授粉之后14-15天的玉米穗切除的1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚以及用于轰击的一台PDS-1000He Biolistics装置。
水稻的转化也可以通过利用原生质体或粒子轰击的直接基因转移技术来进行。原生质体介导的转化已经对Japonica型和Indica型进行了描述(Zhanget al.Plant Cell Rep 7:379-384(1988)；Shimamoto et al.Nature 338:274-277(1989)；Datta et al.Biotechnology 8:736-740(1990))。使用粒子轰击也可常规地转化两种类型(Christou et al.Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO93/21335描述了通过电穿孔用于转化水稻的技术。
专利申请EP 0 332 581描述了用于产生、转化以及再生早熟禾亚科原生质体的技术。这些技术允许转化鸭茅属(Dactylis)和小麦。此外，已经由Vasil等人(Biotechnology 10:667-674(1992))使用粒子轰击进入C型长期可再生愈伤组织的细胞，以及还有Vasil等人(Biotechnology 11:1553-1558(1993))和Weeks等人(Plant Physiol.102:1077-1084(1993))使用离子轰击未成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织描述了小麦的转化。然而，用于小麦转化的一种优选的技术涉及通过离子轰击未成熟胚的小麦转化并且在基因送递之前包括一个高蔗糖步骤或一个高麦芽糖步骤。在轰击之前，将任意数目的胚(长度为0.75-1mm)在具有3％蔗糖(Murashiga & Skoog,Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))以及3mg/l 2,4-D的MS培养基上进行铺板用于诱导体细胞坯，这允许在黑暗中进行。在选择进行轰击的那天，将胚从诱导培养基中取出并且放置在渗压剂上(即，以希望的浓度(典型地是15％)添加有蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。允许这些胚质壁分离2-3小时，然后进行轰击。每个目标板二十个胚是典型的，尽管不是关键性的。使用标准方法使一种适当的携带基因的质粒(如pCIB3064或pSOG35)沉淀在微米大小的金颗粒上。使用约1000psi的爆破压力，使用标准的80目网筛，用DuPont氦装置射击每个板的胚。在轰击之后，将这些胚放回到黑暗中恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂上取出这些胚并将其放回到诱导培养基上，在这里在再生之前它们停留约1个月。约1个月之后，将具有发育中的胚胎发生的愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基中(MS+1mg/升NAA、5mg/升GA)，该再生培养基进一步包含适当的选择剂(在pCIB3064的情况下是10mg/l的basta而在pSOG35的情况下是2mg/l的甲氨蝶呤)。约1个月之后，将发育的嫩枝转移到更大的被称为“GA7”的灭菌容器中，这些容器包含半浓度的MS、2％的蔗糖、以及相同浓度的选择剂。
还已经描述了使用农杆菌转化单子叶植物。参见WO 94/00977以及美国专利号5,591,616，这两者均通过引用结合在此。还参见Negrotto et al.，PlantCell Reports 19:798-803(2000)，通过引用结合在此。
例如，水稻(亚洲栽培稻)可以用于产生转基因植物。可以使用不同的水稻培养品种(Hiei et al.,1994,Plant Journal 6:271-282；Dong et al.,1996,Molecular Breeding 2:267-276；Hiei et al.,1997,Plant Molecular Biology,35:205-218)。还有，以下描述的各种培养基组分可以在量上变化或者被替换。通过在MS-CIM培养基(MS基础盐，4.3g/升；维生素B5(200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/升；酪蛋白水解物，300mg/升；2,4-D(1mg/ml)，2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶，3g/升)上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从成熟的胚建立培养物。将或者在培养物响应的初始阶段的成熟胚或已建立的培养系进行接种并且与含有所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株LBA4404(农杆菌属)进行共培养。将农杆菌(来自甘油母液)在固体YPC培养基(100mg/L壮观霉素或任何其他适当的抗生素)上在28°C培养大约2天。将农杆菌重新悬浮于液态MS-CIM培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD600为0.2-0.3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为200uM。在将该溶液与这些水稻培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌以将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体的细菌悬浮液并将接种的培养物放在共培养培养基上，然后在22°C下培养2天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林(400mg/升)的MS-CIM培养基中以抑制农杆菌的生长。对于使用PMI选择标记基因的构建体(Reed et al.,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37:127-132)，在7天后将培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基(具有2％的甘露糖、300mg/升的替卡西林的MS)中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基(不具有2,4-D、0.5mg/升的IAA、1mg/升的玉米素、200mg/升的特美汀、2％的甘露糖以及3％的山梨糖醇的MS)中并且在黑暗中生长14天。然后将增殖中的菌落转移到另一轮的再生诱导培养基中并且移到光照生长室中。将再生的嫩枝转移到带有GA7-1培养基(不含激素以及2％的山梨糖醇的MS)的GA7容器中持续2周，然后在它们足够大并具有足够的根时将其移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中(以便产生)生长至成熟，并且收获T1代种子。
通过用本发明中的感兴趣的核酸序列的转化获得的植物可以是各种各样的植物种类的任何一种，包括单子叶植物和双子叶植物的那些；然而，在本发明的方法中所使用的植物在此优先选自在别处列出的农学上重要的目标作物的列表。与对于产量和质量重要的其他特征相结合到本发明的一种基因的表达可以通过育种结合到植物系中。育种的方法和技术在本领域中是已知的。参见例如Welsh J.R.,Fundamentals of Plant Genetics and Breeding,JohnWiley & Sons,NY(1981)；Crop Breeding,Wood D.R.(Ed.)American Societyof Agronomy Madison,Wis.(1983)；Mayo O.,The Theory of Plant Breeding,Second Edition,Clarendon Press,Oxford(1987)；Singh,D.P.,Breeding forResistance to Diseases and Insect Pests,Springer-Verlag,NY(1986)；以及Wricke and Weber,Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding,Walter deGruyter and Co.,Berlin(1986)。
对于质体的转化，将烟草“Xanthienc”的种子是在T琼脂培养基上在1″圆形排列中每个板发芽7个，并且在播种12-14天后用1um钨粒子进行轰击(M10,Biorad,Hercules,Calif.)，这些粒子包被有基本上如所描述的来自质粒pPH143和pPH145的DNA(Svab,Z.and Maliga,P.(1993)PNAS 90,913-917)。将轰击的种苗在T培养基上孵育2天，在这之后将它的叶子剪去并且在光亮中(350-500umol光子/m2/s)将轴外面向上放置于含有500ug/ml二盐酸壮观霉素(Sigma,St.Louis,Mo.)的RMOP培养基板上(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.andMaliga,P.(1990)PNAS 87,8526-8530)。将轰击后三至八周出现在褪色的叶子下面出现的抗性嫩枝亚克隆到相同的选择培养基上，允许其形成愈伤组织，并且将次级嫩枝分离并进行亚克隆。在独立的亚克隆中的转化质体基因组拷贝(同质体性(homoplasmicity))的完整分离是由Southern印迹的标准技术进行评定的(Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor)。将BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(Mettler,I.J.(1987)Plant Mol Biol Reporter 5,346349)在1％的三羟甲基氨基甲烷-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分开、转移到尼龙膜(Amersham)上、并且用sup.32P标记的随机引物DNA序列进行探测，这些DNA序列对应于一个0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，该片段来自包含rps7/12质体靶向序列的一部分的pC8。使同质的嫩枝在含壮观霉素的MS/IBA培养基上无菌地生根(McBride,K.E.et al.(1994)PNAS 91,7301-7305)并转移到温室中。
工程化进入以上描述的转基因的种子以及植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长被传递，并且可以因此在子代植物中被维持和繁殖。一般而言，维持和繁殖利用了已知的农业方法，开发这些方法以适合特定的目的(如耕种、播种或收获)。
可以进一步在植物育种中利用根据本发明的转基因植物和种子的有利的遗传特性。取决于所希望的特性，可以采取不同的育种措施。相关的技术是在本领域内是熟知的，并且包括不仅限于：杂交、近亲繁殖、回交育种、多系育种、变种混合、种间杂交、非整倍体技术、等等。因此，根据本发明的转基因种子和植物可以用于改良植物系的育种，这些植物系例如增加常规方法(例如除草剂或杀虫剂处理)的效力或由于它们的修饰的遗传特性而允许免除所述的方法。
使用适合的选择标记(如卡那霉素)、二元载体(如来自农杆菌)以及植物再生(如从烟草叶盘))的许多合适的转化方法在本领域是熟知的。任选地，一个对照种群的植物同样用表达对照HPPD的多核苷酸进行了转化。可替代地，既然如此，一种未转化的双子叶植物(如拟南芥或烟草)可以被用作对照(在任何情况下，表达它自己的内源性HPPD)。
除草剂抗性
本发明提供了已经用编码赋予对除草剂的抗性或耐受性的一个突变体HPPD或它的变体的核酸分子(单独地或与一个或多个编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相结合)转化的转基因植物、植物细胞、组织、和种子。
在一个实施方案中，本发明的转基因植物表现出对以一个从约5至约2000克每公顷(g/ha)的量施用的除草剂的抗性或耐受性，该除草剂的量包括，例如约5g/ha、约10g/ha、约15g/ha、约20g/ha、约25g/ha、约30g/ha、约35g/ha、约40g/ha、约45g/ha、约50g/ha、约55g/ha、约60g/ha、约65g/ha、约70g/ha、约75g/ha、约80g/ha、约85g/ha、约90g/ha、约95g/ha、约100g/ha、约110g/ha、约120g/ha、约130g/ha、约140g/ha、约150g/ha、约160g/ha、约170g/ha、约180g/ha、约190g/ha、约200g/ha、约210g/ha、约220g/ha、约230g/ha、约240g/ha、约250g/ha、约260g/ha、约270g/ha、约280g/ha、约290g/ha、约300g/ha、约310g/ha、约320g/ha、约330g/ha、约340g/ha、约350g/ha、约360g/ha、约370g/ha、约380g/ha、约390g/ha、约400g/ha、约410g/ha、约420g/ha、约430g/ha、约440g/ha、约450g/ha、约460g/ha、约470g/ha、约480g/ha、约490g/ha、约500g/ha、约510g/ha、约520g/ha、约530g/ha、约540g/ha、约550g/ha、约560g/ha、约570g/ha、约580g/ha、约590g/ha、约600g/ha、约610g/ha、约620g/ha、约630g/ha、约640g/ha、约650g/ha、约660g/ha、约670g/ha、约680g/ha、约690g/ha、约700g/ha、约710g/ha、约720g/ha、约730g/ha、约740g/ha、约750g/ha、约760g/ha、约770g/ha、约780g/ha、约790g/ha、约800g/ha、约810g/ha、约820g/ha、约830g/ha、约840g/ha、约850g/ha、约860g/ha、约870g/ha、约880g/ha、约890g/ha、约900g/ha、约910g/ha、约920g/ha、约930g/ha、约940g/ha、约950g/ha、约960g/ha、约970g/ha、约980g/ha、约990g/ha、约1,000g/ha、约1,010g/ha、约1,020g/ha、约1,030g/ha、约1,040g/ha、约1,050g/ha、约1,060g/ha、约1,070g/ha、约1,080g/ha、约1,090g/ha、约1,100g/ha、约1,110g/ha、约1,120g/ha、约1,130g/ha、约1,140g/ha、约1,150g/ha、约1,160g/ha、约1,170g/ha、约1,180g/ha、约1,190g/ha、约1,200g/ha、约1,210g/ha、约1,220g/ha、约1,230g/ha、约1,240g/ha、约1,250g/ha、约1,260g/ha、约1,270g/ha、约1,280g/ha、约1,290g/ha、约1,300g/ha、约1,310g/ha、约1,320g/ha、约1,330g/ha、约1,340g/ha、约1,350g/ha、约1,360g/ha、约1,370g/ha、约1,380g/ha、约1,390g/ha、约1,400g/ha、约1,410g/ha、约1,420g/ha、约1,430g/ha、约1,440g/ha、约1,450g/ha、约1,460g/ha、约1,470g/ha、约1,480g/ha、约1,490g/ha、约1,500g/ha、约1,510g/ha、约1,520g/ha、约1,530g/ha、约1,540g/ha、约1,550g/ha、约1,560g/ha、约1,570g/ha、约1,580g/ha、约1,590g/ha、约1,600g/ha、约1,610g/ha、约1,620g/ha、约1,630g/ha、约1,640g/ha、约1,650g/ha、约1,660g/ha、约1,670g/ha、约1,680g/ha、约1,690g/ha、约1,700g/ha、约1,710g/ha、约1,720g/ha、约1,730g/ha、约1,740g/ha、约1,750g/ha、约1,760g/ha、约1,770g/ha、约1,780g/ha、约1,790g/ha、约1,800g/ha、约1,810g/ha、约1,820g/ha、约1,830g/ha、约1,840g/ha、约1,850g/ha、约1,860g/ha、约1,870g/ha、约1,880g/ha、约1,890g/ha、约1,900g/ha、约1,910g/ha、约1,920g/ha、约1,930g/ha、约1,940g/ha、约1,950g/ha、约1,960g/ha、约1,970g/ha、约1,980g/ha、约1,990g/ha、或约2,000g/ha。
在一个不同浓度的除草剂的范围内，以基于植物损伤、分生组织的漂白症状等的常规方式评估了主要植物转化事件的范围的除草剂耐受性或抗性水平的平均值和分布。这些数据可以以如下方式来表达，例如源自剂量/反应曲线(具有标绘在x轴上的“剂量”以及标绘在y轴上的“杀伤百分比”、“除草效果”、“出现绿色植物的数量”等)的GR50值，其中增加的GR50值对应于增加的固有抑制剂耐受性水平(例如增加的Ki/KmHPP值)和/或表达的HPPD多肽的表达水平。
本发明的这些方法对于保护农作物免受HPPD抑制剂除草剂的除草损伤是特别有用的，这些HPPD抑制剂除草剂具有以下描述的这些类别的HPPD的化学性质。在一个实施方案中，它选自下组，该组由以下各项组成：
a)一种式(Ia)的化合物
其中R1和R2是氢或一起形成亚乙基桥；
R3是羟基或苯硫基；R4是卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷基-、C1-C4烷氧基-C1-C4烷氧基-C1-C4烷基-；
X是次甲基、氮、或C-R5(其中R5是氢)、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基-C1-C4烷基-、或基团
并且
R6是C1-C4烷基磺酰基-或C1-C4卤代烷基；
b)一种式(Ib)的化合物
R1和R2独立地是C1-C4烷基；以及是它们的游离酸；
c)一种式(Ic)的化合物
其中R1是羟基、苯基羰基-C1-C4烷氧基-或苯基羰基-C1-C4烷氧基-(其中该苯基部分在对位被卤素或C1-C4烷基取代)、或苯磺酰氧基-或苯磺酰氧基-(其中该苯基部分在对位被卤素或C1-C4烷基取代)；
R2是C1-C4烷基；
R3是氢或C1-C4烷基；R4和R6独立地是卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、或C1-C4烷基磺酰基-；并且
R5是氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基-C1-C4烷氧基-、或基团
d)一种式(Id)的化合物
其中R1是羟基；
R2是C1-C4烷基；
R3是氢；并且R4、R5和R6独立地是C1-C4烷基；
e)一种式(Ie)的化合物
其中R1是环丙基；
R2和R4独立地是卤素、C1-C4卤代烷基、或C1-C4烷基磺酰基-；并且
R3是氢；
f)一种式(If)的化合物
其中R1是环丙基；
R2和R4独立地是卤素、C1-C4卤代烷基、或C1-C4烷基磺酰基-；并且
R3是氢；
g)一种式(Ig)或化学式(Ih)的化合物
其中：
R2是选自下组，该组由以下各项组成：C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷氧基-C1-C3烷基以及C1-C3烷氧基-C2-C3烷氧基-C1-C3-烷基；
R5是氢或甲基；
R6是选自下组，该组由以下各项组成：氢、氟、氯、羟基和甲基；
R7是选自下组，该组由以下各项组成：氢、卤素、羟基、巯基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6卤代链烯基、C2-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C4-C7环烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、C1-C6卤代烷硫基、氨基、C1-C6烷氨基、C2-C6二烷基氨基、C2-C6二烷基氨基磺酰基、C1-C6烷氨基磺酰基、C1-C6烷氧基-C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基-C2-C6烷氧基、C1-C6烷氧基-C2-C6-烷氧基-C1-C6烷基、C3-C6链烯基-C2-C6烷氧基、C3-C6炔基-C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷基羰基、C1-C4烷烯基-S(O)p-R’(C1-C4-alkylenyl-S(O)p-R’)、C1-C4烷烯基-CO2-R’、C1-C4烷烯基-(CO)N-R’R’、(C1-C4-alkylenyl-CO2-R’、C1-C4-alkylenyl-(CO)N-R’R’)苯基、苯硫基、苯亚磺酰基、苯磺酰基、苯氧基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、以及5或6元杂芳基或杂芳氧基，该杂芳基包含一至三个杂原子，每个杂原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、氮和硫，其中该苯基或杂芳基组分可以任选地由选自下组的一个取代基取代，该组由以下各项组成：C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3卤代烷氧基、卤素、氰基、以及硝基；
X=O或S；
n=0或1；
m=0或1，其条件是，如果m=1则n=0，并且如果n=1则m=0；
p=0、1、或2；
R’是独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢和C1-C6烷基；
R8是选自下组，该组由以下各项组成：氢、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基羰基-C1-C3烷基、C3-C6环烷基链烯基(例如环己基甲烯基)、(C3-C6cycloalkylalkeneyl for example cyclohexylmethylenyl)、C3-C6炔基烷烯基(例如炔丙基)(C3-C6alkynylalkyleneyl for example propargyl)、C2-C6-链烯基烷烯基(例如烯丙基)(C2-C6-alkenylalkylenyl for example allyl)、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、氰基-C1-C6-烷基、芳基羰基-C1-C3烷基(其中该芳基可以任选地被选自下组的一个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3-烷氧基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基)、芳基-C1-C6烷基(其中该芳基可以任选地被选自下组的一个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3-烷氧基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基)、C1-C6烷氧基C1-C6烷氧基C1-C6烷基和一个5或6元杂芳基-C1-C3-烷基或杂环基-C1-C3-烷基，该杂芳基或杂环基包含一至三个杂原子，每个杂原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、氮和硫，其中该杂环基或杂芳基组分可以任选地被选自下组的一个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基以及C1-C3烷氧基；
Q是选自下组，该组由以下各项组成：
以及
其中
A1是选自下组，该组由以下各项组成：O、C(O)、S、SO、SO2和(CReRf)q；
q=0、1、或2；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：C1-C4烷基，该C1-C4烷基可以被选自下组的取代基单、双、或三取代，该组由以下各项组成：C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基羰基、苯基和杂芳基，有可能苯基和杂芳基基团又(in turn)被选自下组的取代基单、双、或三取代，该组由以下各项组成：C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基磺酰基以及C1--C4卤代烷基，在该杂环中的氮上的取代基是除卤素外的其他基团；或
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢、C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基羰基、苯基或杂芳基，有可能苯基和杂芳基基团又(in turn)被选自下组的取代基单、双、或三取代，该组由以下各项组成：C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基磺酰基以及C1-C4卤代烷基，在该杂环中的氮上的取代基是除卤素外的其他基团；或
Ra和Rb一起形成了3至5元碳环，该环可以被C1-C4烷基取代，并且可以被氧、硫、S(O)、SO2、OC(O)、NRg或被C(O)间断；或
Ra和Rc一起形成C1-C3亚烷基链，该链可以被氧、硫、SO、SO2、OC(O)、NRh或被C(O)间断；有可能该C1-C3亚烷基链将顺序被C1-C4烷基取代；
Rg和Rh各自独立地是其它的C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基羰基或C1-C4烷氧基羰基；
Ri是C1-C4烷基；
R3是选自下组，该组由以下各项组成：C1-C6烷基和C3-C6环烷基，该C1-C6烷基任选地被卤素和/或C1-C3烷氧基取代；该C3-C6环烷基任选地被卤素和/或C1-C3烷氧基取代；
R9是选自下组，该组由以下各项组成：环丙基、CF3、以及i.-Pr；
R10是选自下组，该组由以下各项组成：氢、I、Br、SR11、S(O)R11、S(O)2R11和CO2R11；并且
R11是C1-4烷基；
h)一种式(Ij)、(Ik)、或(Im)的化合物
或者是所述化合物的一种农学上可接受的盐，其中：
R1是选自下组，该组由以下各项组成：氢、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C3烷氧基-C1-C3烷基、C1-C3烷氧基-C1-C3烷氧基-C1-C3-烷基、C1-C3烷氧基-C1-C3-卤代烷基、C1-C3-烷氧基-C1-C3-烷氧基-C1-C3-卤代烷基、C4-C6-氧杂取代的环烷氧基-C1-C3-烷基、C4-C6-氧杂取代的环烷基-C1-C3-烷氧基-C1-C3-烷基、C4-C6-氧杂取代的环烷氧基-C1-C3-卤代烷基、C4-C6-氧杂取代的环烷基-C1-C3-烷氧基-C1-C3-卤代烷基、(C1-C3链烷磺酰基-C1-C3-烷氨基)C1-C3烷基、(C1-C3链烷磺酰基-C3-C4环烷氨基)-C1-C3烷基、C1-C6烷羰基-C1-C3烷基、C3-C6环烷基-C2-C6链烯基(alkeneyl)、C3-C6炔基、C2-C6链烯基、氰基-C1-C6-烷基、芳基羰基-C1-C3烷基(其中该芳基可以任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3-烷氧基、C1-C3-烷基、C1-C3卤代烷基)、芳基、5或6元杂芳基、5或6-元杂芳基-C1-C3-烷基和杂环基-C1-C3烷基，该杂芳基或杂环基包含一至三个杂原子，每个杂原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、氮和硫，并且其中该芳基、杂环基或杂芳基组分可以任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3卤代烷氧基、C1-C6烷基-S(O)p-、C1-C6卤代烷基-S(O)p-、氰基和硝基；
R5是选自下组，该组由以下各项组成：氢、氯、氟和甲基；
R6是选自下组，该组由以下各项组成：氢、氟、氯、羟基和甲基；
R7是选自下组，该组由以下各项组成：氢、氰基、硝基、卤素、羟基、巯基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6卤代烷基、C2-C6卤代链烯基、C2-C6链烯基、芳基-C2-C6链烯基、C3-C6炔基、C1-C6烷氧基、C4-C7环烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6烷基-S(O)p、C3-C6环烷基-S(O)p、C1-C6卤代烷基-S(O)p、C3-C6卤环烷基-S(O)p、C1-C6烷基羰基氨基、(C1-C6烷基羰基)C1-C3烷氨基、(C3-C6环烷基羰基)氨基、(C3-C6环烷基羰基)C1-C3烷氨基、芳基羰基氨基、(芳基羰基)-C1-3烷氨基、(杂芳基羰基)氨基、(杂芳基羰基)C1-C3烷氨基、氨基、C1-C6烷氨基、C2-C6二烷基氨基、C2-C6链烯基氨基、C1-C6烷氧基-C2-C6烷氨基、(C1-C6烷氧基-C2-C4烷基)-C1-C6-烷氨基、C3-C6环烷氨基、C3-C6环卤烷氨基、C1-C3烷氧基-C3-C6环烷氨基、C3-C6炔基氨基、二烷基氨基，其中这些取代基连接以形成4-6元环(例如吡咯烷基、哌啶基)，该环任选地包含氧(例如吗啉基)和/或任选地被C1-C3-烷氧基和/或卤素(特别是氟)、C2-C6二烷基氨基磺酰基、C1-C6烷氨基磺酰基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C2-C6烷氧基、C1-C6烷氧基-C2-C6烷氧基-C1-C6-烷基、C3-C6链烯基-C2-C6烷氧基、C3-C6炔基-C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基羰基、C1-C6烷基羰基、C1-C4烷烯基-S(O)p-R’、C1-C4烷烯基-CO2-R’、C1-C4烷烯基-(CO)N-R’R’、芳基(例如苯基)、芳基C1-C3烷基、芳基-S(O)p、杂芳基-S(O)p、芳氧基(例如苯氧基)、5或6元杂芳基、杂芳基C1-C3烷基和杂芳氧基取代，该杂芳基包含一至三个杂原子，每个杂原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、氮和硫，其中该芳基或杂芳基组分可以任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3卤代烷氧基、卤素、氰基和硝基；
X1=N-(O)n或C-R8；
X2=O或S；
n=0或1；
p=0、1或2；
R’是独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢和C1-C6烷基；
R8是选自下组，该组由以下各项组成：氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基羰基-C1-C3烷基、C3-C6环烷基-C2-C6链烯基(例如环己基甲烯基)、C3-C6炔基(例如炔丙基)、C2-C6链烯基(例如烯丙基)、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、氰基-C1-C6烷基、芳基羰基-C1-C3烷基(其中该芳基可以任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3-烷氧基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基)、芳基-C1-C6烷基(其中该芳基可以任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3-烷氧基、C1-C3-烷基、C1-C3-卤代烷基)、C1-C6烷氧基C1-C6烷氧基C1-C6烷基、芳基、一个5或6元的杂芳基、一个5或6元的杂芳基-C1-C3-烷基和杂环基-C1-C3-烷基，该杂芳基或杂环基包含一至三个杂原子，每个杂原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、氮和硫，并且其中该芳基、杂环基或杂芳基组分可以任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基以及C1-C3烷氧基、氰基和硝基；
Q是选自下组，该组由以下各项组成：-
以及
其中
A1是选自下组，该组由以下各项组成：O、C(O)、S、SO、SO2和(CReRf)q；q=0、1或2；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：C1-C4烷基，该C1-C4烷基可以被选自下组的取代基单、双、或三取代，该组由以下各项组成：C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基-羰基、苯基和杂芳基，有可能苯基和杂芳基基团将按顺序被选自下组的取代基单、双、或三取代，该组由以下各项组成：C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基磺酰基以及C1-C4卤代烷基，在该杂环中的氮上的取代基是除卤素外的其他基团；或
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：氢、C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基羰基、苯基或杂芳基，有可能苯基和杂芳基基团将按顺序被选自下组的取代基单、双、或三取代，该组由以下各项组成：C1-C4烷氧基、卤素、羟基、氰基、羟基羰基、C1-C4烷氧基羰基、C1-C4烷基磺酰基以及C1-C4卤代烷基，在该杂环中的氮上的取代基是除卤素以外的其他基团；或
Ra和Rb一起形成了3至5元碳环，该环可以被C1-C4烷基取代，并且可以被氧、硫、S(O)、SO2、OC(O)、NRg或被C(O)间断；或
Ra和Rc一起形成C1-C3亚烷基链，该链可以被氧、硫、SO、SO2、OC(O)、NRh或被C(O)间断；有可能该C1-C3亚烷基链将顺序被C1-C4烷基取代；
Rg和Rh各自独立地是其他C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷基磺酰基、C1-C4烷基羰基或C1-C4烷氧基羰基；
Ri是C1-C4烷基；
Rj是选自下组，该组由以下各项组成：氢、C1-C4烷基和C3-C6环烷基；
R3是选自下组，该组由以下各项组成：C1-C6烷基和C3-C6环烷基，该C1-C6烷基任选地被卤素和/或C1-C3烷氧基取代；该C3-C6环烷基任选地被卤素和/或C1-C3烷氧基取代；
R9是选自下组，该组由以下各项组成：环丙基、CF3、以及i.-Pr；
R10是选自下组，该组由以下各项组成：氢、I、Br、SR11、S(O)R11、S(O)2R11和CO2R11；并且
R11是C1-4烷基。
关于(Ia)-(Im)的结构，将在此说明：
卤素包括氟、氯、溴或碘。同样对应地应用于在上下文或其他定义中的卤素，例如卤代烷基或卤代苯基。
具有链长为1至6个碳原子的卤代烷基基团是，例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、五氟代乙基、1,1-二氟-2,2,2-三氯乙基、2,2,3,3-四氟乙基和2,2,2三氯乙基、七氟正丙基、以及全氟代正己基。
合适的烷烯基基团包括，例如CH2、CHCH3、C(CH3)2、CH2CHCH3、CH2CH(C2H5)。
合适的卤链烯基基团包括被卤素取代一次或多次的链烯基基团，卤素是氟、氯、溴、或碘并且特别是氟或氯，例如2,2-二氟-1-甲基乙烯基、3-氟丙烯基、3-氯丙烯基、3-溴丙烯基、2,3,3-三氟丙烯基、2,3,3-三氯丙烯基和4,4,4,-三氟-2-丁烯-1-基。被卤素取代一次、两次或三次的优选的C2-C6链烯基基团是具有链长为2至5个碳原子的那些。合适的卤代烷基炔基基团包括，例如被卤素取代一次或多次的烷基炔基基团，卤素是溴或碘并且特别是氟或氯，例如3-氟丙炔基、5-氯-2-戊炔-1-基、5-溴-2-戊炔-1-基、3,3,3-三氟丙炔基和4,4,4-三氟-2-丁炔-1-基。被卤素取代一次或多次的优选的烷基炔基基团是具有一个链长为3至5个碳原子的那些。
烷氧基优选地具有1至6个碳原子的链长。烷氧基是，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基或戊氧基或己氧基异构体，优选地是甲氧基和乙氧基。烷基羰基优选地是乙酰基或丙酰基。烷氧基羰基是，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、异丁氧基羰基、仲丁氧基羰基或叔丁氧基羰基，优选地是甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基。
卤代烷氧基是，例如氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基、1,1,2,2-四氟乙氧基、2-氟乙氧基、2-氯乙氧基、2,2-二氟乙氧基或2,2,2-三氯乙氧基，优选地是二氟甲氧基、2-氯氟乙氧基、或三氟甲氧基。
烷硫基基团优选地具有1至6个碳原子的链长。烷硫基是，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基或叔丁硫基，优选地是甲硫基或乙硫基。烷基亚磺酰基是，例如甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、丙基亚磺酰基基、异丙基亚磺酰基、正丁基亚磺酰基、异丁基亚磺酰基、仲丁基亚磺酰基或叔丁基亚磺酰基，优选地是甲基亚磺酰基或乙基亚磺酰基。
烷基磺酰基是，例如甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基基、异丙基磺酰基、正丁基磺酰基、异丁基磺酰基、仲丁基磺酰基或叔丁基磺酰基，优选地是甲基磺酰基或乙基磺酰基。
烷氨基是，例如甲氨基、乙氨基、正丙氨基、异丙氨基或丁基氨基异构体。二烷基氨基是，例如二甲氨基、甲基乙基氨基、二乙氨基、正丙基甲基氨基、二丁氨基或二异丙基氨基。给出的优选是具有一个1至4个碳原子的链长的烷氨基基团。
环烷氨基或二环烷氨基是例如环己氨基或二环丙氨基。
烷氧基烷基基团优选地具有1至6个碳原子。烷氧基烷基是，例如甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、正丙氧基甲基、正丙氧基乙基、异丙氧基甲基、或异丙氧基乙基。
烷硫基烷基基团优选地具有1至6个碳原子。烷硫基烷基是，例如甲硫基甲基、甲硫基乙基、乙硫基甲基、乙硫基乙基、正丙硫基甲基、正丙硫基乙基、异丙硫基甲基、异丙硫基乙基、丁硫基甲基、丁硫基乙基、或丁硫基丁基。
环烷基基团优选地具有3至6个环碳原子并且可以被一个或多个甲基基团取代；它们优选地是未取代的，例如环丙基、环丁基、环戊基、或环己基。
苯基，包括作为部分取代基的苯基，例如苯氧基、苄基、苄氧基、苯甲酰基、苯硫基、苯基烷基、苯氧基烷基或甲苯磺酰基，可以如所希望而处于单或多取代的形式，这些取代基在此情况下可以在邻位、间位和/或对位。
杂环基，例如包括吗啉基、四氢呋喃基。
杂芳基，包括作为部分取代基的杂芳基，例如杂芳氧基，表示包含一至三个杂原子的五或六元杂芳基，每个杂原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、氮和硫。应当理解的是，该杂芳基组分可以任选地被单或多取代。术语杂芳环因此包括，例如呋喃基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、吡唑基、异噻唑基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三唑基。
具有化学式Ij的化合物可以包含多个不对称中心，并且可以表现为一个单一的对映异构体、处于任何比例的多对对映异构体、或其中存在多于一个的不对称中心，以包含所有可能的比率的非对映异构体。与其他可能性相比，典型地这些对映异构体之一已经增强了生物活性。
类似地，在存在双取代的链烯的地方，这些可以以反式或顺式形式存在，或作为以任何比例混合的二者的混合物。
此外，或者当R1是氢时，具有包括Q1、Q5、Q6或Q7的化学式Ij的化合物可以与可替代的羟基互变异构的形式平衡。应当理解的是，所有互变异构的形式(单一的互变异构体或它们的混合物)、外消旋混合物、以及单一的异构体都包括在本发明的范围之内。
技术人员将还会理解的是，关于化学式Ij，如果n是1，为了形成N-氧化物，那么氮和氧将被带电(N+O-)。
在本发明的一个优选实施方案中，X2是氧。
在另一个优选实施方案中，R1是选自下组，该组由以下各项组成：氢、C1-C6烷基、C1-C3烷氧基C1-C3烷基、C1-C3烷氧基C2-C3烷氧基C1-C3烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C3烷氧基-C1-C3卤代烷基以及苯基。
在另一个优选的实施方案中，R1是芳基，优选地是苯基，或包含一至三个杂原子的5或6元杂芳基，每个杂原子独立地选自下组，该组由以下各项组成：氧、氮和硫，并且其中该芳基或杂芳基可以任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下各项组成：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3卤代烷氧基、C1-C6烷基-S(O)p-、C1-C6卤代烷基-S(O)p-、氰基和硝基。
在另一个优选的实施方案中，R5是氢。
在另一个优选的实施方案中，R6是氢或氟。
在另一个优选的实施方案中，Rj是选自下组，该组由以下各项组成：氢、甲基和环丙基。
在另一个优选的实施方案中，该除草化合物具有化学式(Ik)：
在本发明的一个更优选的实施方案中，该除草化合物具有化学式(Ik)，其中Q是Q1，特别是其中A1是CReRf并且其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf是氢，并且其中q=1。在本发明的另一个优选的实施方案中，Q是Q1，其中A1是CReRf并且其中Rb、Rd、Re和Rf是氢，Ra和Rc一起形成了乙烯链并且其中q=1
在另一个优选的实施方案中，当该除草化合物具有化学式(Ik)时，其中R7是选自下组，该组由以下各项组成：氢、羟基、卤素、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基-C2-C6烷氧基、C1-C6-烷氧基-C1-C6烷基、C1-C6-烷氧基-C2-C6烷氧基-C1-C6烷基、C1-C6烷氨基、C1-C6二烷基氨基、C2-C6链烯基氨基、C1-C6烷氧基-C2-C3烷氨基、(C1-C6烷氧基-C2-C4-烷基)-C1-C6烷氨基、C3-C6环烷基氨基、C3-C6环卤代烷基氨基、C1-C3烷氧基-C3-C6环烷基氨基、C3-C6炔基氨基、以及二烷基氨基基团)，其中这些取代基连接以形成4-6元环，任意地包含氧，和/或任选地被C1-C3烷氧基和/或卤素，特别是氟取代。在一个甚至更优选的实施方案中，R7是选自下组，该组由以下各项组成：氢、氯、甲基、乙基、1-甲基乙基、环丙基、氟甲基、1-氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2-二氟乙基、1-氟-1-甲基乙基、2,2,2-三氟乙基、二氟氯甲基、甲氧基、乙氧基、甲氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙氧基、2-甲氧基乙氧基甲基、(2-甲氧基乙基)氨基、以及(2-甲氧基乙基)甲氨基。
在另一个优选的实施方案中，该除草化合物具有化学式(Im)：
在本发明的另一个优选的实施方案中，该除草化合物具有化学式(Im)，其中Q是Q1，特别是其中A1是CReRf并且其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf是氢，并且其中q=1。在本发明的另一个优选的实施方案中，Q是Q1，其中A1是CReRf并且其中Rb、Rd、Re和Rf是氢，Ra和Rc一起形成了乙烯链并且其中q=1。
在另一个优选的实施方案中，其中该除草化合物具有化学式(Im)并且其中R7是选自下组，该组由以下各项组成：氢、氰基、卤素、硝基、C1-C6卤代烷基、C1-C3烷氧基C1-C3卤代烷基、C1-C3烷氧基C2-C6-烷氧基C1-C3卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C1-C6烷基S(O)p、C3-C6环烷基S(O)p C1-C6卤代烷基-S(O)p、C3-C6卤环烷基-S(O)p、芳基-S(O)p和杂芳基-S(O)p。在一个甚至更优选的实施方案中，R7是选自下组，该组由以下各项组成：氯、氟、氰基、硝基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟乙基、1,1-二氟乙基、1-氟-1-甲基乙基、二氟氯甲基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1,1-二氟乙氧基、甲基亚磺酰基、甲基磺酰基、乙基亚磺酰基、乙基磺酰基、苯基亚磺酰基、和苯基磺酰基。
在进一步优选的实施方案中，如在WO2009/016841中描述的那样，HPPD除草化合物是双环化合物。
在一个具体的实施方案中，HPPD抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：苯并双环酮(benzobicyclon)、甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、特呋三酮(tefuryltrione)、tembo三酮(tembotrione)、4-羟基-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-二环[3.2.1]3-辛烯-2-酮(4-hyd oxy-3-[[2-(2-methoxyethoxy)methyl]-6-(trifluoromethyl)-3-pyridinyl]carbonyl]-bicyclo[3.2.1]oct-3-en-2-one)、螺旋多司酮(ketospiradox)或它们的游离酸、吡草酮(benzofenap)、磺酰草吡脱(pyrasulfotole)、苄草唑(pyrazolynate)、匹唑芬(pyrazoxyfen)、苯吡唑草酮(topramezone)、[2-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(甲基磺酰基)-苯基](1-乙基-5-羟基-1H-吡唑-4-基)-甲酮([2-chloro-3-(2-methoxyethoxy)-4-(methylsulfonyl)phenyl](1-ethyl-5-hydroxy-1H-pyrazol-4-yl)-methanone)、(2,3-二氢-3,3,4-三甲基-1,1-二氧代苯并[b]噻吩-5-基)(5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)-甲酮(2,3-dihydro-3,3,4-trimethyl-1,1-dioxidobenzo[b]thien-5-yl)(5-hydroxy-1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-methanone,、异噁氯草酮(isoxachlortole)、异噁唑草酮(isoxaflutole)、α-(环丙基羰基)-2-(甲基磺酰基)-β-氧-4-氯-苯代丙腈、以及α-(环丙基羰基)-2-(甲基磺酰基)-β-氧-4-(三氟甲基)-苯代丙腈)(α-(cyclopropylcarbonyl)-2-(methylsulfonyl)-β-oxo-4-chloro-benzenepropanenitrile,and  α-(cyclopropylcarbonyl)-2-(methylsulfonyl)-β-oxo-4-(trifluoromethyl)-benzenepropanenitrile)。
在本领域中其他HPPD抑制剂也是熟知的，并且可以在本发明的方法内使用，包括具有如下化学文摘登记号的HPPD抑制剂：苯并双环酮(benzobicyclon)(CAS RN 156963-66-5)、甲基磺草酮(mesotrione)(CAS RN104206-82-8)、磺草酮(sulcotrione)(CAS RN 99105-77-8)、特呋三酮(tefuryltrione)(CAS RN 473278-76-1)、tembo三酮(tembotrione)(CAS RN335104-84-2)、4-羟基-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基-二环[3.2.1]3-辛烯-2-酮(4-hydroxy-3-[[2-(2-methoxyethoxy)-methyl]-6-(trifluoromethyl)-3-pyridinyl]carbonyl]-bicyclo[3.2.1]oct-3-en-2-one)(CAS RN 352010-68-5)、螺旋多司酮(ketospiradox)(CAS RN 192708-91-1)或它的游离酸(CAS RN 187270-87-7)、吡草酮(benzofenap)(CAS RN82692-44-2)、磺酰草吡脱(pyrasulfotole)(CAS RN 365400-11-9)、苄草唑(pyrazolynate)(CAS RN 58011-68-0)、匹唑芬(pyrazoxyfen)(CAS RN71561-11-0)、苯吡唑草酮(topramezone)(CAS RN 210631-68-8)、[2-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(甲基磺酰基)苯基](1-乙基-5-羟基-1H-吡唑-4-基)-甲酮([2-chloro-3-(2-methoxyethoxy)-4-(methylsulfonyl)phenyl](1-ethyl-5-hydroxy-1H-pyrazol-4-yl)-methanone)(CAS RN 128133-27-7)、(2,3-二氢-3,3,4-三甲基-1,1-二氧代苯并[b]噻吩-5-基)(5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮((2,3-dihydro-3,3,4-trimethyl-1,1-dioxidobenzo[b]thien-5-yl)(5-hydroxy-1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-methanone)(CAS RN 345363-97-5)、异噁氯草酮(isoxachlortole)(CAS RN 141112-06-3)、异噁唑草酮(isoxaflutole)(CASRN 141112-29-0)、α-(环丙基羰基)-2-(甲基-磺酰基)-β-氧-4-氯-苯代丙腈(α-(cyclopropylcarbonyl)-2-(methylsulfonyl)-β-oxo-4-chloro-benzenepropanenitrile)(CAS RN 143701-66-0)、以及α-(环丙基羰基)-2-(甲基磺酰基)-β-氧-4-(三氟甲基)-苯代丙腈(α-(cyclopropyl-carbonyl)-2-(methylsulfonyl)-β-oxo-4-(trifluoromethyl)-benzenepropanenitrile)(CAS RN 143701-75-1)。
突变体HPPD的表达水平应该足以实质性地减少(相对于同样处理的但是缺乏突变体HPPD转基因植物)遍布植物组织的母体除草剂的残余水平。一位本领域的普通技术人员当然将理解的是，某些突变体HPPD酶可能对某些亚组的HPPD的化学性质赋予抗性，并且一种酶不可能提供对所有HPPD的抗性。
使用的方法
本发明进一步提供了在一种包括作物植物和杂草的场所选择性地控制杂草的方法，其中这些植物是通过上述本发明的任何方法获得的，其中该方法包括对该场所施用杂草控制量的一种或多种除草剂。在此描述的任何转基因植物可以在本发明的这些方法内使用。术语“场所”可以包括土壤、种子、和苗、连同已经长成的植物。可以合适地在作物或杂草的苗前或苗后使用除草剂。
术语“杂草控制量”表示机能上包括除草剂的量，该除草剂的量能够影响一种给定的杂草的生长或发育。因此，该量可以小到足以简单地阻止或抑制一种给定的杂草的生长或发育，或者该量可以大到足以不可逆地破坏一种给定的杂草。
因此，本发明提供了一种在场所控制杂草的方法，包括对该场所施用一个杂草控制量的一种或多种除草剂，其中该场所包括已经用编码赋予对HPPD除草剂的抗性或耐受性的一种突变体HPPD多肽或它的变体的核酸分子进行转化的转基因植物(单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合)。在一个实施方案中，该希望的性状是对一种除草剂的抗性或耐受性，该除草剂包括例如选自下组的除草剂，该组由以下各项组成：一种HPPD抑制剂、草甘膦、以及草铵膦。在另一个实施方案中，该场所包括一种已经用上述核酸分子的任何组合进行转化的转基因植物，这些核酸分子包括编码一种赋予对一种除草剂的抗性或耐受性的突变体HPPD多肽或它的变体的一种或多种核酸分子，这些核酸分子与至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合。
在一个实施方案中，本发明提供了对于控制在作物大田中不想要的植物种类有用的转基因植物和方法，其中这些作物植物通过转化来表达编码突变体HPPD多肽的基因而被赋予对HPPD化学性质的抗性，其中以能够杀死不想要的植物种类(杂草种类、或例如在所希望的作物植物的大田中的残留或“劣种”或“自生”植物作物)或损害其生长的量而应用了作为过多施用的的一种HPPD除草剂。该施用可以是在这些作物植物或这些不想要的种类的苗前或苗后，并且可以与作物对其天然耐受或通过表达一种或多种其他除草剂抗性转基因而对其具有抗性的其他除草剂的施用相结合。参见例如美国申请公开号2004/0058427和PCT申请公开号WO 98/20144。
在另一个实施方案中，本发明还涉及一种保护作物植物免受除草剂损伤的方法。在作物植物的培养中，特别是在商业规模上，正确的作物轮作对于产量稳定性(实现经过长时期的具有良好质量的高产量)以及对于农艺学商业的经济成功是极其重要的。例如，穿过大面积的美国主要玉米生长区(“中央玉米带”)，在超过75％的情况下，大豆是作为玉米的后茬作物而生长。使用HPPD抑制剂除草剂来进行在玉米作物中的选择性杂草控制正在逐渐实现。虽然这个类别的除草剂对于这个目的具有优良的适宜性，但是它可以在后茬作物中导致对这些作物植物的农艺学上不可接受的植物毒性损害(“残余”损害)。例如，某些大豆品种对此类HPPD抑制剂除草剂的甚至非常少的残余是敏感的。因此，本发明的除草剂抗性或耐受性植物对于在来自先前施用的除草剂的任何短期残留的场所进行种植也是有用的(例如，通过在施用一种除草剂后的下一年种植一种本发明的转基因植物，以降低来自该除草剂的土壤残余的损害的风险)。
以下实例是作为说明而并不是作为限制而提供的。
实例
实例1.燕麦属衍生的HPPD SEQ ID NO:14的克隆、表达和测定以及对于不同的HPPD除草剂的kcat、KmHPP以及Ki(kon和koff)的值的确定。
将由GeneArt(德国雷根斯堡)合成的编码来自燕麦的HPPD(SEQ IDNO:14)的DNA序列(SEQ ID NO:1)克隆到pET24a中并且在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，用50μg/ml卡那霉素进行选择(如PCT申请公开号WO 02/46387中所描述)。使用在30°C下生长的过夜培养物，以1:100的比率接种在摇瓶中的3x1升LB。使培养物在37°C、220rpm下生长直至达到A1cm600nm为0.6-0.8，将温度降低到15°C并且用0.1mM IPTG进行诱导。将培养物生长过夜，并且在10,000g下在15分钟的离心之后来收集这些细胞。将这些细胞保存在-20°C下直至提取。将来自3升摇瓶培养物(约12g)的细胞沉淀物以1ml缓冲剂:1g细胞糊(cell paste)的比率融化在提取缓冲液(50mM Tris、10mM抗坏血酸钠、2mM DTT、2mM AEBSF、10μM胰蛋白酶抑制剂、1mMEDTA、pH 7.66)中。在30,000psi下使提取物通过细胞破碎仪，并且在4°C下在50,000g下离心25分钟。任选地，该提取物向下流过Sepadex G25与缓冲液进行交换。上清液在液氮中形成珠粒并且保存在-80°C下。通过蛋白印迹分析并且使用纯的燕麦属(1-10ng)作为标准对HPPD表达的水平进行估计。将提取物以1:6000进行稀释并且将1-10ul加载到12％SDS PAGE上。此外，通过用(英国伦敦帝国化学工业公司)染色来比较诱导的和未诱导的SDS PAGE从而对表达进行定量。将凝胶印迹到PVDF膜上并且使用兔抗小麦HPPD(1:6600)血清作为第一抗体以及羊抗兔FITC-连接的抗体(1:600)作为第二抗体进行蛋白质印迹。通过在FluorimagerTM 595(英国白金汉郡GE Healthcare公司)上进行扫描来进行条带的检测并且通过使用ImageQuantTM(英国白金汉郡GE Healthcare公司)来进行峰值定量。从所有转化的菌株中再次分离出质粒DNA并且对跨编码区的DNA序列进行确认。
通过蛋白质印迹(western)，在大肠杆菌提取物中表达的SEQ ID NO:14多肽的表达水平被估计为在33.5mg/ml的总的可溶性蛋白浓度之外约10-14mg/ml。
通过活性位点滴定还更精确地估计了提取物中活性HPPD的浓度。例如，将一定体积范围的提取物(典型地0-20ul)加入到pH 7.0并且25°C的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶以及3nmoles的14C-标记的具有结构A的化合物(1.81GBq/mmol)的50mM双三羟基氨基丙烷(BisTrisPropane)缓冲液中，总最终测定体积为425μl。
    结构A
3分钟之后通过加入100μl 1mM‘冷的’结构A将放射性标记蛋白结合反应淬灭。通过快速层析向下流入NAP5 G25Sephadex柱子(英国白金汉郡GEHealthcare公司)将蛋白质交换进入pH 7.0的包含0.1M KCl的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中并且使用Tri-Carb 2900TR闪烁计数器((Perkin Elmer,Wellesley,MA)对结合到蛋白质部分上的14C以Optiphase闪烁体进行测量。从如在PCT专利申请公开号WO 02/46387中所述的滴定来计算提取物中HPPD结合位点浓度，并且在一种提取物中被估计为94.9、78.3、以及82.3(平均值85.2)μM并且在另一个实例中为47.2μM。
在一种替代的方法中，该活性位点滴度是基于一个基于活性的测定滴度来计算的，该基于活性测定滴度是通过以下步骤来实现的：预孵育不同比率的提取物和结构A的溶液从而实现精确的活性位点滴定，然后快速稀释到用于立即测定的包含100-200μM pHPP的测定溶液中，用于通过HPLC/UV对30-40s(即在该测定的时间尺度上抑制剂分离和结合不会显著发生的足够短的时间)之后尿黑酸盐的形成进行定量(如下所述)。
表达的HPPD的KmHPP和kcat值是基于在25°C下在pH 7.0的包含25mM抗坏血酸盐钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma,St.Louis,MO)、以及一定浓度范围(典型地0.5-10X Km)的4-羟基苯丙酮酸的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂的溶液中进行的测定来估计的。典型地在最终体积为110μl中的这些测定是通过加入酶开始的并且在20秒或优选10秒钟之后随着涡旋混合加入20μl 25％高氯酸而精确地终止。将测定溶液转移到Chromacol 03-CVG HPLC小瓶中，密封并且通过注射到反向Aqua C185μ75x 4.6mm HPLC柱子上以1.5ml/min流动5.5％乙腈0.1％TFA(缓冲剂A)来确定在40μl等分部分中形成的尿黑酸盐的量。在1.5ml/分钟下通过以下各步骤来洗脱该柱子：使用缓冲液A洗涤2分钟、然后使用缓冲液A和100％乙腈的30/70混合物洗涤2分钟，并且进一步用缓冲液A洗涤3.5分钟。尿黑酸盐的洗脱是通过在292nm处的UV来监测的并且通过与标准校准曲线进行比较来对各反应中形成的量进行定量。
使用一个非线性最小二乘法拟合使用Grafit 4TM软件(英国米德塞克斯Erithacus软件公司)确定了Km和Vmax值(例如图1)。通过将最大速率、Vmax(以nmol/秒来表示)除以HPPD酶的纳摩尔的数量(基于通过活性位点滴定而确定的浓度)确定了Kcat值。
根据与图1中所示数据所产生的那些类似的一组分开的实验，就HPPDSEQ ID NO:14的一个提取物而言，Km值被估计为6.17、4.51、6.09、6.13、4.37、4.62、5.41、5.13以及6μM(Km平均值=5.38μM)。相应地kcat值是4.92、6.25、7.08、6.26、5.5、6.77、6.89、7.12以及7.39s-1(kcat平均值=6.46s-1)。注意对于这个计算，并且在此标准地是，Mr被取为约94kD并且假设每个二聚体一个活性位点(即，半位点活性以及抑制剂结合；参见Garcia et al.(2000)Biochemistry,39:7501-7507；Hawkes“HydroxyphenylpyruvateDioxygenase(HPPD)-The Herbicide Target.”In Modern Crop ProtectionCompounds.Eds.and Schirmer.Weinheim,Germany:Wiley-VCH,2007.Ch.4.2,pp.211-220)。如果已经假设该替代的假设是每个单体一个活性位点，则计算的kcat值应当相应地减半。
对于酶：抑制剂复合体的形成的结合速率(由结合速率常数(kon)决定)、EI以及解离速率(由解离速率常数(koff)决定)是通过本领域已知的方法并且基本上如Hawkes et al.(2001)Proc.Bright.Crop.Prot.Conf.Weeds,2:563-568以及PCT专利申请公开号WO 02/46387中所述来确定的。
例如，通过在零时间并且在不同时间点处(0-180s)将约60皮摩尔HPPD加入在pH 7.0并且在25°C的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma,St.Louis,MO)以及过量的(约300皮摩尔)14C抑制剂的处于425μl的总测定体积的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲液中，然后加入并且快速混合100μl‘冷的’1mM结构A来淬灭放射性标记的结合反应来测量结合速率。然后通过快速层析向下进入一个NAP5G25Sephadex柱子(英国白金汉郡GEHealthcare公司)将在不同时间淬灭的蛋白质样品交换进入pH 7.0的包含0.1M KCl的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中并且使用一台Tri-Carb 2900TR闪烁计数器(Perkin Elmer,Wellesley,MA)对结合到蛋白部分上的14C的量以Optiphase闪烁体进行定量。按照下面的方案来拟合数据从而取得表观二级速率常数(k2)的值，该值决定酶和放射性标记的抑制剂的结合速率。使用了一定范围的酶和抑制剂浓度。任选地，可以从类似实验得到该速率常数，其中在这种情况下酶(处于约0.05-0.2μM结合位点)和未标记的抑制剂(处于约0.5至2μM)在pH 7.0并且25°C的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma,St.Louis,MO)的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中反应一个短时间(0-60s)的范围，并且然后通过快速稀释到包含100-200μM HPP的测定溶液中进行淬灭用于通过对30-40s(即在该测定的时间尺度上抑制剂分离和结合不会显著发生的足够短的时间)之后尿黑酸盐形成的HPLC/UV定量进行立即测定(如上所述)。另外的实例的方法描述于PCT专利申请公开号WO 02/46387中。
从交换速率研究得到多个解离速率(以下方案中的k1)，其中测试抑制剂(I)或它的交换配偶体(J)被放射性标记并且根据以下方案进行数据拟合。如在Hawkes et al.(2001)Proc.Bright.Crop.Prot.Conf.Weeds,2:563-568中注释的，HPPD制品典型地显示出包含抑制剂结合位点的15％-30％的更快的交换(较弱的结合)部分。这可以是该酶的一种轻度损害的形式(它保持催化活性并且可以具有较高的底物Km)，并且除了其中解离速率是这样快以致使得快和慢交换部分无法区别之外，解离速率通常是指显著较慢交换部分的行为，即代表HPPD抑制剂结合位点整体的70％-85％存在于被测试的提取物中。
例如通过将约200皮摩尔的HPPD结合位点(如上所述在一个用结构A进行的3分钟反应中通过活性位点滴定来确定)预孵育在pH 7.0并且在25°C的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma,St.Louis,MO)的包含25°C的约1.0纳摩尔14C抑制剂的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂(总测定体积为1.3ml)中来确定解离速率。30分钟之后，通过在充分混合下加入100μl1mM‘冷的’结构A来起始交换反应，并且立即抽取150μl并且加载到一个NAP5柱上，通过快速(<2分钟)色谱向下进入NAP5 G25Sephadex柱子(英国白金汉郡GE Healthcare公司)将该蛋白被交换进入pH 7.0的包含0.1M KCl的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中，并且使用一台Tri-Carb 2900TR闪烁计数器(Perkin Elmer，Wellesley,MA)对结合到蛋白质上的14C的量以Optiphase闪烁体进行测量。在经过根据需要的数分钟或数小时的不同时间处以相同方式移开并且测量另外的等分部分从而确定交换动力学。
在有用于更好地区别相对快的(例如当在25°C下t1/2<15分钟时)这些解离速率的方法的一个变体中，该实验的温度从25°C降低到冰温。在这种情况下，通过将约200皮摩尔的HPPD预孵育在25°C的总测定体积为1.3ml的包含约1.0纳摩尔14C抑制剂的反应缓冲液中(50mM BTP pH 7、25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶、以及10％甘油)来确定解离速率。30分钟之后，将反应器转移到冰上。在冰温下持续另外的10分钟之后，通过在充分混合下加入100μl 1mM结构A来启动该交换反应，并且抽出150μl并且在冷室中在约5°C至8°C下加载到NAP5柱子上，从而在冰温下在从交换开始的不同时间对保持结合在该蛋白质上的放射性标记的量进行定量。
可以间接地测量HPPD抑制剂的解离速率(k1)，这些抑制剂不是放射性标记可获得的或存在其他测量问题(例如高水平的背景非特异性蛋白结合，这可能被测量为放射性标记结合，这种结合保持高浓度的‘冷’抑制剂的存在)。在这种情况下，首先与未标记的抑制剂一起形成酶复合物(约0.1至0.2μM),然后通过用一种高浓度的14C-标记的结构A赶走(chase off)它并且监测在该标记结合到蛋白质时的速率而得到交换动力学。结构A是一种具有已知动力学特性的特别有效的抑制剂，并且在20倍或更高的过量下在>95％的平衡时将占据与在此所测试的其他抑制剂以及实际上的大多数其他抑制剂处于交换竞争的结合位点，(本领域普通技术人员当然可以设计该实验/相对浓度并且因此拟合这些数据)。示例性的方法还被描述于PCT专利申请公开号WO 02/46387中。
针对以下化合物，对于燕麦属衍生的HPPD SEQ ID NO:11得到了示例性的结合和解离速率数据(以及衍生的Ki值)。
结构A(14C 1.81GBq/mmol)
解离速率(k1=1.67E-05s-1)。25°C，直接放射化学法。
结合速率(k2=8.50E+04M-1s-1)。25°C，直接放射化学法。
Kd=1.96E-10M。
Kd/Km比率=0.000036。
结构B(14C 1.81GBq/mmol)
在25°C下解离速率k1(av)=8.1E-04s-1(单独的实验产生k1=8.00E-04,8.88E-04,7.50E-04以及8.00E-04，如通过直接放射化学法所确定的)。在冰温下通过直接放射化学法测量的k1=1.21E-05s-1(单独的实验产生1.16E-05s-1、1.0E-05s-1、1.2E-05s-1、1.5E-05s-1)。
在25°C下结合速率k2(av)=6.7E+04s-1M-1(单独的实验产生k2=6.35E+04、7.50E+04、6.2E+04，如通过直接放射化学法确定的)。对于甲基磺草酮而言(它具有相对快速的解离速率)，基于以活性为基础的方法对于结合速率的估计是更加可变的，在25°C下其范围从4.2E+04s-1M-1、4.9E+04s-1M-1至7.5E+04s-1M-1。
因此从这些放射化学数据中估计Kd为1.16E-08M，相应于Kd/Km比率为0.00217。
结构C(14C 0.774GBq/mmol)
在25°C下解离速率k1(av)=7.04E-05s-1(单独的实验产生k1=7.80E-05、9.17E-05、4.5E-05、6E-05、7E-05以及7.80E-05，如通过间接放射化学法所估计的)。
在25°C下如通过直接放射化学法所估计的结合速率k2=7.50E+03s-1M-1与在25°C下来自基于酶活性的方法的估计值7.50E+03s-1M-1、7.80E+03s-1M-1、7.60E+03s-1M-1、7.20E+03s-1M-1以及1.0E+04s-1M-1是良好一致的。
基于放射化学法Kd的估计值=9.4E-09M。
因此，Kd/Km比率的估计值=0.0017。
结构D(14C 1.036GBq/mmol)
如使用直接放射化学法所确定的在25°C下解离速率k1=3.96E-05s-1(单独的测量为4.17E-05s-1以及3.75E-05s-1)。
如通过直接放射化学法所确定的在25°C下结合速率k2=3.20E+04M-1s-1。这与来自基于活性的方法的估计值(对于结合速率为3.20E+04M-1s-1以及5.7E+04M-1s-1)很好地一致。
基于放射化学法Kd的估计值=1.23E-9M。
Kd/Km比率的估计值=0.00023。
结构E
如通过间接放射化学法所确定的在25°C下解离速率k1=4.17E-05s-1。(单独的测量为5.50E-05s-1和2.85E-05s-1)。
如通过直接非放射化学法所确定的在25°C下结合速率k2=1.30E+05M-1s-1。
Kd的估计值=3.21E-10M。
Kd/Km比率的估计值=0.000059。
实例2.燕麦属衍生的HPPD SEQ ID NO:12-20的另外的变体克隆、表达以及测定以及对于不同的HPPD除草剂的kcat、KmHPP以及Ki(kon和koff)的值的确定。
将由GeneArt(德国雷根斯堡)合成的编码来自燕麦的相应于SEQ IDNOS:15-26的HPPD多肽的相应于SEQ ID NOS:2-14的DNA序列克隆到pET24a中并且在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，用50μg/ml卡那霉素进行选择(如PCT申请公开号WO 02/46387中所描述)。使细胞生长，制备蛋白提取物，并且如实例1中所描述进行HPPD活性位点滴定以及(kcat、KmHPP、k1、k2以及Ki值的)动力学测量。
在本实例中，使用以下HPPD序列：
通过将序列基序GVQHIA(SEQ ID NO:55的残基1-6)内的Q取代为A，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:15。
通过将序列基序GVQHIA(SEQ ID NO:55的残基1-6)内的Q取代为G，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:16。
通过将序列基序GVQHIA(SEQ ID NO:55的残基1-6)内的Q取代为S，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:17。
通过将序列基序SQIQTY(SEQ ID NO:53的残基1-6)内的I取代为T，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:18。
通过将序列基序SQIQTY(SEQ ID NO:53的残基1-6)内的I取代为A，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:19。
通过将序列基序SQIQTY(SEQ ID NO:53的残基1-6)内的I取代为S，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:20。
通过将序列基序SQIQTY(SEQ ID NO:53的残基1-6)内的I取代为V，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:21。
通过将序列基序SGLNS(SEQ ID NO:43的残基5-9)内的L取代为M，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:22。
通过将序列基序FAEFT(SEQ ID NO:42的残基5-9)内的A取代为W，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:23。
通过将序列基序G(I,V)LVDRD(SEQ ID NO:30)内的L取代为M，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:24。
通过将序列基序G(I,V)LVDR(SEQ ID NO:30的残基1-6)内的L取代为A，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:25。
通过将序列基序G(I,V)LVDR(SEQ ID NO:30的残基1-6)内的L取代为M，并且通过将序列基序SGLNS(SEQ ID NO:43的残基5-9)内的L取代为M，将SEQ ID NO:14改变为HPPD SEQ ID NO:26。
在本实例中对于如表3中所示的不同抑制剂结构针对HPPD得到了kon(k2)、koff(k1)、以及Ki(都在25°C下)的值(通常以放射化学方式确定的)。对于在表3中参考SEQ ID NO:14所给出的值是如上所述的多次实验的平均值。使用其他HPPD的所有这些实验包括使用SEQ ID NO:14作为比较对照的并排测量。在这些实验中，相对于这个并排对照的结合和解离速率的比率是可重现的，甚至在绝对值稍微地改变时。因此对于HPPD SEQ IDNO:15-26，在表3中给出的这些值是根据这些观察的比率对用于HPPD SEQID NO:14的平均对照值而归一化的。
表3.用于HPPD突变体的Kon、koff以及Kd的值的汇总
例如，来自HPPD SEQ ID NO:14的甲基磺草酮(结构B)的解离速率是与来自SEQ ID NO:24(参见图4A至图4C)的解离速率清楚地分开的，其中该拟合度对于koff中小的改变是敏感的。从这些数据可以看到的是，甲基磺草酮从HPPD SEQ ID NO:26解离约是其从HPPD SEQ ID NO:24解离的两倍快，并且甲基磺草酮从HPPD SEQ ID NO:24解离约是其从HPPD SEQ IDNO:14解离的2倍快。通常，从与这些数据的拟合得到的koff的绝对估计值在+/-10％内是可重复的并且通常是更好的。
当解离速率变得相对快(t1/2<10分钟)时，在冰温下进行比较测量从而更精确地确定一个HPPD与另一个之间的差异也是有用的。因此，例如，在冰温下，甲基磺草酮从HPPD SEQ NO:14解离是由1.16E-05s-1的速率常数(koff)决定的(比在25°C下估计的8.1E-04s-1的值慢得多)，而对于SEQ IDNO:22、24以及26而言，在冰温下的相应的甲基磺草酮的解离速率是2.17E-05s-1、2.25E-05s-1以及4.17E-05s-1；这些值与在25°C下的那些处于良好的比例一致(参见表3)。
从表3中的数据得到了许多结论。关于例如结构A、B和C，HPPD SEQ IDNO:15-17的特性表明氨基酸序列GVQHI内的天冬酰胺(Q)的某些取代相对于HPPD SEQ ID NO:14在耐受性方面(较慢的kon值和/或较快的koff值)提供了显著的改进。
关于例如结构A和B，来自HPPD SEQ ID NO:18-21的数据表明氨基酸序列SQIQTY内的异亮氨酸(I)的某些取代相对于HPPD SEQ ID NO:14在耐受性方面(主要经由较慢的kon值)提供了显著的改进。
关于例如结构B和C，来自HPPD SEQ ID NO:22的数据表明氨基酸序列ESGLN内的亮氨酸(L)的某些取代相对于HPPD SEQ ID NO:14在耐受性方面(主要经由较快的koff值)提供了显著的改进。
关于例如结构A，来自HPPD SEQ ID NO:23的数据表明在氨基酸序列EFAEF内的丙氨酸(A)的某些取代相对于HPPD SEQ ID NO:14在耐受性方面(主要经由较快的koff值)提供了显著的改进。
关于例如结构A、结构B、结构C和结构D，来自HPPD SEQ ID NO:24和25的数据表明在氨基酸序列G(I,V)LVDRD内的亮氨酸(L)的某些取代相对于HPPD SEQ ID NO:14在耐受性方面(经由较快的koff值和/或较慢的kon值)提供了显著的改进。
关于例如结构B，来自HPPD SEQ ID NO:26的数据表明在氨基酸序列ESGLN内的亮氨酸(L)的某些取代与在氨基酸序列G(I,V)LVDRD内的亮氨酸(L)的某些取代的组合(并且胜过和高于任一单一改变的效果)相对于HPPD SEQ ID NO:14在耐受性方面(主要经由较快的koff值)仍然进一步提供了显著的改进。
再一次如实例1所述，针对表达于提取物中的本发明的多个HPPD确定了kcat和Km值并且将这些值描述于表4中。
表4.不同HPPD的Km和kcat值
许多HPPD变体具有低的类似于HPPD SEQ ID NO:14的Km值以及相对于不同HPPD除草剂的较高的Ki/Km值，并且因此预期在植物中过表达以提供对于这些除草剂的增强的除草剂抗性。例如，HPPD SEQ ID NO:24对于甲基磺草酮的抗性是HPPD SEQ ID NO:14的两倍，因为与0.0021相比较它展示出Ki/Km比率为0.0047。
此外，将所有这些上述序列以及在相同的氨基酸位置处突变的变体库(它们显示了改变和增强水平的除草剂耐受性)包括在诱变和改组过程中以产生还进一步改组的以及突变的HPPD(作为用于赋予除草剂耐受性的转基因是有用的)是有用的。例如，在表5中披露的突变体对于产生除草剂耐受性HPPD突变体多肽并且对于包括在重组反应中以产生进一步的HPPD是有用的。
表5.在除草剂耐受性HPPD多肽中有用的突变的实例
作为另一个实例，在表6中披露的突变体对于产生除草剂耐受性HPPD突变体多肽并且对于包括在重组反应中以产生进一步的HPPD也是有用的。
表6.在除草剂耐受性HPPD多肽中有用的突变的实例
表7汇总了来自相对于对照(‘无’，表示未突变的HPPD SEQ ID NO:14)表达的范围的HPPD SEQ ID NO:14的突变体的动力学研究的数据。如表4所描述进行实验。‘Sulc’表示磺草酮(sulcotrione)并且‘nd’表示“无数据’。对于V217I、L271I、L271V、V258M和A326R，在25°C下在pH 7.0下并且在底物浓度为120μM HPP下的常规酶活性测定中通过比较类似地制备和表达的HPPD在细胞提取物中的初始速率来估计kcat的相对值。SEQ ID NO:14的V217I、V258M和A326R、M325L和L358M突变体是活性的HPPD酶，这些酶提供一定的对于磺草酮的抗性，并且还可以提供对于B的抗性。K411T提供了显著的对E的抗性，并且特别是因为在对于这种除草剂的Kd方面大于5倍的增加主要包括在解离速率方面(3.5X)而不是在结合速率方面的一个改进。关于D，L358M、M325L以及K411T都提供了改进。对于除草剂耐受性，L271I和L271V显得在kcat方面提供了显著的胜过未突变的酶的优点。
表7.SEQ ID NO:14的不同突变体的相对动力学
应当理解的是，对于在HPPD的高度保守性活性位点区域内并且位于结合的甲基磺草酮的原子的8°A内的氨基酸的大多数取代(根据公开的玉米的和拟南芥属HPPD以及对燕麦HPPD构建的同源模型的X射线晶体数据的解释)导致有缺陷的酶或仅部分具有功能性的酶。通过将数据库中的(活性)HPPD序列进行序列比对，选择了作为易于在一些残基方面的变化而不失去酶活性的约60个SEQ ID NO:14的单突变体或双突变体(基于它们是代表在这些位置处在天然HPPD中所发现的序列变异的某种延伸的变化)。制造这些突变体、使其生长，表达这些HPPD，并且制备提取物并对它们的催化活性以及对甲基磺草酮的抗性(相对于对照，未突变的SEQ ID NO:14)进行了测试。甚至在这些特许的组中，大多数展示出显著损伤的催化活性和/或与对照相比较对磺草酮是显著更敏感的。Y287F和I370V是具有与未突变的酶类似(在20％内)的kcat值以及对磺草酮抗性的中性突变。在包括距离这些结合的抑制剂的原子远至10°A的残基的约70个突变体的另一个组中，另外的这类中性突变(相对于SEQ ID NO:14)是G254S、G254A、E416Q、V258M、V258I、V258A、V258K、S415K、S415Q、I421L、A326S、L269M、L269F、S420A、T372S、Y172V以及I299M。可以任选地将所有这些另外的突变与赋予抗性的突变相结合从而产生本发明的HPPD除草剂抗性酶的催化活性变体。
HPPD SEQ ID NO:14的另一个突变体G408A展示出关于B和C的抑制动力学，表明这个突变体对于这些化合物的抑制是相对抵抗的。抑制的时间过程不是径直的并且不能被拟合到上述动力学模型中。所使用的实验方法类似于上述的通过监测酶活性用于测量抑制剂结合的结合速率。抑制的时间过程描绘于图10A至图10D中。将约75nM的酶与0.15或0.6μM的抑制剂一起孵育持续不同的时间(长达260s)并且然后在加入115μM HPP(并且因此具有约30XKm的[S]也显著减慢了任何进一步的抑制剂结合)之后在150s时间期间内立即进行测定。在该突变体的情况下，出现了初始快速抑制相，该初始快速抑制相随后减慢从而使该酶仅部分被抑制。在对照的情况下酶抑制发展到(或在规定的过程中朝向)完全抑制。尽管注意到在由化合物B进行的对照酶的抑制的情况下并没有完全达到100％。在这种情况下，约8％的残余活性是一种该方法的假象，这是由于化合物B的相对快速解离速率(这允许在用来监测酶与抑制剂之间的反应进展的该150s测定中恢复一些活性)造成的。对于较慢的解离抑制剂(例如Ｃ)这种假象是可以忽略的。随着实验时间的过去并且在0.6μM B下，突变体G408A的抑制呈现出稳定(level off)到约35％的残余活性。可以清楚的是，这不是由于来自G208A的对于B的甚至更快的解离速率(相比于来自对照酶)，因为在冰温下，通过放射化学方法确定的来自G408A的B的解离速率显得与用对照SEQ ID NO:14HPPD所观察到的速率是不能区别的。突变体G408还展示出与SEQ ID NO:14HPPD类似的kcat和kcat/Km。无论何种解释，与对照酶相比较，B和C两者都显出将G408A突变体HPPD抑制到较小的程度。还值得注意的是，G408A活性显得不稳定，因为对照活性在缺乏抑制剂下随着实验的过程而降低。加入抑制剂显得阻止了在活性方面的这种降低，并且在进一步的实验中证实的是，突变体G408A的活性在缺乏抑制剂或底物下是不稳定的但是被抑制剂所稳定、并且在经过延长的测定时间过程中在底物存在下或当被HPPD除草剂部分抑制时显示不低于野生型酶的稳定性。因此，尽管有一些不稳定性，当除草剂存在于突变体G408A表达于其中的这些植物组织中时，突变体G408A独自地或与其他突变相结合下是有用的从而提供有用的除草剂耐受性。
除了酶动力学实验之外，当本发明的HPPD被表达于大肠杆菌中并且经由黑脓素的产生而可视地评定不同HPPD的比较的除草剂抗性时，进一步证实了对HPPD除草剂的增强的耐受性。例如，从一种在大肠杆菌BL21细胞中的pET24载体表达HPPD SEQ ID NO:14以及HPPD SEQ ID NO:24。在不加入IPTG下进行生长，对于培养物而言存在足够的HPPD表达从而由于黑脓素色素的产生而缓慢地变成褐色(这是由于HPPD衍生的尿黑酸盐的自氧化作用而造成的)。使细胞从10％起始接种物转入包含50μg卡那霉素ml-1的0.5ml L-肉汤的45孔板中在15°C下生长48至96小时。典型地在约72小时之后对培养基中黑脓素颜色进行读取(在430nm处)。注意到的是，相比于表达HPPD SEQID NO:14，在表达HPPD SEQ ID NO:24的细胞中，加入12.5ppm甲基磺草酮引起了黑脓素显色的显著成比例的更小的抑制。图5比较了在并排的一式三份的表达HPPD SEQ ID NO:14、18、以及24的大肠杆菌(都生长在同一个板中)生长72小时之后得到的培养基的吸光度。
在培养基中存在和不存在12.5ppm甲基磺草酮下生长的细胞之间，表达HPPD SEQ ID NO:24的展示最高比率的Ki/Km的细胞在颜色方面始终展示出最小的差异。当用20ppm磺草酮替代甲基磺草酮时(数据未显示)看到了相同的情况，表明SEQ ID NO 24提供了对磺草酮以及对甲基磺草酮的增强的耐受性。同样地，根据用25ppm磺草酮进行的黑脓素测定，表达突变体G408A的细胞相对于SEQ ID NO:14也展示出对磺草酮的抗性。
实例3.表达异源HPPD酶的稳定的转基因植物系的制备和测试
在本实例中，从燕麦属HPPD得到的突变体HPPD基因是在SEQ IDNO:1-13(针对烟草优化)中列出的这些序列，或任选地是根据目标作物(例如大豆)优化的密码子(并且合成地制备并从GeneArt(德国雷根斯堡)以商业方式获得)。每个序列被设计成具有5’Nde1和3’BamH1位点以有助于直接克隆。例如，在SEQ ID NO:11、12、或13中列出的这些序列被克隆到适合的二元载体中用于基于农杆菌的植物转化。
在一个具体的实例中，编码HPPD SEQ ID NO:14和HPPD SEQ IDNO:24的基因被克隆到如下所述的相同的表达构建体中并且被转化到烟草中。
如在PCT专利申请公开号WO 02/46387中所述，通过PCR(或从头合成)来编辑HPPD编码核苷酸序列用来包括5’Nco1和3’Kpn1位点(并且用来移开任何这类内部位点)。然后将这个产物连接到pMJB1上。pMJB1是一种pUC19衍生的质粒，该质粒包含植物可操作的双重增强的CaMV35S启动子、TMVΩ增强子、以及NOS转录终止子。得到的质粒的示意性说明示于PCT专利申请公开号WO 98/20144的图2中。使用Hind III/EcoR1(部分Eco R1消化)切除该表达盒(包含双重增强的35S启动子、TMVΩ引导序列、4-HPPD基因以及nos终止子)并且克隆到同样地消化的pBIN 19中并且转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中。使用从该大肠杆菌中回收的DNA来转化根癌农杆菌LBA4404，并且在包含利福平和卡那霉素的培养基上选择转化的细菌。使用本领域中已良好描述的方法或如在此所述使烟草组织经受农杆菌介导的转化。例如，使用包含表达HPPD的二元载体的根癌农杆菌的母板来接种包含100mg/l利福平加上50mg/l卡那霉素的10ml LB(L肉汤)(使用一个单一的菌落)。在28°C下在200rpm摇动下将这种培养物孵育过夜。使用这种整个的过夜培养物来接种50ml体积的包含相同抗生素的LB。再一次，在28°C下在200rpm摇动下将这种培养物培养过夜。通过在3000rpm下离心15分钟使这些农杆菌细胞沉淀，然后再悬浮于包含30g/l蔗糖,pH 5.9MS(Murashige andSkoog)的培养基中至OD(600nM)=0.6。将这种悬浮液以25ml等分部分分配到皮氏培养皿中。
克隆地微繁殖的烟草嫩枝培养物被用来切除嫩叶(还没有完全展开)。将中脉和外叶缘移开并且弃去，并且将剩余的叶片切成1平方cm。将这些叶片转移到农杆菌悬浮液中持续20分钟。然后将外植体移开，在无菌滤纸上轻拍以移除过量的悬浮液，然后转移到固体NBM培养基(在pH 5.9下的包含30g/l蔗糖、1mg/l BAP(苯甲酸嘌呤)以及0.1mg/l NAA(萘乙酸)并且用8g/l植物琼脂进行固化的MS培养基)上，使各外植体的背轴面与该培养基相接触。每个皿转化约7个外植体，然后将该皿密封并且在光照培养箱中在25°C下保持16小时光周期持续3天。
然后将这些外植体转移到包含100mg/l卡那霉素加上抗生素的NBM培养基上以进一步阻止农杆菌的生长(具有250mg/l羧苄青霉素的200mg/l特美汀)。然后每2周在这种相同的培养基上进行进一步的传代培养。
当嫩枝开始从愈伤组织叶外植体再生时，将这些移到嫩枝伸长培养基中(MS培养基，30g/l蔗糖、8g/l植物琼脂、100mg/l卡那霉素、200mg/l特美汀、250mg/l羧苄青霉素、pH 5.9)。在2周内这些稳定的转基因植物容易地生根。为了对每个转殖项提供多种植物，以最终允许对每种转基因植物的一种以上的除草剂测试，将所有生根的嫩枝进行微繁殖从而产生3个或更多个生根的克隆。
使用引物(这些引物扩增了该HPPD转基因内的500bp片段)通过PCR对在结合卡那霉素的培养基上正在生根并且显示出旺盛的枝生长的推定的转基因植物进行分析。在未转化的烟草上的这种相同的引物集的评估结论性地显示出这些引物不会扩增来自天然烟草HPPD基因的序列。
将转化的嫩枝分成2或3个克隆并且从卡那霉素抗性愈伤组织进行再生。这些嫩枝在包含卡那霉素的MS琼脂上生根。使存活的生根的外植体再生根从而提供了来自各转殖项的约70-80个卡那霉素抗性的并且PCR阳性的转殖项。
一旦生根，将这些小植株从琼脂转移并且盆栽到具有50％泥炭、具有缓释肥料的50％John Innes Soil No.3的3英寸圆形盆中，有规律地浇水从而在温室中建立8至12天。温室条件是白天约24°C至27°C；夜间18°C至21°C并且大致14小时的光周期。将湿度调节到大约65％并且所使用的光水平是在台式水平(bench level)下高达2000μmol/m2。
因此产生了两个转基因群体，这些群体各自具有约80个烟草植株并且可替代地包含一种对在另外的完全相同的表达盒内的HPPD SEQ ID NO:14或HPPD SEQ ID NO:24进行编码的HPPD基因。使这两个群体生长直至大约2至4叶期并且然后各自被分成两个亚群，一个群体包含来自组织培养物的已经显现出相当大并且更先进的那些小植株，而另一个群体包含较小的植物。因此如同具有较大尺寸植物的两个群体一样，SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:24的小尺寸群体在视觉上看起来类似于彼此可以比较。
然后对两个较小的群体各自以300g/ha的甲基磺草酮进行喷雾并且对两个较大的群体以500g/ha的甲基磺草酮进行喷雾。在水中将与0.2％-0.25％X-77表面活性剂进行混合并且从适当的轨道喷雾器上的喷杆进行喷雾，该喷雾器以2mph移动其中喷嘴距离植物顶部约2英寸。喷雾量是200l/ha。
针对损害对这些植物进行评定并且在处理后13天进行评分(DAT)。所有四个群体都显示对于除草剂处理具有高度抗性但是表达SEQ ID NO:24HPPD的群体比对照SEQ ID NO:14群体更是如此。在喷雾有500g/ha的两个较大尺寸的群体中，38个表达SEQ ID NO:24的形态学正常的PCR阳性植株(一个出现嵌合体)中仅4个(10％)展示出除草剂损害的症状，而总计33个表达SEQ ID NO:14的植株中的9个(27％)展示出损害。在喷雾有300g/ha甲基磺草酮的较小尺寸的群体上看到了很小的损害；与26个表达SEQ ID NO:14的植株中的4个展示出可见的除草剂损害相比较，在此的28个表达SEQ IDNO:24的植株中的2个展示出可见的除草剂损害。
使显示最小损害的转殖项的植物生长至开花，然后用袋子封住(bagged)并且允许自花授精(self)。将来自选择的转殖项的种子收集起来并且再次播种在盆中，并且再次在用于对HPPD除草剂抗性(例如甲基磺草酮)的喷雾测试中对除草剂抗性进行测试。通过它们的3:1分离比率(关于卡那霉素和/或除草剂)并且通过定量RT-PCR来鉴定这些T1植物系中的单一拷贝转殖项。将来自如此选择的T1烟草(Samsun变体)系的种子播种在包含50％泥炭和50％John Innes Soil No.3的3英寸直径的盆中。
实例4.大豆转化载体的构建。
用以下各项来构建用于双子叶植物(大豆)转化的二元载体：启动子(例如包含CaMV 35S的合成启动子)以及FMV转录增强子以及合成的TATA盒，该盒驱动紧接着Nos基因3’终止子的HPPD编码序列(例如SEQ ID NO:24)的表达。基于HPPD基因编码区的预测的氨基酸序列，HPPD基因被密码子优化以用于大豆表达。在这种情况下，HPPD本身并不被用作选择标记，通过加入转化选择标记基因来构建包含HPPD表达盒的农杆菌二元转化载体。例如，二元转化载体17146(SEQ ID NO:33)包含用于HPPD变体(SEQ IDNO:24)的表达盒，该表达盒连接有两个PAT基因盒(具有35S启动子并且具有CMP启动子，并且两个PAT基因都紧接着nos终止子)用于在转化过程期间进行基于草铵膦的选择。另一种二元转化载体(17147)(SEQ ID NO:34)包含HPPD变体(SEQ ID NO:24)表达盒并且还有EPSPS选择标记盒。将载体17147转化到大豆中，并且在不成熟种子目标物的农杆菌介导的转化之后使用草甘磷选择得到转基因植物。类似地，构建了二元载体15764(SEQ IDNO:35)以包括用来表达HPPD(SEQ ID NO:14)连同bar选择标记基因一起的表达盒，并且构建了二元载体17149(SEQ ID NO:36)以包括表达HPPD变体(SEQ ID NO:26)连同两个PAT基因盒一起的表达盒。在所有情况下，这些HPPD基因的编码DNA序列被密码子优化以用于在大豆中表达。
使用本领域的普通技术人员所熟知的方法(如重叠PCR、DNA合成、限制性片段亚克隆以及连接)的组合来构建上述二元载体。它们的独特结构在图6(载体17146)、图7(载体17147)、图8(载体15764)、以及图9(载体17149)中，并且在序列表(SEQ ID NO:33-36)中变得清楚。关于图6至图9中所示的这些载体的另外的信息提供如下：
在图6(载体17146)中所使用的缩写被定义如下：
cAvHPPD-04
起点：1024终点：2343
编码SEQ ID NO 24的大豆密码子优化的Oat HPPD基因
cPAT-03-01
起点：3209终点：3760
PAT HoeschtAO2774合成的产绿色链霉菌，植物密码子；与Q57146膦丝菌素乙酰转移酶蛋白相同。
cPAT-03-02
起点：5062终点：5613
PAT Q57146产绿色链霉菌膦丝菌素乙酰转移酶蛋白，cPAT-03-01DNA，具有突变的BamH1、Bgl2位点。
cSpec-03
起点：6346终点：7134
也被称为aadA；编码酶氨基糖苷3′腺苷酰转移酶的基因，赋予了对壮观霉素和链霉素的抗性用来将载体保持在大肠杆菌和农杆菌akacSPEC-03中。
cVirG-01
起点：7434终点：8159
来自pAD1289的virG(推定的)(具有TTG起始密码子)。virGN54D来自Hansen et al.1994,PNAS 91:7603-7607中所描述的pAD1289。
cRepA-01
起点：8189终点：9262
RepA，pVS1复制蛋白。
eNOS-01
起点：168终点：259
来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)
eFMV-03
起点：396终点：589
来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区
e35S-05
起点：596终点：888
在花椰菜花叶病毒35S增强子区中的C至T以及C至A的碱基对变化。
eTMV-02
起点：953终点：1020
被考虑用来增强表达的TMV Ω5′UTR引导序列。EMBL:TOTMV6
eFMV-03
起点：4054终点：4247
来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区
e35S-05
起点：4254终点：4546
在花椰菜花叶病毒35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化。
eNOS-01
起点：4557终点：4648
来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)
bNRB-05
起点：4终点：259(互补序列)
右边缘/NOS T-DNA区；可以影响多个启动子。EMBL号:J01826,V00087,AF485783。
bNRB-01-01
起点：101终点：125(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的右边缘重复序列
bNLB-03
起点：5937终点：6066(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的左边缘区
bNRB-01-01
起点：5972终点：5996(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的25bp左边缘重复序列区
prCMP-04
起点：4655终点：5051
夜香树黄叶卷曲病毒启动子以及引导序列(起始aagggagc?)，genbank AF364175.US20040086447，prCMP-01在5′端上具有1个碱基对平截并且在3′端上具有2个碱基对平截。
pr35S-04-01
起点：2664终点：3184
来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，EMBL:CAMVG2
起点：9305终点：9709
来自假单胞菌的质粒pVS1的复制起始和分隔区(Itoh et al.1984,Plasmid 11:206-220)；类似于GenBank登录号U10487；在根癌农杆菌宿主中用作复制起始区。
oCOLE-06
起点：10387终点：11193(互补序列)
从pUC19得到的在大肠杆菌中起作用的ColE1复制起始区
tNOS-05-01
起点：2360终点：2612
合成胭脂碱合成酶终止子
tNOS-05-01
起点：3794终点：4046
合成胭脂碱合成酶终止子
tNOS-05-01
起点：5642终点：5894
合成胭脂碱合成酶终止子
在图7(载体17147)中所使用的缩写被定义如下：
cAvHPPD-04
起点：1024终点：2343
编码SEQ ID NO 24的大豆密码子优化的Oat HPPD基因
cGmEPSPS-01
起点：3672终点：5249
双重突变型大豆EPSPS cDNA的大豆密码子优化形式
cSpec-03
起点：5982终点：6770
也被称为aadA；编码酶氨基糖苷3′腺苷酰转移酶的基因，赋予了对壮观霉素和链霉素的抗性用来将载体保持在大肠杆菌和农杆菌akacSPEC-03中。
cVirG-01
起点：7070终点：7795
来自pAD1289的virG(推定的)(具有TTG起始密码子)。virGN54D来自Hansen et al.1994,PNAS 91:7603-7607中所描述的pAD1289。
cRepA-01
起点：7825终点：8898
RepA，pVS1复制蛋白。
起始位置说明：
eNOS-01
起点：168终点：259
来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)
eFMV-03
起点：396终点：589
来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区
e35S-05
起点：596终点：888
在花椰菜花叶病毒35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化。
eTMV-02
起点：953终点：1020
被考虑用来增强表达的TMV Ω5′UTR引导序列。EMBL:TOTMV6
eFMV-03
起点：2664终点：2857
来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区
e35S-05
起点：2864终点：3156
在花椰菜花叶病毒35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化。
eNOS-01
起点：3167终点：3258
来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)
bNRB-05
起点：4终点：259(互补序列)
右边缘/NOS T-DNA区；可以影响多个启动子。EMBL no:J01826,V00087,AF485783。
bNRB-01-01
起点：101终点：125(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的右边缘重复序列
bNLB-03
起点：5573终点：5702(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的左边缘区
bNLB-01-01
起点：5608终点：5632(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的25bp左边缘重复序列区
prCMP-04
起点：3265终点：3661
夜香树黄叶卷曲病毒启动子以及引导序列(起始aagggagc?)，genbank AF364175.US20040086447，prCMP-01在5′端上具有1个碱基对平截并且在3′端上具有2个碱基对平截。
起始位置说明：
oVS1-02
起点：8941终点：9345
来自假单胞菌的质粒pVS1的复制起始和分隔区(Itoh et al.1984,Plasmid 11:206-220)；类似于GenBank登录号U10487；在根癌农杆菌宿主中用作复制起始区。
oCOLE-06
起点：10023终点：10829(互补序列)
从pUC19得到的在大肠杆菌中起作用的ColE1复制起始区
tNOS-05-01
起点：2360终点：2612
合成胭脂碱合成酶终止子
tNOS-05-01
起点：5278终点：5530
合成胭脂碱合成酶终止子
在图8(载体15764)中所使用的缩写被定义如下：
cAvHPPD-03
起点：450终点：1769(互补序列)
编码SEQ ID NO 14的大豆密码子优化的Oat HPPD基因
cPATBAR-07
起点：3034终点：3585
BAR X17220S.hygroscopicus基因(突变的Bgl2位点)，caa35093膦丝菌素乙酰转移酶蛋白
cSpec-03
起点：4334终点：5122
链霉素腺苷转移酶；来自Tn7(aadA)
cVirG-01
起点：5422终点：6147
来自根癌农杆菌的毒力G基因(virGN54D，包含TTG起始密码子)，virGN54D来自Hansen et al.1994,PNAS 91:7603-7607中所描述的pAD1289。
cRepA-03
起点：6177终点：7250
在nt735处具有A变成G的RepA，pVS1复制蛋白。
eTMV-02
起点：1773终点：1840(互补序列)
被考虑用来增强表达的烟草花叶病毒(TMV Ω5′UTR引导序列)。EMBL:TOTMV6
e35S-05
起点：1905终点：2197(互补序列)
具有C变成T以及C变成A的碱基对变化的花椰菜花叶病毒35S增强子区。
eFMV-03
起点：2204终点：2397(互补序列)
玄参花叶病毒(FMV)增强子
bNRB-04
起点：5终点：144(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的右边缘区。
在5′端与bNRB-03有20bp的不同。
bNRB-01-01
起点：102终点：126(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的右边缘重复序列。
bNLB-03
起点：3925终点：4054(互补序列)
来自根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的左边缘区。(Zambryski et al.1980,Science,209:1385-1391)EMBL no:J01825.
bNLB-01-01
起点：3960终点：3984(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的25bp左边缘区。
pr35S-04-01
起点：2494终点：3014
35S启动子；绘图最初定义的启动子为641bp长；与文献中(LF July2004)中发现的不完全匹配。
oVS1-02
起点：7293终点：7697
来自假单胞菌的质粒pVS1的复制起始和分隔区(Itoh et al.1984,Plasmid 11:206-220)；类似于GenBank登录号U10487；在根癌农杆菌宿主中用作复制起始区。
oCOLE-06
起点：8375终点：9181(互补序列)
在大肠杆菌中起作用的ColE1复制起始区。
tNOS-05-01
起点：181终点：433(互补序列)
NOS终止子：胭脂碱合成酶基因的3′UTR。
tNOS-05-01
起点：3619终点：3871
NOS终止子：胭脂碱合成酶基因的3′UTR。
在图9(载体17149)中所使用的缩写被定义如下：
cAvHPPD-05
起点：1024终点：2343
编码SEQ ID NO 26的大豆密码子优化的序列
cPAT-03-01
起点：3209终点：3760
PAT Hoescht AO2774合成的产绿色链霉菌(S.viridochromogenes)，植物密码子；与Q57146膦丝菌素乙酰转移酶蛋白相同。
cPAT-03-02
起点：5062终点：5613
PAT Q57146产绿色链霉菌膦丝菌素乙酰转移酶蛋白，cPAT-03-01DNA，具有突变的BamH1、Bgl2位点。
cSpec-03
起点：6346终点：7134
也被称为aadA；编码酶氨基糖苷3′腺苷酰转移酶的基因，赋予了对壮观霉素和链霉素的抗性用来将载体保持在大肠杆菌和农杆菌akacSPEC-03中。
cVirG-01
起点：7434终点：8159
来自pAD1289的virG(推定的)(具有TTG起始密码子)。virGN54D来自Hansen et al.1994,PNAS 91:7603-7607中所描述的pAD1289。
cRepA-01
起点：8189终点：9262
RepA，pVS1复制蛋白。
起始位置说明
eNOS-01
起点：168终点：259
来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)
eFMV-03
起点：396终点：589
来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区
e35S-05
起点：596终点：888
在花椰菜花叶病毒35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化。
eTMV-02
起点：953终点：1020
被考虑用来增强表达的TMV Ω5′UTR引导序列。EMBL:TOTMV6
eFMV-03
起点：4054终点：4247
来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区
e35S-05
起点：4254终点：4546
eNOS-01
起点：4557终点：4648
来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)
bNRB-05
起点：4终点：259(互补序列)
右边缘/NOST-DNA区；可以影响多个启动子。EMBL no:J01826,V00087,AF485783。
bNRB-01-01
起点：101终点：125(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的右边缘重复序列
bNLB-03
起点：5937终点：6066(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的左边缘区
bNLB-01-01
起点：5972终点：5996(互补序列)
根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的25bp左边缘重复序列区
prCMP-04
起点：4655终点：5051
夜香树黄叶卷曲病毒启动子以及引导序列(起始aagggagc?)，genbankAF364175.US20040086447。prCMP-01在5′端上具有1个碱基对平截并且在3′端上具有2个碱基对平截。
pr35S-04-01
起点：2664终点：3184
来自CaMV的35S启动子，EMBL:CAMVG2(与该EMBL记录100％匹配)
oVS1-02
起点：9305终点：9709
来自假单胞菌的质粒pVS 1的复制起始区和分隔区(Itoh et al.1984,Plasmid 11:206-220)；类似于GenBank登录号U10487；在根癌农杆菌宿主中用作复制起始区。
oCOLE-06
起点：10387终点：11193(互补序列)
从pUC19得到的在大肠杆菌中起作用的ColE1复制起始区
tNOS-05-01
起点：2360终点：2612
合成胭脂碱合成酶终止子
tNOS-05-01
起点：3794终点：4046
合成胭脂碱合成酶终止子
tNOS-05-01
起点：5642终点：5894
合成胭脂碱合成酶终止子
实例5：大豆的转化以及除草剂抗性植物的选择
可以将大豆植物材料适当地转化并且通过本领域的普通技术人员熟知的多种方法再生育性植物。例如，可以通过以下各项得到育性的形态学正常的转基因大豆植物：1)从例如不成熟的子叶、下胚轴或其他适合的组织生产体细胞胚性组织；2)通过粒子轰击或用农杆菌感染来进行转化；以及3)再生出植株。在一个实例中，如在美国专利号5,024,944中所描述的，从大豆的不成熟胚中切除子叶组织，优选地将胚轴移出，并且在包含激素的培养基中进行培养从而形成体细胞胚性植物材料。使用例如直接DNA方法、DNA包被的微弹轰击或用农杆菌感染来将该材料转化，在一种适合的选择培养基上进行培养并且任选地还在选择剂的连续存在下再生成育性转基因大豆植物。选择剂可以是抗生素如卡那霉素、潮霉素或除草剂(如草胺膦或草甘磷)，或可替代地，选择可以是基于可见标记基因(如GUS)的表达。可替代地，用于转化的靶组织包括分生组织而不是体细胞克隆胚性组织或任选地是花或形成花的组织。可以找到大豆转化的其他实例，例如通过物理的DNA递送方法，如粒子轰击(Finer and McMullen (1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182；McCabe et al.(1988)Bio/technology 6:923-926)、噬菌体颈须法(Khalafalla et al.(2006)African J.of Biotechnology 5:1594-1599)、气溶胶束注射(美国专利号7,001,754)、或通过农杆菌介导的递送方法(Hinchee et al.(1988)Bio/Technology 6:915-922、美国专利号7,002,058、美国专利申请公开号20040034889、美国专利申请公开号20080229447、Paz et al.(2006)PlantCell Report 25:206-213)。还可以将HPPD基因递送到细胞器中，例如用来提供增加的除草剂耐受性的质体(美国专利申请公开号20070039075)。
可以用不同的转化方法用上述的包含HPPD基因变体的二元载体(实例4)来产生大豆转基因植物。任选地，该HPPD基因可以提供选择和鉴定转基因组织的手段。例如，如所述(美国专利申请公开号20080229447)使用一种载体来转化不成熟的种子目标物从而直接地用HPPD抑制剂(例如甲基磺草酮)作为选择剂来产生转基因HPPD大豆植物。任选地，HPPD基因可以在其他序列的旁边存在于多核苷酸中，这些其他序列提供选择/鉴定转化的组织的另外的手段，包括例如提供对卡那霉素、潮霉素、草胺膦、氟丙嘧草酯、或草甘膦具有抗性的已知基因。例如，将包含如在实例4中所述的PAT或EPSPS选择标记基因的不同的二元载体转化到不成熟大豆种子目标物中，从而使用如所述的农杆菌介导的转化以及草铵膦或草甘膦选择而产生HPPD除草剂抗性植物(美国专利申请公开号20080229447)。
可替代地，选择标记序列可以存在于分开的多核苷酸上或使用例如一种共转化或共选择的方法。可替代地，除了选择标记基因之外，可以使用一种可评分的标记基因(例如GUS)来鉴定转化的组织。
如所述可以使用一种用于大豆转化的基于农杆菌的方法使用草铵膦、草甘膦或HPPD抑制剂甲基磺草酮作为选择剂使用不成熟的大豆种子来产生转基因植物(美国专利申请公开号20080229447)。
实例6：大豆转基因植物的生长、分析以及除草剂耐受性的评估
将来自组织培养物的T0植物放到温室中，在温室中将它们移植到在2”方形盆中的混合有1％颗粒性(宾夕法尼亚州Mainland市奥林匹克园艺制品公司)(5-10g/gal土壤)的水饱和的土壤(华盛顿州贝尔维尤市Sun Gro Horticulture公司Plug and Seedling Mix或FafardGerminating Mix)中。将这些植物用潮湿拱顶进行覆盖并且置于具有以下环境条件的一个Conviron室(北达科他州彭比纳)中：白天24°C；夜间20°C；16至23小时光照以及1至8小时黑暗光周期；80％相对湿度。
在植物已经被建立在土壤中并且出现新的生长(约1至2周)之后，将植物取样并且使用适当的用于HPPD基因的探针、或启动子(例如prCMP)通过分析对所希望的转基因的存在进行测试。将阳性植物移植到包含Fafard#3土壤的4”方形盆中。以推荐的比率将Sierra 17-6-12缓释肥料掺入土壤中。然后将这些植物重新安置在一个标准温室中以与适应环境(约1周)。这些环境条件是：白天27°C；夜间21°C；14小时光周期(具有补充光照)；环境湿度。在适应环境之后(约1周)，对这些植物取样并且详细测试插入的转基因的存在和拷贝数量。将这些转基因大豆植物生长至成熟用于T1种子生产。T1植物长大，并且在分析之后，使纯合植物生长用于种子生产。使用转基因种子和子代植物来进一步对它们的除草剂耐受性性能以及分子特征进行评估。
使来自用载体15764(图8)制成的2个转殖项以及用载体17147(图7)制成的多个转殖项(它们对应地表达SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:24，来自相同的HPPD表达盒)的纯合大豆植物生长并且对一定范围的HPPD除草剂的耐受性进行测试。表8汇总了来自在V2生长阶段进行喷雾的植物的这些测试的结果每个数据点代表来自n=7次重复的平均损害值。
表8.对抗载体15764以及17147大豆转殖项的除草剂喷雾测试的结果
转殖项1对于甲基磺草酮是最耐受的，并且转殖项2是选自约90个的群体的第二最耐受的15764转殖项。使用这些转殖项来比较五个17147转殖项的性能。没有将这些中的四个(SF、S8、S7以及S3)对于耐受性水平进行预先选择(而不是证实抗性、非嵌合体性质以及该基因的存在)同时其余的转殖项T0已经被预先选择为在预备的田间试验中的五个17147转殖项中最具抗性的。
植物在4X4X4英寸塑料盆中并且在18°C的最小夜间温度以及27°C的最高白天温度下在15/9小时光照方案(在温室中通过人造光补充日光)下生长。土壤是常规的VBRC混合物(Vero大田土壤和Fafard混合物II的1:1混合物)，其中Vero大田土壤是98％砂和2％粘土。用化合物 用化合物C(200g ai/L)EC、用IFT=Balance Pro 4SC(480gai/L)、并且用化合物E=Laudis 3.5SC(420g ai/L)，包括处于比率当量为8.5lbs/加仑下的0.25％v/v INDUCE(一种非离子型表面活性剂)和硫酸铵(N-PAK液体AMS)进行处理。喷雾体积为150L/ha并且损害评分反映了在14DAT的评估。
令人惊奇的是，来自这样小集合的所有五个测试的17147个转殖项都提供了对甲基磺草酮以及对异恶唑草酮的耐受性(等同于最好的15764转殖项之一(转殖项2))，并且实际上它们中的两个(T0和S7)超过了从多个转殖项中选出的最具抗性的15764转殖项(转殖项1)的性能。
该体外数据，并且特别是解离速率数据，显示就B和IFT而言SEQ IDNO:24优于SEQ ID NO:142和2.3倍，但是就C和E而言是中性的。据此的事实是，表达SEQ ID NO:24HPPD的植物展示出同样地改变的除草剂耐受性模式。因此，例如，转殖项SF和S8展示出与6W相比对于IFT和B两者类似的或更好的耐受性，但是与6W不同，基本上对于化合物E或C之一无耐受性。类似地，只有展示出接近于转殖项4R的对Ｅ和Ｃ的耐受性的17147转殖项(T0和S7)也展示出与4R相比对于B以及IFT更优越的耐受性。这些体外数据具有在植物中的预测值并且SEQ ID NO:24提供了对甲基磺草酮以及IFT的改进的耐受性但是对于例如tembotrione不是如此。
本说明书中提到的所有公开文献以及专利申请都指示了本发明涉及的本领域内的普遍技术人员的水平。所有公开文献和专利申请均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开文献或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而结合。
尽管为了清楚理解的目的已经通过解释和实例详细地描述了以上发明，在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和变更。

Claims (17)

1.由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的修饰序列组成的多肽，其中所述修饰为相应于选自下述组成的组的氨基酸取代的一个或多个氨基酸取代：L358M,A326R,V217I和G408A。
2.编码根据权利要求1所述多肽的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中该核苷酸序列被优化用于在植物中进行表达。
4.表达盒，该表达盒包括可操作地连接到启动子上的如权利要求3所述的多核苷酸，该启动子在植物或植物细胞中驱动表达。
5.如权利要求4所述的表达盒，进一步包括编码多肽的可操作地连接的多核苷酸序列，该多肽赋予希望的性状。
6.如权利要求5所述的表达盒，其中所述希望的性状是对除草剂的抗性或耐受性。
7.如权利要求6所述的表达盒，其中所述希望的性状是对HPPD抑制剂、草甘磷、或草铵膦的抗性或耐受性。
8.如权利要求7所述的表达盒，其中赋予希望的性状的所述多肽是细胞色素P450。
9.如权利要求7所述的表达盒，其中赋予希望性状的所述多肽是EPSPS（5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶）。
10.如权利要求7所述的表达盒，其中赋予希望性状的所述多肽是膦丝菌素乙酰转移酶。
11.载体，该载体包括根据权利要求4-10中任何一项所述的表达盒。
12.如权利要求11所述的载体，其中所述载体包括多核苷酸，该多核苷酸由在SEQ ID NO:33、34、35、或36中列出的序列组成。
13.用于在植物中赋予对HPPD抑制剂的抗性或耐受性的方法，所述方法包括将根据权利要求4-10中任何一项所述的至少一种表达盒引入到所述植物中。
14.制备源于转化的植物细胞的植物的方法，其中该转化的植物细胞包括根据权利要求4-10中任何一项所述的至少一种表达盒。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述植物细胞是水稻、大麦、马铃薯、甘薯、低芥酸菜籽、向日葵、黑麦、燕麦、小麦、玉米（corn）、大豆、糖甜菜(sugar beet)、烟草、芒草(Miscanthus grass)、柳枝稷(Switch grass)、红花、树类、棉花、木薯、番茄、高粱、苜蓿、糖甜菜、以及甘蔗植物细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述植物细胞是大豆植物细胞。
17.控制在场所(locus)的杂草的方法，所述方法包括对所述场所施用杂草控制量的一种或多种HPPD抑制剂，其中所述场所包括植物，所述植物包括根据权利要求14所述的转化的植物细胞和其中所述一种或多种HPPD抑制剂选自下述组成的组：甲基磺草酮(mesotrione)，sulcitrione，异噁唑草酮(isoxaflutole),tembotrione，和bicyclopyrone。
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