DE69034081T2 - Krankheitsresistente transgene Pflanze - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre DNA-Konstrukte, die zur Herstellung transgener krankheitsresistenter Pflanzen und zur genetischen Veränderung von Pflanzen, so dass diese einen krankheitsresistenten Phänotyp erhalten, geeignet sind. Insbesondere betrifft sie die konstitutive Expression von DNA-Sequenzen in transgener Pflanzen, welche für pathogen-bezogene Proteine (PRPs) kodieren. Wildtyppflanzen exprimieren PRPs während der Pathogen-induzierten systemisch erworbenen Resistenz.
  • Durch Fortschritte bei der rekombinanten DNA-Technologie zusammen mit Fortschritten in der Pflanzentransformations- und Regenerierungstechnologie wurde es möglich, neues genetisches Material in Pflanzenzellen, Pflanzen oder Pflanzengewebe einzuführen, und damit neue Züge, z. B. Phänotypen, einzuführen, die den Wert der Pflanze oder des Pflanzengewebes erhöhen. Die vor Kurzem erfolgte Präsentation genmanipulierter Pflanzen, welche gegen Pathogene ( EP 0 240 332 und EP 0 223 452 ) oder Insekten (Vaeck et al., 1987) resistent sind und die Herstellung Herbizid-toleranter Pflanzen (de Block et al., 1987) hebt das Potential für eine Ertragssteigerung hervor. Der Sollbestand reicht von hölzernen Pflanzen wie Bäumen und Sträuchern bis zu Zierpflanzen und Ackerfrüchten.
  • Cutt et al. (1988) J. Cell Biochem., Zusatzband 12c, Abstract Y210, untersucht den pathogenresistenten Zustand transgener Pflanzen, welche mit PR-Proteinkonstrukten transformiert wurden, offenbart jedoch keine Ergebnisse oder Daten zu solche Pflanzen.
  • Die Herstellung transgener, krankheitsresistenter Pflanzen kann nun durch vorliegende Erfindung realisiert werden, welche unter anderem auf chimäre DNA-Konstrukte gerichtet ist, die sich zur Herstellung transgener, krankheitsresistenter Pflanzen eignen. Die chimären DNA-Konstrukte enthalten eine kodierende DNA-Sequenz, welche für ein Pflanzen-PRP kodiert, das normalerweise in einer Wildtyppflanze durch ein Pathogen induziert wird, und für eine Promotor-DNA-Sequenz, die in einer transgenen Pflanze, welche das chimäre DNA-Konstrukt enthält, zur konstitutiven Expression von PRPs oder Antisense-mRNA für PRPs führt.
  • A. PATHOGENESE-BEZOGENE PROTEINE: SYSTEMISCH ERWORBENE RESISTENZ (SAR).
  • Sogenannte Pathogenese-bezogene Proteine (PRPs) sind pflanzliche Proteine, die nach der Infektion mit einem Pathogen induziert werden. Man nimmt an, dass diese Proteine daran beteiligt sind, der Pflanze eine systemisch erworbene Resistenz zu verleihen. Diese pflanzlichen Proteine werden in großer Anzahl als Antwort auf eine Infektion durch verschiedene Pathogene, einschließlich Viren, Bakterien und Pilze, induziert. PRPs wurden zunächst in Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum), die überempfindlich auf die Infektion mit dem Tabak-Mosaik-Virus (TMV) reagieren, entdeckt. Anschließend wurden PRPs in vielen Pflanzensorten gefunden (zur Übersicht siehe Redolfi, 1983; van Loon, 1985) und man nimmt an, dass sie eine übliche Abwehrantwort von Pflanzen auf Infektionen mit Pathogene sind.
  • Wie hier verwendet stehen PRPs für Proteine, welche in auf Pathogene überempfindlich reagierenden Pflanzen exprmiert werden. Dieser Begriff umfasst SAR.2a- und SAR8.2b-Proteine, die sauren und basischen Formen der Tabak-PR-1a-, PR-1b-, PR-lc-, PR-1'-, PR-2-, PR-N-, PR-O-, PR-O'-, PR-P-, PR-Q-, PR-S-, PR-P-Proteine, die Chitinase, welche ein basisches Gegenstück zu PR-P oder PR-Q ist, sowie die β-1,3-Glucanase (G1ucan-endo-l,3-β-glucosidase, EC 3.2.1.39), dem basischen Gegenstück zu PR-2, PR-N oder PR-O, und der Pathogen-induzierbaren Chitinase aus Gurke, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Eine überempfindliche Reaktion ist durch eine lokale Nekrose des Gewebes direkt um die Pathogen-Infektionsstelle herum und eine anschließende örtliche Begrenzung des Pathogens gekennzeichnet. Sie unterscheidet sich von einer empfindlichen Reaktion, bei der sich das Pathogen in der Pflanze ausbreitet. Pathogene sind beispielsweise Viren oder Viroide, z. B. Tabak- oder Gurken-Mosaik-Virus, Ringfleckenvirus oder Nekrosevirus, Pelargonienblattkräusel-Virus, Rotklee-Flecken-Virus, Tomatenzwergbusch-Virus und ähnliche Viren, Pilze, z. B. Phytopthora parasitica oder Peronospora tabacina, Bakterien, z. B. Pseudomonas syringae oder Pseudomonas tabaci, oder Blattläuse, z. B. Myzus persicae. Diese Liste ist in keiner Weise beschränkend.
  • B. GESAMTÜBERSICHT ZUR PFLANZENTRANSFORMATIONSTECHNOLOGIE
  • Auf dem Gebiet kennt man verschiedene Verfahren zur genetischen Transformation von Pflanzen und Pflanzengewebe (d. h. zum stabilen Einführen von fremder DNA in Pflanzen). Diese umfassen die Transformation durch Agrobacterium-Arten und die Transformation durch den direkten Gentransfer.
  • 1. Agrobacterium-verimttelte Transformationen
  • Agrobacterium tumefaciens ist die Ursache der Wurzelhalsgalle, einer Krankheit zahlreicher Dikotyledonen und Gymonspermen, die zur Bildung von Tumoren oder Gallen am Infektionsort im Pflanzengewebe führt. Agrobacterium, welches normalerweise die Pflanze an offenen Stellen infiziert, trägt ein großes extrachromosomales Element, das als Ti(Tumor-induzierendes)-Plasmid bezeichnet wird.
  • Ti-Plasmide enthalten zwei für die Tumorogenizität benötigte Bereiche. Ein Bereich ist die T-DNA (transferierte DNA), und zwar die DNA-Sequenz ist, die man letztlich als stabil in die genomische pflanzliche DNA transferiert vorfindet. Der andere Bereich, der für die Tumorbildung benötigt wird, ist der vir (Virulenz) -Bereich, der mit dem Übertragungsmechanismus in Verbindung steht. Obwohl der vir-Bereich unbedingt für die stabile Transformation benötigt wird, wird die vir-DNA tatsächlich nicht in die infizierte Pflanze übertragen. Die Transformation von Pflanzenzellen, die durch die Infektion mit A. tumefaciens vermittelt wird, und die anschließende. Übertragung der T-DNA alleine sind gut beschrieben (Bevan und Chilton, 1982).
  • Nach vielen Jahren intensiver Forschung in vielen Labors wurde das Agrobacteium-System dahin entwickelt, dass es routinemässige Transformationen in eine Vielzahl Pflanzengewebe ermöglicht. Beispiele von Geweben, die auf diese Weise transformiert wurden, umfassen Tabak, Tomate, Sonnenblume, Baumwolle, Raps, Kartoffel, Sojabohen und Pappel. Während bekannt ist, dass die Auswahl an Wirten für die Ti-Plasmidtransformation mit Hilfe von A. tumefaciens als infizierendes Mittel sehr groß ist, wurde Tabak als Wirt gewählt, weil er leicht zu manipulieren ist.
  • Agrobacterium rhizogenes wurde auch als Vektor für die Pflanzentransformation verwendet. Dieses Bakterium, welches zu einer haarigen Wurzelbildung in vielen Dikotyledonen-Pflanzensorten führt, trägt ein großes extrachromosomales Element, das als Ri-(„root-inducing"; Wurzel-induzierendes) Plasmid bezeichnet wird und in analoger Weise zu dem Ti-Plasmid aus A. tumefaciens wirkt. Die Transformation mit Hilfe von A. rhizogenes hat sich analog zu der von A. tumefaciens entwickelt und wurde beispielsweise erfolgreich zur Transformation von Luzerne, Solairum nigrum L. und Pappel eingesetzt.
  • 2. Direkter Gentransfer
  • Sogenannte direkte Gentransferverfahren wurden entwickelt, um Pflanzen und Pflanzengewebe ohne die Verwendung einer Agrobacterium-Zwischenstufe zu transformieren. Bei der direkten Transformation von Protoplasten kann auf die Aufnahme von exogenem genetischen Material in einen Protoplasten durch Verwenden eines chemischen Mittels oder eines elektrischen Felds gefördert werden. Das exogene Material kann dann in das nukleare Genom integriert werden. Die frühen Studien wurden mit dikotoylem Tabak durchgeführt, wobei gezeigt wurde, dass fremde DNA aufgenommen und auf die Pflanzenabkömmlinge übertragen wurde (Paszkowski et al., 1984; Potrykus et al., 1985).
  • Monokotyle Protoplasten wurden auch mit diesem Verfahren transformiert, beispielsweise Triticum monococcum, Lolium multiflorum (Italienisches Raygrass), Mais und „Black Mexican"-Zuckermais.
  • Alternativ kann exogene DNA durch Mikoinjektion in Zellen oder Protoplasten eingeführt werden. Eine Lösung der Plasmid-DNA wird mechanisch direkt in die Zelle injiziert, wobei gewöhnlich eine fein ausgezogene Glasnadel verwendet wird. Auf diese Weise wurden Luzerne-Protoplasten mit einer Vielzahl Plasmiden transformiert (Reich et al., 1986).
  • Ein in jüngerer Zeit entwickeltes Verfahren zum direkten Gentransfer umfasst den Beschuss der Zellen mit DNA-haltigen Mikroprojektilen (Klein et al., 1987). In diesem Verfahren werden Wolframteilchen, die mit der exogenen DNA beschichtet sind, in Richtung auf die Zielzellen beschleunigt, was in dem berichteten Beispiel (Zwiebel) zu einer wenigstens transienten Expression führte.
  • C. REGENERIERUNG DES TRANSFORMIERTEN PFLANZENGEWEBES
  • Ebenso wie es eine Vielfalt Verfahren zur Transformation von Pflanzengewebe gibt, gibt es eine Vielfalt Verfahren zur Regenerierung von Pflanzen aus Pflanzengewebe. Das jeweilige Verfahren zur Regenerierung hängt von dem ursprünglichen Pflanzengewebe und der jeweiligen Pflanzensorte, die regeneriert werden soll, ab. In den letzten Jahren wurde es möglich viele Pflanzensorten aus Kallusgewebe, das von Pflanzenexplantaten stammte, zu regenerieren. Die Pflanzen, die aus Kallus regeneriert werden können, umfassen monokotyle Pflanzen, wie Mais, Reis, Gerste, Weizen und Roggen, sowie dikotyle Pflanzen, wie Tomate, Sonnenblume, Sojabohne, Baumwolle, Raps und Tabak.
  • Die Regenerierung von Pflanzen aus Gewebe, welches mit A. tumefaciens transformiert wurde, wurde für mehrere Pflanzensorten gezeigt. Diese umfassen Sonnenblume, Tomate, weißen Klee, Raps, Baumwolle, Tabak und Pappel. Die Regenerierung von Luzerne aus Gewebe, welches mit A. rhizogenes transformiert wurde, wurde auch gezeigt. Die Pflanzenregenerierung aus Protoplasten ist eine besonders nützliche Technik (Evans und Bravo, 1983). Läßt sich eine Pflanzensorte aus Protoplasten regenerieren, können direkte Gentransferverfahren verwendet werden und die Transformation ist nicht vom Einsatz von A. tumefaciens ahängig. Die Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten wurde für Reis, Tabak, Raps, Kartoffel, Aubergine, Gurke, Pappel und Mais gezeigt.
  • Verschiedene Pflanzengewebe können zur Transformation mit fremder DNA verwendet werden. Kotyledon-Triebkulturen von Tomate wurden beispielsweise für die durch Agrobacterium vermittelte Transformation und Regenerierung von Pflanzen verwendet ( EP 0 249 432 ). Weitere Beispiele umfassen Brassica-Sorten (WO 87/07299) und hölzerne Pflanzensorten, insbesondere Pappel ( US 4,795,855 ).
  • D. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung ist es transgene Pflanzen bereitzustellen, die in konstitutiver Weise erhöhte Spiegel pflanzlicher PRPs oder dazu im wesentlichen homologer Proteine exprimieren. Eine weitere Aufgabe ist es transgene Pflanzen bereitzustellen, die in konstitutiver Weise solche Proteine exprimieren und einen stärker krankheitsresistenten Phänotyp in Bezug auf die Wildtyppflanzen bereitstellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es transgene Pflanzen bereitzustellen, die in konstitutiver Weise Sense- oder Antisense-mRNA-Stränge von DNA-Sequenzen transkribieren, welche für pflanzliche PRPs kodieren, oder Sense- oder Antisense-mRNA-Stränge von DNA-Sequenzen transkribieren, welche im wesentlichen homolog zu den genomischen oder cDNA-Sequenzen sind, die für pflanzliche PRPs kodieren, so dass derartige transgene Pflanzen einen stärker krankheitsresistenten Phänotyp als die Wildtyppflanzen besitzen.
  • Um diese und weitere Aufgaben zu erfüllen, umfasst die hierin offenbarte Erfindung
    • (a) chimäre DNA-Konstrukte, die geeignet sind zur Herstellung transgener krankheitsresistenter Pflanzen, welche eine erste DNA-Sequenz, die in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer zweiten DNA-Sequenz dient, und eine zweite DNA-Sequenz, welche eine kodierende Sequenz für ein induzierbares pflanzliches PRP oder eine kodierende Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer kodierenden Sequenz eines induzierbaren pflanzlichen PRPs ist, umfasst;
    • (b) Vektoren, die solche chimären DNA-Konstrukte enthalten; und
    • (c) transgene Pflanzen, transgenes Pflanzengewebe, Brutkörper und Samen von transgenen Pflanzen, welche die chimären DNA-Konstrukte zur Erzeugung krankheitsresistenter Pflanzen enthalten.
  • Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung eine chimäre DNA-Sequenz, welche umfasst:
    • (a) eine erste DNA-Sequenz, welche in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer zweiten DNA-Sequenz dient, und
    • (b) eine zweite DNA-Sequenz, welche eine kodierende Sequenz eines induzierbaren pflanzlichen Pathogenese-bezogenen Proteins oder eine kodierende Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer kodierenden Sequenz eines induzierbaren Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins umfasst, wobei die zweite DNA-Sequenz entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung in Bezug auf die erste DNA-Sequenz vorliegt.
  • Bevorzugt ist eine chimäre DNA-Sequenz, worin die erste DNA-Sequenz von heterologem Ursprung in Bezug auf die zweite DNA-Sequenz ist.
  • Besonders bevorzugt ist eine chimäre DNA-Sequenz, wobei die erste DNA-Sequenz den Promotor der kleinen Untereinheit der Tabakribulose-bisphosphatcarboxylase (RUBISCO) oder einen doppelten CaMV 35S-Promotor umfasst.
  • Die zweite DNA-Sequenz der chimären DNA kodiert vorzugsweise für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein, welches aus der Gruppe PR-1A, PR-1B, PR-1C, PR-R-Haupt, PR-R-Neben, PR-P, PR-Q, PR-2-, PR-N, PR-O, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b, Gurkenchitinas/Lysozym, basischer Gurkenperoxidase, basischer Tabakglucanase und basischer Tabakchitinase ausgewählt ist.
  • Auch bevorzugt ist eine chimäre DNA-Sequenz, worin die zweite DNA-Sequenz für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, das aus der Gruppe aus PR-1A, PR-1B, PR-1C, PR-R-Haupt, PR-R-Neben, PR-P, PR-Q, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b, Gurkenchitinase/Lysozym, basischer Tabakglucanase und basischer Tabakchitinase ausgewählt ist.
  • Besonders bevorzugt ist eine chimäre DNA-Sequenz, worin die zweite DNA-Sequenz für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, welches aus der Gruppe aus PR-R-Haupt, PR-R-Neben, PR-P, PR-Q, PR-2, PR-N, PR-O, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b, Gurkenchitinase/Lysozym, basischer Gurkenperoxidase, basischer Tabakglucanase und basischer Tabakchitinase ausgewählt ist.
  • Ferner beschrieben sind rekombinante DNA-Moleküle, welche eine erfindungsgemäße chimäre DNA-Sequenz enthalten. Ein rekombinantes DNA-Molekül ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es ein Vektormolekül ist. Besonders bevorzugt ist ein Vektormolekül, das pCGN1703 enthält.
  • Ein Verfahren zur Herstellung der obigen chimären DNA- Se
    • (a) das Herstellen aus einer geeigneten Quelle, wie beispielsweise einem pflanzlichen RUBISCO-Gen oder einem CaMV-Genom, eine erste DNA-Sequenz, welche in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer zweiten DNA-Sequenz dient;
    • (b) das Herstellen einer DNA-Banke aus mit Pathogen infiziertem oder aus infiziertem und nicht-infiziertem Pflanzengewebe, wobei die DNA-Bank somit induzierte oder sowohl induzierte als auch nicht-induzierte DNA-Populationen enthält, und das Isolieren einer zweiten DNA-Sequenz daraus, welche eine kodierende Sequenz eines induzierbaren Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins oder eine kodierende Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer kodierenden Sequenz eines induzierbaren Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins enthält; und
    • (c) das operative Verknüpfen der ersten DNA-Sequenz aus Schritt (a) mit der zweiten DNA-Sequenz aus Schritt (b), so dass die erste DNA-Sequenz als Promotor für die Transkription der zweiten DNA-Sequenz wirkt, wobei auf dem Gebiet bekannte Verfahren eingesetzt werden.
  • Das Verknüpfen der ersten und der zweiten DNA-Sequenz erfolgt vorzugsweise derart, dass die zweite DNA-Sequenz entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung in Bezug auf die erste DNA-Sequenz vorliegt.
  • Auch von der vorliegenden Erfindung umfasst sind Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenbrutkörper oder Pflanzensamen, die eine der oben beschriebenen chimären DNA-Sequenzen enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung.
  • Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine transgene Pflanze, die konstitutiv erhöhte Spiegel Pflanzenpathogenese-bezogener Proteine bereitstellt, welche zu einem krankheitsresistenten Phänotyp führen.
  • Weiter bevorzugt ist eine transgene Pflanze, welche in konstitutiver Weise Sense- oder Antisense-Stränge von DNA-Sequenzen transkribiert, welche für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodieren, das einen krankheitsresistenten Phänotyp bereitstellt.
  • Besonders bevorzugt sind Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzenbrutkörper oder Pflanzensamen mit einer chimären DNA-Sequenz, die eine erste DNA-Sequenz, welche den Promotor der kleinen Untereinheit von Tabakribulose-bisphosphatcarboxylase (RUBISCO) enthält, und eine zweite DNA-Sequenz, welche die kodierende Sequenz des PR-1A-Pathogenese-bezogenen Proteins umfasst, enthält, wobei die zweite DNA-Sequenz in Bezug auf die erste DNA-Sequenz derart angeordnet ist, dass die erste DNA-Sequenz als Promotor für die Transkription des Antisense-Strangs der zweiten DNA-Sequenz wirkt.
  • Auch hier umfasst ist ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder von Pflanzengewebe mit dem Potential, eine ganze Pflanze zu regenerieren, die einen krankheitsresistenten Phänotyp zeigt, umfassend das Transformieren der Pflanzenzelle oder des Pflanzengewebes, die oder das in Form einer in vitro-Kultur oder als Teil eines Embryos oder einer ganzen Pflanze vorliegt, mit einer chimären DNA-Sequenz, welche eine erste DNA-Sequenz, die in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer zweiten DNA-Sequenz dient, und eine zweite DNA-Sequenz, die eine kodierende Sequenz eines induzierbaren Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins oder eine kodierende Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer kodierenden Sequenz eines induzierbaren Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins enthält, umfasst, wobei die erste DNA-Sequenz mit der zweiten DNA-Sequenz derart verknüpft ist, dass sie als Promotor für die Transkription der zweiten DNA-Sequenz dient.
  • Die Transformation von Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe kann mit Hilfe hier zuvor beschriebener Transformationsverfahren durchgeführt werden, entweder durch Verwenden einer isolierten Pflanzenzelle oder von isoliertem Pflanzengewebe, das Teil einer Zell- oder Gewebekultur ist, oder einer Pflanzenzelle oder einem Pflanzengewebe, das Teil eines Pflanzenembryos oder einer ganzen Pflanze ist.
  • Weiter bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder von transgenen Pflanzengewebe, worin die zweite DNA-Sequenz entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung in Bezug auf die erste DNA-Sequenz vorliegt.
  • Auch bereitgestellt werden hier neue cDNA-Klone, die für pflanzliche PRPs kodieren. Erfindungsgemäß werden folgende, im wesentlichen reine cDNA-Sequenzen bevorzugt:
    • (1) Eine im wesentlichen reine, für SAR8.2a kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für SAR8.2a kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pCIB/SAR8.2a, ATCC-Hinterlegungsnummer 40584, hinterlegt am 22. März 1989.
    • (2) Eine im wesentlichen reine, für SAR8.2b kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für SAR8.2b kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pCIB/SAR8.2b, ATCC-Hinterlegungsnummer 40585, hinterlegt am 22. März 1989.
    • (3) Eine im wesentlichen reine, für PR-P kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für PR-P kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pBScht28, ATCC-Hinterlegungsnummer 40588, hinterlegt am 24. März 1989.
    • (4) Eine im wesentlichen reine, für PR-2 kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für PR-2 kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pBSGL117, ATCC-Hinterlegungsnummer 40691, hinterlegt am 19. Oktober 1989.
    • (5) Eine im wesentlichen reine, für PR-N kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für PR-N kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pBSGLl48, ATCC-Hinterlegungsnummer 40689, hinterlegt am 19. Oktober 1989.
    • (6) Eine im wesentlichen reine, für PR-O kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für PR-O kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pBSGL134, ATCC-Hinterlegungsnummer 40690, hinterlegt am 19. Oktober 1989.
    • (7) Eine im wesentlichen reine, für PR-2' kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für PR-2' kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pBSGL135, ATCC-Hinterlegungsnummer 40685, hinterlegt am 19. Oktober 1989.
    • (8) Eine im wesentlichen reine, für Gurkenperoxidase kodierende cDNA-Sequenz oder eine DNA-Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu einer für Gurkenperoxidase kodierenden cDNA, jedoch insbesondere das Plasmid pBPER1, ATCC-Hinterlegungsnummer 40686, hinterlegt am 19. Oktober 1989, oder das Plasmid pBPERB24 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 40687, hinterlegt am 19. Oktober 1989.
    • (9) Eine im wesentlichen reine DNA-Sequenz der „Sequenz 6" oder mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu der in „Sequenz 6" gezeigten Sequenz.
    • (10) Eine im wesentlichen reine DNA-Sequenz mit der „Sequenz 9" oder einer wesentlichen Sequenzhomologie zu der in „Sequenz 9" gezeigten Sequenz.
    • (11) Eine im wesentlichen reine DNA-Sequenz mit der „Sequenz 10" oder einer wesentlichen Sequenzhomologie zu der in „Sequenz 10" gezeigten Sequenz.
  • Ferner wird ein neues Verfahren zum differentiellen Screenen und Anreichern von cDNA-Populationen bereitgestellt, umfassend
    • (a) Bereitstellen einzelsträngiger cDNA aus induzierten und nicht-induzierten cDNA-Populationen, wobei die einzelsträngigen cDNAs aus den induzierten und nicht-induzierten Populationen eine entgegengesetzte DNA-Polarität besitzen und die cDNA der nicht-induzierten Population einen Biotin-Affinitätsmarker trägt;
    • (b) Hybridisieren der einzelsträngigen cDNA-Populationen aus Schritt (a) miteinander; und
    • (c) Auftrennen des hybridisierten Gemischs aus Schritt (b) durch Biotin-Avidin-Chromatographie, um einzelsträngige cDNAs aus der induzierten Population, welche nicht an cDNAs aus der nicht-induzierten Population hybridisiert haben, anzureichern.
  • Ferner wird hier ein Verfahren zum Klonieren von cDNAs, welche für krankheitsresistente Proteine kodieren, bereitgestellt, umfassend
    • (a) Bereitstellen von Gewebe, welches mit Hilfe biologischer Induktoren zu einer systemisch erworbenen Resistenz oder einer lokal erworbenen Resistenz induziert wurde, und (b) Isolieren von cDNA-Klonen, die für krankheitsresistente Proteine kodieren. Während man zuvor cDNAs aus RNA hergestellt hatte, die aus Pathogeninfiziertem Material isoliert worden war, ist dies das erste Beispiel für die Herstellung von cDNAs aus RNAs, welche aus nicht-infizierten Pflanzenteilen, bei denen eine Resistenz durch Pathogene induziert worden war, isoliert worden war. Das heißt, das Gewebe ist nicht durch Pathogene infiziert und zeigt eine erworbene Resistenz.
  • Die chimären Gene der nachstehend beschriebenen Beispiele umfassen Pflanzen-cDNA-Sequenzen, die für PRPs kodieren. Die Erfindung betrifft jedoch gleichermaßen geno mische Klone und synthetische homologe Sequenzen, welche für PRPs oder Proteine mit einer wesentlichen Homologie dazu kodieren. Der Umfang der Ansprüche dieser Erfindung ist daher nicht auf die offenbarten spezifischen Ausführungsformen beschränkt.
  • E. BEISPIELE
  • Hinterlegungen beim ATCC
  • Die nachstehenden Hinterlegungen wurden beim ATCC gemäß dem Budapester Vertrag i vorgenommen:
    Figure 00110001
  • Definitionen
  • Für ein klares und einheitliches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich dem Umfang der solchen Begriffen zugesprochen wird, werden nachstehende Definitionen bereitgestellt:
  • Chimäre Sequenz oder chimäres Gen: eine DNA-Sequenz, die wenigstens zwei heterologe Teile enthält, z. B. Teile, die von natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen, die in ihrem natürlich vorliegenden Zustand nicht assoziiert sind, stammen, oder die wenigstens einen Teil enthält, der von synthetischem Ursprung ist und nicht in der Natur vorkommt.
  • Kodierende DNA-Sequenz: eine DNA-Sequenz, die, wenn sie transkribiert und translatiert wird, zu der Bildung eines zellulären Polypeptids führt.
  • Konstitutive Transkription: Transkription einer im wesentlichen bestimmten Menge einer DNA-Sequenz, unabhängig von Umgebungsbedingungen.
  • Gen: ein bestimmter chromosomaler Bereich, der für ein bestimmtes zelluläres Produkt verantwortlich ist.
  • Induktor: Moleküle, die zur Produktion größerer Mengen Makromoleküle führen, und zwar im Vergleich zu den Mengen, die man in Abwesenheit des Induktors findet.
  • Induzierbares Protein: Proteine, deren Produktionsrate durch das Vorliegen von Induktoren im Umfeld erhöht werden kann.
  • Nicht-kodierende DNA-Sequenz: eine nicht-translatierte DNA-Sequenz, die zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt, wenn sie mit einer bestimmten kodierenden DNA-Sequenz assoziiert. Eine Sequenz, die in Assoziation mit einer kodierenden Sequenz nicht-kodierend ist, kann daher beispielsweise kodierend sein, wenn sie mit einer anderen kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz assoziiert ist.
  • Phänotypisches Merkmal: eine sichtbare Eigenschaft, die auf die Expression eines Gens zurückgeht.
  • Pflanzengewebe: jedes Gewebe aus einer Pflanze in Pflanzung oder in Kultur. Dieser Begriff umfasst ganze Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzenorgane, Pflanzensamen, Protoplasten, Kallus, Zellkulturen und jede Pflanzenzellgruppe, die in strukturellen und/oder funktionalen Einheiten organisiert ist, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Verwendung dieses Begriffs in Verbindung mit einer oder ohne eine spezifische Sorte Pflanzengewebe, wie oben aufgeführt oder ansonsten durch diese Definition umfasst, ist nicht so zu verstehen, dass andere Sorten Pflanzengewebe ausgeschlossen sind.
  • Im wesentlichen reine DNA-Sequenz: eine DNA-Sequenz, die in einer wesentlichen reinen Form aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen Quelle isoliert wurde. Eine solche Sequenz kann in einem natürlichen System vorkommen, beispielsweise in Bakterien, Viren oder Pflanzen- oder Tierzellen, oder kann beispielsweise durch synthetische Mittel oder als cDNA-Sequenz bereitgestellt werden. Im wesentlichen reine DNA-Sequenzen werden gewöhnlich in Form eines Vektors, der die beabsichtigte DNA enthält, isoliert. Im wesentlichen rein meint, dass andere DNA-Sequenzen neben der beabsichtigten nur in vernachlässigbaren Mengen vorliegen, beispielsweise unter 5%, unter 1% oder vorzugsweise unter 0,1%. Im wesentlichen reine DNA-Sequenzen und Vektoren, welche diese enthalten, werden üblicherweise in Lösung bereitgestellt, beispielsweise in wässriger, Puffer-haltiger Lösung oder in üblichen Kulturmedien.
  • Wesentliche Sequenzhomologie: wesentliche Sequenzhomologie meint eine nahe strukturelle Verwandtschaft zwischen Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen. Im wesentlichen homologe DNA-Sequenzen können beispielsweise 60% homolog sein, vorzugsweise 80% oder 90% homolog und im wesentlichen homologe Amionsäuresequenzen können üblicherweise 50% homolog sein oder mehr. Die Homologie umfasst auch ein Verhältnis, worin ein oder mehrere Nukleotid- oder Aminosäure-Untersequenzen fehlen oder Untersequenzen mit zusätzlichen Nukleotiden oder Aminosäuren eingefügt sind. Abkürzungen
    bP Basenpaar
    kp Kilobasenpaar
    ATCC American Type Culture Collection, Rockville, MD
    TMV Tabak-Mosaik-Virus
    TNV Tabak-Nekrose-Virus
    HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
    Cvcpm Cerenkov-Zähler pro Minute
    w/v Gewicht/Volumen, es sei denn es ist anders angegeben
    ICF Intrazelluläres Fluid
    PAGE Polyacrylamidelelektrophorese
    PCR Polymerase-katalisierte Kettenreaktion
    PCV gepacktes Zellvolumen: abgesetztes Zellvolumen in einer Pipette
    MW Molekulargewicht
    LGT niedere Gelierungstemperatur
    ATP Adenosintrtriphosphat
    BSA Rinderserumalbumin
    CETAB Hexadecyltimethylammoniumbromid
    2,4-D 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
    DTT Dithiothreitol
    dicamba 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoesäure
    EDTA Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure
    MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
    MU 4-Methyl-umbelliferylglucuronid
    PEG Polyethylenglycol
    icloram 4-Amino-3,5,6-trichlorpicolinsäure
    SDS Natriumdodecylsulfat
    TFA Trifluoressigsäure
    Tris-HCl Tris(hydroxyethyl)methylaminhy drochlorid
    PRP Pathogenese-bezogene Proteine
    CIAP Intestinale Alkalische Phosphatase vom Kalb
    PTH Phenylthiohydantoin
    RUBISCO Ribulose-l,5-bis-phosphat-carboxylase
    NAA α-Naphthalenessigsäure
    BAP 6-Benzylaminopurin
  • Medien und Puffer
  • Enzymreaktionen wurden gemäß den vom Hersteller empfohlenen Verfahren durchgeführt, es sei denn es ist etwas anderes angegeben. Die erfindungsgemäßen chimären Gene und Vektoren wurden durch Verfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, hergestellt. Geeignete Techniken sind beschrieben in Maniatis et al. (1982); Methods in Enzymology, Band 68, 100, 101 und 118 (1979, 1983, 1983 und 1986); sowie Glover (1985). Mediumzusammensetzungen sind in Miller (1972) sowie den zuvor genannten Referenzen beschrieben.
  • SH-0-Medium: Medium nach Schenk und Hildebrandt (1972) ohne Hormone. SH-Medium kann flüssig oder mit 0,8% Agar oder 0,5% GelRite® verfestigt sein. Das Medium wird gewöhnlich durch Hitze in einem Autoklav bei etwa 125°C 15 bis 20 min sterilisiert.
  • SH-30-Medium: SH-0-Medium mit 30 μm Dicamba.
  • SH-45-Medium: SH-0-Medium mit 45 μm Dicamba.
  • OMS-Medium: Medium von Murashige und Skoog (1962). Das Medium kann mit 0,8% Agar oder Agarose oder 0,5% GelRite® verfestigt sein.
  • KM-8p- und N6-Medium: Makroelementea, Mikroelementea und Fe-EDTA waren wie in der Literatur, angegeben: KM-Medium gemäß Kao und Michayluk (1975); N6-Medium gemäß Chu et al. (1975).
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Material
  • Agarose: Die Herstellung und Reinigung von Agarose ist beschrieben von Guiseley und Renn (1975). Agarose ist einer der Bestandteile von Agar. Gewerblich erhältlicher Agar besteht normalerweise aus einem Gemisch aus neutraler Agarose und ionischem Agaropektin mit einer großen Anzahl Seitengruppen. Üblicherweise bleibt eine bestimmte Anzahl Seitengruppen in Takt und bestimmt die physiochemischen Eigenschaften der Agarose, wie die Gelbildung und die Schmelztemperatur. Niederschmelzende Agarose, insbesondere SeaPlaque®-Agarose, ist ein bevorzugtes Verfestigungsmittel.
  • Kaseinhydrolysat: Kaseinhydrolysat – Enzymatisches Hydrolysat aus Rindermilch, Typ 1, Sigma Co., Postfach 14508, St. Louis, MO 63178, USA.
  • Zellulase RS: Cellulase RS, Yakult Honsha Co. Ltd., 1.1.19 Higashi-Shinbashi, Minatoku, Tokyo, 105 Japan.
  • GelRite®: GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories Inc., Fiskerville, R. I. 02823, USA.
  • IBI Random Primer Kit: „Prime Time" random primer kit, International Biotechnologies Ins., Postfach 1565, New Haven, CT 07606, USA.
  • Nalgene® Filter: Nalge Col, Tochtergesellschaft der Sybron Corp. Rochester, N. Y. 14602, USA.
  • Parafilm®: Parafilm® Laborfolie – American Can Co. Greenwich, CT 06830, USA
  • T4 DNA Ligase: New England BioLabs
  • Gene-Screen Plus: DuPont
  • Dialog Electroporator: (DIA-LOG GmbH, D-4000 Düsseldorf 13, Bundesrepublik Deutschland)
  • ABSCHNITT 1. ALLGEMEINE VERFAHREN
  • Diese Gruppe Beispiele beschreibt allgemeine Verfahren, die bei der Durchführung nachstehender ausführlicher Beispiele verwendet wurden.
  • Beispiel 1: Ligation in Agarose
  • Nach dem Restriktionsendonukleaseverdau der DNA und der elektrophoretischen Auftrennung der Fragmente auf einem niederschmelzenden TAE-Agarosegel wurden die Banden, die die geeigneten Fragmente enthielten, ausgeschnitten, in ein Teströhrchen gegeben und auf 65°C erwärmt, um die Agarose zum Schmelzen zu bringen. 2 bis 5 μl wurden zu 15 μl Wasser zugegeben, und man ließ die Lösung 10 Minuten bei 65°C stehen. Diese Lösung wurde auf 37°C abgekühlt und 5 Minuten stehen gelassen, so dass sich die Temperatur angleichen konnte. 2 μl 10 × Ligasepuffer (200 mM Tris, pH 8,0, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP) wurden zusammen mit 1 μl 74 DNA Ligase zugegeben und diese Lösung wurde über Nacht bei 15°C inkubiert, so dass sie sich verfestigte.
  • Beispiel 2: Transformation aus Agarose
  • Die Agarose, welche die geeignete DNA enthielt, wurde durch 10 Minuten Inkubation bei 65°C geschmolzen. 10 μl dieser Lösung wurden zu 30 μl TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA) gegeben, gemischt und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Gefrorene kompetente Zellen (E.coli-Stamm DH5α) wurden zum Auftauen auf nasses Eis gelegt. Die verdünnte DNA-Lösung von oben wurden zu 200 μl Zellen zugegeben und man ließ sie 20 Minuten auf Eis stehen. Die Zellen plus die DNA wurden dann 90 Sekunden bei 41°C Hitze-Schock-behandelt. Die Zellen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. 0,8 ml SOC-Medium (Hanahan, 1983) wurde zugegeben und die Kultur 1 Stunde bei 37°C inkubiert. 100 μl der Kultur wurden auf LB-Platten (Miller, 1972), enthaltend 100 μg/ml Ampicillin (L-amp) ausplattiert und die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Überlebende Kolonien wurden gepickt und auf einer zweiten antibiotischen Platte ausgestrichen und die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Beispiel 3: Markierung-der DNA-Restriktionsfragmente DNA wurde mit den geeigneten Restriktionsenzymen behandelt und die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem LGT-Agarosegel aufgetrennt. Eine Bande, die das gesuchte Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und die DNA wurde durch übliche Verfahren gereinigt. 50 ng des DNA-Fragments wurden mit Hilfe des IBI Random Primer Kits nach den Anweisungen des Herstellers markiert.
  • Beispiel 4: Southern-Blotting der genomischen DNA
  • 3 μg Tabak-DNA wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen und unter den vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen verdaut. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und dann in Gel-Ladepuffer (15% Ficoll, 0,025% Bromphenolblau, 10 mM EDTA, pH 8) wieder suspendiert. Proben wurden auf das Gel aufgetragen und auf einem 0,5%-igen Agarosegel bei 5Vcm-1 elektrophoretisch aufgetrennt, bis der Bromphenolblau-Farbstoff das Ende des Gels erreichte. Danach wurde die DNA mit Hilfe eines alkalischen Transferverfahrens, wie vom Hersteller beschrieben, auf Gene-Screen Plus transferiert. Die Vorhybridisierung, Hybridisierung und das Waschen erfolgten gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die Hybridisierung wurde durch Autoradiographie nachgewiesen.
  • Beispiel 5: Molekulare Adaptoren
  • Ein typischer molekularer Adapter ist die Sequenz
  • Figure 00190001
  • mit der eine PstI-Stelle in eine BamHI-Stelle umgewandelt werden kann. Dieses Molekül wurde auf einem Synthesegerät von Applied Biosystems mit Hilfe der (3-Cyanoethylphosphoramiditchemie hergestellt und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Etwa 2 μg dieses Oligonukleotids wurden gemäß Maniatis et al. (1982, Seite 125) kinasiert. Danach wurde die Oligonukleotidlösung in einem Wasserbad auf 65°C erwärmt und man ließ sie über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen. Ein etwa 10-facher molarer Überschuss dieses annealten Adapters wurde zu der verdauten DNA zusammen mit 10 × Ligasepuffer, T4 DNA-Ligase und einer geeigneten Menge Wasser zugegeben. Eine typische Reaktion bestand aus:
    DNA, die zu adaptieren war: 1–2 μl(~ 1 pmol)
    Adaptor: 1 μl(~ 10 pmol)
    10 × Ligasepuffer : 1 μl
    T4 DNA Ligase : 1 μl
    Wasser : 5–6 μl
  • Diese Lösung wurde 30 Minuten bei 12° bis 15°C inkubiert und 30 Minuten auf 65°C erwärmt, um die Ligase zu inaktivieren. Die Salzkonzentration und das Volumen wurden für den richtigen Restriktionsenzymverdau angepasst und die adaptierte DNA wurde verdaut, so dass „klebrige Enden" entstanden. Nicht-inkorporierte Adaptoren wurden entweder durch Elektrophorese auf einem Agarosegel oder durch sequentielle Isopropanolpräzipitation entfernt.
  • Beispiel 6: Primerverlängerungs-Kartierung
  • A. Synthese und 5'-Endmarkierung der Primer zur Primerverlängerung Nachstehende Primeroligomere wurden mit Hilfe eines Synthesegeräts von Applied Biosystems und mit Hilfe der β-Cyanoethylphosphoramiditchemie hergestellt:
    Figure 00200001
  • Die Oligonukleotide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. 5 pmol jedes Oligonukleotids wurden kinasiert (Maniatis et al., 1982, Seite 125), wobei 200 μCi 32P-ATP (6000 Ci/mmol, 10 μCi/μl) verwendet wurden. Nach der Inkubation bei 37°C für 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch auf 100 μl verdünnt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann dreimal mit 50 μg Träger-RNA präzipitiert. Das Endpräzipitat wurde wieder in 1 × Reverse-Transkriptase-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 mM KCl, 3 mM MgCl2) in einer Konzentration von 2 nM suspendiert. Die spezifische Aktivität des markierten Oligonukleotids wurde als etwa 3 × 106 Cvcpm/pmol bestimmt.
  • B. Gesamt-RNA-Präparation. Gesamt-RNA wurde im wesentlichen wie von Lagrimini et al. (1987) beschrieben hergestellt. Gewebe wurde unter flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stempel zermahlen. Das zermahlene Gewebe wurde zu Mahlpuffer (Lagrimini et al., 1987) zugegeben, wobei 2,5 ml/g Gewebe eingesetzt wurden. Ein gleiches Volumen Phenol wurde dann zugegeben und die Emulsion wurde in einem Brinkman-Polytron homogenisiert. Ein halbes Volumen Chloroform wurde zugegeben und die Emulsion wurde 15 Minuten sanft gemischt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt und die wässrige Phase entfernt. RNA wurde durch Zugabe von Natriumacetat mit einer Endkonzentration 0,3 M und 2,5 Volumen Ethanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation aufgefangen und in 2 ml sterilem Wasser neu suspendiert. Lithiumchlorid wurde mit einer Endkonzentration von 3 M zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation aufgefangen und das Pellet in eiskaltem 80%-igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde getrocknet und wieder in 500 μl sterilem Wasser suspendiert. Die Konzentration dieser Gesamt-RNA-Präparation wurde spektrophotometrisch bestimmt.
  • Alternativ wurde RNA aus Kallus wie oben beschrieben extrahiert, außer dass das Kallusgewebe in 3 mm große Würfel geschnitten wurde und in vorgekühlte Mörser und Stempel gegeben wurde, wo es vor dem Polyfron-Schritt in flüssigen Stickstoff gemahlen wurde.
  • C. Primerverlängerung 50 μg Gesamt-RNA wurden in einem 500-μl-Eppendorfröhrchen lyophilisiert. Die RNA wurde wieder in 30 μl Lösung für radioaktive Sonden suspendiert und 10 Minuten auf 70°C erwärmt. Das Röhrchen wurde langsam auf 37°C abgekühlt und man ließ es über Nacht inkubieren. Ohne dass man das Röhrchen aus dem 37°C warmen Wasserbad entfernte, wurden 2 μl 10 × Reverse-Transkriptase-Puffer (500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 400 mM KCl, 30 mM MgCl2), 1 μl 5 mg/ml BSA, 5 μl 100 mM DTT, 5 μl 10 × dNTPs (10 mM jedes dNTP in H2O), 3 μl H2O, 2 μl RNAse (80 Einheiten) und 2 μl Reverse Transkriptase (400 Einheiten) zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, wurden 5 μl 3 M Natriumacetat, pH 5, und 150 μl absolutes Ethanol zugegeben. Das Röhrchen wurde 30 Minuten bei –20°C gelassen, das Präzipitat durch Zentrifugation aufgefangen, mit 80%igem Ethanol gewaschen und man ließ es an der Luft trocknen. Das Präzipitat wurde wieder in 10 bis 20 μl Auftragsfarbstoff (90% Formamid, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylolcyanol, 1 mM EDTA) suspendiert und die Verlängerungsprodukte wurden auf einem 6%-igen Sequenzierungsgel (Maniatis et al., 1982) aufgetrennt. Die Verlängerungsprodukte wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • ABSCHNITT 2. PROTEINIDENTIFIKATION UND -CHARAKTERISIERUNG
  • Die für diese Beispiele relevanten PRPs wurden isoliert, gereinigt und sequenziert, in manchen Fällen erstmalig und in anderen gemäß den in der Literatur beschriebenen Verfahren, um die Isolierung der entsprechenden cDNAs zu ermöglichen und schließlich die Identitäten dieser cDNAs zu bestätigen.
  • Beispiel 7: Allgemeine Verfahren zur Peptiderzeugung Reinigung und zum automatisierten Sequenzieren A. Reduktion und Alkylierung Gereinigtes, lyophilisiertes Protein wurde in 6 M Guanidin-HCl, enthaltend 1 M Tris-HCl, pH 8,6, 10 mM EDTA, gelöst. DTT wurde mit einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben und 4-Vinylpyridin wurde in einer Endkonzentration von 50 mM zugegeben. Die Probe wurde dann 1,5 Stunden unter Stickstoff inkubiert. Das pyridylethylierte Material wurde auf einer HPLC mit einer Aquapore-Phenlysäule (2,1 × 10 cm, Brownlee) entsalzt. Die Säule wurde mit einem linearen 5 bis 80% Gradienten aus Acetonitril:Isopropanol (1 : 1) in 0,1% TFA eluiert.
  • B. Cyanogenbromid-Spaltung und Entfernung von Pyroglutamat. Die Cyanogenbromid-Spaltung erfolgte in situ gemäß Simpson und Nice (1984). Der Verdau des PR-1-Proteins mit Pyroglutamataminopeptidase (Boehringer Mannheim) erfolgte nach Allen, G. (1981).
  • C. LysC-Verdau. Das Protein wurde mit der Endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim) in 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, 24 Stunden bei Raumtemperatur mit einem Verhältnis von Enzym zu Substrat von 1 : 10 verdaut. Die erhaltenen Peptide wurden mittels HPLC mit einer Aquapore C-8-Säule (1 × 22 cm, Brownlee) isoliert, wobei mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril:Isopropanol (1 : 1 Verhältnis) (0 bis 60%) in 0,1 %TFA eluiert wurde.
  • D. Trypsinverdau. Der Verdau mit Trypsin (Cooper) erfolgte in 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,2, enthaltend 0,1 M Calciumchlorid 5 Stunden bei 37°C, mit einem Verhältnis von Enzym:Substrat von 1 : 100. Die erzeugten Peptide wurden auf HPLC unter den gleichen Bedingungen wie die Lys-C-Peptide oder mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, 24 Stunden bei 37°C mit einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1 : 50 aufgetrennt. Die Peptide wurden mittels HPLC mit Hilfe einer Vydac C-18-Säule (2,1 × 150 mm) mit einem linearen 0 bis 60% Gradienten aus Acetonitril:Isopropanol (1 : 1) in 0,1% TFA isoliert.
  • E. Sequenzierung, Der automatisierte Edman-Abbau erfolgte mit einem Gasphasensequenzierer 470A von Applied Biosystems. PTH-Aminosäuren wurden mit einem 120A PTH Analysegerät von Applied Biosystems identifiziert.
  • Beispiel 8: Reinigung und Sequenz des PR-1a- und PR-1b-Proteins Eine Zuordnung der DNA-Sequenzen der drei cDNA-Klone mit den PR-1a-, -1b- und -1c-Proteinen erfolgte erstmals von Cornelissen, B. J. C. et al. (1986) auf Basis eines Vergleichs der veröffentlichten Proteinsequenzdaten der drei Peptide, die von PR-1a (Lucas et al., 1985) stammten, mit der Primärstruktur der von den cDNA-Klonen abgeleiteten Proteine. Der als PR-1a bezeichnete cDNA-Klon ist jedoch am 5'-Ende trunkiert und kann nur mit zwei der drei Peptide mit einem Mismatch von einem Rest verglichen werden.
  • Die kodierte Aminosäuresequenz, die von der wie in nachstehendem Beispiel hergestellten und analysierten cDNA abgeleitet wurde, und die PR-1a-cDNA-Sequenz von Pfitzner, U. M. et al. (1987) zeigen, wie beschrieben, mit der veröffentlichten Proteinsequenz ein Mismatch am Tryptophanrest. Sie stimmen auch an drei weiteren Positionen der Amino-endständigen Proteinsequenz nicht überein. Diese Anomalie stellt die früheren Nachweise der PR-1-Klone in Frage. Um die Identität unserer cDNA-Klone entweder als PR-1a, PR-lb oder PR-lc zu identifizieren, wurde ein Großteil der Primärstruktur der gereinigten PR-1a- und PR-lb-Proteine und der von diesen Proteinen abstammenden Peptide durch Aminosäuresequenzierung bestimmt. Diese Daten wurden dann mit der von der Nukleotidsequenz der cDNAs abgeleiteten Proteinsequenz verglichen, um festzustellen, welcher der cDNA-Klone welchem Protein entspricht.
  • N. tabacum cv. Xanthi-Pflanzen wurden in einem Glashaus aufgezogen und, als sie acht Wochen alt waren, durch leichtes Einreiben der Blätter mit einer Suspension eines üblichen TMV-Stamms (U1) (0,5 μg/ml) infiziert. Die Blätter wurden sieben Tage nach der Infektion geerntet und die ICF wurde gemäß Parent und Asselin (1984) aus den Blättern ausgewaschen und gewonnen. 250 ml der ICF wurden durch Lyophilisieren auf 50 ml auflconzentriert und auf eine Ultragel ACA54-Säule, die mit Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA äquilibriert worden war, aufgetragen.
  • Die Eluate dieser Säule wurden durch Elektrophorese auf 10%-igen nativen Polyacrylamidgelen untersucht. Fraktionen, die PR-1-Proteine enthielten, wurden vereint, lyophilisiert, in 3 ml Wasser resuspendiert und dann über Nacht gegen Wasser dialysiert. Dieses Präparat wurde weiter durch HPLC-Anionenaustauschchromatographie auf einer TSK-DEAE-5PN-Säule gereinigt. Die Säule wurde mit einem 0 bis 0,6 M NaCl-Gradienten in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA eluiert. Die Fraktionen wurden mittels PAGE analysiert. PR-lb eluierte als erstes von der Säule bei 0,18 M NaCl und PR-1a eluierte bei 0,28 M NaCl. Fraktionen der jeweiligen Proteine wurden vereint, gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.
  • Die Reinheit der PR-1a- und PR-Ib-Proteinpräparate wurde durch Umkehrphasen-HPLC mit einer Aquapore Phenyl-Säule (2,1 × 100 mm, Brownlee) bestätigt, wobei mit einem linearen Gradienten aus Acetonitril:Isopropanol (1 : 1) (5 bis 80%) in 0,1% TFA eluiert wurde.
  • Die Proteinsequenz wurde entweder von dem endblockierten Aminoterminus des intakten Proteins, von den aus der Cyanogenbromid-Spaltung der Proteine stammenden Peptide, von aus dem LysC-Verdau der Proteine stammenden Proteinen oder von aus dem Trypsinverdau des Proteins stammenden Peptiden mit Verfahren, die nachstehend ausführlich beschrieben sind, oder durch andere Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, abgeleitet. Eine Zusammenfassung der Daten aus dieser Analyse ist nachstehend für PR-1a und PR-lb gezeigt.
  • PR-1a
    Figure 00240001
  • PR-1b
    Figure 00240002
  • Beispiel 9 : Reinigung und Sequenz von PR-R-Haupt- und PR-R-Neben
  • N. tabaccum cv. Xanthi-Pflanzen wurden in einem Glashaus aufgezogen und, als sie acht Wochen alt waren, durch leichtes Einreiben der Blätter mit einer, Suspension eines üblichen TMV-Stamms (U1) (0,5 μg/ml) infiziert. Die Blätter wurden sieben Tage nach der Infektion geerntet und die ICF wurde gemäß Parent und Asselin (1984) aus den Blättern ausgewaschen und gewonnen. 250 ml der ICF wurden durch Lyophilisierung auf 50 ml aufkonzentriert und auf eine Ultragel ACA54-Säule, die mit Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Eluate wurden durch Elektrophorese auf 10%-igen Polyacrylamidgelen untersucht.
  • Fraktionen, die das PR-R-Protein und mehrere geringfügigere kontaminierende Proteine enthielten, wurden vereint, lyophilisiert, in 3 ml Wasser neu suspendiert und dann über Nacht gegen Wasser dialysiert. Dieses Präparat wurde weiter durch HPLC-Umkehrphasenchromatographie gereinigt, wobei eine Brownlee Aquapore Phenylsäule (2,1 × 100 mm) verwendet wurde. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 20 bis 80% Acetonitril:Isopropanol (1 : 1) in 0,1% TFA eluiert, wobei eine Fließgeschwindigkeit von 50 μl/min über 80 Minuten verwendet wurde. Es wurde gefunden, dass die hauptsächlich vorkommenden Proteine Isoformen von PR-R waren und diese wurden als PR-R-Haupt, für das vorwiegend vorliegende Protein, das nach 46 Minuten eluierte, und mit PR-R-Neben, für das in geringeren Mengen vorkommende Protein, das nach 47,5 Minuten eluierte, bezeichnet. Die Peaks, die PR-R-Haupt und PR-R-Neben enthielten, wurden aufgefangen und die Proben bis zur Trockenheit eingedampft. Die Proteine wurden dann in 6 M Guanidin-HCl, 1 M Tris-HCl resuspendiert, wie oben beschrieben reduziert und alkyliert und einer wie oben beschriebenen Sequenzierung unterworfen.
  • Eine Zusammenfassung der erhaltenen Daten ist nachstehend gezeigt.
  • Figure 00250001
  • Beispiel 10: Reinigung und Sequenz von PR-P und PR-Q
  • N. tabaccum cv. Xanthi-Pflanzen wurden in einem Glashaus aufgezogen und, als sie acht Wochen alt waren, durch leichtes Einreiben der Blätter mit einer Suspension eines üblichen TMV-Stamms (U1) (0,5 μg/ml) infiziert. Die Blätter wurden sieben Tage nach der Infektion geerntet und die ICF wurde gemäß Parent und Asselin (1984) aus den Blättern ausgewaschen und gewonnen. 250 ml der ICF wurden durch Lyophilisierung auf 50 ml aufkonzentriert und auf eine UltragelACA54-Säule, welche mit Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA äquilibriert worden war, geladen. Die Eluate wurden durch Elektrophorese auf 10%-igen Polyacrylamidgelen analysiert. Fraktionen aus der Ultragel ACA54-Chromatographie, welche PR-O, PR-P, PR-Q und PR-R enthielten, wurden vereint und durch Lyophilisierung aufkonzentriert. Die Proteine wurden weiter durch PAGE gereinigt und anschließend auf eine PVDF-Membran elektrochemisch geblotted (Matsudaira, 1987). Die geblotteten Proteinbanden, welche PR-P und PR-Q enthielten, wurden ausgeschnitten und mit 0,5% PVP-40 in 100 mM Essigsäure gemäß den Angaben im Handbuch Nr. 36, 21. März 1988 von Applied Biosystems behandelt. Die Endblockierung der Proteine wurde durch Pyroglutamataminopeptidase, wie beschrieben, durchgeführt und das Protein wurde aus der PVDF durch automatisierten Edman-Abbau, wie zuvor beschrieben, sequenziert.
  • Die Sequenzen der Aminotermini der PR-P- und PR-Q-Proteine sind nachstehend beschrieben.
  • Um die Proteinsequenz aus den von PR-P und PR-Q abstammenden Peptiden zu erlangen, wurden die Fraktionen der Ultragel-Säule, welche PR-Proteine enthielten, vereint, lyophilisiert, in Wasser gelöst und dann gegen Wasser dialysiert, bevor sie einer Chromatographie auf DEAE-Sephacel unterworfen wurde. die DEAE-Sephacel-Säule wurde mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA äquilibriert und mit einem linearen 0 bis 0,4 M Gradienten Natriumchlorid eluiert. Die Fraktion 6, welche ein Gemisch aus PR-R-Haupt, PR-R-Neben, PR-P, PR-Q, PR-O und mehreren geringfügigeren Kontaminanten enthielt, wurde lyophilisiert und dann wieder in destilliertem Wasser suspendiert.
  • Die Proteine aus der Fraktion 6 wurden weiter mittels HPLC auf einer Umkehrphasen-Phenylsäule gereinigt und mit einem linearen 20 bis 80%-Gradienten aus Acetonitril:Isopropanol (1 : 1) in 0,1% TFA eluiert. PR-P- und PR-Q-Proteine eluierten gemeinsam in einem einzigen Peak, welcher aufgefangen und im Vakuum fast zur Trockene aufkonzentriert, wieder in 10 mM Ammoniumacetat, pH 7,0 suspendiert und auf eine Brownlee Labs AX-300-HPLC-Ionenaustauschsäule (2,1 mm × 10 cm), welche in 10 mM Ammoniumacetat (pH 7,0) äquilibriert worden war, aufgetragen wurde. Die Proteine wurden von dieser Säule mit Hilfe eines linearen Gradienten von 10 bis 250 mM Ammoniumacetat (pH 7,0) eluiert. PR-P und PR-Q eluierten in Form eines einzigen abgesonderten Peaks bei etwa 75 mM bzw. etwa 95 mM Ammoniumacetat.
  • Die Peptide wurden entweder durch Cyanogenbromid-Spaltung, Trypsinverdau oder LysC-Verdau gewonnen und wie in Beispiel 7 beschrieben gereinigt. Die Aminosäuresequenzen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt und sind nachstehend zusammengefasst: PR-P
    Aminoterminus (Q)GIGSIVTNDLFNEML
    CNBR RNDGR?PANGF
    Tryp 46,4 (R/K)GPIQLTNQNNYEK
    Tryp 64,7 (R/K)QDLVNNPDLVATDATI
    Tryp 60,2 (R/K)Y?GMLNVAPGDNLD?YNQ(R/K)
    PR-Q
    Aminoterminus (QGIGSIVT?DLFNEML
    CNBR (M)LKGR?PANGFYTYDAFIA
    Tryp 74,2 (R/K)?PANGFYTYDAF
    Tryp 44,7 (R/K)GPIQLTN(R/K)
    Tryp 38,6 (R/K)WTPSAADQAAN(R/K)
    Tryp 37,5 (R/K)IGYY(R/K)
    Tryp 50,3 (R/K)YCGMLNVAPGENLDCYN
  • Beispiel 11: Proteinreinigung und Sequenz von PR-O'
  • N. tabaccum cv. Xanthi-Pflanzen wurden in einem Glashaus aufgezogen und, als sie acht Wochen alt waren, durch leichtes Einreiben der Blätter mit einer Suspension eines üblichen TMV-Stammes (U1) (0,5 μg/ml) infiziert. Die Blätter wurden sieben Tage nach der Infektion geerntet und die ICF wurde gemäß Parent und Asselin (1984) aus den Blättern ausgewaschen und gewonnen. 250 ml der ICF wurden durch Lyophilisierung auf 50 ml auflconzentriert und auf eine Ultragel ACA54-Säule, welche mit Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Eluate wurden mittels Elektrophorese auf 10%-igen Polyacrylamidgelen analysiert. Fraktionen aus der Ultragel ACA54-Chromatographie, welche wie in der Gelelektrophorese bestimmt PR-Proteine enthielten, wurden vereint, lyophilisiert, in Wasser gelöst und vor der Chromatographie auf DEAE-Sephacel gegen Wasser dialysiert. Die DEAE-Sephacel-Säule wurde mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA äquilibriert und es wurde mit einem linearen 0 bis 0,4 M Gradienten Natriumchlorid eluiert. Die Fraktion 6, welche ein Gemisch aus PR-R-Haupt, PR-R-Neben, PR-P, PR-Q und mehreren geringfügigeren Kontaminanten enthielt, wurde lyophilisiert und dann wieder in destilliertem Wasser suspendiert. Die einzelnen Proteine wurden weiter durch Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie mit einer Vydac-Phenylsäule (4,6 × 250 mm) gereinigt. Proteine wurden mit einem linearen 20 bis 80%-Gradienten aus Acetonitril:Isopropanol (1 : 1) in 0,1% TFA eluiert. Die Ergebnisse dieses Reinigungsschritts zeigten, dass das Proteingemisch wenigstens neun verschiedene Proteine enthielt. Eines dieser Proteine, PR-O', eluierte nach 46 Minuten und wurde aufgefangen und durch Lyophilisierung aufkonzentriert. Das Protein wurde in 6 M Guanidin-HCl, 1 M Tris-HCl resuspendiert und wie oben beschrieben reduziert und alkyliert. Peptide wurden durch Trypsinverdau erzeugt und wie oben beschrieben aufgetrennt. Eine Zusammenfassung der Aminosäuresequenzen dieser Peptide ist nachstehend gezeigt.
  • Figure 00270001
  • Beispiel 11B: Reinigung und Proteinsequenzen von PR-2, PR-N und PR-O
  • N. tabaccum cv. Xanthi.nc-Pflanzen wurden in einem Glashaus aufgezogen und, als sie acht Wochen alt waren, durch leichtes Einreiben der Blätter mit einer Suspension eines üblichen TMV-Stammes (U1) (0,5 μg/ml) infiziert. Die Blätter wurden sieben Tage nach der Infektion geerntet und die intrazelluläre Flüssigkeit (ICF) wurde nach Parent und Asselin (1984) aus den Blättern ausgewaschen und aufgefangen. 250 ml der ICF wurden durch Lyophilisierung auf 50 ml aufkonzentriert und auf eine Ultragel ACA54-Säule, welche mit Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA äquilibriert worden war, geladen. Die Eluate wurden durch Elektrophorese auf 10%-igen Polyacrylamidgelen analysiert. Fraktionen, welche gemäß der Gelelektrophorese PR-Proteine enthielten, wurden vereint, lyophilisiert, in Wasser gelöst und vor der Chromatographie auf DEAE-Sephacel gegen Wasser dialysiert. Die DEAE-Sephacel-Säule wurde mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA äquilibriert und es wurde mit einem linearen 0 bis 0,4 M Gradienten Natriumchlorid eluiert. Die Fraktion 6, welche ein Gemisch aus PR-R-Haupt, PR-R-Neben, PR-P, PR-Q, PR-O und mehreren geringfügigeren Kontaminanten enthielt, wurde lyophilisiert. Die Fraktion 3, welche ein Gemisch aus PR-2, PR-N und mehreren geringfügigeren Kontaminanten enthielt, wurde separat davon aufgefangen und durch Lyophilisierung aufkonzentriert.
  • PR-O wurde weiter von den anderen Proteinen der Fraktion 6 gereinigt, indem man die Fraktion 6 zunächst in 2 ml Wasser neu suspendierte und dann, die Proteine durch Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie mit einer Vydac Phenylsäule (4,6 × 250 mm) auftrennte. Die Proteine wurden mit einem linearen 20 bis 80%-Gradienten aus Acetonitril:Isopropanol (1 : 1) in 0,1% TFA eluiert. Die Ergebnisse dieses Reinigungsschritts zeigten, dass das Gemisch wenigstens 9 Proteine enthielt. Eines dieser Proteine, welches bei einem Lauf nach 51 Minuten eluierte, war PR-O, wie sich durch Gelelektrophorese feststellen ließ. Der Peak, der PR-O enthielt, wurde aufgefangen und durch Lyophilisierung aufkonzentriert. Das Protein wurde in 6 M Guanidin-HCl, 1 M Tris-HCl resuspendiert und wie oben beschrieben reduziert und alkyliert. Peptide wurden durch Trypsinund LysC-Verdau erzeugt und wie oben beschrieben gereinigt. Die Proteinsequenz wurde wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt. Eine Zusammenfassung der Sequenzdaten ist nachstehend gezeigt.
  • Die Proteine PR-2 und PR-N wurden mit Hilfe einer Brownlee Aquapore AX-300 (2,1 × 100 mm) Anionenaustauschersäule aus der Fraktion 3 gereinigt. Die Proteine wurden mit einem linearen Gradienten von 10 mM bis 350 mM Ammoniumacetat, pH 7,0, von der Säule eluiert. PR-N eluierte nach 37,5 Minuten und PR-2 eluierte nach 50,0 Minuten als einzelne gleichförmige Peaks. Die Identität der Proteine wurde durch Gelelektrophorese bestätigt. Die Proteine wurden aufgefangen, durch Lyophilisierung auflconzentriert und dann wie oben beschrieben reduziert und alkyliert. Peptide wurden durch Trypsinverdau erzeugt und weiter wie in Beispiel 7 beschrieben gereinigt. Die Proteinsequenzierungsdaten sind nachstehend zusammengefasst. PR-2
    Peptidbestimmung Peptidsequenz
    49,2 DSIFR
    54/69,5 YQLNFN
    54/72 VSTATYSGILANTNP
    58,9 HFGLFSPDQR
    65,9 IYNPDTNVFN 57/94,5
    ANGRVQDNIIN
    78,8 APGNAIETYLFAMFDENN.EGD
    82,5 YIAVGNEVSPGNNGQYAPF
    91,8 GSNIEII
    PR-N
    Peptidbestimmung Peptidsequenz
    44,8 YQLNFN
    46,1 VSTATYSGILAN.YP
    50,4 DNLPPDQQVINLYNA
    53,3 IYNPDTNVFNAL
    65,3 AGGQNVEINSESG.PSE
    65,3B DIETYLFAMFD.NN.EGD
    65,6A AGGQNLEII
    65,6B DIE.YVFAM
    67 IYNPDTNVFNAL
    79 GSNIEIILDVPLQDLQSLTDP
    PR-O
    Peptidbestimmung Peptidsequenz
    39,1 NLIDHV
    43,2 YQLNF
    46,7 HFGLFSPDQR
    51,5 IANNLPSDQDVINLYNANGI
    54,5 PENTNVFNAL
    57,6 NNLPLLANVYP
    64,9 GSNIEIILDVPNQDLESLTDPS
    70,9 YIAVGNEVSPTN
    83,3 AGGPNVEINSESG.P
  • Beispiel 12: Reinigung und Proteinsequenz von Gurkenchitinase/Lysozym
  • Ein pathogen-induzierbares Chitinase-Protein wurde wie beschrieben aus infizierten Gurkenblättern isoliert (Metraux et al., 1988). Aus diesem homogenen Proteinpräparat wurden Peptide im wesentlichen wie auf dem Gebiet und oben beschrieben erzeugt. Die Aminosäuresequenz dieser Peptide ist nachstehend zusammengefasst.
  • Figure 00300001
  • Beispiel 12B: Reinigung und Proteinsequenz der Gurkenperoxidase
  • Das pathogen-induzierte, saure Gurkenperoxidaseprotein wurde wie von Smith, J. A., Dissertation, Abteilung für Botanik und Pflanzenpathologie, Michigan State University, Lansing, Michigan (1988) beschrieben aus nicht-infizierten Blättern von Gurkenpflanzen isoliert, die sieben Tage zuvor mit einer Sporensuspension von Colletotrichum lagenarium infiziert worden waren, gereinigt.
  • Das gereinigte Protein wurde reduziert und alkyliert und die Aminosäuresequenz des Aminoterminus und von Peptiden, die entweder aus einem LysC- oder einem Trypsinverdau stammten, wurden wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse der Aminosäuresequenzierung sind nachstehend zusammengefasst. Peptidbestimmung Peptidsequenz
    Aminoterminus (Q)LSPTFYNTTWPNV
    LysC 84,0/60,7 TAVENVCPGVVSCADILALGSRDAVT
    LysC 71,6 DAVTLASGQGWTVQLGR
    LysC 54,1/55,1 IIRLHFHDCFVDGCDGSVLLEDQDGIT.E
    LysC 28,6 TGTTGEIRTNCRRLN
    Tryp 66,4 LNNNPNADDSPIDSTAYASQL
  • ABSCHNITT 3. ISOLIERUNG NEUER cDNA-KLONE
  • Dieser Abschnitt beschreibt die Isolierung neuer cDNA-Klone. Er ist in drei Abschnitte unterteilt: Abschnitt A betrifft die Konstruktion der zur Isolierung der Klone verwendeten Banken. Abschnitt B betrifft die Identifizierung und Reinigung der so isolierten Klone. Abschnitt C betrifft die Entwicklung einer neuen cDNA-Klonierungstechnik.
  • Abschnitt 3A: Konstruktion von cDNA-Banken
  • Beispiel 13: Herstellung-einer cDNA-Bank aus mit TMV-infizierten Tabakblättern Blätter von N. tabacum cv. Xanthi.nc wurden mit TMV infiziert und fünf Tage nach der Infektion geerntet. Gesamt-RNA wurde wie oben beschrieben hergestellt und Poly A+-RNA wurde nach üblichen Verfahren isoliert. Eine cDNA-Bank wurde mit dieser Poly A+-RNA in dem Lambda ongC-Klonierungsvektor (Stratagene) im wesentlichen wie beschrieben hergestellt (Gubler und Hoffman, 1983).
  • Beispiel 14A: Herstellung einer cDNA-Bank aus nicht-infizierten Blättern von mit TMV geimpftem Tabak mit Hilfe eines neuen cDNA-Klonierungsvektors
  • PCGN1703, ein Plasmid-cDNA-Klonierungsvektor des Vektor-Primertyps, wie beschrieben von Okayama und Berg (1982), wurde als verbesserter Vektor konstruiert, um das Klonierungsverfahren zu vereinfachen und zu ermöglichen, dass Banken leicht in einen Phagenvektor übertragen werden können, und um weitere Funktionen bereitzustellen, die bei der derzeitigen Verwendung nicht bereitstehen.
  • A. Konstruktion des pCGN1703-Klonierungsvektors. Bluescribe-M13-(Stratagene, Inc.) wurde als Ausgangsplasmid verwendet. Die BamHI-Stelle wurde durch BamHI-Verdau und Behandlung mit Mungbohnennuklease deletiert und anschließend folgte eine Ligation mit T4 DNA-Ligase, so dass pCGN1700 entstand. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI und SacI verdaut und dann mit einem doppelsträngigen synthetischen Polylinker, der durch das Annealen von zwei Oligonukleotiden der Sequenz
    Figure 00320001
    erzeugt wurde, ligiert.
  • Das so erhaltene Plasmid besaß zusätzliche Restriktionsstellen für SmaI, ApaI, XbaI, PstI und BamHI und wurde als pCGN1702 bezeichnet. Zu beachten ist, dass die EcoRI-Stelle nicht rekonstruiert wurde.
  • pCGN1702 wurde vollständig mit HindIII verdaut und mit T4-Polymerase wurden stumpfe Enden erzeugt. Die erhaltene DNA wurde einem Teilverdau mit PvuII unterworfen und dann mit T4 DNA-Ligase ligiert. Ein Transformant, bei dem das 214-bp-HindIII-PvuII-Fragment, welches den lac Operator-Promotor-Bereich umfasste, deletiert war, wurde ausgewählt; dieses Plasmid wurde als pCGN1703 bezeichnet.
  • Die Verwendung von Vektor-Primer-Plasmiden, wie pCGN1703 wurde zuvor beschrieben (Alexander, 1987). Wie in dem Nachtrag zu dieser Arbeit beschrieben, ist der vorliegende Vektor ein Monomervektor. Die T-Abschnitte, die als Primer für die cDNA-Synthese verwendet wurden, lagen während der Reaktion mit der Reversen Transkriptase und der terminalen Transferase (G-Schwanz) an beiden Enden des Vektors vor, und die Linker-DNA, die zum Ringschluss der Endprodukte aus der cDNA-Klonierung mit pCGN1703 verwendet wurde, hatte folgende Allgemeinstruktur: T7 Promotor, eine Multicloning-Stelle (SmaI, ApaI, XbaI, PstI, BamHI, NotI, EcoRI, SacI), einen C:G-Homopolymer-Abschnitt (10 bis 15 Reste), ein cDNA-Insert (5'-3' des mRNA-Sense-Strangs), einen A:T-Homopolymer-Abschnitt (40 bis 100 Reste) und eine weitere Multicloning-Stelle (KpnI, SmaI, XbaI, SmaI, PstI und SphI), alle enthalten in dem Plasmidrückgrat, das von obendem beschriebenen Bluescribe M13 abstammt.
  • B. Konstruktion der cDNA-Bank mit pCGN1703. Xanthi.nc-Tabakpflanzen wurden in einem Phytotron aufgezogen, bis sie etwa 10 bis 12 Inch hoch waren. Zwei Blätter aus dem unteren Bereich jeder Pflanze wurden entweder mit einer Scheinprobe, die nur Puffer enthielt (10 mM Natriumphosphat, pH 7,0), oder mit einer Probe aus TMV (10 μg/ml in dem gleichen Puffer) beimpft. Elf Tage später wurden drei bis vier höher gelegene Blätter, welche nicht beimpft worden waren, geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Poly-A+-mRNA wurde durch zuvor beschriebene Verfahren isoliert (Hall et al., 1978, Seiten 3196 bis 3200; Maniatis et al., 1982, Seiten 297 bis 209). Eine cDNA-Bank wurde hergestellt, wobei die Poly-A+-RNA, welche aus mit TMV induzierten Blättern isoliert worden war, verwendet wurde, und zwar in dem cDNA-Vektor pCGN1703 durch zuvor beschriebene Verfahren (Alexander, 1987). Plasmid-DNA aus der amplifizierten cDNA-Bank (Alexander, 1987) wurde vollständig mit EcoRI verdaut und in die EcoRI-Stelle von lgt-10 (Stratagene, Inc.) subkloniert. Zu beachten ist, dass der Plasmidvektor mit den cDNAs verbunden blieb und auch in den Phagenvektor kloniert wurde. Daher wurden mit diesem Verfahren zwei cDNA-Banken hergestellt, und zwar eine, in der die Bank in einem Plasmidvektor enthalten war, und eine andere, in der die cDNA-Bank in einem Phagenvektor enthalten war.
  • Beispiel 14B: Herstellung einer cDNA-Bank aus mit TNV infizierten Gurkenblättern Gurkenblättern wurden mit dem Tabak-Necrose-Virus (TNV) infiziert und fünf Tage nach der Infektion wurde die RNA wie oben beschrieben isoliert. Poly-A+-RNA wurde durch übliche Verfahren isoliert und eine cDNA-Bank in dem Lambda-Zap-Klonierungsvektor (Stratagene) hergestellt, im wesentlichen wie bereits beschrieben (Gubler und Hoffman, 1983).
  • Abschnitt 3B: Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von cDNA-Klonen
  • Beispiel 15: Isolierung von cDNAs die für PR-1a, PR-lb und PR-lc kodieren
  • Etwa 300.000 Plaques aus der oben hergestellten cDNA-Bank wurden mit einem Oligonukleotid der Sequenz:
    Figure 00330001

    gescreent.
  • 25 positive Plaques wurden durch übliche Techniken gereinigt und es wurde die DNA aus den Phagen hergestellt. Ein Fragment des rekombinanten Phagen, welches die cDNA enthielt, wurde in das Bluescript-Plasmid subkloniert. Eine Teil-cDNA-Sequenz von jedem Klon wurde durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Es wurde gefunden, dass die 26 Klone in drei cDNA-Klassen unterteilt werden können. Klasse 1 steht für den Klon pBSPRI-207, Klasse 2 steht für den Klon pBSPRI-1023 und Klasse 3 steht für den Klon pBSPRI-312.
  • Um die Identität der drei Klone in Bezug auf bekannte PR-1-Proteine zu bestimmen, wurden die oben bestimmten Aminosäuresequenzdaten für die PR-1a- und PR-lb-Proteine mit den aus den drei repräsentativen cDNA-Klonen abgeleiteten Aminosäuresequenzen verglichen. Der Vergleich ist nachstehend zusammengefasst.
  • Die experimentell bestimmte Aminosäuresequenz von oben ist in der obersten Zeile gezeigt, wobei die erste (geschlussfolgerte) Aminosäure in Klammern steht. Die, von den Klonen pBSPR1-207 (= a), pBSPRI-1023 (= b) und pBSPRI-312 (= c) abgeleiteten Sequenzen sind unter den Peptiddaten gezeigt, wobei Übereinstimmungen mit (–) angedeutet sind. Reste, die nicht übereinstimmen, sind durch ihr Aminosäuresymbole dargestellt.
  • PR-1a
    Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Der Vergleich der Proteinsequenz von PR-1a mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von pBSPRl-207 zeigt, dass die Sequenzen in allen Resten übereinstimmen. Vergleicht man jedoch die abgeleitete Aminosäuresequenz von den pBSPRl-1023- oder pBSPR1-312-Peptiden mit der Proteinsequenz von PR-1a, so sind sieben bzw. sechs Mismatches festzustellen. Dieser Nachweis zeigt daher deutlich, dass der Klon pBSPRl-207 für das PR-1a-Protein kodiert.
  • Wird die Aminosäuresequenz des PR-1b-Proteins mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von dem pBSPR1-1023-Protein verglichen, besteht eine Übereinstimmung in allen Resten. Im Vergleich zu der von pBSPRl-207 oder pBSPR1-312 abstammenden Sequenz, gibt es jedoch drei bzw. sechs Mismatches. Die Daten zeigen somit deutlich, dass der Klon pBSPR1-1023 für das PR-1b-Protein kodiert. Ferner wurde automatisch bestimmt, dass der Klon pBSPR1-312 für das PR-1c-Protein kodiert. Die Sequenzen der cDNAs, welche für PR-1a, PR-lb und PR-1c kodieren, sind wie folgt:
  • Sequenz 1: PR-1a-cDNA, kloniert in das Plasmid pBSPRl-207
    Figure 00360002
  • Figure 00370001
  • Sequenz 2: PR-lb-cDNA, kloniert in das Plasmid pBSPR1-1023
    Figure 00370002
  • Sequenz 3: PR-1c-cDNA, kloniert in das Plasmid pBSPR1-312
    Figure 00370003
  • Figure 00380001
  • Beispiel 16: Isolierung von cDNA-Klonen, welche für PR-R-Haupt und PR-R-Neben kodieren Etwa 300.000 Plaques aus der oben konstruierten Bank wurden mit einer Oligonukleotidprobemit folgender Sequenz gescreent:
    Figure 00380002
  • 15 positive Plaques wurden durch übliche Techniken gereinigt und die DNA wurde aus dem Phagen präpariert. Ein Fragment des rekombinanten Phagen, welches die cDNA enthielt, wurde in das Bluescript-Plasmid subkloniert. Eine Teil-DNA-Sequenz aus dem cDNA-Insert zeigte, dass man die Klone in zwei Klassen unterteilen kann. Die Sequenz aus einem dieser Klone, pBSPRR-401, welche für die Hauptform von PR-R kodiert (Pierpoint et al., 1987; und oben) ist wie folgt:
  • Sequenz 4: PR-R-Haupt-cDNA, kloniert in das Plasmid pBSPRR-401
    Figure 00380003
  • Figure 00390001
  • Die Identität dieser cDNA als cDNA, die für die Hauptform von PR-R-Haupt kodiert, wurde durch Vergleichen der kodierten Proteinsequenz mit der oben experimentell bestimmten aminoterminalen Sequenz bestätigt und ebenso durch den Vergleich mit der Sequenz, die von Pierpoint et al. (1987) für die PR-R-Haupt-Isoform gezeigt wurde. Dieses kodierte Protein besitzt eine sehr starke Homologie zu einem bekannten Trypsin/α-Amylase-Inhibitor, der aus Mais isoliert wurde (Richardson et al., 1987). Das clonierte PR-R kann ein Inhibitor von entweder Protease oder α-Amylasen sein und wird als solcher, wenn er transgen in Pflanzen exprimiert wird, den Pflanzen eine Insekten-, Viren- oder Pilz-bekämpfende Aktivität verleihen. Beispiel 17: Isolierung von cDNA-Klonen, die für PR-P und PR-Q kodieren Etwa 300.000 Plaques aus der oben hergestellten cDNA-Bank wurden gescreent, wobei man eine makierte cDNA-Sonde, welche für das basische Tabak-Chitinasegen kodierte (Shinshi et al., 1987) verwendete und die Filter bei 50°C in 0,125 mM NaCl, 1% SDS, 40 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 1 mM EDTA wusch. 24 positive Plaques wurden gereinigt und die DNA-Sequenz aus einem Klon, der pBScht15 genannt wurde, war wie folgt:
  • Sequenz 5: PR-Q-cDNA, kloniert in das Plasmid pBScht15
    Figure 00400001
  • Das Protein, das von dem Klon dieser Sequenz kodiert wurde, erwies sich als PRP-Q, und zwar beruhend auf:
    (1) der begrenzten Strukturhomologie zu der basischen Tabakchitinase und (2) der Identität zu der aminoterminalen Proteinsequenz von PR-Q und der Identität zu der Sequenz einer Anzahl interner Peptide, die von PR-Q abstammen, wie bestimmt durch Proteinsequenzierung (siehe oben). Der isolierte Klon schien eine trunkierte cDNA zu sein. Um das 5'-Ende der cDNA zu isolieren, wurde zuerst das Ende der mRNA bestimmt. Ein Oligonukleotidprimer der Sequenz:
    Figure 00400002
    das als Oligo A bezeichnet wird, wurde mittels ß-Cyanoethylphosphoramiditchemie synthetisiert und durch übliche Verfahren gereinigt. Dieser Primer wurde in einem Primerverlängerungsversuch, wie oben, verwendet, wobei RNA aus mit TMV infizierten Blättern isoliert wurde. Zwei Verlängerungsprodukte wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht und entsprachen den mRNA-Endpunkten, die 43 bp und 53 bp länger als die pBScht15-cDNA waren.
  • Um das 5'-Ende der PR-Q-cDNA zu isolieren, wurde ein neues Klonierungsverfahren, das auf der PCR-Technologie beruht, entwickelt. Im wesentlichen wurden zur Amplifizierung zwei Primer verwendet und dann wurde das 5'-Ende des cDNA-Klons aus der cDNA-Bank kloniert. Ein Primer (Oligo A), komplementär zum Sense-Strang der cDNA und 160 Basen in der pBScht15-cDNA lokalisiert, und ein zweiter Primer (entweder Oligo B oder Oligo C, siehe unten), welcher als Primer für die cDNA von beiden Seiten des Lambda-Klonierungsvektors verwendet werden kann, wurden in diesem Verfahren verwendet.
  • Oligo A ist komplementär zu der PR-Q-mRNA und enthält eine Sequenz, die von der Endonuklease NsiI erkannt wird. Zwei weitere Oligonukleotide mit den Sequenzen
    Figure 00410001
    wurden synthetisiert, gereinigt und als Oligo B und Oligo C bezeichnet. Oligo B hatte die gleiche Sequenz wie ein Teil des λ OngC-Klonierungsvektors und Oligo C ist komplementär zu dem Polylinker des λ OngC-Klonierungsvektors. Um das 5'-Ende der PR-QcDNA zu klonieren, wurden zwei PCRs durchgeführt, eine, bei der Oligos A und B verwendet wurden und eine weitere, bei der Oligos A und C verwendet wurden. Ein Aliquot der cDNA-Bank wurde als Templat für die Reaktion verwendet. Die zwei Reaktionen waren notwendig, um Klone zu amplifizieren, die in einer der beiden Richtungen in den λ OngC-Vektor ligiert waren. Als Kontrolle wurden auch Reaktionen mit Aliquots von gereinigtem Phagenlysat durchgeführt, wobei das Chitinase-15-Isolat verwendet wurde. Nach der Amplifikation wurde die DNA gereinigt und mit NsiI und EcoRI verdaut und auf einem 1,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt. Gelstreifen, die DNA-Fragmente enthielten, welche länger als die Kontrollen waren, wurden ausgeschnitten und in pBluescript ligiert, welcher sowohl mit EcoRI als auch PstI, wie oben beschrieben, verdaut war. Nach der Transformation wurden positive Kolonien isoliert und die DNA-Inserts durch DNA-Sequenzierung analysiert. Mehrere Inserts enthielten das 5'-Ende der PR-Q-cDNA und andere enthielten das 5'-Ende von PR-P (bestimmt durch Vergleichen der von den Klonen abgeleiteten Aminosäuresequenz mit der oben bestimmten Proteinsequenz).
  • Das 3'-Ende von PR-P wurde dann aus der cDNA-Bank durch Screenen von etwa 100.000 Klonen aus der cDNA-Bank mit einer Sonde aus einem der 5'-Isolate von PR-P, pBScht5'-5, isoliert. Positive Phagen wurden isoliert und gereinigt und das Insert in pBluescript subkloniert. Mehrere Inserts wurden sequenziert und eines, pBSCht28, zeigte, dass es für PR-P kodierte. Die DNA-Sequenz von PR-P ist nachstehend gezeigt:
  • Sequenz 6: PR-P-cDNA, kloniert in das Plasmid pBScht28
    Figure 00420001
  • Beispiel 18: Isolierung von cDNA-Klonen die für PR-O' kodieren
  • Etwa 300.000 Plaques der oben beschriebenen cDNA-Bank wurden mit Hilfe einer markierten cDNA-Sonde gescreent, die für die basische Form der (β-1,3-Glucanase kodierte (Shinshi et al., 1988) und die Filter wurden bei 50°C in 0,125 M Nacl, 1% SDS, 40 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 1 mM EDTA gewaschen. 15 positive Plaques wurden isoliert und das Insert in das Bluescript-Plasmid subkloniert. Eine teilweise DNA- Sequenzierung zeigte, dass pBSGLS und pBSGL6e für identische cDNAs kodierten, welche etwa 55% Homologie zu der bekannten DNA-Sequenz der basischen Form von β-1,3-Glucanase besaßen. Die Sequenz der cDNA in Klon 5 und 6 wurde bestimmt und ist als Sequenz 7 für die cDNA in dem Plasmid pBSGL6e gezeigt.
  • Sequenz 7: PR-O'-cDNA, kloniert in das Plasmid pBSGL6e
    Figure 00430001
    Sequenz 7A: Full-length PR-O', kloniert in das Plasmid pBSGLSB-12
    Figure 00440001
  • Diese cDNA kodiert für das PR-O'-Protein (einer sauren Form von β-1,3-Glucanase), was aus dem Vergleich mit der Aminosäuresequenz der von dem PR-O'-Protein abstammenden Peptide beruht.
  • Der Punkt-Matrix-Vergleich mit der basischen β-1,3-Glucanase zeigt, dass bei der cDNA-Sequenz 7 wahrscheinlich etwa 80 Basen am 5'-Ende fehlen. Um die Full-length-Form der PR-O'-cDNA zu isolieren, wurde die Bank nochmals mit einem markierten EcoRI-Restriktionsfragment, das von dem pBSGL6e-Plasmid abstammte, gescreent. Sechs positive Klone wurden isoliert, gereinigt und in das Bluescript-Plasmid subkloniert. Die Sequenzen der Inserts in den Plasmiden wurden durch DNA-Sequenzierung be stimmt. Ein Klon, pBSGLSB-12, war 87 bp länger als die cDNA in pBSGL6e (Sequenz 7A).
  • Beispiel 18B: Isolierung von cDNA-Klonen, die für PR-2, PR-N, PR-O und PR-2' kodieren Etwa 300.000 Plaques aus der cDNA-Bank, die wie beschrieben aus mit TMV infizierten Tabakblättern isolierter RNA hergestellt worden war, wurden gescreent, wobei die Sonde ein Gemisch aus markierten Oligonukleotiden (JR138) der Formel:
    Figure 00450001

    enthielt, wobei Y unabhängig ausgewählt ist aus einem Pyrimidin C oder T und jedes R unabhängig ausgewählt ist aus einem Purin G oder C. Diese Sonde war 17 Basen lang mit einer 16-fachen Redundanz im Gemisch. Das Sondendesign beruht auf einer Analyse der Proteindaten in Beispiel 11B. Die Sonde erkennt Klone, welche PR-2, PR-N oder basische β-1,3-Glucanase, nicht jedoch PR-O' oder PR-O enthalten. 30 positiv hybridisierte Plaques wurden isoliert und gereinigt und deren Inserts wurden in das Bluescript-Plasmid subkloniert. Die Sequenz der Inserts wurde durch DNA-Sequenzierung bestimmt und die Ergebnisse zeigen, dass wenigstens drei separate cDNAs isoliert wurden. Beim Vergleich mit den Proteindaten aus Beispiel 11B wird deutlich, dass ein Typ der Klone eine Full-length-cDNA enthält, die für das PR-2-Protein (pBSGL117) kodiert, ein Typ für das PR-O-Protein (pBSGL134) kodiert, ein Typ für das PR-N-Protein (pBSGL125 und pBSGL148) kodiert und ein Typ für ein eng verwandtes Protein kodiert, welches weder PR-2, PR-N noch PR-O ist. Wir haben diesen Typ cDNA PR-2' (pBSGL135) genannt.
  • Um einen cDNA-Klon zu isolieren, der für PR-O kodiert, und auch weitere Full-lengthcDNA-Klone zu isolieren, wurde die Bank ein zweites Mal mit einem PstI-Restriktionsfragment aus pBSGL125 gescreent. pBSGL125 ist ein 500-bp-Klon, der für ein PR-N kodiert, welches am 5'-Ende trunkiert ist. Etwa 300.000 Plaques der Bank wurden gescreent und 17 positive Plaques wurden isoliert, gereinigt und die Inserts in Bluescript subkloniert. Die Sequenzen der Inserts wurden durch DNA-Sequenzierung bestimmt.
  • Um sicherzustellen, dass die Full-length-Klone aus allen sauren Glucanasen isoliert wurden, wurden zwei abschließende Strategien verwendet. Zunächst wurde eine abschließende Screeningrunde mit einem 210-bp-PvuII-TagI-Restriktionsfragment, das von pBSGL117 abstammte, als Sonde durchgeführt. Bei diesem Screening wurden 17 Klone isoliert, gereinigt, in Bluescript subkloniert und ihre Sequenzen durch DNA-Sequenzierung bestimmt.
  • Die zweite Strategie war die Amplifizierung des 5'-Endes der cDNA aus der Bank durch eine PCR-Strategie, wie in Beispiel 17 beschrieben. In diesem Fall wurden die zwei Oligonukleotide B und C zusammen mit einem dritten Oligonukleotid JR209, welches komplementär zu den Positionen 152 bis 169 der PR-2-cDNA-Sequenz ist, verwendet. In diesem Versuch wurden zwei PCRs durchgeführt; eine enthielt ein Aliquot der cDNA-Bank als Templat und die Primer JR209 und DPO1 (oligo B aus Beispiel 17) und bei der anderen wurde ein Aliquot der cDNA-Bank als Templat und JR209 und GP38 (oligo C aus Beispiel 17) als Primer verwendet. Die Sequenz von JR209 ist wie folgt:
    Figure 00460001
  • Eine positive Kontrolle in dem Amplifikationsversuch war ein Aliquot des gereinigten GL117-Klons, der für die Full-length-PR-2-cDNA kodiert und mit JR209 und DPO1 amplifiziert wurde. Eine negative Kontrolle in dem Experiment war eine Amplifikation mit JR209 und GP38. Aliquots der Produkte aus der PCR wurden durch Agarosegelelektrophorese untersucht und es wurde gefunden, dass eine Bande mit etwa der Größe der positiven Kontrolle aus der Bank für jedem Primersatz amplifiziert wurde. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass das Verfahren erfolgreich war und somit wurde die restliche DNA gereinigt und dann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I in Gegenwart aller vier dNTPs, wie von Maniatis et al.(1982) beschrieben, behandelt, um die Enden der DNA-Moleküle „bündig" zu machen. Das Klenow-Enzym wurde inaktiviert, indem man es 15 Minuten auf 65°C erwärmte und die DNA wurde dann mit EcoRI geschnitten. Die DNA wurde gereinigt und dann auf einem 1,5%-igen LGT-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA-Bande mit der richtigen Größe wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in das Bluescript-Plasmid ligiert, welches sowohl mit EcoRI als auch EcoRV geschnitten worden war. Die Ligation wurde zum Transformieren von Bakterien verwendet und positive Kolonien wurden ausgewählt und durch DNA-Sequenzierung analysiert.
  • Das Ergebnis der vorstehenden Verfahren ist die Isolierung von Klonen, welche die Fulllength-cDNA-Klone für PR-2, PR-N, PR-O und einem vierten Typ der sauren Glucanase, PR-2', welcher für ein unbekanntes Protein kodiert, enthielten. Die Sequenz für PR-2 ist wie folgt: Sequenz 8: PR-2, kloniert in das Plasmid pBSGL117
    Figure 00470001
    pBSGL134 ist das isolierte Plasmid, das ein cDNA-Insert enthält, welches für ein PR-O-Protein kodiert. Die Lambda-Phagen λtobcDNAGL153 und λtobcDNAGL162 sind Klone, die die Full-length-PR-O-cDNA enthalten. Der Phage λtobcDNAGL161 ist ein Klon, der die Full-length-PR-2'-cDNA enthält.
  • Die Bestimmung des Proteins, das von dem cDNA-Insert kodiert wird, beruht auf einem Vergleich zwischen den Proteindaten in 11B und der abgeleiteten Proteinsequenz, die von dem cDNA-Insert kodiert wird.
  • Beispiel 19: Isolierung von cDNA-Klonen, die für SAR8.2a und SAR8.2b kodieren
  • Filterabzüge der oben hergestellten subklonierten Bank wurden mit markierten cDNA-Sonden nach einem zuvor beschriebenen Verfahren (St. John und Davis, 1979) gescreent, außer dass die gleichen Filterabzüge nacheinander gescreent wurden anstelle des Screenens mehrfacher Abzüge. Die erste Sonde wurde wie beschrieben synthetisiert, wobei Reverse Transkriptase und [α32]-dCTP verwendet wurde, und zwar aus mRNA der oben isolierten Schein-induzierten RNA-Sonde; nach dem Behandeln mit der Sonde und dem Aussetzen gegenüber einem Röntgenfilm wurden die gleichen Filter wieder mit einer Sonde behandelt (ohne Strippen), wobei eine wie oben synthetisierte Sonde verwendet wurde, die jedoch aus der oben isolierten mit TMV-induzieren RNA-Sonde isoliert wurde. Nach der Exponierung wurden die zwei Röntgenfilme mit Hilfe eines computerisierten digitalen Abbildungsanalysesystems (Biological Vision, Inc., San Jose, Californien) gemäß den Angaben des Herstellers verglichen und es wurden Plaques ausgewählt, die ein verstärktes Signal zeigten, wenn man sie mit der TMV-induzierten Sonde untersuchte. Die ausgewählten Plaques wurden durch eine zweite Sondierungsrunde gereinigt, und zwar bei einer ausgewählten Plaquedichte von etwa 100 pro Platte und die cDNA-Inserts des Phagen wie folgt zurückgewonnen: eine kleine Menge isolierte Phagen-DNA wurde mit EcoRI verdaut und anschließend wurde das Restriktionsenzym inaktiviert, die DNA wurde verdünnt, neu mit T4 DNA-Ligase ligiert und in den E. coli-Stamm DH-5α(Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland) transformiert und anschließend wurde der Stamm auf Ampicillin-haltigen Kulturplatten aufgezogen. Durch dieses Verfahren war es möglich die cDNA, die in dem Plasmidvektor enthalten war, direkt aus dem Phagenvektor zurückzugewinnen. Die DNA-Sequenzen dieser zwei leicht unterschiedlichen Klone sind in Sequenz 9 und Sequenz 10 gezeigt, und zwar für die cDNA der Plasmide pCIB/SAR8.2a (z. B. cDNA-SAR8.2a) und pCIB/SAR8.2b (z. B. cDNA-SAR8.2b).
  • Sequenz 9: SAR8.2a-cDNA, kloniert in das Plasmid pCIP/SAR8.2a
    Figure 00490001
    Sequenz 10: SAR8.2b-cDNA, kloniert in das Plasmid pCIP/SAR8.2b
    Figure 00490002
  • Die Analyse von RNA aus Schein-induzierten gegenüber TMV-induzierten Tabakblättern mit Hilfe der Northern-Analyse und des Primer-Verlängers-Assays bestätigte, dass die stationären Anteile der mRNAs der pSAR8.2-Familie durch die TMV-Induktion erhöht worden waren.
  • Beispiel 20: Isolierung von cDNA-Klonen, die für das Chitinase/Lysozym aus Gurke kodieren
  • Zwei Bereiche der in Beispiel 12 bestimmten Proteinsequenz wurden ausgewählt und es wurden Oligonukleotidproben synthetisiert, die zu allen möglichen Kombinationen der mRNA, die für die Peptide kodieren kann, komplementär waren. Die Sequenzen der Sonden waren:
    Figure 00500001
  • Etwa 300.000 Plaques aus der oben konstruierten Bank wurden ausplattiert und doppelte Plaqueabzüge wurden entweder mit einem 32P-markierten Oligonukleotidgemisch 1 (Sonde 1) oder Gemisch 2 (Sonde 2) untersucht. Plaques, die positive Ergebnisse beim Screenen mit einer der Sonden zeigten, wurden isoliert. Die Isolierung von Phagen und das automatische Ausschneiden wurde wie in dem Strategene Lambda Zap Laborhandbuch, Stratagene, San Diego, USA beschrieben durchgeführt.
  • Sobald die Chitinase-cDNA-Klone in das Bluescript-Plasmid isoliert waren, wurden sie durch Dideoxy-Sequenzierung sequenziert. Die Sequenz der Chitinase-cDNA, die in dem Plasmid pBScuccht5 (aka pBScucchi/Chitinase) enthalten war, war wie folgt: Sequenz 11: Gurkenchitinase/Lysozym-cDNA, kloniert in das Plasmid pBScucchi/ Chitinase. (aka pBScuccht5)
    Figure 00510001
  • Beispiel 20B: Gurkenperoxidase-cDNA
  • Auf Basis der in Beispiel 12B gezeigten Proteindaten wurden eine Oligonukleotidsonde zur Isolierung von cDNAs, die für Gurkenperoxidase kodieren, bestimmt. Die Sequenz des Oligonukleotidgemischs war wie folgt:
    Figure 00510002

    worin R unabhängig ausgewählt ist aus einem Purin G oder C. Dieses Oligonukleotidgemisch ist 20 Basen lang und enthält 64 Arten.
  • Eine cDNA-Bank wurde aus RNA hergestellt, die 5 Tage nach der Infektion mit Tabak-Nekros-Virus, wie in Beispiel 14B beschrieben, aus Gurkenpflanzen isoliert worden war. Diese Bank wurde in dem Lambda-ZAP-Klonierungsvektor hergestellt.
  • Etwa 300.000 Plaques dieser cDNA-Bank wurden mit der Oligonukleotidsonde gescreent und es wurden 25 Plaques isoliert. Diese wurden mehrere Male nachgescreent und gereinigt. Nach diesem Verfahren verblieben nur 6 Plaques, die nach mehreren Reinigungsrunden noch positiv waren. Die in diesen Klonen enthaltenen Inserts wurden mit Hilfen des automatischen Ausschneideprotokolls, das in dem Laborhandbuch von Stratagene Lambda ZAP beschrieben ist, ausgeschnitten. Die Inserts wurden durch doppelsträngige Dideoxy-Sequenzierung sequenziert und dann wurden die Strukturen durch Punktmatrixanalyse analysiert, wobei sie mit der Sequenz einer sauren, Lignin-bildenden Peroxidase, die aus Tabak isoliert worden war (Lagrimini et al., 1987) verglichen wurden. Zwei dieser Klone, Perl und Per25 zeigten eine begrenzte Homologie zu der TabakcDNA und wurden zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Nach der vollständigen Sequenzierung der Klone wurde gefunden, dass sie für das gleiche Protein kodieren.
  • Eine von der Gurkenperoxidase abstammende Sonde wurde dann verwendet, um die Gurkenbank nachzuscreenen und es wurden etwa 30 Plaques isoliert. Nach der Reinigung wurden die Inserts aus dem Phagen als Plasmide ausgeschnitten und dann wurde die Sequenz durch DNA-Sequenzierung bestimmt.
  • Das Ergebnis dieser Analyse war die Isolierung von zwei Typen Peroxidase-cDNA-Klone aus Gurke. Einer kodierte für ein basisches Protein, das von dem Plasmid pBSPERI kodiert wird, dessen Nukleotidsequenz nachstehend gezeigt ist, und der andere kodierte für eine verwandte Peroxidase, die in den Plasmiden pBSPER24 und pBSPER25 enthalten ist.
  • Sequenz 12: Gurkenperoxidase-cDNA, kloniert in das Plasmid pBSPER1
    Figure 00530001
  • Abschnitt 3C: Entwicklung einer neuen, differentiellen Klonierungs- und Screening-Technologie
  • Beispie 21: Differentielles Anreicherungsschema
  • Es wurde ein Verfahren entworfen und entwickelt, welches es ermöglicht, Sequenzen, die in einer Population von Molekülen in größeren Mengen als in anderen Populationen vorliegen, wirksam anzureichern. Am nützlichsten ist das Verfahren in Fällen, wo die Populationen sehr ähnlich sind und die vorliegenden abweichenden Sequenzen einen sehr geringen Anteil der Population ausmachen.
  • Sind zwei Populationen von Klonen sehr ähnlich und möchte man die Klone isolieren, die in einer Population in einer größeren Menge vorliegen (d. h. „induziert sind" oder „differentiell reguliert sind"), musste man diese bei bisherigen Verfahren mit Sonden aus den zwei Populationen screenen (+/- -Screening; St. John und Davis, 1979) oder die Proben oder mRNAs durch Hybridisierung und Hydroxyapatit- (HAP) -Chromatographie anreichern (Davis et al., 1984). Das erste Verfahren zeigte eine beschränkte Empfindlichkeit, und zwar darin, dass nur Klone, die in einer Konzentration über einem in 2.000 vorlagen, nachzuweisen waren. Das zweite Verfahren ist arbeitsintensiv, technisch schwierig und erreicht höchstens 20- bis 50fache Anreicherungen.
  • Bei den vorliegenden Verfahren werden zwei junge Entwicklungen in der Molekulartechnologie genutzt: PCR (Saiki et al., 1988) und die Biotin-Avidin-Chromatographie (Stahl et al., 1988). Die PCR ermöglicht eine einfache Synthese großer Mengen DNA einer spezifischen Sequenz. Die Biotin-Avidin-Chromatographie ermöglicht die wirksame Abtrennung von Molekülen mit einem Biotin-Affinitätsmarker von solchen Molekülen, die den Marker nicht tragen.
  • In seiner allgemeinen Form besteht das Verfahren aus dem Isolieren einzelner cDNA-Stränge, die für die zwei unterschiedlichen Populationen („induziert" gegenüber „nichtinduziert") stehen, jedoch eine unterschiedliche cDNA-Polarität bei den zwei Populationen aufweisen, d. h, einer besitzt eine „Sense"-Polarität in Bezug auf die mRNAs und der andere besitzt eine komplementäre oder „Antisense"-Polarität dazu, bezogen auf die mRNAs. Die isolierten Stränge aus der „induzierten" Population haben keinen Affinitätsmarker, während die Stränge der entgegengerichteten Polarität aus den „nichtinduzierten" Populationen stabile Affinitätsmarker besitzen. Wenn diese zwei Populationen miteinander hybridisiert werden, bilden sich Hybride zwischen komplementären Strängen, die in den zwei Populationen vorliegen. Stränge aus der „induzierten" Population, die kein Gegenstück finden oder für die in der „nicht-induzierten" Population nur wenige Gegenstücke vorliegen, bleiben einzelsträngig. Durch das Vorliegen von Affinitätsmarkern (dem Wesen nach ein Griff) auf den Strängen der Moleküle aus der „nicht-induzierten" Population können diese Stränge und besonders wichtig alle Hybridmoleküle durch Affinitätschromatographie aus dem Gemisch entfernt werden. Es bleiben daher nur solche „induzierten" Moleküle zurück, die in der „nicht-induzierten" Population in keiner wesentlichen Menge vorliegen. Diese „induzierten" Moleküle können dann durch übliche Mittel kloniert werden und dienen als angereicherte Population, aus der „induzierte" Klone isoliert werden können; alternativ können die angereicherten Moleküle einzeln amplifiziert und direkt sequenziert werden.
  • Ein alternatives Schema ist genau wie das oben beschriebene, außer dass man dabei nur an die Moleküle der „induzierten" Population einen labilen Affinitätsmarker anbringt, während der Affinitätsmarker auf der „nicht-induzierten" Population stabil ist. „Labil" in diesem Fall meint, dass der Affinitätsmarker bei Bedarf entfernt werden kann oder bei Bedarf in einer Weise verändert werden kann, so dass er nicht länger als Affinitätsmarker dient. In diesem Schema können alle Moleküle in dem Hybridisationsgemisch an die Affinitätsmatrix binden, jedoch nur solche „induzierten" Moleküle, die nicht an ein komplementäres „nicht-induziertes" Gegenstück hybridisieren, können selektiv aus der Matrix zurückgewonnen und anschließend kloniert zu werden.
  • Das Nachstehende ist ein spezifisches Beispiel für das erste oben beschriebene Schema, wobei cDNA-Populationen in Phagen-Klonierungsvektoren verwendet wurden. Die „induzierten" und „nicht-induzierten" cDNA-Populationen (hergestellt aus mRNA aus TMV-induzierten oder Schein-induzierten Tabakblättern in diesem Fall) wurden in zwei verschiedene Phagen kloniert, so dass die zur Amplifizierung der Kloninserts verwendeten Primer verschieden sein werden (und daher in späteren Schritten nicht hybridisieren). Die „induzierte" cDNA-Bank wurde in λGEM-4 (Promega, Inc.) hergestellt und die „nicht-induzierte" oder „Schein-induzierte" DNA-Bank wurde in λZAP-II (Stratagene, Inc.) hergestellt. Für jeden Vektor wurden spezifische Oligonukleotidprimer synthetisiert, so dass sie für Sequenzen in dem Phagenvektor stehen, die direkt an die cDNA-Klonierungsstelle angrenzen und dass, wenn man sie in einer Polymerasekettenreaktion in Gegenwart des entsprechenden Phagen verwendet, die in die cDNA-Klonierungsstelle klonierte DNA amplifiziert wird. Eine Population von Phagen, die für alle Mitglieder der jeweiligen Banken steht, wurde zusammen amplifiziert, so dass eine Population aus cDNA-Inserts entstand, die die Bank repräsentierte. Einer der Oligonukleotidprimer war jeweils biotinyliert, so dass ein spezifischer Strang jeder amplifizierten Bank-DNA positiv durch Avidin-Affinitätschromatographie und Strangtrennung selektiert und anschließend freigesetzt und der Biotin-selektierte Strang zurückgewonnen werden konnte; wichtig ist, dass die zur Biotinylierung verwendeten Primer derart ausgewählt werden, dass Stränge mit entgegengesetzter Polarität aus den „induzierten" und den „nicht-induzierten" cDNA-Banken ausgewählt werden.
  • Der Biotinmarker ist im Fall der „induzierten" DNA ein labiler Marker, und zwar dadurch, dass der Spacerarm, durch den die Biotingruppierung angefügt ist, eine Disulfidbindung enthält, und der Marker in der „nicht-induzierten" DNA ist ein stabiler Marker. In diesem Fall wird der Einzelstrang von der „induzierten" Population durch DTT-Behandlung freigesetzt, indem er seinen Biotinmarker verliert, und der Einzelstrang der „nicht-induzierten" Population wird durch Denaturierung des Avidinmoleküls freigesetzt, während er seinen Biotinmarker behält. Wird die zurückgewonnene „Ziel"-DNA (Einzelstrang aus der „induzierten" Bank) mit der zurückgewonnenen „Sonden"-DNA (Einzelstrang aus der „Schein-induzierten" oder „nicht-induzierten" Bank) hybridisiert, können die gebildeten Komplexe und überschüssige „Sonden"-DNA durch Affinitätschromatographie entfernt werden. Die zurückbleibende „Ziel"-DNA trägt weiterhin Primersequenzen, die ihre Rückgewinnung durch anschließende Reparatur- oder Amplifikation und Klonierung sehr einfach gestaltet.
  • In dem alternativen Schema werden sowohl die einzelsträngigen „Ziel"- als auch „Sonden"-DNAs durch Denaturierung des Avidins auf der Affinitätsmatrix zurückgewonnen und beide behalten dabei ihren Biotinmarker. Nach der Hybridisierung binden alle Moleküle an die Affinitätsmatrix und nach dem Waschen wird die nicht-hybridisierte „Ziel"-DNA, die den „labilen" Affinitätsmarker trägt, selektiv durch DTT von der Matrix eluiert.
  • Diese Modifikation ermöglicht eine positive Selektion der einzelsträngigen „Ziel"-DNA und vermeidet potentielle Probleme mit einer weniger als quantitativen Bindung des Hybrtdisationsgemischs an die Affinitätsmatrix. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber den zuvor beschriebenen ist die Fähigkeit solche Gene zu isolieren, die unter bestimmten Bedingungen in nur geringer Menge aktiviert werden und die bei einigen wichtigen biologischen Phänomenen eine ursächliche Rolle spielen. In beiden oben beschriebenen Verfahren wird die einzelsträngige „Ziel"- und „Sonden"-DNA durch Biotin-Avidin-Affinitätschromatographie erzeugt.
  • Ein alternatives Verfahren zur Erzeugung dieser einzelsträngigen Populationen ist ein Verfahren, das als „asymmetrische" PCR bezeichnet wird (Gyllensten und Erlich, 1988). Dieses besteht aus mehreren Zyklen von durch Polymerase vermittelter Verlängerung und Denaturierung, wie in der PCR, erfolgt jedoch in Anwesenheit nur einer der Primer. Der ausgewählte Primer bestimmt die Polarität der erhaltenen DNA, was die selektive Polarität, die in dem oben beschrieben Verfahren kritisch ist, zulässt. Die asymmetrische PCR kann in diesem Fall höchst einfach erfolgen, indem man als Templat eine kleine Menge der doppelsträngigen PCR-Produkte der jeweiligen Populationen verwendet, aus denen die überschüssigen Primer entfernt werden.
  • ABSCHNITT 4. CHIMÄRE GENE
  • Dieser Abschnitt beschreibt Kombinationen von cDNA-Sequenzen mit Sequenzen, welche die Transkription von cDNAs fördern, und solchen, die das Prozessieren des 3'-Endes der mRNA in den Pflanzenzellen erleichtern. Der erste Satz Beispiele betrifft die Konstruktion von Plasmiden, welche die Expressionskassette enthalten, und der zweite Abschnitt beschreibt das Subklonieren von cDNAs in die Kassetten, sowohl in Sense- als auch Antisense-Orientierung.
  • Abschnitt 4A: Konstruktion von Plasmiden, welche pflanzliche Expressionskassetten enthalten.
  • Beispiel 22: Konstruktion von pCGN1509 (Promotorkassette der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO)
  • pCGN1509 ist ein Expressionskassettenplasmid, das den regulatorischen 5'-Bereich und den Promotor aus einem Gen der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO und den 3'-Bereich des Octopinsynthase-(ocs)-Gens des Ti-Plasmids von A. tumefaciens enthält, mit einzigartigen Restriktionsstellen zwischen den zwei Teilen. Der regulatorische 5'-Bereich stammt letztlich von einem 3,4-kb-EcoRI-Fragment ab, welches das Gen TSSU3-8 der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO enthält (O'Neal et al., 1988).
  • Das 3,4-kb-EcoRI-Fragment aus TSSU3-8 wurde in die EcoRI-Stelle von M13-mp18 kloniert (Yanisch-Perron et al., 1985), so dass man einen M13-Klon 8B erhielt. Einzelsträngige DNA wurde als Templat zur Verlängerung des Oligonukleotidprimers „Sonde 1" (O'Neal et al., 1987) mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I verwendet. Die Verlängerungsprodukte wurden mit Mungbohnennuklease behandelt und dann mit HindIII verdaut, so dass ein 1450-bp-Fragment entstand, welches den Promotorbereich der kleinen Untereinheit enthielt; das Fragment wurde in mit HindIII-SmaII verdautes pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985) kloniert, so dass pCGN625 entstand. Das BamHI-EcoRI-Fragment von pCGN625 wurde in das BamHI-EcoRI-Fragment (Plasmidrückgrat) des mit BamHI-EcoRI verdauten pCGN607 kloniert, worin die SmaI-Stelle in. Position 11207 (Barker et al., 1983) des ocs-3'-Bereichs durch Ligation eines synthetischen BgIII-Linkers (Facciotti et al., 1985) in eine BgIII-Stelle umgewandelt wurde. Dies führte zu dem Plasmid pCGN630. Die BamHI-Stelle von pCGN630 wurden durch Verdau mit BamHI deletiert und durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase I entstand pCGN1502. Die KpnI-Stelle von pCGN1502 wurde durch einer BamHI-Stelle ersetzt, und zwar durch Verdau des pCGN1502 mit KpnI, Behandlung mit dem Klenow-Enzym und der Ligation eines synthetischen BamHI-Linkers. Das erhaltene Konstrukt war pCGN1509.
  • Beispiel 23: Konstruktion von pCGNl761 (eine doppelte CaMV-35S-Promotor/ Terminator-Kassette die eine Ampicillin-Resistenz enthält) und pCGNl431 (eine doppelte CaMV-35S-Promotor/Terminator-Kassette, die eine Chloramphenicol-Resistenz enthält)
  • pCGNl761 enthält einen doppelten CaMV-35S-Promotor und den tm-1-3'-Bereich mit einer EcoRI-Stelle dazwischen, die in einem von pUC-abstammenden Plasmidrückgrat enthalten sind. An die Promotor-EcoRI-3'-Prozessierungsstellen-Kassette grenzen Mehrfach-Restriktionsstellen für ein leichtes Entfernen an. Das Plasmid wird durch eine Reihe Schritte (siehe unten) aus dem ursprünglichen doppelten 35S-Plasmid, pCGN2113, gewonnen, welches selbst wiederum von pCGN164 und pCGN638 abstammt.
  • pCGN1431 enthält auch den doppelten CaMV-35S-Promotor und den tm-1-3'-Bereich mit einer zwischen diesen liegenden Mehrfachklonierungsstelle. Diese Promotor/ Terminator-Kassette ist in einem von pUC abstammden Vektor enthalten, der ein Chloramphenicolresistenz-Gen anstelle eines Ampicillinresistenz-Gens enthält. Zur einfachen Entfernung ist die Kassette durch Mehrfach-Restriktionsstellen eingegrenzt.
  • A. Konstruktion von pCGN986. pCGN986 enthält einen 35S-CaMV-35-Promotor und einen T-DNA-tm-1-3'-Bereich mit dazwischen angeordneten Mehrfach-Restriktionsstellen. pCGN986 stammt von einem weiteren Plasmid, pCGN206, ab, welches einen CaMV-35S-Promotor und einen anderen 3'-Bereich, dem 3'-Ende des CaMV-Bereichs VI, enthält. Der CaMV-35S-Promotor wird als AluI-Fragment (bp 7144-7734) (Gardner et al., 1981) in die HincII-Stelle von M13mp7 (Messing et al., 1981) kloniert, so dass C614 entsteht. Ein EcoRI-Verdau von C614 erzeugt das EcoRI-Fragment von C614, welches den 35S-Promotor enthält und in die EcoRI-Stelle von pUC8 (Vieira und Messing, 1982) kloniert wird, so dass pCGN147 entsteht.
  • pCGN148a, das einen Promotorbereich, einen selektierbaren Marker (Kanamycin mit 2 ATGs) und einen 3'-Bereich enthält, wurde durch den Verdau von pCGN528 mit BglII und Einfügen des BamHI-BglII-Promotorfragments aus pCGN147 hergestellt. Dieses Fragment wurde in die BglII-Stelle von pCGN528 kloniert, so dass die BglII-Stelle neben dem Kanamycin-Gen von pCGN5281ag.
  • Der Shuttlevektor pCGN528, der für dieses Konstrukt verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt: pCGN525 wurde durch den Verdau eines Plasmids, enthaltend Tn5 mit einem Kanamycin-Gen (Jorgensen et al., 1979), mit HindIII-BamHI und Einfügen des HindIII-BamHI-Fragments, welches das Kanamycinresistenz-Gen enthielt, in die HindIII-BamHI- Stellen des Tetracyclin-Gens von pACYC184 (Chang und Cohen, 1978) gewonnen. pCGN526 wurde durch Einfügen des BamHI-Fragments-19 aus pTiA6 (Thomashow et al., 1980), modifiziert mit XhoI-Linkern, die in die SmaI-Stelle eingefügt waren, in die BamHI-Stelle von pCGN525 hergestellt. pCGN528 wurde durch Deletieren der kleinen XhoI und Religieren gewonnen.
  • pCGN149a wurde durch Klonieren des BamHI-Kanamycin-Genfragments aus pMB9KanXXI in die BamHI-Stelle von pCGN148a hergestellt. pMB9KanXXI ist eine pUC4K-Variante (Vieira und Messing, 1982), bei der die XhoI-Stelle fehlt, die jedoch ein funktionales Kanamycin-Gen aus Tn903 enthält, so dass eine wirksame Selektion in Agrobacterium möglich ist.
  • pCGN149a wurde mit HindIII und BamHI verdaut und an pUC8, verdaut mit HindIII und BamHI, ligiert, so dass pCGN169 entstand. Dadurch wurde der Tn903-Kanamycinmarker entfernt. pCGN565 und pCGN169 wurden beide mit HindIII und PstI verdaut und ligiert, so dass pCGN203 entstand, ein Plasmid, welches den CaMV-35S-Promotor und einen Teil des 5'-Endes des Tn5-Kanamycin-Gens (bis zur PstI-Stelle, Jorgensen et al., 1979) enthielt. Ein regulatorischer 3'-Bereich aus pCGN204 (ein EcoRI-Fragment von CaMV (bp 408-6105)), welches den 3'-Bereich des Gens VI subkloniert in pUC18 (Gardner et al., 1981) enthielt, wurde durch den Verdau mit HindIII und PstI und die Ligation an pCGN203 angefügt. Die erhaltene Kassette, pCGN206, war Grundlage für die Konstruktion von pCGN986.
  • Die pTiA6 T-DNA-tm-1-3'-Sequenzen wurden aus Bam19 T-DNA-Fragmenten (Thomashow et al., 1980) als ein BamHI-EcoRI-Fragment (Nukleotide 9062 bis 12, 823, Nummerierung wie in Barker et al., 1983) subkloniert und mit dem pACYC184 (Chang und Cohen, 1978) Replikationsursprung als EcoRI-HindII-Fragment und einem Gentamycin-Resistenzmarker (aus dem Plasmid pLB41), [D. Figurski] als BamHI-HindII-Fragment kombiniert, so dass man pCGN417 erhielt.
  • Die einzigartige SmaI-Stelle von pCGN417 (Nukleotid 11.207 aus dem Bam19-Fragment) wurde mit Hilfe von Linkem in eine SacI-Stelle umgewandelt und das BamHI-SacI-Fragment wurde in pCGN565 subkloniert, so dass pCGN971 entstand. Die BamHI-Stelle von pCGN971 wurde mit Hilfe von Linkern in eine EcoRI-Stelle umgewandelt, so dass man pCGN971E erhielt. Das erhaltene EcoRI-SacI-Fragment aus pCGN971E, welches die regulatorische tm-1-3'-Sequenz enthielt, wurde durch Verdau mit EcoRI und SacI an pCGN206 angefügt, so dass pCGN975 entstand. Ein kleiner Teil des Tn5-Kanamycinresistenz-Gens wurde vom 3'-Ende des CaMV-35S-Promotors durch Verdau mit SaII und BgIII deletiert, so dass stumpfe Enden entstanden, und die Ligation erfolgte mit SaII-Linkern. Die fertige Expressionskassette pCGN986 enthielt den CaMV-35S-Promotor und nachfolgend zwei SaII-Stellen, eine Xbal-Stelle, BamHI, SmaI, KpnI und die tm-1-3'-Region (Nukleotide 11207-9023 der T-DNA).
  • B. Konstruktion von pCGN164. Das AluI-Fragment von CaMV (bp 7144-7735) (Gardner et al., 1981) wurde durch Verdau mit AluI gewonnen und in die HincII-Stelle von M13mp7 (Vieira und Messing, 1982) kloniert, um C614 zu erzeugen. Ein EcoRI-Verdau von C614 erzeugte das EcoRI-Fragment aus C614, welches den 35S-Promotor enthielt und in die EcoRI-Stelle von pUC8 (Vieira und Messing, 1982) kloniert wurde, so dass man pCGN146 erhielt. Um den Promotorbereich zurecht zu schneiden, wurde die BglII-Stelle (bp 7670) mit BglII und Bal31 behandelt und anschließend wurde ein BglII-Linker an die mit Ba131 behandelte DNA angebracht, um pCGN147 zu erzeugen. pCGN147 wurde mit EcoRI, HphI verdaut und das erhaltene EcoRI-HphI-Fragment, welches den 35S-Promotor enthielt, wurde in das mit EcoRI-Small verdaute M13mp8 (Vieira und Messing 1982) ligiert, um pCGN164 zu erzeugen.
  • C. Konstruktion von pCGN638. Der Verdau von CaMV10 (Gardener et al., 1981) mit BglII erzeugte ein BglII-Fragment, welches einen 35S-Promotorbereich (bp 6493-7670) enthielt und in die BamHI-Stelle von pUC19 (Norrander et al., 1983) ligiert wurde, so dass pCGN638 entstand.
  • D. Konstruktion von pCGN2113. pCGN164 wurde mit EcoRV und BamHI verdaut, so dass ein EcoRV-BamHI-Fragment freigesetzt wurde, welches einen Teil des 35S-Promotors (bp 7340-7433) enthielt; pCGN638 wurde mit HindIII und EcoRV verdaut, so dass ein HindIII-EcoRV-Fragment, welches einen anderen Teil des 35S-Promotors enthielt (bp 6493-7340), freigesetzt wurde. Diese zwei Fragmente wurden in pCGN986, das mit HindIII und BamHI verdaut worden war, um das HindIII-BamHI-Fragment, welches den 35S-Promotor enthielt, zu entfernen, ligiert; diese Ligation erzeugte pCGN639 mit dem Rückgrat und dem tm-1-3'-Bereich aus pCGN986 sowie die zwei 35S-Promotorfragmente aus pCGN164 und pCGN638. pCGN638 wurde mit EcoRV und DdeI verdaut, so dass ein Fragment des 35S-Promotors (bp 7070-7340) freigesetzt wurde; das Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und wurde in die EcoRV-Stelle von pCGN639 ligiert, so dass pCGN2113 mit dem Fragment in der richtigen Orientierung entstand.
  • E. Konstruktion von pCGN1761. pCGN2113 wurde mit EcoRI verdaut und das Plasmid wurde in Gegenwart eines synthetischen DNA-Adaptors, der eine XbaI-Stelle und eine BamHI-Stelle enthielt (der Adaptor enthielt klebrige EcoRI-Enden am einen Ende, die benachbarten Basen waren jedoch derart, dass sich an dieser Stelle keine neue eine EcoRI-Stelle bildete) enthielt, ligiert, so dass pCGN2113M entstand. pCGN2113M wurde vollständig mit SacI verdaut und dann einem Teilverdau mit BamHI unterworfen. Diese DNA wurde dann mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und ein EcoRI-Linker wurde in das Plasmid mit den stumpfen Enden ligiert. Nach der Transformation wurde ein Plasmidklon, der eine einzigartige EcoRI-Stelle zwischen dem Promotor und dem intakten tm-1-3'-Bereich enthielt, ausgewählt und als pCGN1761 bezeichnet.
  • F. Konstruktion von pCGN1431. Das SaII-EcoRI-Fragment von pCGN2113, welches die gesamte Promotor-Polylinker-3'-Kassette enthielt, wurde durch SaII-EcoRI-Verdau entfernt und in das mit SaII-EcoRI verdaute pCGN565 kloniert, umd pCGN2120 zu erzeugen; pCGN565 ist ein Klonierungsvektor auf Basis von pUC8-Cm [K. Buckley, Dissertation, UC San Diego 1985], enthielt jedoch den Polylinker pUCl8 (Yanisch-Perron et al., 1985). pCGN2120 wurde vollständig mit PstI verdaut und dann wieder ligiert. Ein Klon wurde ausgewählt, bei dem nur das 858-bp-PstI-PstI-Fragment (9207-10065, Barker et al., 1983) aus der tm-1-3'-Region deletiert war, so dass pCGN1431 entstand.
  • Abschnitt 4B: Chimäre Gene Beispiel 24: Konstruktion von pCGN1752A und pCGN1752B (SSU-Promotor/PR-1A-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung))
  • Das 807-bp-EcoRI-Fragment aus pBSPRI-207 wurde in mit EcoRI verdautes pCGN1509 subkloniert und die Plasmide, die die cDNA in beiden möglichen Orientierungen enthielten, wurden ausgewählt; ein Plasmid, bei dem anzunehmen ist, dass der Promotor der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO ein Transkript mit dem mRNA-Sense-Strang von PR-1a erzeugt, wurde als pCGN1752A bezeichnet, und ein Plasmid, bei dem man erwarten würde, dass der Promotor der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO ein Transkript mit dem Antisense-Strang (d. h. der komplementären Sequenz zu der mRNA) von PR-1a erzeugt, wurde als pCGN1752B bezeichnet.
  • Beispiel 25: Konstruktion von pCGN1753A und pCGN1753B (SSU-Promotor/PR-1B-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung))
  • Das 717-bp-EcoRI-Fragment aus pBSPRI-1023 wurde in mit EcoRI verdautes pCGN1509 subkloniert und die Plasmide, welche die cDNA in einer der zwei möglichen Orientierungen enthielten, wurden ausgewählt; ein Plasmid, bei dem zu erwarten war, dass der Promotor der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO ein Transkript mit dem mRNA-Sense-Strang von PR-lb bildet, wurde als pCGN1753A bezeichnet, und ein Plasmid, in dem man erwarten würde, dass der Promotor der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO ein Transkript mit dem Antisense-Strang (d. h. der komplementären Sequenz der mRNA) von PR-lb erzeugt, wurde als pCGN1753B bezeichnet.
  • Beispiel 26: Konstruktion von pCGN1762A und pCGN1762B (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-1A-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung))
  • Ein 807-bp-EcoRI-Fragment, das die Tabak-PR1a-cDNA enthielt, wurde durch EcoRI-Verdau aus pBSPRI-207 freigesetzt und in mit EcoRI verdautes pCGN565 subkloniert, so dass man pCGN1750 erhielt. Ein 717-bp-EcoRI-Fragment, welches den gesamten kodierenden Bereich einer Tabak-PR-1b-cDNA enhielt, wurde durch Verdau mit EcoRI aus pBSPRI-1023 freigesetzt und in mit EcoRI verdautes pCGN565 subkloniert, so dass pCGN1751 entstand. Diese zwei Plasmide wurden konstruiert, um nachfolgende Subklonierungsexperimente zu vereinfachen.
  • Das 807-bp-EcoRI-Fragment von pCGN1750 wurde in mit EcoRI verdautes pCGN1761 subkloniert und die Plasmide, die die cDNA in einer der zwei möglichen Orientierungen enthielten, wurden ausgewählt; ein Plasmid, bei dem zu erwarten war, dass ein doppelter 35S-Promotor ein Transkript mit dem mRNA-Sense-Strang von PR-1a erzeugt, wurde als pCGN1762A bezeichnet und ein Plasmid, bei dem man erwartete, dass der doppelte 355-Promotor ein Transkript mit dem Antisense-Strang (d. h. der komplementären Sequenz der mRNA) von PR-1a erzeugt, wurde als pCGN1762B bezeichnet.
  • Beispiel 27: Konstruktion von pCGN1763A und pCGN1763B (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-1b-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung))
  • Das 717-bp-EcoRI-Fragment von pCGN1751 (siehe oben) wurde in mit EcoRI verdautes pCGN1761 subkloniert und Plasmide, die die cDNA in einer der beiden möglichen Orientierungen enthielten, wurden ausgewählt; ein Plasmid, bei dem zu erwarten war, dass der doppelte 35S-Promotor ein Transkript mit dem mRNA-Sense-Strang von PR-lb erzeugt, wurde als pCGN1763A bezeichnet, und ein Plasmid, von dem zu erwarten war, dass der doppelte 35S-Promotor ein Transkript mit dem Antisense-Strang (d. h. der komplementären Sequenz der mRNA) von PR-1b erzeugt, wurde als pCGN1763B bezeichnet.
  • Beispiel 28: Konstruktion von pCIB1002 und pCIB1003 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-R-Haupt-Expressionskassetten (Sense- und Antisense-Orientierung))
  • Das Plasmid pBSPRR-401 wurde teilweise mit EcoRI verdaut und die enthaltenen DNA-Fragmente wurden auf einem 1,0%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt. Eine Bande von etwa 900 bp, welche das Full-length-PR-R-cDNA-Insert enthielt, wurde ausgeschnitten und mit pCGN1761 ligiert, welches vollständig mit EcoRI verdaut und mit Hilfe von Intestinaler Alkalischer Phosphatase vom Kalb dephosphoriliert worden war. Die DNA wurde wie oben beschrieben ligiert und transformiert, positive Kolonien wurden gescreent und deren Plasmide analysiert. Ein Plasmid, welches die PR-R-cDNA in einer Sense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor enthielt, wurde ausgewählt und als pCIB 1002 bezeichnet. Ein zweites Plasmid, welches die PR-R-cDNA in einer Antisense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor enthielt, wurde ausgewählt und pCIB 1003 bezeichnet.
  • Beispiel 29: Konstruktion von pCIB1020 und pCIB1021 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/ PR-R-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung))
  • Das Plasmid pBScht28 (siehe oben) wurde mit EcoRI verdaut und die Fragmente wurden auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt. Die Bande, welche die Pr-P-cDNA enthielt, wurde ausgeschnitten und mit pCGN1761 (siehe oben), welches mit EcoRI verdaut worden war, gemischt, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel gereinigt. Das Gemisch wurde wie oben beschrieben ligiert und transformiert. Die Plasmide wurden nach einem Insert der PR-P-cDNA in einer beliebigen Orientierung gescreent. Ein Plasmid, in dem die PR-P-cDNA in einer Sense-Orientierung mit Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor eingefügt war, wurde als pCIB1020 bezeichnet. Ein Plasmid, in dem die PR-P-cDNA in einer Antisense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor eingefügt war, wurde als pCIB1021 bezeichnet.
  • Beispiel 30: Konstruktion von pCIB1022 und pCIB1023 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-Q-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierun
  • Die Full-length-cDNA-Sequenz von PR-Q ist in zwei verschiedenen Plasmiden enthalten; PBScht15 enthält das 3'-Ende der cDNA und pBSchtS'-4 enthält das 5'-Ende der cDNA. Aufgrund dieser Situation wurden die Plasmide pCIB1022 und pCIP1023 in einer Drei-Weg-Ligation konstruiert und unterscheiden sich in ihrer Orientierung in dem pCGNl761-Vektor. pCGN1761 wurde mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel gereinigt. pBScht15 (siehe oben) wurde mit NsiI und EcoRI verdaut und die Fragmente wurden aus einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt. Eine PCR wurde mit Hilfe von pBSchtS'-4 (siehe oben) als Templat und den Oligonukleotiden
    Figure 00640001

    als Primer durchgeführt, um das 5'-Ende der PR-Q-cDNA zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit NsiI und EcoRI verdaut und das 210-bp-Produkt wurde aus einem 1,0%-igen LGT-Agarosegel gereinigt. Der gereinigte pCGN1761-Vektor, das 810-bp-Nsil/EcoRI-Fragment aus pBScht15 und das mit Nsil/EcoRI verdaute PCR-Fragment wurden ligiert und wie oben beschrieben transformiert. Die Transformanten wurden gescreent und nach solchen ausgewählt, die die gesamte cDNA in einer der Orientierungen enthielten. Ein Plasmid, welches eine Full-length-PR-Q-cDNA in einer Sense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor enthielt, wurde als pCIB 1022 bezeichnet. Ein Plasmid, welches die Full-length-PR-Q-cDNA in Antisense-Orientierung in Bezug auf den Promotor enthielt, wurde als pCIB1023 bezeichnet.
  • Beispiel 31: Konstruktion von pCIB1024 und pCIB1025 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/pR-O'-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung))
  • Die in pBSGL6e klonierte PR-O'-cDNA ist am 5'-Ende trunkiert und es fehlt ihr fast die gesamte Signalsequenz. Diese Sequenz ist für den extrazellulären Transport des Proteins erforderlich und sollte ersetzt werden, um transgene Pflanzen herzustellen, die das Protein sekretieren. Dieses Beispiel beschreibt das Subklonieren der PR-O'-cDNA in die doppelte CaMV-35S-Expressionskassette in einer solchen Weise, dass ein Signalpeptid von PR-1a an das PR-O'-Protein angefügt wird.
  • Diese Konstruktion erfolgte in einer schwierigen Drei-Weg-Ligation. Zuerst erfolgte eine Fusion des PR-1a-Leit-und Signalpeptids an die kodierende Sequenz des fertigen PR-O' durch ein PCR-Genfusionsverfahren. Dieses Teil wurde dann zusammen mit dem 3'-Ende der PR-O'-cDNA in den pCGN1761-Vektor ligiert und Transformanten, die das Insert in einer beliebigen Orientierung in Bezug auf den Promotor enthielten, wurden ausgewählt.
  • Eine Genfusionstechnik, die auf der PCR-Amplifikation beruht, wurde von Ho et al. (1989) entwickelt. In diesem Verfahren wird eine Genfusion erreicht, indem man zwei Fragemente mit überlappenden Enden durch PCR herstellt. In einer anschließenden Reaktion werden diese zwei Fragmente dann auch durch PCR fusioniert, so dass eine perfekte Fusion zwischen den zwei Molekülen entsteht. Diese Strategie wurde zum Fusionieren des PR-1a-Signalpeptids und des Leitmoleküls an die PR-O'-cDNA verwendet. Es wurden vier Oligonukleotide mit nachstehenden Sequenzen synthetisiert:
    Figure 00650001
  • Die GP50- und GP51-Oligonukleotide sind komplementär zueinander und enthalten die gewünschte DNA-Sequenz für die Fusion zwischen der PR-1a-Leit- und Signal-Sequenz und der reifen PR-O'-Kodierungssequenz. Dies ist nachstehend dargestellt:
    Figure 00650002
  • Das Oligonukleotid GP52 besitzt die gleiche Sequenz wie das 5'-Ende der PR-1a-cDNA und enthält am 5'-Ende eine Sequenz, die für eine EcoRI-Stelle kodiert.
  • Figure 00650003
  • Das Oligonukleotid GP53 dient als Primer und ist komplementär zu den Positionen 180 bis 195 der PR-O'-Sequenz, Sequenz 7.
  • Um die zwei DNA-Stücke zu fusionieren wurden PCRs aufgestellt. Eine verwendet das Plasmid pBSPR1-207 als Templat und die zwei Primer GP52 und GP50; die andere verwendet pBSGL6e als Templat und die Primer GP51 und GP53. Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Die PCR-Produkte wurden dann gereinigt und jeweils ein Aliquot wurde in einer zweiten PCR-Stufe verwendet. In dieser Reaktion waren die Template die beiden Produkte aus den ersten zwei Reaktionen und die Primer waren GP52 und GP53. Eine modifizierte PCR wurde aufgestellt, so dass in der ersten Syntheserunde die DNA-Template ohne Primer zugegeben und die Template erwärmt und anschließend gekühlt und dann bei 65°C verlängert wurden. Die zwei Primer wurden dann zugegeben und die PCR wurde auf normale Weise fortgeführt. Ein Aliquot der PCR-Produkte wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Die zurückbleibende DNA wurde dann gereinigt und mit SacI und EcoRI verdaut und der Verdau auf einem 1,5%igen LGT-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Bande, die dem richtigen PCR-Produkt entsprach, wurde ausgeschnitten und zur Ligation verwendet.
  • Das Plasmid pBSGL6e wurde sowohl mit SacI als auch EcoRI verdaut und der Verdau wurde auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die 1,0-kb-Bande, welche das große PR-O'-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten und mit dem SacI-EcoRI-PCR-Produkt von oben und dem Plasmid pCGN1761, welches mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel gereinigt worden war, ligiert. Die Fragmente wurden wie oben beschrieben ligiert und transformiert. Transformanten wurden nach dem richtigen Konstrukt gescreent. Ein Plasmid, worin die PR-1a-Leit- und Signalsequenz an die reife kodierende PR-O'-Sequenz fusioniert worden war und in Sense-Orientierung in Bezug auf den Promotor vorlag, wurde als pCIB 1024 bezeichnet; dieses Konstrukt wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Ein Plasmid mit der richtigen Fusion, jedoch in entgegengesetzter Orientierung in Bezug auf den Promotor, wurde als pCIB1025 bezeichnet. Dieses Konstrukt wurde auch durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Beispiel 31A: Konstruktion von pCIB1024A und pCIB1025A (Doppel-35S-Promotor/ PR-O'-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung
  • Das Plasmid pBSGLSB-12, welches die Full-length-cDNA, die für das PR-O'-Protein kodiert, enthielt, wurde mit EcoRI verdaut und die Fragmente wurden auf einem 0,5%igen LGT-Agarosegel aufgetrennt. Die 1,2-kb-Bande wurde ausgeschnitten und mit pCGN1761, welches wie oben beschrieben mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel gereinigt worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde wie beschrieben transformiert und die Transformanten wurden nach einem Klon gescreent, der die PR-O'-cDNA in einer der beiden Orientierungen enthielt. Ein Plasmid, worin die cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor eingefügt war, wurde als pCIB1024 bezeichnet. Ein Plasmid, worin die cDNA in Antisense-Orientierung in Bezug auf den Promotor eingefügt war, wurde als pCIB1025A bezeichnet.
  • Beispiel 31B: Konstruktion von pCIB1032 und pCIB1033 (Doppel-35S-PromotorlPR-2-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung
  • Das Plasmid pBSGL117 enthielt eine Full-length-cDNA, die für das PR-2-Protein kodierte. Die PR-2-cDNA aus pBSGL117 wurde in das pCGN1761-Expressionsplamid in beiden Orientierungen subkloniert, so dass pCIB 1032 und pCIB 1033 entstanden. Die cDNA enthielt jedoch eine interne EcoRI-Stelle und so musste die cDNA durch Teilverdau mit EcoRI ausgeschnitten werden.
  • Das Plamid pBSGL117 wurde unter Bedingungen, unter denen ein Teilverdau erfolgt, mit EcoRI verdaut. Die Produkte aus dem Verdau wurden auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt und die 1,2-kb-Bande, welche die Full-length-cDNA für PR-2 enthielt, wurde ausgeschnitten und mit pCGN1761 ligiert, welches mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt worden war. Die Ligation und Transformation wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Positive Transformanten wurden isoliert und in Gegenwart des großen PR-2-cDNA-Fragments, das in einer der beiden Orientierungen eingefügt war, gescreent. Ein Plasmid, worin die PR-2-cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf die Transkriptions-Startstelle subkloniert war, wurde als pCIB1032 bezeichnet und ein Plasmid mit dem Fragment in Antisense-Orientierung wurde als pCIB1033 bezeichnet. Die Struktur dieser Konstrukte kann durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
  • Beispiel 31C: Konstruktion von pCIB1034 undpCIB1035 Doppel-35S-Promotor/PR-2-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung)
  • Ein Plasmid, welches die für das PR-N-Protein kodierende Full-length-cDNA enthielt, wurde als Quelle zum Subklonieren der PR-N-cDNA in das pCGN1761-Expressionsplasmid in beiden Orientierungen verwendet. Die resultierenden Plasmide wurden als pCIB1034 und pCIB1035 bezeichnet. Die cDNA enthielt jedoch eine interne EcoRI-Stelle und so musste die cDNA durch Teilverdau ausgeschnitten werden.
  • Das Plasmid, das die Full-length-PR-N-cDNA enthielt, wurde mit EcoRI unter Bedingungen verdaut, die zu einem Teilverdau führen. Die Produkte des Verdaus wurden auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt und die 1,2-kb-Bande, die die Full-lengthcDNA für PR-N enthielt, wurde ausgeschnitten und mit pCGNl761 ligiert, welches mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel gereinigt worden war. Die Ligation und Transformation erfolgte wie zuvor beschrieben.
  • Positive Transformanten wurden isoliert und auf das Vorliegen des großen PR-N-cDNA-Fragments, das in einer der beiden Orientierungen eingefügt war, gescreent. Ein Plasmid, in dem die PR-N-cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf die Transkriptions-Startstelle subkloniert war, wurde als pCIB1034 bezeichnet und ein Plasmid, in dem das Fragment in Antisense-Orientierung eingefügt war, wurde als pCIB1035 bezeichnet. Die Struktur dieser Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Beispiel 31D: Konstruktion von pCIB1036 und pCIB1037 (Doppel-35S-Promotor/PR-O-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung)
  • Ein Plasmid, welches die Full-length-cDNA, die für das PR-O-Protein kodiert, enthielt, wurde als Ausgangsmaterial zum Subklonieren der PR-O-cDNA in das pCGN1761-Expressionsplasmid in eine der beiden Orientierungen verwendet. Die erhaltenen Plasmide wurden als pCIB 1036 und pCIB 1037 bezeichnet. Die cDNA enthielt jedoch eine interne EcoRI-Stelle und so musste die cDNA durch Teilverdau mit EcoRI ausgeschnitten werden.
  • Das Plasmid, das die Full-length-PR-O-cDNA enthielt, wurde mit EcoRI unter Bedingungen verdaut, die zu einem Teilverdau führen. Die Produkte des Verdaus wurden auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt und die 1,2-kb-Bande, die die Full-lengthcDNA für PR-O enthielt, wurde ausgeschnitten und an pCGN1761 ligiert, welches mit EcoRI ausgeschnitten, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel gereinigt worden war. Die Ligation und Transformation erfolgte wie zuvor beschrieben. Positive Transformanten wurden isoliert und auf das Vorliegen des großen PR-O-cDNA-Fragments, eingefügt in einer der beiden Orientierungen, gescreent. Ein Plasmid, welches die PR-O-cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf die Transkriptions-Startstelle als Subklon enthielt, wurde als pCIB1036 bezeichnet und ein Plasmid, mit dem Fragment in Antisense-Orientierung, wurde als pCIB1037 bezeichnet. Die Struktur dieser Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Beispiel 31E: Konstruktion von pCIB1038 und pCIB1039 (Doppel-35S-Promotor/PR-2'-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung)
  • Ein Plasmid (pBSGL135 aus Beispiel 18B), welches eine Full-length-cDNA enthielt, die für das PR-2'-Protein kodierte, wurde als Ausgangsmaterial zum Subklonieren der PR-2'cDNA in das pCGN1761-Expressionsplasmid in beliebiger Orientierung verwendet. Die erhaltenen Plasmide wurden als pCIB1038 und pCIB1039 bezeichnet. Die cDNA enthielt jedoch eine interne EcoRI-Stelle und so musste die cDNA durch Teilverdau mit EcoRI ausgeschnitten werden.
  • Das Plasmid, das die Full-length-PR-2'-cDNA enthielt, wurde mit EcoRI unter Bedingungen verdaut, die einen Teilverdau zuließen. Die Produkte des Verdaus wurden auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt und die 1,2-kb-Bande, die die Fulllength-cDNA für PR-2' enthielt, wurde ausgeschnitten und an pCGN1761 ligiert, welches mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel gereinigt worden war.
  • Die Ligation und Transformation erfolgte wie zuvor beschrieben. Positive Transformanten wurden isoliert und auf das Vorliegen des in beliebiger Orientierung eingefügten großen PR-2'-cDNA-Fragments, gescreent. Ein Plasmid, bei dem die PR-2'-cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf die Transkriptions-Startstelle subkloniert worden war, wurde als pCIB1038 bezeichnet und ein Plasmid, mit dem Fragment in Antisense-Orientierung, wurde als pCIB1039 bezeichnet. Die Struktur dieser Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Beispiel 32: Konstruktion von pCIB1005B und pCIB1006B (Doppelter CaMV-35S-Promotor/basische Glucanase-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung)
  • Das Plasmid pGLN17 ist eine Hybrid-cDNA, die für die basische (β-1,3-Glucanase aus N. tabacum (Shinshi et al., 1988) kodiert, die durch Fusionierung des 5'-Endes des pGL31-Klons mit dem 3'-Ende des pGL36-Klons konstruiert wurde. Die von dieser HybridcDNA kodierten Sequenz war wie folgt: Sequenz 13: cDNA-Sequenz des basischen (β-1,3-Glucanase-cDNA-Hybrids, kloniert in das Plasmid pGLN17
    Figure 00700001
    Figure 00710001
  • Diese cDNA ist am 5'-Ende trunkiert und kodiert nicht für das gesamte Signalpeptid. Um eine transgene Pflanze herzustellen, in der dieses Protein richtig zielgeführt wird (d. h. in die zentrale Vakuole), ist es erforderlich, diese Sequenz wieder an die trunkierte cDNA anzufügen. Daher wurde die Expressionskassette mit dem doppelten CaMV-35S in einem Zweischrittverfahren konstruiert. Im ersten Schritt wurde das Signalpeptid der cDNA durch ein Signalpeptid ersetzt, das von dem genomischen Klon kodiert wird. In dem zweiten Schritt wurde diese „reparierte cDNA" in den Expressionsvektor verlegt.
  • Das Plasmid pSGL2 ist ein Subklon der pGLN17-cDNA. Dieses Plasmid wurde mit ClaI und EcoRI verdaut und das 1-kb-Fragment, welches die Glucanase-cDNA enthielt, wurde aus einem LGT-Agarosegel isoliert. Das pBluescript-Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem LGT-Agarosegel gereinigt.
  • Das Plasmid pBS-Gluc-39,1 enthielt ein 4,4-kb-Insert, welches die für Glucanase kodierende Sequenz, etwa 1,5 kb der 5'-flankierenden Sequenz, ein 600-bp-Intron und etwa 1 kb der 3'-flankierenden Sequenz enthielt. Dieses Plasmid wurde als Templat in einem PCR-Versuch verwendet, der nachstehende zwei Primer umfasste:
    Figure 00720001
  • Das Ergebnis dieser Amplifikation besteht darin ein Fragment zu erzeugen, mit dem das trunkierte 5'-Ende der Glucanase-cDNA ersetzt werden kann. Eine Punktmutation, die eine EcoRI-Stelle erzeugt, wurde eingeführt, um die Klonierungsversuche zu erleichtern. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und ClaI verdaut und die Fragmente wurden auf einem 2,0%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt. Eine 120-bp-Bande wurde ausgeschnitten, mit dem 1-kb-ClaI-EcoRI-Fragment aus pSGL2 und dem gereinigten, mit EcoRI verdauten Bluescript-Vektor gemischt, ligiert und wie oben beschrieben transformiert. Die Transformanten wurden auf das Vorliegen des Inserts gescreent und ein Plasmid mit der richtigen Struktur wurde als pCIB 1009 bezeichnet.
  • Das Plasmid pCIB1009 wurde mit EcoRI verdaut und das 1,2-kb-Fragment wurde auf einem LGT-Agarosegel gereinigt. Das Plasmid pCGN1761 wurde mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt, auf einem LGT-Agarosegel gereinigt, mit dem 1,2-kb-EcoRI-Fragment gemischt und dann ligiert und transformiert. Die Transformanten wurden auf das Vorliegen des Inserts gescreent. Ein Plasmid, in dem die Glucanase-cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf den CaMV-Promotor vorlag, wurde als pCIB 1005B bezeich net. Ein weiteres Plasmid, worin das cDNA-Insert in Antisense-Orientierung vorlag, wurde als pCIB 1006B bezeichnet.
  • Beispiel 33: Konstruktion von pCIB1007 und pCIB1008 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/ basische Chitinase-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung)
  • Das Plasmid pSCH10 enthielt ein cDNA-Insert der basischen Tabak-Chitinase, das ähnlich zu dem Insert in pCFiN50 (Shinshi, H. et al., 1987) ist, jedoch mit einer 81-bp-Verlängerung am 5'-Ende. Die zusätzlichen 80 bp sind:
    Figure 00730001
  • pSCH10 wurde mit BamHI verdaut und dann mit einem molekularen Adaptor mit der Sequenz 5'-GATCCGGAATTCCG-3', wie in Beispiel 5 beschrieben, ligiert. Das Ligationsprodukt wurde dann gereinigt und mit EcoRI verdaut und das 1,2-kb-Fragment, das die angepasste Chitinase-cDNA enthielt, wurde aus einem LGT-Agarosegel gereinigt.
  • Dieses Fragment wurde mit dem mit EcoRI verdauten, mit CIAP behandelten pCGNl761 gemischt, welches auch von einem LGT-Agarosegel gereinigt worden war, und das Gemisch wurde ligiert und transformiert. Die Transformanten wurden nach ChitinasecDNA-Inserts gescreent und ein Plasmid, welches die Chitinase-cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf den CaMV-Promotor enthielt, wurde als pCIB 1007 bezeichnet. Ein Plasmid mit der Chitinase-cDNA in Antisense-Orientierung in Bezug auf den Promotor wurde als pCIB 1008 bezeichnet.
  • Beispiel 34: Konstruktion von pCGN1788A und pCGN1788B (Doppelter CaMV-35S-Promotor/SAR8.2-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung)
  • Die pSAR8.2a-cDNA (siehe oben) wurde in die doppelter CaMV-35S-Promotor/3'tm-1-Terminator-Kassette pCGN1431 (siehe oben) subkloniert, wobei ein PCR-Amplifika tionsverfahren verwendet wurde. Vier Oligonukleotide, zwei für jedes der Sense- und Antisense-Konstrukte und jeweils 33 Nukleotide lang, wurden zur Verwendung als Primer synthetisiert, um die cDNA-Sequenz von pSAR8.2a mittels PCR und mit Hilfe des Plasmids pSAR8.2a als Templat herzustellen. Die Primer enthielten zusätzliche Sequenzen an ihren 5'-Enden, die neuen Restriktionsstellen nach Abschluss der PCR-Amplifikation erzeugten.
  • Für das Sense-Konstrukt war die Sequenz des Oligonukleotids 1167
    Figure 00740001

    welche eine SstI-Stelle in der Nähe des 3'-Endes der cDNA-Sequenz erzeugt.
  • Die Sequenz des Oligonukleotids 1168 war
    Figure 00740002

    und erzeugte eine BamHI-Stelle in der Nähe des 5'-Endes der cDNA.
  • Für das Antisense-Konstrukt war die Sequenz des Oligonukleotids 1224
    Figure 00740003

    welche eine BamHI-Stelle in der Nähe des 3'-Endes der cDNA erzeugt.
  • Die Sequenz des Oligonukleotids 1225 war
    Figure 00740004

    und erzeugte eine SstI-Stelle nahe dem 5'-Ende der cDNA.
  • Die Oligonukleotide 1167 und 1168 wurden in einer PCR verwendet, in der das Plasmid pSAR8.2a als DNA-Templat diente. Das in dieser Reaktion erzeugte gereinigte PCR-Produkt wurde mit SstI und BamHI verdaut und in pCGNl431 kloniert, welches mit SstI und BamHI verdaut worden war. Die DNA wurde transformiert und die Plasmide auf das Vorliegen des pSAR8.2a-cDNA-Inserts in Sense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor gescreent. Putative Plasmide wurden dann einer DNA-Sequenzierung unterworfen und eines, welches die richtige Orientierung hatte, und keine eingeführten Mutationen enthielt, wurde als pCGN1788A bezeichnet.
  • Für das Antisense-Konstrukt wurden die Oligonukleotide 1224 und 1225 wie oben beschrieben in einer PCR eingesetzt. Nach dem Verdau mit SstI und BamHI wurde die DNA in mit SstI und BamHI verdautes pCGN1431 kloniert. Putativ positive Plasmide wurden auf die Insertion der cDNA in Antisense-Orientierung in Bezug auf den Promotor gescreent und die Konstrukte wurden durch Sequenzieren der gesamten cDNA bestätigt.
  • Ein Plasmid, in dem die cDNA in der richtigen Orientierung eingefügt war und die DNA-Sequenz richtig war, wurde als pCGN1788B bezeichnet.
  • Beispiel 35: Konstruktion von pCIB1000 und pCIB1001 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/Gurkenchitinase/Lysozym-Expressionskassette (Sense- und Antisense-Orientierung)
  • Das Plasmid, pBScuccht5 (auch als pBSucchi/Chitinase bezeichnet) wurde mit EcoRI verdaut und die Fragmente wurden auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel aufgetrennt. Die 1,2-kb-Bande wurde ausgeschnitten und mit pCGNl761 ligiert, welches mit EcoRI verdaut, mit CIAP behandelt und auf einem 0,5%-igen LGT-Agarosegel, wie oben beschrieben, gereinigt worden war. Das Ligationsgemisch wurde wie beschrieben transformiert und die Transformanten wurden auf das Vorliegen der Chitinase/LysozymcDNA in beliebiger Orientierung gescreent. Ein Plasmid, worin die cDNA in Sense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor eingefügt worden war, wurde als pCIB 1000 bezeichnet. Ein Plasmid, worin die cDNA in Antisense-Orientierung in Bezug auf den doppelten CaMV-35S-Promotor eingefügt worden war, wurde als pCIB 1001 bezeichnet.
  • ABSCHNITT 5. VEKTOREN
  • Dieser Abschnitt beschreibt ausführlich die Konstruktion binärer Vektoren, die alle chimären Gene enthalten. Der erste Abschnitt erläutert die Entwicklung der einzusetzenden binären Vektoren und der zweite Abschnitt beschreibt ausführlich das Subklonieren der Expressionskassette in den binären Vektor.
  • Abschnitt 5A: Konstruktion von binären Vektoren
  • Beispiel 36: Konstruktion von pCGN783
  • pCGN783 ist ein binäres Plamid, welches die linke und rechte T-DNA-Grenze des A. tumefaciens-Octopin-Ti-Plasmids pTiA6 (Currier und Nester, 1976), das Gentamycinresistenz-Gen von pPH1JI (Hirsch und Beringer, 1984), den 35S-Promotor von CaMV (Gardner et al., 1981), das Kanamycinresistenz-Gen von Tn5 (Jorgensen et al., 1979) und den 3'-Bereich des Transkripts 7 aus pTiA6 (Currier und Nester, 1976) enthält. Der Vektor wurde gemäß nachstehend ausführlich beschriebenem Mehrschrittverfahren konstruiert.
  • A. Konstruktion von pCGN739. Um den Gentamycin-Resistenzmarker zu erhalten, wurde das Resistenzgen aus einem 3,1-kb-EcoRI-PstI-Fragment aus pPhIJI (Hirsch und Beringer, 1984) isoliert und in pUC9 (Vieira und Messing, 1982) kloniert, wobei pCGN549 entstand. Das pCGN549-HindIII-BamHI-Fragment, welches das Gentamycin-Resistenzgen enthielt, ersetzte das HindIII-BglII-Fragment aus pCGN587 (von oben), so dass pCGN594 entstand. Der pCGN594-HindIII-BamHI-Bereich, der ein ocs-Kanamycin-ocs-Fragment enthielt, wurde mit dem HindIII-BamHI-Polylinkerbereich aus pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985) ersetzt, so dass pCGN739 entstand.
  • B. Konstruktion von pCGN726C. pCGN566 enthält den EcoRI-HindIII-Linker aus pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985), eingefügt in die EcoRI-HindIII-Stellen von pUC13-cm [K. Buckley, Dissertation, UC San Diego, 1985]. Das HindIII-Bg1II-Fragment von pNW31c-8, 29-1 (Thomshow et al., 1980), welches 0RF1 und 2 (Barker et al., 1983) enthält, wurde in die HinIII-BamHI-Stellen von pCGN566 subkloniert, so dass pCGN703 entstand. Das Sau3A-Fragment von pCGN703, welches die 3'-Region des Transkripts 7 aus pTiA6 (entsprechend den Basen 2396-2920 von pTi15955 (Barker et al., 1983) enthält, wurde in die BamHI-Stelle von pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985) subkloniert, so dass pCGN709 entstand. Der EcoRI-SmaI-Polylinkerbereich von pCGN709 wurde durch das EcoRI-SmaI-Fragment aus pCGN587 (für die Herstellung siehe: unten), welches das Kanamycin-Resistenzgen (APH3'II) enthält, ersetzt, so dass pCGN1726 entstand. Das EcoRI-SaII-Fragment von pCGN726 plus das BglII-EcoRI-Fragment aus pCGN734 wurden in die BamHI-SaII-Stellen von pUC8-pUC13-cm [Chloramphenicolresistent, K. Buckley, Dissertation, UC San Diego, 1985] eingefügt, so dass pCGN738 entstand. Um pCGN734 zu konstruieren, wurde das HindIII-SphI-Fragment aus pTiA6, das den Basen 3390-3241 (Barker et al., 1983) entspricht, in die HindIII-SphI-Stelle von M13mp19 (Yanisch-Perron et al., 1985; Norrander et al., 1983) kloniert. Mit einem Oligonukleotid, das den Basen 3287-3300 entsprach, wurde die DNA-Synthese von diesem Templat geprimt. Nach der S1-Nukleasebehandlung und dem HindIII-Verdau wurde das erhaltene Fragment in die HindIII-SmaI-Stelle von pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) kloniert. Das resultierende EcoRI-HindIII-Fragment, das den Basen 3287 bis 3390 (Barker et al., 1983) entspricht, wurde mit dem EcoRI-HindIII-Fragment von pTiA6 (entsprechend den Basen 3390-4494) in die EcoRI-Stelle von pUC8 (Vieira und Messing, 1982) kloniert, so dass pCGN374 gewonnen wurde. pCGN726c wurde aus pCGN738 durch Deletieren des 900-bp-EcoRI-EcoRI-Fragments gewonnen.
  • C. Konstruktion von pCGN766C. Das HindIII-BamHI-Fragment von pCGN167 (siehe unten), welches den CaMV-35S-Promotor, 1-ATG-Kanamycin-Gen und das BamHI- Fragment 19 aus pTiA6 enthielt, wurde in die BamHI-HindIII-Stellen von pUC19 (Norrander et al., 1983; Yanisch-Perron et al., 1985) kloniert, so dass pCGN976 entstand. Der 35S-Promotor des 3'-Bereichs aus dem Transkript 7 wurde durch Einfügen eines 0,7-kb-HindIII-EcoRI-Fragments aus pCGN976 (35S-Promotor) und des 0,5-kb-EcoRI-SaII-Fragments aus pCGN709 (Transkript 7 : 3') in die HindIII-SaII-Stellen von pCGN566 entwickelt, so dass pCGN766c konstruiert wurde. Um pCGN167 zu konstruieren, wurde das AluI-Fragment aus CaMV (bp 7144-7735) (Gardner et al., 1981) durch Verdau mit AluI gewonnen und in die HincII-Stelle von M13mp7 (Vieira und Messing, 1982) kloniert, um C614 zu erzeugen. Ein EcoRI-Verdau von C614 erzeugte das EcoRI-Fragment aus C614, welches den 35S-Promotor enthielt und in die EcoRI-Stelle von pIC8 (Vieira und Messing, 1982) kloniert wurde, um pCGN146 herzustellen. Um den Promotorbereich zurechtzuschneiden, wurde die BgIII-Stelle (bp 7670) mit BgIII und Ba131 behandelt und anschließend wurde ein BglII-Linker an die mit Ba131 behandelte DNA angefügt, um pCGN147 herzustellen. pCGN148a, das eine Promotorregion, einen selektierbaren Marker (KAN mit 2 ATGs) und einen 3'-Bereich enthielt, wurde durch Verdauen von pCGN528 (siehe unten) mit BglII und Einfügen des BamHI-BglII-Promotor-Fragments aus pCGN147 hergestellt. Dieses Fragment wurde in die BglII-Stelle von pCGN528 kloniert, so dass die BglII-Stelle neben dem Kanamycin-Gen aus pCGN528 liegt. Der für dieses Konstrukt verwendete Shuttlevektor, pCGN528, wurde wie folgt hergestellt: pCGN525 wurde durch Verdauen eines Plasmids, welches Tn5 enthielt, das wiederum ein Kanamycin-Gen enthielt (Jorgensen et al., 1979), mit HindIII-BamHI und Einfügen des HindIII-BamHI-Fragments, welches das Kanamycin-Gen enthielt, in die HindIII-BamHI-Stellen des Tetracyclin-Gen von pACYC184 (Chang und Cohen, 1978) hergestellt. pCGN526 wurde durch Einfügen des BamHI-Fragments 19 aus pTiA6 (Thomashow et al., 1980) in die BamHI-Stelle von pCGN525 hergestellt. pCGN528 wurde durch Deletieren des kleinen XhoI-Fragments aus pCGN526 durch den Verdau mit XhoI und der Relegierung gewonnen. pCGN149a wurde durch Klonieren des BamHI-Kanamycin-Genfragments aus 9MB9KanXXI in die BamHI-Stelle von pCGN148a hergestellt. pMB9KanXXI ist eine pUC4k-Variante (Vieira und Messing, 1982), bei der die XhoI-Stelle fehlt, die jedoch ein funktionales Kanamycin-Gen aus Tn903 besitzt, so dass eine wirksame Selektion in Agrobacterium möglich ist. pCGN149a wurde mit BglII und SphI verdaut. Dieses kleine BglII-SphI-Fragment aus pCGN149A wurde mit dem BamHI-SphI-Fragment aus MI (siehe unten) durch den Verdau mit BamHI und SphI isoliert. Dies erzeugte pCGNl67, ein Konstrukt, welches den Fulllength-CaMV-Promotor, ein ATG-Kanamycin-Gen, 3'-Ende und das bakterielle Tn903-Typ-Kanamycin-Gen enthielt. MI ist ein EcoRI-Fragment aus pCGN550 (siehe die Konstruktion von pCGN587) und wurde in die EcoRI-Klonierungsstelle von M13mp9 in einer solchen Weise kloniert, dass die PstI-Stelle in dem 1-ATG-Kanamycin-Gen neben dem Polylinkerbereich von M13mp9 liegt.
  • D. Konstruktion von pCGN451. pCGN451 enthält die ocs5'-ocs3'-Kassette, kloniert in ein Derivat von pUC8 (Vieira und Messing, 1982). Der modifizierte Vektor wird durch Verdauen von pUC8 mit HincII und Ligieren in Gegenwart einer synthetischen Linker-DNA gewonnen, wobei pCGN416 entstand, und dann wurde die EcoRI-Stelle von pCGN416 durch EcoRI-Verdau deletiert, anschließend wurde mit dem Klenow-Enzym behandelt und es erfolgte eine Selbstligation, wobei pCGN426 entstand. Die ocs5'-ocs3'-Kassette wurde in einer Reihe Schritten aus der von dem Octopin-Ti-Plasmid pTiA6 (Currier und Nester, 1976) stammenden DNA konstruiert. Ein EcoRI-Fragment aus pTiA6 (bp 13362-16202; die Nummerierung erfolgte nach Barker et al. (1983) für das eng verwandte Ti-Plasmid pTi15955) wurde durch EcoRI-Verdau aus pVK232 (Knauf und Nester, 1982) entfernt und in das mit EcoRI verdaute pACYC184 (Chard und Cohen, 1978) kloniert, so dass pCGN15 entstand. Das 2,4-kb-BamHI-EcoRI-Fragment (bp 13774-16202) aus pCGN15 wurde in das mit EcoRI-BamHI verdaute pBR322 (Bolivar et al., 1977) kloniert, so dass pCGN429 entstand. Das 412-bp-EcoRI-BamHI-Fragment (bp 13362-13774) aus pCGN15 wurde in das mit EcoRI-BamHI verdaute pBR3322 (Bolivar et al., 1977) kloniert, wobei pCGN407 entstand. Das beschnittene Promotorfragment wurde durch Verdauen von pCGN407 mit XmnI (bp 13512) erhalten, und es folgte ein neuer Schnitt mit Ba131-Exonuklease, die Ligation mit synthetischen EcoRI-Linkern und der Verdau mit BamHI. Die erhaltenen Fragmente mit einer Länge von etwa 130 bp wurden auf einem Gel gereinigt und in M13mp9 (Vieira und Messing, 1982) kloniert und sequenziert. Ein Klon, I-4, worin der EcoRI-Linker bei bp 13642 zwischen dem Transkriptionsinitiationspunkt und dem Translationsinitiationscodon insertiert wurde, wurde durch den Vergleich mit der Sequenz von de Greve et al. (1982) nachgewiesen; die EcoRI-Spaltstelle ist an Position 13639, stromabwärts von der mRNA-Startstelle. Das 141-bp-EcoRI-BamHI-Fragment von I-4, welches den beschnittenen Promotor enthielt, wurde in das mit EcoRI-BamHI verdaute pBR322 (Bolivar et al., 1977) kloniert, wobei pCGN428 entstand. Das 141-bp-EcoRI-BamHI-Promotorstück aus pCGN428 und das 2,5-kb-EcoRI-BamHI-ocs-5'-Stück aus pCGN429 wurden zusammen in das mit EcoRI verdaute pUC9 (Vieira und Messing, 1982) kloniert, um pCGN442 zu erzeugen, wobei der stromaufwärts liegende ocs-Bereich mit einem beschnittenen Promotorabschnitt rekonstruiert wurde. Das HindIII-Fragment aus pLB41 [D. Figurski], welches das Gentamycin-Resistengen enthielt, wurde in das mit HindIII verdaute pACYC 18 (Chang und Cohen, 1978) kloniert, so dass pcDNA413b erstand. Das 4,7-kb-BamHI-Fragment aus pTiA6 (Currier und Nester, 1976), welches den ocs-3'-Bereich enthielt, wurde in das mit BamHI verdaute pBR325 (Bolivar, 1987) kloniert, so dass 33c-19 entstand. Die SmaI- Stelle in Position 11270 von 33c-19 wurde mit Hilfe synthetischer XhoI-Linker-DNA in eine XhoI-Stelle umgewandelt, so dass pCGN401.2 entstand. Das 3,8-kb-BamHI-EcoRI-Fragment aus pCGN401.2 wurde in das mit BamHI-EcoRI verdaute pCGN413b kloniert, so dass pCGN419 entstand. Die ocs5'-ocs3'-Kassette wurde durch Klonieren des 2,64-kb-EcoRI-Fragments aus pCGN442, welches den 5'-Bereich enthielt, in das mit EcoRI verdaute pCGN419 kloniert, so dass pCGN446 entstand. Das 3,1-kb-XhoI-Fragment aus pCGN446 mit dem ocs-5'-Bereich (bp 13639-15208) und dem ocs-3'-Bereich (bp 11207-12823) wurde in die XhoI-Stelle von pCGN426 kloniert, so dass pCGN451 entstand.
  • E. Konstruktion von pCGN587. Das HindIII-SmaI-Fragment aus Tn5, welches das gesamte Strukturgen für APH3'II (Jorgensen et al., 1979) enthielt, wurde in pUC8 (Vieira und Messing, 1982) kloniert; dadurch wurde das Fragment in ein HindIII-EcoRI-Fragment umgewandelt, da es eine EcoRI-Stelle direkt neben der SmaI-Stelle gibt. Das PstI-EcoRI-Fragment von pCGN300, welches den 3'-Bereich des APH3'II-Gens enthielt, wurde dann mit einem EcoRI-BamHI-SalI-PstI-Linker in die EcoRI-Stelle von pUC7 zusammengebracht, so dass pCGN546W entstand. Ein ATG-Codon war stromaufwärts und außerhalb des Leserahmens mit dem ATG-Startcodon von APH3'II. Das ungewünschte ATG wurde dadurch umgangen, dass man ein Sau3A-PstI-Fragment vom 5'-Ende von APH3'II, wobei das Fragment das überflüssige ATG nicht enthält, in die BamHI-PstI-Stelle von pCGN546W einfügte, wobei das Plasmid pCGN550 entstand. Das EcoRI-Fragment aus pCGN550, welches das APH3'II-Gen enthielt, wurde dann in die EcoRI-Stelle von pUS8-pICl3-cm [K. Buckley (1985), siehe oben] kloniert, so dass pCGN551 entstand. Das Plasmid pCGN451 (oben beschrieben) mit dem ocs-5' und dem ocs-3' in der richtigen Orientierung wurde mit EcoRI verdaut und das EcoRI-Fragment aus pCGN551, welches das intakte Kanamycinresistenz-Gen enthielt, wurde in die EcoRI-Stelle eingefügt, so dass pCGN552 mit dem Kanamycinresistenz-Gen in der richtigen Orientierung entstand. Dieses ocs/KAN-Gen wurde verwendet, um einen selektierbaren Marker für den trans-Typ, binären Vektor pCGN587 bereitzustellen. Der 5'-Bereich der manipulierten Octopinsynthase-Promotorkassette bestand aus pTiA6-DNA aus dem XhoI bei bp 15208-13644 (Barker et al., 1983), welche auch die T-DNA-Grenzsequenz (Grenze) enthielt, die in den T-DNA-Transfer verwickelt ist. In dem Plasmid pCGN587 stellt das ocs/KAN-Gen aus pCGN552 einen selektierbaren Marker sowie die rechte Grenze. Die linke Grenzregion wurde zunächst in M13mp9 als HindIII-SmaI-Stück (pCGN502) (bp 602-2212) kloniert und als KpnI-EcoRI-Fragment in pCGN565 nachkloniert, so dass pCGN580 entstand. pCGN565 war ein Klonierungsvektor auf Basis von pUC-pUC13-Cm [K. Buckley, Dissertation, UC San Diego, 1985] der jedoch pUC18-Linker enthielt (Yanisch-Perron et al., 1985). pCGN580 wurde mit BamHI linearisiert und verwendet, um das kleinere BgII-Fragment aus pVCK102 (Knauf und Nester, 1982) zu ersetzen, wobei pCGN585 entstand. Durch das Ersetzen des kleineren SaII-Fragments aus pCGN585 mit dem XhoI-Fragment aus pCGN552, welches das ocs/KAN-Gen enthielt, wurde pCGN587 gewonnen.
  • F. Abschließende Konstruktion von pCGN783. Das 0,7-kb-HindIII-EcoRI-Fragment aus pCGN766c (CaMV-35S-Promotor) wurde an das 1,5-kb-EcoRI-SaII-Fragment von pCGN726c (2-ATG-KAN-3'-Bereich) in die HindIII-SaII-Stellen von pUC119 [Sambrook J. et al., 1989] ligiert, so dass pCGN778 entstand. Der 2,2-kb-Bereich von pCGN778, das HindIII-SalI-Fragment, welches den CaMV-35S-Promotor (1-ATG-KAN-3'-Bereich) enthielt, ersetzte den HindIII-SalI-Polylinkerbereich von pCGN739, so dass pCGN783 entstand.
  • Beispiel 37: Konstruktion von pCGN1539 und pCGN1540
  • pCGN1539 und pCGN1540 sind binäre pflanzliche Transformationsvektoren, welche die linke und rechte T-DNA-Grenze des A. tumefaciens-Octopin-Ti-Plasmids pTiA6 (Currier und Nester, 1976), das Gentamycinresistenz-Gen von pPHiJI (Hirsch und Beringer, 1984), einen A. rhizogenes-Ri-Plasmid-Replikationsursprung aus pLJB1I (Jouanin et al., 1985), die mas-Promotorregion eines mas-3'-Bereichs von pTiA6 mit dem Kanamycinresistenz-Gen von Tn5 (Jorgensen et al., 1979), einen CoIEI-Replikationsursprung aus pBR322 (Bolivar et al., 1977) und ein 1acZ'-screenbares Markergen aus pUC18 (Norrander et al., 1983) enthielt. Das Rückgrat von pCGN1539-1540, welches das Gentamycinresistenz-Gen und die Ri- und ColEI-Ursprünge enthielt, stammte von pCGN1532 (siehe unten). Die Ti-Grenzen und das selektierbare Pflanzen-Markergen (mas-5'-kan-mas3') stammten von pCGN1537; die selektierbare Pflanzen-Markerkassette stammte wiederum von pCGN1536, während die rechte Grenze und die lacZ'-Fragmente von pCGN565RBx2X stammten und die rechte Grenze von pCGN65 war.
  • A. pCGN1532-Konstruktion. Das 3,5-kb-EcoRI-PstI-Fragment, welches das Gentamycinresistenz-Gen enthielt, wurde durch EcoRI-PstI-Verdau aus pPh1JI (Hirsch und Beringer, 1984) entfernt und in mit EcoRI-PstI verdautes pUC9 (Vieira und Messing, 1982) kloniert, so dass pCGN549 entstand. Der HindIII-PstI-Verdau von pCGN549 ergab ein 3,1-kb-Fragment, welches das Gentamycinresistenz-Gen enthielt und an den Enden durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I abgestumpft und in mit PvuII verdautes pBR322 (Bolivar et al., 1977) kloniert wurde, so dass pBR322Gm entstand. pBR322GM wurde mit DraI und ShpI verdaut, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt und das 2,8-kb-Fragment wurde in das den Ri-Ursprung enthaltende Plasmid pLJbB11 (Jouanin et al., 1985) kloniert, welches mit ApaI verdaut und mit dem Klenow-Enzym an den Enden abgestumpft worden war, so dass pLHbB11Gm entstand. Der zusätzliche CoIEI-Ursprung und das Kanamycinresistenz-Gen wurden durch Verdau mit BamHI und anschließendem Selbstschluss aus pLHbB11 Gm deletiert, so dass pGmB11 entstand. Die HindII-Stelle aus pGmB11 wurde durch HindII-Verdau deletiert und darauf folgte die Behandlung mit dem Klenow-Enzym und ein Selbstschluss, so dass pGmBll-H entstand. Die PstI-Stelle von pGmBll-H wurde durch PstI-Verdau deletiert und anschließend folgte die Behandlung mit dem Klenow-Enzym und ein Selbstschluss, so dass pCGN1532 entstand.
  • B. pCGN1536-Konstruktion. Das 5,4-kb-EcoRI-Fragment wurde durch EcoRI-Verdau aus pVK232 (Knauf und Nester, 1982) entfernt und in das mit EcoRI verdaute pACYC184 (Chang und Cohen, 1978) kloniert, so dass pCGNl4 entstand. Das 1434-bp-ClaI-SphI-Fragment von pCGNl4, welches den mas-5'-Bereich enthielt (bp 20128-21562 gemäß der Nummerierung von Barker et al., 1983) wurde in das mit AccI-SphI verdaute pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) kloniert, so dass pCGN50 entstand. Ein 746-bp-EcoRV-NaeI-Fragment aus der mas-5'-Region wurde durch eine XhoI-Stelle ersetzt, indem pCGN40 mit EcoRV und NaeI verdaut und anschließend in Gegenwart einer synthetischen XhoI-Linker-DNA ligiert wurde, so dass pCGN1036 entstand. Das 765-bp-SstI-HindIII-Fragment (bp 18474-19239) von pCGNl4, welches den mas-3'-Bereich enthielt, wurde in das mit SstI-HindIII verdaute pUC18 (Norrander et al., 1983) kloniert, so dass pCGN43 entstand. Die HindIII-Stelle von pCGN43 wurde durch eine EcoRI-Stelle ersetzt, und zwar indem mit HindIII verdaut wurde, die Enden mit dem Klenow-Enzym abgestumpft wurden und eine Ligation an eine synthetische EcoRI-Linker-DNA erfolgte, so dass pCGN1034 entstand. Das 767-bp-EcoRI-Fragment aus pCGN1034 wurde in das mit EcoRI verdaute pCGN1036 in einer solchen Orientierung kloniert, dass das bp 19239 des mas-3'-Bereichs neben den mas-5'-Bereich zu liegen kam und pCGN1040 entstand. pCGN1040 wurde einem Teilverdau mit SstI unterworfen, mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und in Gegenwart einer synthetischen XhoI-Linker-DNA ligiert; ein Klon wurde ausgewählt, indem nur eine SstI-Stelle am Schnittpunkt zwischen bp 18474 und der Vektor-DNA (konstruiert in pCGN43 und pCGN1040 übertragen) durch eine XhoI-Stelle ersetzt wurde, so dass pCGN1047 entstand. pCGN565 [siehe oben] wurde mit EcoRI und HindIII verdaut, mit dem Klenow-Enzym behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen, und in Gegenwart synthetischer XhoI-Linker-DNA ligiert, so dass pCGN1003 entstand; dies stellt die EcoRI-Stelle neben dem XhoI-Linker wieder her. pCGN1003 wurde mit EcoRI verdaut, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt und in Gegenwart synthetischer PstI-Linker-DNA ligiert, so dass pCGN1007 entstand. Das 1,5-kb-XhoI-Fragment aus pCGN1047, welches den mas-5'-Bereich und den mas-3'-Bereich mit einer dazwischen liegenden Multicloning-Stelle enthielt, wurde in das mit XhoI verdaute pCGN1007 kloniert, so dass pCGN1052 entstand.
  • Ein Teil der Multicloning-Stelle von pCGN1052 wurde durch Verdau mit XbaI und SstI deletiert, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt und ligiert, so dass pCGN1052δXS entstand. Das 1-kb-EcoRI-SmaI-Fragment von pCGN550 [pCGN783-Beschreibung], welches das 1-ATG-Kanamycin-Resistenzgen enthielt, wurde in EcoRI-SmaI verdautes Bluescript M13-KS (Stratagene, Inc.) kloniert, um pBSKm zu erzeugen; dieses Plasmid enthielt einen M13-Bereich, der die Herstellung einzelsträngiger DNA ermöglichte. Einzelsträngige DNA wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt und es wurde eine in vitro-Mutagenese (Adelmann et al., 1983) durchgeführt, wobei ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz
    Figure 00820001
    verwendet wurde, um eine PstI-Stelle in dem Kanamycin-Resistenzgen zu verändern und es unverdaubar zu machen, so dass pCGN1534 entstand. pCGN1534 wurde mit SmaI verdaut und in Gegenwart einer synthetischen EcoRI-Linker-DNA ligiert, so dass pCGN1535 entstand. Das 1-kb-EcoRI-Fragment von pCGN1536 wurde in mit EcoRI verdautes pCGN1052δXS kloniert, so dass die Kassette mit der selektierbaren Pflanzenmas5'-kan-mas3'-Markerkassette pCGN1536 erzeugt wurde.
  • C. pCGN565RAx2X-Konstruktion. PCGN451 [pCGN783-Beschreibung] wurde mit HpaI verdaut und in Gegenwart einer synthetischen SphI-Linker-DNA ligiert, um pCGN55 zu erzeugen. Das XhoI-SphI-Fragment von pCGN55 (p13800-15208, einschließlich der rechten Grenze, von A. tumefaciens-T-DNA; Barker et al., 1977) wurde in das mit SaII-SphI verdaute pUC 19 (Yanisch-Perron et al., 1984) kloniert, um pCGN60 zu erzeugen. Das 1,4-kb-HindIII-BamHI-Fragment aus pCGN60 wurde in das mit HindIII-BamHI verdaute pSP64 (Promega, Inc.) kloniert, um pCGN1039 zu erzeugen. PCGN1039 wurde mit SmaI und NruI verdaut (wobei die bp14273-15208 deletiert wurden; Barker et al., 1977) und in Gegenwart einer synthetischen BglII-Linker-DNA ligiert, wobei pCGN1039δNS entstand. Das 0,47-kb-EcoRI-HindIII-Fragment von pCGN1039δNS wurde in das mit EcoRI-HindIII verdaute pCGN565 kloniert [beschrieben in der Beschreibung zu pCFN783], so dass pCGN565RB entstand. Die HindIII-Stelle von pCGN565RB wurde mit einer XhoI-Stelle durch HindIII-Verdau, Behandlung mit dem Klenow-Enzym und der Ligation in Gegenwart einer synthetischen XhoI-Linker-DNA ersetzt, so dass pCGN565RB-H+X entstand. pUCl8 (Norrander et al., 1983) wurde mit HaeII verdaut, so dass das lacZ'-Fragment freigesetzt wurde, mit dem Klenow-Enzym zur Erzeugung stumpfer Enden behandelt und das IacZ'-haltige Fragment wurde in pCGN565RB-H+X ligiert, welches mit AccI und SphI verdaut und mit dem Klenow-Enzym behandelt worden war, und zwar in einer solchen Orientierung, dass der lacZ'-Promotor neben dem rechten Grenzfragment zu liegen kam; dieses Konstrukt, pCGN565RBx2x, zeigte eine positive lacZ'-Expression, wenn man es auf einem geeigneten Wirt ausplattierte, und enthielt bp 13990-14273 des rechten Grenzfragments (Barker et al., 1983), bei dem das AccI-SphI-Fragment (bp 13800-13990) deletiert war.
  • D. pCGN65-Konstruktion. PCGN501 wurde durch Klonieren eines 1,85-kb-EcoRI-XhoI-Fragments aus pTiA6 (Currier und Nester, 1976), welches die Basen 13362-15208 (Barker et al., 1983) der T-DNA (rechte Grenze) enthielt, in mit EcoRI-SaII verdautes M13mp9 (Vieira und Messing,- 1982) hergestellt. PCGN502 wurde durch Klonieren eines 1,6-kb-HindIII-SmaI-Fragments aus pTiA6, welches die Basen 602-2212 der T-DNA (linke Grenze) enthielt, in das mit HindIII-SmaI verdaute M13mp9 hergestellt. pCGN501 und pCGN502 wurden beide mit EcoRI und HindIII verdaut und beide T-DNA-haltigen Fragmente wurden zusammen in das mit HindIII verdaute pUC9 (Vieira und Messing, 1982) kloniert, so dass pCGN503 entstand, das beide T-DNA-Grenzfragmente enthielt. pCGN503 wurde mit HindIII und EcoRI verdaut und die zwei erhaltenen HindIII-EcoRI-Fragmente (welche die T-DNA-Grenzen enthielten) wurden in das mit EcoRI verdaute pHC79 (Hohn und Collins, 1980) kloniert, so dass pCGN518 entstand. Das KpnI-EcoRI-Fragment aus pCGN518, welches die linke T-DNA-Grenze enthielt, wurde in das mit KpnI-EcoRI verdaute pCGN565 kloniert, so dass pCGN580 entstand. Das BamHI-BglII-Fragment aus pCGN580 wurde in die BamHI-Stelle von pACYC184 (Chang und Cohen, 1978) kloniert, um pCGN51 zu erzeugen. Das 1,4-kb-BamHI-SphI-Fragment aus pCGN60 (siehe oben den Abschnitt zu pCGN65x2X), welches das rechte T-DNA-Grenzfragment enthielt, wurde in das mit BamHI-SphI verdaute pCGN51 kloniert, so dass pCGN65 entstand.
  • E. pCGN1537-Konstruktion. PCGN65 wurde mit KpnI und XbaI verdaut, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt und in Gegenwart der synthetischen BglII-Linker-DNA ligiert, so dass pCGN65δKX entstand. Das pCGN65δKX wurde mit SaII verdaut, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt und in Gegenwart einer synthetischen XhoI-Linker-DNA ligiert; so dass pCGN65δKX-S+X entstand. Das 728-bp-Bg1II-XhoI-Fragment aus pCGNRBx2X, welches das rechte T-DNA-Grenzstück und das lacZ'-Gen enthielt, wurde in mit Bg1II-XhoI verdautes pCGN65δKX-S+X kloniert und ersetzte damit pCGN65x2X. Das ClaI-Fragment aus pCGN65x2X wurde deletiert und mit einem XhoI-Linker, der mit ClaI verdaut war, ersetzt, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt und in Gegenwart einer synthetischen XhoI-Linker-DNA ligiert, so dass pCGN65δ2XX entstand. pCGN65δ2XX wurde mit blgII verdaut und mit dem mit BgIII verdauten pCGN549 (siehe oben den Abschnitt zu pCGN1532) fusioniert, so dass pCGN1530 entstand, welches das Rückgrat beider Plasmide enthielt. pCGN1530 wurde mit XhoI verdaut und wieder ligiert, dann wurde ein Gentamycin-resistenter Chloramphenicolempfindlicher Klon ausgewählt, bei dem das von pACYC 184 abstammende Rückgrat deletiert worden war, ausgewählt, so dass pCGN1530A entstand. Das 2,43-kb-XhoI-Fragment aus pCGN1536, welches die mas5'-kan-mas3'-Kassette enthielt, wurde in mit XhoI verdautem pCGN1530A kloniert, so dass pCGN1537 entstand.
  • F. Letztliche Zusammenführung von pCGN1540. Das BgIII-Fragment von pCGN1537, welches das selektierbare Pflanzen-Marker-Gen und das screenbare lac-Z'-Markergen (mit Multicloning-Stelle), alles zwischen den T-DNA-Grenzen, enthielt, wurde in mit BamHI verdautes pCGN1532 kloniert. Ein Klon mit der Orientierung, worin die rechte T-DNA-Grenze neben dem pBR322-Replikationsursprung lag, wurde als pCGN1539 bezeichnet und die Orientierung, worin die rechte T-DNA-Grenze neben dem Ri-Plasmid-Replikationsursprung lag, wurde als pCGN1540 bezeichnet. Diese binären Vektoren haben mehrere vorteilhafte Merkmale, einschließlich einer geringstmöglichen DNA-Menge zwischen den T-DNA-Grenzen, einer hohen Stabilität im Agrobacterium-Wirt, einer hohen Kopiezahl in E.coli-Wirten und einem blauweiß-Screen mit Mehrfach-Restriktionsstellen zum einfachen Klonieren der Ziel-DNA.
  • Abschnit 5B: Konstruktion von binären Vektoren, welche chimäre Gene enthalten.
  • In dem vorstehenden Abschnitt wurde die Konstruktion von pCGN783 und pCGN1540 ausführlich beschrieben. Dieses sind binäre Vektoren, welche man in durch Agrobacterium vermittelten Transformationsexperimenten zum Transformieren von Pflanzen verwenden kann. Die Vektoren sind so maßgeschneidert, dass sie ein gefragtes chimäres Gen in eine Pflanze co-transformieren können, das chimäre Gen muss jedoch zunächst in den binären Vektor subkloniert werden. Der nachstehende Abschnitt beschreibt ausführlich das Subklonieren der in Abschnitt 4 konstruierten chimären Gene, entweder in den binären Vektor pCGN783 oder in den binären Vektor pCGN1540. Die erhaltenen Vektoren besitzen die Fähigkeit Pflanzen mit dem chimären Gen zu transformieren.
  • Beispiel 38: Konstruktion von pCGN1754 und pCGN1760 (pCGN783 mit der leeren SSU-Promotor-Kassette in beliebiger Orientierung)
  • Die BamHI-Stelle von pCGN783 liegt nahe der rechten T-DNA-Grenze, wobei das selektierbare Pflanzen-Markergen zwischen der linken T-DNA-Grenze und der BamHI-Stelle liegt. Das Klonieren eines chimären Genkonstrukts in die BamHI-Stelle bringt das Chimäre Gen zwischen das selektierbare Pflanzen-Markergen und die rechte T-DNA-Grenze. Die einzigartige BglII-Stelle von pCGN1509 liegt in einem nicht-essenziellen Teil des ocs-3'-Bereichs.
  • pCGN1509 wurde mit BglII verdaut und der gesamte Vektor wurde in die BamHI-Stelle von pCGN783 kloniert, und es wurden beide möglichen Orientierungen gewonnen. Ein Plasmid, worin der Promotor der kleinen Untereinheit von RUBISCO und die ocs-3'-Bereiche neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1754 bezeichnet und ein Plasmid, worin der Promotor der kleinen Untereinheit von RUBISCO und die ocs3'-Bereiche neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1760 bezeichnet.
  • Beispiel 39: Konstruktion von pCGN1755A, pCGN1755B, pCGN1755C und pCGN1755D (pCGN783 mit der SSU/PR-1a- (Sense und Antisense) Expressions-Kassette in beliebiger Orientierung)
  • pCGN1752A wurde mit BglII verdaut und der gesamte Vektor wurde in das mit BamHI verdaute pCGN783 kloniert, und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin die PR1-ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1755C bezeichnet und ein Plasmid, worin die PR1-ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1755A bezeichnet.
  • pCGN1752B wurde mit BgIII verdaut und der gesamte Vektor wurde in das mit BamHI verdaute pCGN783 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin die PR1-ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1755B bezeichnet und ein Plasmid, worin die PR1-ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1755B bezeichnet.
  • Beispiel 40: Konstruktion von pCGN1756A, pCGN1756B, pCGN1756C und pCGN1756D (pCGN783 mit der SSU-Promotor-PR-Ib- (Sense und Antisense) Expressions-Kassette in beliebiger Orientierung)
  • pCGN1753A wurde mit BglII verdaut und der gesamte Vektor in mit BamHI verdautes pCGN783 kloniert, und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin die PR1-ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1756C bezeichnet und ein Plasmid, worin die PR1-ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1756A bezeichnet.
  • pGN1753B wurde mit BglII verdaut und in mit BamHI verdautes pCGN783 kloniert und es wurden die beiden möglichen Orientierungen gewonnen. Ein Plasmid, worin die PR1ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1756D bezeichnet und ein Plasmid, worin die PR1-ocs-3'-Bereiche des Promotors der kleinen Untereinheit von RUBISCO neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1756B bezeichnet.
  • Beispiel 41: Konstruktion von pCGN1766 und pCGN1767 (pCGN783 mit einer leeren doppelter CaMV-35S-Promotor-Kassette in beliebiger Orientierun
  • pCGN1761 wurde mit BamHI verdaut und der gesamte Vektor in mit BamHI verdautes pCGN783 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin der doppelte CaMV-35S-Promotor und die tm-1-3'-Bereiche neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1767 bezeichnet und ein Plasmid, worin der doppelte 35S-Promotor und die tm-1-3'-Bereiche neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGNl766 bezeichnet.
  • Beispiel 42: Konstruktion von pCGN1764A, pCGN1764B, pCGN1764C und pCGN1764D (doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-1a (Sense und Antisense) in pCGN783
  • pCGN1762A wurde mit BamHI verdaut und in mit BamHI verdautes pCGN783 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin die doppelter 35S-PR1-tm-1-3'-Bereiche neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN783 lagen, wurde als pCGN1764A bezeichnet und ein Klon, worin die doppelter 35S-PR1-tm-1-3'-Bereiche neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1764C bezeichnet.
  • pCGN1762B wurde mit BamHI verdaut und in mit BamHI verdautes pCGN783 kloniert und beide Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin der doppelte 355-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag, wurde als pCGN1764B bezeichnet. Ein Plasmid in der entgegengesetzten Orientierung wurde als pCGN1764D bezeichnet.
  • Beispiel 43: Konstruktion von pCGN1765A, pCGN1765B, pCGN1765C und pCGN1765D (doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-1b (Sense und Antisense) in pCGN783 in beliebiger Orientierung)
  • pCGN1763A wurde mit BamHI verdaut und in mit BamHI verdautes pCGN783 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin die doppelter 35S-PR1-tm-1-3'-Bereiche neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN783 lagen, wurde als pCGN1765A bezeichnet und ein Plasmid, worin die Doppel-35S-PR1-tm-1-3'-Bereiche neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1765C bezeichnet.
  • pCGN1763B wurde mit BamHI verdaut und in mit BamHI verdautes pCGN783 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin die Doppel-35S-PR1-tm-1-3'-Bereiche neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN783 lagen, wurde als pCGN1765B bezeichnet und ein Plasmid, worin die Doppel-35S-PR1tm-1-3'-Bereiche neben der rechten T-DNA-Grenze aus pCGN783 lagen, wurde als pCGN1765D bezeichnet.
  • Beispiel 44: Konstruktion von pCGN1780A pCGN1780B pCGN1780C pCGN1780D (Doppelter CaMV-35S-Promotor/Gurkenchitinase/Lysozym (Sense und Antisense) in pCGN783 in beliebiger Orientierung)
  • pCIB 1000 wurde mit BamHI verdaut und in die BamHI-Stelle in pCGN783 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin die Doppel-35S-Chitinase-tm-1-3'-Bereiche neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN783 lagen, wurde als pCGN1780A bezeichnet und ein Plasmid, worin die Doppel-35S- Chitinase-tm-1-3'-Bereiche neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1780C bezeichnet.
  • pCIB1001 wurde mit BamHI verdaut und in mit BamHI verdautes pCGN783 in beliebiger Orientierung kloniert. Ein Plasmid, worin die Doppel-35S-Chitinase-tm-1-3'-Bereiche neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN783 lagen, wurde als pCGN1780B bezeichnet. Ein Plasmid, worin die Doppel-35S-Chitinase-tm-1-3'-Bereiche neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN783 lagen, wurde als pCGN1780D bezeichnet.
  • Beispiel 45: Konstruktion von pCGN1789 (leere doppelter CaMV-35S-Promotor-Kassette in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 2,36-kb-XbaI-PstI-Fragment von pCGNl431 wurde in mit XbaI-PstI verdautes pCGN1540 subkloniert, so dass das Plasmid pCGN1789 entstand. In diesem Plasmid lag das Insert in einer derartigen Orientierung vor, dass der Doppel-35S-CaMV-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag.
  • Beispiel 46: Konstruktion von pCGN1774A, pCGN1774B, pCGN1774C und pCGN1774D (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-1a (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 4,2-kb-XbaI-Fragment von pCGN1762A wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN1540 lag, wurde als pCGN1774A bezeichnet und ein Plasmid, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN1540 lag, wurde als pCGN1774C bezeichnet.
  • Das 4,2-kb-XbaI-Fragment von pCGN1762B wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN1540 lag, wurde als pCGN1774B bezeichnet und ein Plasmid, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN1540 lag, wurde als pCGN1774D bezeichnet.
  • Beispiel 47: Konstruktion von pCGN1775A, pCGN1775B, pCGN1775C und pCGN1775D (Doppel-CaMV-35S-Promotor/PR-1b (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 4,1-kb-XbaI-Fragment von pCGN1763A wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN1540 lag, wurde als pCGN1775A bezeichnet und ein Plasmid, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN1540 lag, wurde als pCGN1775C bezeichnet.
  • Das 4,1-kb-XbaI-Fragment von pCGN1763B wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 kloniert und beide möglichen Orientierungen wurden gewonnen. Ein Plasmid, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben der rechten T-DNA-Grenze von pCGN1540 lag, wurde als pCGN1775B bezeichnet und ein Klon, worin das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN1540 lag, wurde als pCGN1775D bezeichnet.
  • Beispiel 48: Konstruktion von pCGN1783C und pCGN1783D (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-R-Haupt (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 4,5-kb-XbaI-Fragment aus pCIB1002 wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung subkloniert, dass der doppelte 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus 1540 lag. Dieses Plasmid wurde als pCGN1783C bezeichnet.
  • Das 4,5-kb-XbaI-Fragment aus pCIB1003 wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung subkloniert, dass das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN1540 lag, so dass pCGN1783D entstand.
  • Beispiel 49: Konstruktion von pCIB1026 und pCIB1027 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-P (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB 1020, welches das chimäre PR-P-Gen enthielt, wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, und zwar in einer solchen Orientierung, dass das Promotorfragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB 1026 bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1021, welches das chimäre PR-P-anti-sens-Gen enthielt, wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung subkloniert, dass das Promotorfragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB 1027 bezeichnet.
  • Beispiel 50: Konstruktion von pCIB1028 und pCIB1029 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-Q (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB 1022, welches das chimäre PR-Q-Gen enthielt, wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung subkloniert, dass das Promotorfragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB 1028 bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB 1023, welches das chimäre PR-Q-Antisense-Gen enthielt, wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung subkloniert, dass das Promotorfragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Das Plasmid wurde als pCIB 1029 bezeichnet.
  • Beispiel 51: Konstruktion von pCIB1030 und pCIB1031 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-O' (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB 1024, welches das chimäre PR-O'-Gen enthielt, wurde in einer solchen Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 355-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB 1030 bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment von pCIB 1025, welches das chimäre PR-O'-Antisense-Gen enthielt, wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer ähnlichen Orientierung wie pCIB1030 subkloniert. Das neue Plasmid wurde als pCIB 1031 bezeichnet.
  • Beispiel 51A: Konstruktion von pCIB1030 und pCIB1031 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-O' (Sense und Antisense) in pCGN1540)
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1024A, welches das chimäre PR-O'-Gen enthielt, wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Weise subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB1030A bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1025A, welches das chimäre PR-O'-Gen in Antisense Orientierung enthielt, wurde auf eine solche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Das erhaltene Plasmid wurde als pCIB1031A bezeichnet.
  • Beispiel 51B: Konstruktion von pCIB1042 und pCIB1043 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-O' (Sense und Antisense) in pCGN1540)
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1032, welches das chimäre PR-O'-Gen enthielt, wurde in einer solchen Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB 1042 bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1033, welches das chimäre PR-O'-Gen in Antisense Orientierung enthielt, wurde auf solche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Das resultierende Plasmid wurde als pCIB 1043 bezeichnet.
  • Beispiel 51C: Konstruktion von pCIB1044 und pCIB1045 (Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-N (Sense und Antisense) in pCGN1540)
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB 1034, welches das chimäre PR-O'-Gen enthielt, wurde auf solche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB1044 bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1035, welches das chimäre PR-O'-Gen in Antisense Orientierung enthielt, wurde auf solche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Das resultierende Plasmid wurde als pCIB 1045 bezeichnet.
  • Beispiel 51D: Konstruktion von pCIB1046 und pCIB1047 (Doppelter CaMV-35S Promotor/PR-O (Sense und Antisense) in pCGN1540)
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1036, welches das chimäre PR-O'-Gen enthielt, wurde auf solche Weise in das mit XbaI verdaute pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB1046 bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment aus pCIB1037, welches das chimäre PR-O'-Gen in Antisense Orientierung enthielt, wurde auf solche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Das resultierende Plasmid wurde als pCIB 1047 bezeichnet.
  • Beispiel 51E: Konstruktion von pCIB1048 und pCIB1049 Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-2' (Sense und Antisense) in pCGN1540)
  • Das XbaI-Fragment von pCIB1038, welches das chimäre PR-O'-Gen enthielt, wurde auf solche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Dieses Plasmid wurde als pCIB1048 bezeichnet.
  • Das XbaI-Fragment von pCIB1039, welches das chimäre PR-O'-Gen in Antisense-Orientierung enthielt, wurde auf solche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 subkloniert, dass der 35S-Promotor neben dem selektierbaren Pflanzenmarker lag. Das erhaltene Plasmid wurde als pCIB 1049 bezeichnet.
  • Beispiel 52: Konstruktion von pCGN1781C und pCGN1781D (Doppelter CaMV-35S-Promotor/basische Glucanase (Sense und Antisense, in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 4,9-kb-XbaI-Fragment aus pCIB 1005B wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung subkloniert, dass das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN1540 1ag und pCGN1787C entstand.
  • Das 4,5-kb-XbaI-Fragment von pCIB1006B wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung subkloniert, dass das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzen-Gen von pCGN1540 lag und somit pCGN1787D entstand.
  • Beispiel 53: Konstruktion von pCGN1782C und pCGN1782D (Doppelter CaMV-35S-Promotor/basische Chitinase (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 4,8-kb-YbaI-Fragment aus pCGN1007 wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung kloniert, dass das Doppel-35S-Promotorfragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen von pCGN1540 lag und pCGN1782C entstand.
  • Das 4,8-kb-Fragment von pCIB1008 wurde auf ähnliche Weise in mit XbaI verdautes pCGN1540 kloniert, so dass pCGN1782D entstand.
  • Beispiel 54: Konstruktion von pCGN1790C und pCGN1790D (Doppelter CaMV-35S-Promotor/SAR8.2 (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 2,89-kb-XbaI-PstI-Fragment aus pCGN1788A wurde in mit XbaI-PstI verdautes pCGN1540 subkloniert, so dass pCGN1790C entstand. Die Orientierung des doppelten 35S-Promotors in diesem Konstrukt ist die gleiche wie in dem anderen C-Typ-Konstrukt aus obigen Beispielen.
  • Das 2,89-kb-Fragment aus pCGN1788B wurde in mit XbaI-PstI verdautes pCGN1540 subkloniert, so dass pCGN1790D entstand. Die Orientierung des Promotors in dem Konstrukt war genau so wie in pCGN1790C.
  • Beispiel 55: Konstruktion von pCGN1779C und pCGN1779D (Doppelter CaMV-35S-Promotor/Gurkenchitinase/Lysozym (Sense und Antisense) in pCGN1540 in beliebiger Orientierung)
  • Das 4,6-kb-XbaI-Fragment von pCIB1000 wurde in mit XbaI verdautes pCGN1540 in einer solchen Orientierung kloniert, dass das Doppel-35S-Promotorfragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN1540 lag und pCGN1779C entstand. Das 4,6-kb-XbaI-Fragment aus pCIB 1001 wurde in einer solchen Orientierung in mit XbaI verdautes pCGN1540 kloniert, dass das Doppel-35S-Promotor-Fragment neben dem selektierbaren Pflanzenmarker gen aus pCGN1540 lag und pCGN1779D entstand.
  • Beispiel 56: Vektoren mit Hygromycin-Resistenz als selektierbares Pflanzen-Marker-Gen
  • Pflanzentransformationsvektoren mit dem Hygromycin-Resistenzgen anstelle des Kanamycin-Gens, wie oben verwendet, wurden konstruiert (Rothstein et al., 1987). Der Vektor pCIB743 ist ein solcher Vektor. Das chimäre Gen zur Expression in Pflanzen wurde aus einem der oben beschriebenen Vektoren mit einem geeigneten Restriktionsenzym, beispielsweise XbaI, ausgeschnitten und in den Polylinker von pCIB743 eingefügt. Diese erzeugt ein oder mehrere chimäre Gene zur Pflanzenexpression bei einem breiten Wirtsspektrum, wobei der Transformationsvektor dem transformierten Pflanzengewebe eine Hygromycin-Resistenz verleiht. Dies ermöglicht dem Fachmann bei der Selektion nach transformiertem Pflanzengewebe entweder die Hygromycin-Resistenz oder die Kanamycin-Resistenz zu verwenden.
  • ABSCHNITT 6. TRANSFORMATION VON A. TUMEFACIENS
  • Beispiel 57: Transformation von A Tumefaciens mit binären Vektoren
  • Die in Abschnitt 5 beschriebenen binären Vektoren wurden durch nachstehendes Verfahren in den A. Tumefaciens-Stamm LB4404 transformiert. Der Agrobacterium-Stamm wurde über Nacht bei 30°C in 5 ml LBMG-Medium (50% L-Nährlösung, 50% Mannitol-Glutamat-Nährlösung (Garfinkel Nester, 1980)) aufgezogen. Die 5-ml-Kultur wurde zu 250 ml LBMG zugegeben und heftig geschüttelt, bis die Kulturdichte bei einer Wellenlänge von 600 nm einen OD von 0,6 erreichte. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation bei 8000 × g gewonnen und wieder in 5 ml LBMG suspendiert. 200 μl Zellen wurden zu 0,2 bis 1 μg binäre Plasmid-DNA in LBMG zugegeben und das Gemisch sofort in einem Trockeneis/Ethanol-Bad eingefroren. Nach 5 Minuten wurde das Röhrchen 5 Minuten in ein Wasserbad bei 37°C gegeben und dann wurden 2 ml LBMG zugegeben. Die Suspension wurde zwei bis drei Stunden bei 30°C im Wasserbad gehalten und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Die Zellen wurden in einem minimalen Volumen LBMG resuspendiert und dann auf selektivem Medium (LBMG-Platten mit 100 μg/ml Gentamycin) ausplattiert. Kolonien erschienen nach 2 bis 3 Tagen bei 30°C.
  • ABSCHNITT 7. TRANSFORMATION VON PFLANZEN
  • Beispiel 58: A. Tumefaciens-vermittelte Transformation von N. tabacum
  • Etwa 5 bis 10 mm-lange Explantate wurden von jungen Blättern, die 3 bis 5 cm lang und an dritter bis sechster Stelle von Scheitel von N. tabacum cv "Xanthi nc" waren, welche unter axenischen Bedingungen (Facciotti und Pilet, 1979) in festem MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962), enthaltend 0,7% Phytagar (Gibco-BRL), 1 ml/I IAA, 0,15 mg/l Kinetin, aufgezogen worden waren, abgeschnitten. Diese Explantate wurden auf festem MS-Medium, welches 0,6% Phytagar, 40 mg/l Adeninsulfat, 2 mg/l IAA und 2 mg/l Kinetin enthielt, ausplattiert und auf die Oberfläche davon wurde ein Nummer 1-Whatman-Filter gelegt und 24 Stunden im Dunkeln bei 24°C inkubiert. Agrobacterium-Stämme (welche das chimäre Genkonstrukt aus Abschnitt 5 enthielten) wurden über Nacht in LBMG bei 30°C auf einem Schüttler bei 180 Ump aufgezogen. Die Explantate wurden etwa 5 Minuten in eine Bakteriensuspension aus 3,3 × 108 Zellen pro ml getaucht, auf sterile Papiertücher geblottet und wieder auf die gleichen Platten ausplattiert. Nach 48 Stunden wurden die Explantate auf Selektionsmedium, welches das gleiche Plattenmedium wie oben plus 350 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin enthielt, gegeben. Co-kultiviertes Kontrollgewebe wurde auf das gleiche Medium, jedoch ohne Kanamycin, gegeben. Die Explantate wurden alle zwei Wochen auf frisches Medium übertragen. Keimlinge wurden 4 bis 8 Wochen nach der Co-Kultivierung geerntet, in 50-ml-Kulturröhrchen mit 25 ml festem MS-Medium, welches 0,6% Phytagar, 1 mg/l IBA, 350 mg/l Cefotaxim und 100 mg/l Kanamycin enthielt, gegeben. Alle Gewebe wurden bei 24° bis 28°C, mit 12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit und einer Lichtintensität von 6700 bis 8400 1x aufgezogen. Die Keimlinge wurzelten in 1 bis 2 Wochen und wurden dann in Substrat in 4-Inch-Töpfe eingebracht und in das "Phytotron für transgene Pflanzen" gegeben.
  • Beispiel 59: Blattscheiben-Transformation bei Tabak
  • Agrobacterium-Stämme, welche die oben beschriebenen binären Vektoren enthielten, wurden 18 bis 24 Stunden in Glutamatsalz-Medium, welches auf pH 5,6 eingestellt und mit 0,15% Mannitol, 50 μg/ml Kanamycin, 50 μg/ml Spectinomycin und 1 mg/ml Streptomycin angereichert worden war, aufgezogen, bevor sie auf einen OD600 von 0,2 im gleichen Medium, ohne die Antibiotika, verdünnt wurden. Die Bakterien wurden dann vor dem Verdünnen auf einen OD600 von 0,2 bis 0,4 drei bis fünf Stunden aufgezogen und wurden dann wurden damit 5 bis 7 mm-große Scheiben, die aus Blättern von N. tabacum cv. Xanthi, welche in aseptischen GA7-Behältern aufgezogen worden waren, ausgestanzt wurden, zu beimpfen, und zwar nach einer Modifikation des Verfahrens von Horsch et al. (1985).
  • Die Blattscheiben wurden auf 0,7 %igem Agar, der die Haupt- und Nebensalze nach Murashige und Skoog (MS), 1 mg/l Benzyladenin und 1 mg/ml NAA enthielt, zwei Tage vor der Übertragung auf das gleiche Medium, welches 50 μg/ml Kanamycin, 100 μg/ml Carbenicillin und 100 μg/ml Mefoxin enthielt, gehalten. Keimlinge, die sich auf diesen Scheiben bildeten, wurden ausgeschnitten und vermehrt, bis man sechs Pflänzchen durch Subkultivieren der Keimlingspitzen auf MS-Medium, welches 50 μg/ml Kanamycin enthielt, in GA7-Behältern erhielt.
  • Die Pflänzchen wurzelten auf Medium, welches keine Hormone und 50 μg/ml Kanamycin enthielt, sie wurden in Erde eingetopft und in einem Phytotron abgehärtet, bevor man sie zur Induktionsbehandlung mit chemischen Regulatoren in ein Gewächshaus überführte. Zur Blütezeit wurden die Blüten zur Selbstbestäubung induziert. Nach dem Heranreifen wurden die Samen gewonnen.
  • Beispiel 60: Herstellung von transgenem Tabak-Kallus und -Pflanzen
  • Agrobacterium-Stämme, welche die binären Vektoren enthielten, wurden zum Transformieren von Kallus verwendet, der sich aus den Blattscheiben (Beispiel 34) bildete. Kallus, der sich auf Kanamycin-haltigem MSBN-Selektionsmedium bildete, wurde auf einem Kallus-Wachstumsmedium, welches die MS-Haupt- und -Neben-Salze und Fe-EDTA (Gibco Nr. 500-1117; 4,3 g/l), MS-Vitamine, 100 mg/l Myo-Inositol, 20 g/l Sucrose, 20 mg/l NAA und 0,3 mg/l Kinetin enthielt, gehalten.
  • Der Kallus kann zum Regenerieren von transgenen Pflanzen verwendet werden, indem man Kallus-Stücke auf MSBN-Medium setzt und nachstehende Verfahren befolgt.
  • Beispiel 61: Transformation von Karotte
  • Agrobacterium-Stämme, welche die binären Vektoren enthielten, wurden wie in Beispiel 59 beschrieben, aufgezogen. Die Bakterien, verdünnt auf ein OD600 von 0,2 bis 0,4 wurden dann zum Impfen der Scheibenschnitte aus Oberflächen-sterilisierten Karotten verwendet.
  • Um bei den Karotten eine Oberflächen-Sterilisation durchzuführen, wurden sie geschält und dann 20 Minuten in einer 10%igen Chlorox-Lösung eingeweicht. Die Karotten wurden mit sterilem Wasser gespült, in 5-mm-Stücke geschnitten und mit der Unterseite nach oben auf Wasseragar gesetzt. 20 bis 50 μl Bakterien wurden dann auf die Oberfläche der Scheiben aufgebracht. Nach 7 Tagen wurden die Scheiben auf 0,7%-igen Agar, der MS-Salze, 3% Sucrose, 0,1 mg/l 2,4-D, 50 μg/ml Kanamycin, 100 μg/ml Carbenicillin und 100 μg/ml Mefoxin enthielt, übertragen. Kallus, der sich um den Kambialring bildete, wurde ausgeschnitten und auf einen 0,7%-igen MS-Agar, angereichert mit 3% Sucrose, 0,1 mg/l 2,4-D, 50 μg/ml Kanamycin, 100 μg/ml Carbenicillin und 100 μg/ml Mefoxin, gegeben. Nachdem der Kallus gewachsen war, wurde er in kleine Stücke geschnitten und statistisch auf vier Platten mit dem gleichen Medium gegeben.
  • Beispiel 62: Transformation von Sonnenblume
  • Agrobacterium-Stämme, welche die binären Vektoren enthielten, wurden wie beschrieben aufgezogen. Die Bakterien, verdünnt auf einen OD600 von 0,2 bis 0,4, wurden dann zum Beimpfen der Stämme von Sonnenblumenpflanzen verwendet, die wie folgt hergestellt worden waren:
  • Sonnenblumensamen wurden 10 Minuten in 10%-igem Captan und anschließend 10 Minuten in 10%-igem Chlorox eingeweicht und dann mit sterilem Wasser gespült. Die Samenhüllen wurden entfernt und dann ließ man die Samen drei Tage im Dunkeln auf 0,7%-igem Wasseragar keimen, wonach man sie in einen Labline-Inkubator, der auf 23°C und einen 12-Stunden-Tag-und-Nacht-Rhythmus eingestellt war, gab. Die Keimlinge ließ man eine Woche wachsen, bevor sie abgeschnitten und auf der Schnittfläche des Stamms mit Bakterien beimpft wurden. Nach einer Woche wurden die beimpften Stämme zerschnitten und auf 0,7%-igen Agar, enthaltend MS-Salze, 3% Sucrose, 2 mg/ml NAA, 1 mg/ml BAP, 100 μg/ml Carbenicillin, 100 μg/ml Mefoxim und 50 μg/ml Kanamycin, gegeben. Der Kallus wurde alle zwei Wochen auf frisches Medium übertragen, bis die gewonnene Menge für vier Platten ausreichte. Die Hälfte des Kallus, der aus dem virulenten Agrobacterium-Stämmen gewachsen war, wurde auf Medium ohne Hormonen, welches 50 μg/ml Kanamycin enthielt, übertragen.
  • Beispiel 63: Transformation von Tomate
  • Agrobacterium-Stämme, welche binäre Vektoren enthielten, wurden wie in Beispiel 59 beschrieben aufgezogen. Die Bakterien, verdünnt auf einen OD600 von 0,2 bis 0,4, wurden dann zum Beimpfen der Stämme von Tomatenkeimlingen verwendet, die wie folgt hergestellt wurden:
  • Tomatensamen wurden 20 Minuten in 10% Chlorox eingeweicht und mit sterilem Wasser gespült. Die Samen ließ man auf 0,7%-igem Wasseragar drei Tage im Dunkeln keimen, wonach man sie in einen Labline-Inkubator, der auf 23°C mit einen 12-Stunden-Tag-und-Nacht-Rhythmus eingestellt war, gab. Die Keimlinge ließ man eine Woche wachsen, bevor man die Köpfe abschnitt und die Schnittfläche des Stamms mit Bakterien beimpfte.
  • Nach einer Woche wurden die beimpften Stämme zerschnitten und auf 0,7%-igen Agar, enthaltend MS-Salze, 3% Sucrose, 2 mg/ml NAA, 1 mg/ml BAP, 100 μg/ml Carbenicillin, 100 μg/ml Mefoxim und 50 μg/ml Kanamycin, gegeben. Der Kallus wurde alle zwei Wochen auf frisches Medium übertragen, bis die gewonnene Menge für vier Platten ausreichte.
  • Beispiel 64: Transformation von Baumwolle
  • Agrobacterium-Stämme, welche die binären Vektoren enthielten, wurden wie beschrieben aufgezogen. Die Bakterien, verdünnt auf einen OD600 von 0,2 bis 0,4, wurden dann zum Beimpfen der Baumwoll-Kotyledonen verwendet, die wie folgt hergestellt wurden: Die Baumwollsamen wurden 20 Minuten in 10%-iges Chlorox eingeweicht und mit sterilem Wasser gespült. Die Samen ließ man auf 0,7%-igem Wasseragar im Dunkeln keimen. Die Keimlinge wurden eine Woche aufgezogen, bevor man sie auf der Kotyledonenoberfläche mit Bakterien beimpfte.
  • Die beimpften Kotyledonen ließ man Kallus bilden, bevor sie zerschnitten und auf 0,7%igen Agar, der MS-Salze, 3% Sucrose, 100 μg/ml Carbenicillin, und 100 μg/ml Mefoxim enthielt, gegeben wurden. Der Kallus wurde alle drei Wochen auf frisches Medium übertragen, bis die erhaltene Menge für vier Platten ausreichte. Die Hälfte des Kallus, der aus den virulenten Agrobacterium-Stämmen gewonnen wurde, wurde auf Medium übertragen, welches keine Hormone und 50 μg/ml Kanamycin enthielt.
  • Beispiel 65: Herstellung eines speziellen Kallustyps aus Zea mays Elite-Inzuchtlinie Funk 2717
  • Zea mays-Pflanzen aus der Inzuchtlinie Funk 2717 wurden bis zur Blüte in einem Gewächshaus aufgezogen und selbst bestäubt. Embryos mit unfreifen Öhrchen und einer Länge von 2 bis 2,5 mm wurden aus den Pflanzen entfernt und in 10%-iger Chlorox-Lösung 20 Minuten sterilisiert. Die Embryos wurden auf aseptische Weise aus den Samenkernen entfernt und mit der Embryoachse nach unten gerichtet auf OMS-Medium gegeben, welches 0,1 mg/l 2,4-D, 6% sucrose und 25 mM L-Prolin enthielt und mit 0,24 % Gelrite® (Initiationsmedium) verfestigt worden war. Nach zweiwöchiger Kultivierung im Dunkeln bei 27°C wurde der Kallus, der sich auf dem Schildchen entwickelt hatte, von dem Embryo entfernt und auf B5-Medium (Gamborg et al., 1968), welches 0,5 mg/l 2,4-D enthielt und mit 0,24% Gelrite® verfestigt worden war, ausplattiert. Der Kallus wurde alle zwei Wochen auf frischem Medium subkultiviert. Insgesamt 8 Wochen nachdem die Embryos auf das Initiationsmedium gegeben worden waren, wurde der spezielle Kallustyp anhand seiner charakteristischen Morphologie identifiziert. Dieser Kallus wurde weiter auf dem gleichen Medium subkultiviert. Nach einem weiteren Zeitraum von zwei Monaten wurde der Kallus auf N6-Medium, welches 2 mg/l 2,4-D enthielt und mit Gelrite® verfestigt worden war, übertragen und fortlaufend subkultiviert.
  • Beispiel 66: Herstellung einer Suspensionskultur aus Zea mays Elite-Inzuchtlinie Funk 2717
  • Der oben beschriebene Kallus wurde für insgesamt wenigstens sechs Monate subkultiviert. Dieser für die Subkultur ausgewählte Kallustyp ist relativ unschleimig, granulär und sehr bröckelig, so dass er leicht in einzelne Zellaggregate aufgetrennt werden kann, wenn er in flüssiges Medium gegeben wird. Man erhält keine Kulturen mit Aggregaten aus großen, expandierten Zellen. Etwa 500-mg-Aliquots des speziellen Kallus aus Zea mays-Eliteinzucht-Funk 2717 wurden in 30 ml N6-Medium, welches 2 mg/l 2,4-D enthielt, in 125-ml-Delong-Flaschen gegeben. Nach einer Woche des Kultivierens bei 26°C im Dunkeln auf einem Rotationsschüttler (130 Upm, 2,5 cm Hub) wurde das Medium mit frischem Medium ersetzt. Die Suspensionen wurden nach einer weiteren Woche nochmals auf diese Weise subkloniert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen untersucht und diejenigen, die keine große Anzahl expandierter Zellen zeigten, wurden zurückbehalten. Suspensionskulturen, die Aggregate mit großen, expandierten Zellen enthielten, wurden verworfen. Das bevorzugte Gewebe bestand aus sich dicht zytoplasmatisch teilenden Zellaggregaten mit einer charakteristisch glatteren Oberfläche als der übliche Typ Zellaggregate. Die zurückbehaltenen Kulturen besaßen wenigstens 50% Zellen, die sich in diesen kleinen Aggregaten zeigten. Dies ist die gewünschte Morphologie. Diese Suspensionen haben auch eine schnelle Wachstumsgeschwindigkeit, mit einer Verdopplungszeit von weniger als einer Woche. Die Suspensionskulturen wurden wöchentlich subkultiviert, indem man 0,5 ml PCV in 25 ml frisches Medium übertrug. Nach vier bis sechs Wochen Subkultivierung auf diese Weise, wurden die Kulturen wöchentlich 2- bis 3-mal subkultiviert. Kulturen, in denen über 75 % der Zellen die gewünschte Morphologie besaßen, wurden für weitere Subkulturen zurückbehalten. Die Linien wurden aufrecht gehalten, indem man für die Subkultur immer die Flasche auswählte, deren Inhalt die beste Morphologie zeigte. Die regelmäßige Filtration durch ein Stahlsieb mit einer Porengröße von 630 μm, alle zwei Wochen, wurde in manchen Fällen eingesetzt, um die Dispersion der Kulturen zu erhöhen, ist jedoch nicht zwingend.
  • Beispiel 67: Herstellung von Protoplasten aus Suspensionskulturen von Zea mal
  • 1 bis 1,5 ml PCV der obigen Zellen aus Suspensionskultur wurden in 10 bis 15 ml eines Filter-sterilisierten Gemischs aus 4% Zellulase RS mit 1% Rhozym in KMC (8,65 g/l KCl, 16,47 g/l MgCl2·6H2O und 12,5 g/l CaCl2·2H2O, 5 g/l MES, pH 5,6)-Salzlösung inkubiert. Der Verdau erfolgte bei 30°C auf einem leicht schaukelnden Tisch für einen Zeitraum von drei bis vier Stunden. Die Herstellung wurde unter einem Umkehrmikroskop anhand der Protoplastenfreisetzung überwacht. Die freigesetzten Protoplasten wurden wie folgt aufgefangen: das Präparat wurde durch ein 100-μm-Mesh-Sieb und anschließend durch ein 50-μm-Mesh-Sieb filtriert. Die Protoplasten wurden mit einem Volumen aus KMC-Salzlösung, das dem ursprünglichen Volumen der Enzymlösung entsprach, durch die Siebe gewaschen. 10 ml der Protoplastenpräparation wurden jeweils in mehrere Einweg-Kunststoffzentrifugenröhrchen gegeben und 1,5 bis 2 ml 0,6 M Sucroselösung (mit 0,1% MES und KOH auf pH 5,6 gepuffert) wurden untergeschichtet. Das Röhrchen wurde bei 60 bis 100 x g 10 Minuten zentrifugiert und die Protoplasten-Bande an der Grenzschicht wurden mit Hilfe einer Pipette gewonnen und in ein frisches Röhrchen überführt. Die Protoplastenpräparation wurde in 10 ml frischer KMC-Salzlösung resuspendiert und 5 Minuten bei 60 bis 100 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und verworfen und die Protoplasten wurden sanft in dem zurückbleibenden Tropfen resuspendiert und dann wurden 10 ml einer KMC-Lösung mit einer Stärke von 13/14 langsam zugegeben. Nach der weiteren Zentrifugation für 5 Minuten wurde der Überstand wieder entfernt und die Protoplasten wurden in einer 6/7-starken KMC-Lösung resuspendiert. Ein Aliquot wurde zum Zählen entnommen und die Protoplasten wieder durch Zentrifugation sedimentiert. Die Protoplasten wurden in einer Konzentration von 107 pro ml in KM-8p-Medium oder in 0,5 M Mannitol, welches 6 mM MgCl2 enthielt, oder einem anderen Medium, das für die Transformation, wie in nachstehenden Beispielen beschrieben, geeignet ist, resuspendiert. Diese Protoplastensuspension wurde zur Transformation verwendet und wurde wie nachstehend beschrieben kultiviert.
  • Beispiel 68: Transformation von Zea mays-Protoplasten durch Elektroporation
    • A. Alle Schritte bis auf den Hitzeschock erfolgten bei Raumtemperatur (22 bis 28°C). Die Protoplasten wurden in dem letzten Schritt von oben in 0,5 M Mannitol, enthaltend 0,1% MES und 6 mM MgCl2, resuspendiert. Der Wiederstand dieser Suspension wurde in einer Kammer eines Dialog-Elektroporators gemessen und mit Hilfe einer 300 mM MgCl2-Lösung auf 1 bis 1,2 kΩ eingestellt. Die Protoplasten wurden einer Hitzeschock-Behandlung unterworfen, indem das Röhrchen, das die Probe enthielt, 5 Minuten in ein 45°C warmes Wasserbad eingetaucht und anschließend auf Eis auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. 4 μg des linearisierten Plasmids, welches ein selektierbares Pflanzen-Hygromycin-Resistenzgen, wie von Rothstein et al. (1987) beschrieben, oder ein chimäres Genkonstrukt, wie beschrieben, enthielt, und 20 μg Kalbsthymus-Träger-DNA wurden zu 0,25-ml-Aliquots dieser Suspension zugegeben. 0,125 ml einer 24%-igen PEG-Lösung (MW 8000) in 0,5 M Mannitol, welche 30 mM MgCl2 enthielt, wurde zu den Protoplasten zugegeben. Das Gemisch wurde gründlich aber sanft gemischt und 10 Minuten inkubiert. Die Probe wurde in die Kammer des Elektroporators übertragen und dreimal in 10-Sekunden-Abständen mit einer Anfangsspannung von 1500, 1800, 2300 oder 2800 Vcm–1 und einer exponentiellen Zerfallszeit von 10 mSek. gepulst.
  • Die Protoplasten wurden wie folgt kultiviert. Die Proben wurden bei Raumtemperatur in 6-cm-Petrischalen ausplattiert. Nach weiteren 5 bis 15 Minuten, wurden 3 ml KM-8p-Medium, welches 1,2% SeaPlaque®-Agarose und 1 mg/l 2,4-D enthielt, zugegeben. Die Agarose und die Protoplasten wurden gut gemischt und man ließ das Medium gelieren.
    • B. Dieses wurde mit ein oder mehreren der nachstehenden Modifikationen wiederholt:
    • (1) Der Wiederstand des Protoplastenpräparation wurde auf 0,5 bis 0,5 kΩ eingestellt.
    • (2) Das verwendete PEG war PEG mit einem MW von 4000.
    • (3) Es wurde kein PEG zugegeben oder es wurde das halbe Volumen von 12%-igem PEG zugegeben.
    • (4) Die Pulse wurden in Abständen von 3 Sekunden zugeführt.
    • (5) Die Protoplasten wurden nach der Elektroporation in Schalen plattiert, die auf einer Platte standen, welche auf eine Temperatur von 16°C gekühlt war.
    • (6) Die Protoplasten wurden nach dem Elektroporationsschritt in Röhrchen gegeben, mit 10 ml 6/7-starker KMC-Lösung oder mit WS-Lösung (bestehend aus 380 mg/l KCl, 18,375 g/l CaCl2·2H2O, 9 g/l NaCl; 9 g/l Glucose, pH 6,0) gewaschen, dann durch 10-minütige Zentrifugation bei 60 x g aufgefangen, in 0,3 ml KM-Medium resuspendiert und wie in A ausplattiert.
    • (7) Es wurde keine Kalbsthymus-Träger-DNA zugegeben.
  • Beispiel 69: Transformation von Zea mays-Protoplasten durch Behandlung mit PEG
    • A. Die Protoplasten wurden im letzten Schritt von oben in einer 0,5 M Mannitol-Lösung, welche 12 bis 30 mM MgCl2 enthielt, resuspendiert. Es erfolgte eine Hitzeschockbehandlung bei 45°C für 5 Minuten, wie oben beschrieben. Die Protoplasten wurden für die Transformation in Aliquots in Zentrifugenröhrchen gegeben, und zwar 0,3 ml suspendierte Protoplasten pro Röhrchen. In den nachfolgenden 10 Minuten wurde folgendes zugegeben: DNA und PEG-Lösung (MW 6000, 40%, enthaltend 0,1 M Ca(NO3)2 und 0,4 M Mannitol; pH 8 bis 9 mit KOH), so dass eine Endkonzentration von 20% PEG gewonnen wurde. Die Aliquots wurden unter gelegentlichem sanften Schütteln 30 Minuten inkubiert, dann wurden die Protoplasten in Petrischalen gegeben (0,3 ml der ursprünglichen Protoplastensuspension pro 6-cm-Durchmesser-Schale) und wie beschrieben kultiviert.
    • B. Dieses wurde wiederholt und die Protoplasten wurden nach 30 Minuten Inkubation in obiger PEG-Lösung gewaschen, indem man 0,3 ml der WS-Lösung fünfmal in Zwei- bis Drei-Minuten-Abständen zugab. Die Protoplastensuspension wurde zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Protoplasten wurden wie beschrieben kultiviert.
    • C. Das oben stehende wurde mit der Modifikation wiederholt, dass die Endkonzentration von PEG zwischen 13 und 25% lag.
  • Beispiel 70: Regeneration des Kallus aus Protoplasten
  • Die Platten, welche die in Agarose enthaltenen Protoplasten enthielten, wurden bei 26°C ins Dunkle gestellt. Nach 14 Tagen entstanden aus den Protoplasten Kolonien. Die Agarose, die die Kolonien enthielt, wurde auf die Oberfläche einer 9-cm-Durchmesser-Petrischale gegeben, die 30 ml N6-Medium, enthaltend 2 mg/l 2,4-D, verfestigt mit 0,24% Gelrite , enthielt. Dieses Medium wird als 2N6 bezeichnet. Der Kallus wurde weiter im Dunkeln bei 26°C kultiviert und Kallusstücke wurden alle zwei Wochen auf frisches festes 2N6-Medium subkultiviert.
  • Beispiel 71: Selektion von transformiertem Kallus aus Zea mays
  • Das obige Beispiel wurde mit der Modifikation wiederholt, dass 100 mg/l oder 200 mg/l Hygromycin B zu dem 2N6-Medium zugegeben wurde, um die transformierten Zellen zu selektieren.
  • Beispiel 72: Regeneration von Maispflanzen
    • A. Kallus wurde zur Erhaltung auf 2N6-Medium und zur Initiation der Regenerierung auf ON6-Medium (bestehend aud N6-Medium ohne 2,4-D) und N61-Medium (bestehend aus N6-Medium mit 0,25 mg/12,4-D und 10 mg/l Kinetin) gegeben. Kallus, der auf ON6-und N61-Medium wächst, wurde im Licht aufgezogen (16 Stunden/Tag Licht mit 840 bis 8400 1x aus weißen Fluoreszenzlampen). Kanus, der auf N61-Medium gewachsen war, wurde nach zwei Wochen auf ON6-Medium übertragen, da eine längere Zeit auf N61-Medium schädlich ist. Der Kallus wurde alle zwei Wochen subkultiviert, selbst wenn der Kallus wieder auf die gleiche Mediumformulierung übertragen werden soll. Nach etwa vier bis acht Wochen erschienen Pflänzchen. Sobald die Pflänzchen wenigstens 2 cm hoch waren, wurden sie auf ON6-Medium in GA7-Behälter überführt. Nach zwei bis vier Wochen entstanden Wurzeln und, wenn die Wurzeln ausreichend ausgebildet erschienen, um das Wachstum zu unterstützen, wurden die Pflänzchen in Erde in Torftöpfe umgepflanzt, wobei das Licht für die ersten vier bis sieben Tage abgeschattet wurde. Oft ist es hilfreich, einen durchsichtigen Plastikbecher für die ersten zwei bis drei Tage über die Transplantate zu stülpen, um das Abhärten zu unterstützen. Sobald sich Pflanzen entwickelt hatten, wurden sie wie normale Maispflanzen behandelt und bis zur Reife in einem Gewächshaus aufgezogen. Um Pflanzenabkömmlinge zu erzeugen, wurden die Pflanzen selbst bestäubt oder mit dem Wildtyp gekreuzt.
    • B. Das obige Beispiel wurde mit der Modifikation wiederholt, dass 100 mg/l oder 200 mg/l Hygromycin B zu dem Medium zugegeben wurde, das zum Erhalten des Kallus verwendet wurde.
  • Beispiel 73: Herstellung von embryogenen Suspensionen aus Gewebe von Dactylis glomerata L. (Knaulgras
    • A. Embryogener Kallus wurde aus dem Basalbereich der jüngsten Blätter von im Gewächshaus aufgewachsenen Knaulgraspflanzen (Dactylis glomerata L.), wie von Hanning und Conger (1982) beschrieben, initiiert. Die Blätter wurden auf der Oberfläche durch Eintauchen in eine 1 : 10 Verdünnung einer Chlorox-Lösung (5,25% Natriumhypochlorit; The Clorox Company, Oakland, Ca.) etwa 10 Minuten sterilisiert und dann in aseptischer Weise in kleine Stücke mit einer Länge oder einem Durchmesser von 1 bis 5 mm geschnitten. Diese Stücke wurden auf steriles SH-30-Medium gegeben, welches 0,8 % Agarose als Geliermittel enthielt. Kallus- und/oder embryogene Strukturen erschienen innerhalb von zwei bis sechs Wochen nach dem Ausplattieren bei einer Kultivierung bei etwa 25°C. Der embryogene Kallus wurde alle zwei bis vier Wochen durch Subkultivieren auf frisches SH-30-Medium und Kultivieren im Dunkeln bei 25°C erhalten.
    • B. Embryogene Suspensionskulturen wurden initiiert, indem man etwa 0,5 g Frischgewicht von embryogenem Kallus in 50 ml Flüssigmedium, wie von Gray und Conger (1985) beschrieben gab, welches 45 μM Dicamba und 4 g/l Caseinhydrolysat enthielt. Die Suspensionskulturen wurden bei 27°C und bei 16 Stunden Licht (3300 1x), acht Stunden Dunkelheits-Photoperiode auf einem Rotationsschüttler bei etwa 130 Upm in 125-ml-Delong-Flaschen, welche mit einer Metallkappe und Parafilm® versiegelt waren, aufgezogen. Nach etwa vier Wochen ließ man die großen Klumpen etwa 30 Sekunden absitzen und, 10-ml-Aliquots des überstehenden Mediums, welches kleine Zell-cluster enthielt, wurden entfernt und in 50 ml frisches Medium überführt. Dieses Verfahren wurde alle drei bis vier Wochen wiederholt, wobei die erfolgreichsten Kulturen verwendet wurden, welche aufgrund der kleineren Klumpengröße und der besseren Qualität, bezogen auf das Vorliegen kleiner zytoplasmatischer Zellen, bewertet wurden. Nach 5 bis 8 Transfers waren die Suspensionen im wesentlichen frei von nicht-embryogenen Zellen und die Mehrzahl der embryogenen Zellcluster waren recht klein (150 bis 200 μm).
  • Beispiel 74: Isolierung und Reinigung von Dactylis glomerata L.-Protoplasten
  • Protoplasten wurden aus obigen embryogenen Suspensionskulturen durch aseptisches Filtrieren der Zellen durch eine Nalgene® 0,2-μm-Filtereinheit und dann Zugeben von 0,5 g Frischgewicht Zellen zu jedem 12,5-ml-Protoplasten-Enzym-Gemisch in einer Petrischale hergestellt. Das Enzymgemisch bestand aus 2% Zellulase RS, 7 mM CaCl2 × H2O, 0,7 mM NaH2P O4 × H2O, 3 mM MES (pH 5,6), Glucose (550 mOs/kg H2O mit pH 5,6) und war Filter-sterilisiert. Das Gemisch wurde auf einem Orbitalschüttler bei etwa 50 Upm bei gedimmtem (< 420 1x) Licht etwa vier bis fünf Stunden geschüttelt. Der Verdau wurde dann durch ein Stahlsieb (100 μm Meshgröße) gesiebt und in 12-ml-Zentrifugenröhrchen verteilt, die dann bei etwa 60 bis 100 x g etwa fünf Minuten zentrifugiert wurden. Das Protoplasten-haltige Sediment wurde dann dreimal mit Protoplasten-Kulturmedium KM-8p, eingestellt auf 550 mOs/kg H2O mit Glucose, gewaschen. An diesem Punkt kann ein Flutationsschritt eingefügt werden, um die Protoplasten weiter zu reinigen. In diesem Fall wurden die gewaschenen Protoplasten auf 10 ml KM-8p-Kulturmedium geschichtet, welches mit Sucrose auf 700 mOs/kg H2O eingestellt worden war. Nach der Zentrifugation bei 60 bis 100 × g für etwa 10 Minuten wurde die Protoplastenbande an der Grenzschicht mit Hilfe einer feinen Pipette entnommen. Schließlich wurden die Protoplasten in 1 bis 2 ml KM-8p-Kulturmedium resuspendiert und durch ein Meshsieb aus Stahl (20 μm Meshgröße) gesiebt. Die freigesetzten Protoplasten wurden entnommen und gewaschen und in KM-8p-Kulturmedium oder in einem osmotisch angepassten Medium, das sich für die Transformation gemäß nachstehender Beispiele eignet, resuspendiert.
  • Beispiel 75: Dactylis glomerata L.-Protoplastenkultur und Wachstum des Kallus
    • A. Die gereinigten Protoplasten wurden in einer Dichte von etwa 5 × 105 Protoplasten pro ml in KM-8p-Kulturmedium, welches 1,3% SeaPlaque®-Agarose (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, Maine, USA) und 30 bis 40% konditioniertes Medium (gewonnen aus 3- bis 4-Wochen-alten Dactylis glomerata L. embryogenen Suspensionskulturen durch Filtrieren des Mediums durch einen sterilen Nalgene® 0,2-μm-Filter, Einstellen des Mediums auf 550 mOs/kg H2O durch Zugabe von Glucose und wieder Filtersterilisierung) enthielt, ausplattiert. Diese Platten wurden dann bei einer konstanten Temperatur von 28°C ins Dunkle gestellt. Nach 10 bis 14 Tagen wurde die Agarose in Keile geschnitten und in „Bead-Kultur", wie von Shillito et al. (1983) beschrieben, gegeben, wobei 20 ml SH-45-Suspensionskulturmedium mit 3% Sucrose pro 3 ml ursprünglich in Agarose eingebettete Kultur verwendet wurde. Die Platten wurden auf einen Tellerschüttler gegeben und bei etwa 50 Upm bei Licht von 6701x geschüttelt. Neue Suspensionskulturen bildeten sich mit dem Auswachsen der Kolonien der Agarose und dem Freisetzen von Zellen in das Flüssigmedium. Die erhaltene Suspension aus kultivierten Zellen wurde auf Agar-verfestigtem SH-30-Medium gegeben und bei 25°C ins Dunkle gestellt, bis sich Kallus bildete.
    • B. Protoplasten wurden wie oben beschrieben kultiviert, außer dass die Kulturmedium kein konditioniertes Medium enthielten.
  • Beispiel 76: Transformation von Dactylis glomerata L. Protoplasten mittels Elektroporation
    • A. Direkt nach der Reinigung der Protoplasten wurden eine Elektroporation gemäß Shillito et al. (1985) durchgeführt, wobei linearisiertes Plasmid verwendet wurde. Die Protoplasten wurden nach dem letzten Waschen in einer Dichte von etwa 7 × 106 Protoplasten pro ml in Elektroporationspuffer (0,4 M Mannitol, 6 mM MgCl2) resuspendiert. Die Protoplasten wurden in 0,7-ml-Aliquots in 10-ml-Kunststoff-Zentrifugenröhrchen gegeben. Plasmid-DNA und ultrabeschallte Kalbsthymus-DNA (Sigma) zur Erlangung von Endkonzentrationen von 10 μg/ml bzw. 50 μg/ml wurden in die Röhrchen gegeben. Dann wurden 0,38 ml PEG-Lösung [24% PEG-6000 in 0,4 M Mannitol, 30 mM MgCl2, 0,1% MES (pH 5,6)] zugegeben und die Lösung vorsichtig gemischt. Die Protoplastensuspension wurde in die Kammer des Dialog®-Elektroporators gegeben und es wurden 10 Pulse von 3250 Vcm–1 Anfangsspannung und eine exponentielle Zerfallskonstante von 10 msec in 30-Sekunden-Abständen angelegt. Die Probe wurde aus der Kammer entfernt und in eine 10-cm-Durchmesser-Petrischale gegeben. 10 ml KM-8p-Medium, welches 1,2% SeaPlaque®-Agarose enthielt, wurde zugegeben und die Protoplasten wurden gleichmäßig durch das Medium verteilt und man ließ die Agarose gelieren.
    • B. Das obige wurde wiederholt, außer dass die verwendete Anfangsspannung 3500 Vcm–1 , 4000 Vcm–1, 5000 Vcm–1, 3000Vcm–1 oder 2500 Vcm–1 betrug.
  • Beispiel 77: Transformation von Dactylis glomerata L.-Protoplasten durch die Behandlung mit PEG
    • A. Der direkte durch PEG-vermittelte Gentransfer wurde gemäß Negrutiu, I. et al. (1987) durchgeführt. Die verwendete DNA war das beschriebene linearisierte Plasmid.
  • Die Protoplasten wurden nach dem letzten Waschen in 0,5 M Mannitol, enthaltend 15 mM MgCl2, mit einer Dichte von etwa 2 × 106 pro ml suspendiert. Die Protoplastensuspension wurde als 1-ml-Aliquots in 10-ml-Kunststoff-Zentrifugenröhrchen verteilt. Die DNA wurde wie oben beschrieben zugegeben und dann wurden 0,5 ml der PEG-Lösung zugegeben (40% PEG-4000 in 0,4 M Mannitol, 0,1 M Ca(NO3)2, pH 7,0).
  • Die Lösungen wurden sanft gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 24°C) bei gelegentlichem Schütteln inkubiert. 1,4 ml der Waschlösung wurden dann zugegeben und der Inhalt des Röhrchens sanft gemischt. Die Waschlösung bestand aus 87 mM Mannitol, 115 mM CaCl2, 27 mM MgCl2, 39 mM KCl, 7 mM Tris-HCl und 1,7 g/l Myo-Inositol, pH 9,0. Vier weitere 1,4-ml-Aliquots der Waschlösung wurden in 4-Minuten-Abständen zugegeben, wobei nach jeder Zugabe gemischt wurde. Das Röhrchen wurde dann bei etwa 60 × g etwa 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die abgesetzten Protoplasten wurden 1-ml-KM-8p-Kulturmedium aufgenommen und in eine 10-cm-Petrischale gegeben. 10 ml KM-8p-Medium, enthaltend 1,2% SeaPlaque® – Agarose wurden zugegeben. Die Protoplasten wurden gleichmäßig im Medium verteilt und man ließ die Agarose gelieren.
    • B. Dies wurde mit ein oder mehreren der nachstehenden Modifikationen wiederholt:
    • (1) Der pH der Waschlösung wurde auf 5,6 oder 7,0 eingestellt.
    • (2) Das verwendete PEG war PEG mit einem MW von 6000, PEG mit einem MW von 2000 oder PEG mit einem MW von 8000.
    • (3) Das Waschmedium bestand aus 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM Glucose, pH 6,0 mit KOH, aus 0,2 M CaCl2, 0,1% MES, pH 6,0 mit KOH oder aus 0,2 M CaCl2, 7 mM Tris/HCl, pH 9,0 mit KOH.
  • Beispiel 78: Transformation von Dactylis glomerata L.-Protoplasten mittels Elektroporation oder PEG-Behandlung
  • Die Transformation wurde wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass die Protoplasten bei 45°C etwa 5 Minuten behandelt wurden, und zwar bevor die Aliquots in die Transformationsröhrchen verteilt wurden oder nach der Verteilung der Aliquots und vor der Zugabe des PEG.
  • Beispiel 79: Selektion der transformierten Kolonien
    • A. Die Kulturplatten (Petrischalen) mit den Protoplasten wurden 10 Tage im Dunkeln bei etwa 25°C inkubiert und dann für „Bead-Kulturen" (Shillito et al., 1983) in fünf gleiche Scheiben geschnitten. Vier der Scheiben wurden in jeweils 20 ml SH-45-Kulturmedium mit 4 g/l Casein-Hydrolysat und 20 μg/ml Hygromycin B gegeben. Die fünfte Scheibe wurde in 20 ml desgleichen Mediums, jedoch ohne Hygromycin B als nichtselektierte Kontrolle gegeben. Nach vier bis fünf Wochen wurden putative transformierte Protoplasten-abstammende Zellkolonien, die in Hygromycin B gewachsen waren, aus der Agarose ausgeschnitten und in eine 19-mm-Petrischale mit 2 ml flüssigem SH-45-
  • Medium, welches 20 μg/ml Hygromycin B enthielt, gegeben und auf einem Orbitalschüttler bei 50 Upm geschüttelt. Nach weiteren vier bis fünf Wochen wurden alle gewachsenen Kolonien zum Herstellen neuer Suspensionen in 150-ml-Erlenmeyerkolben übertragen und auf ähnliche Weise wie die Eltern-Suspensionkultur aufgezogen, außer dass 20 μg/ml Hygromycin B in das Medium zugegeben wurden.
  • Die neuen Suspensionen wurden alle ein bis drei Wochen mit SH-45-Medium, welches 4 g/l Casein-Hydrolysat und 20 μg/ml Hygromycin B enthielt, subkultiviert. Zellen aus diesen Suspensionen wurden auch auf verfestigtem SH-30-Medium, welches 20 μg/ml Hygromycin B enthielt ausplattiert und bei etwa 25°C im Dunkeln inkubiert. Kallus, der auf den plattierten Zellen wuchs, wurde alle zwei Wochen auf frischem Medium subkultiviert. Die Zellen, die in Gegenwart von Hygromycin B wuchsen, waren vermutlich Transformanten.
    • B. Die Selektion erfolgte in beschriebener Weise, außer dass die von Protoplasten abstammenden Zellkolonien, die in Hygromycin B-haltigem Medium wuchsen, auf Agarplatten mit SH-30-Medium, welches 20 μg/ml Hygromycin B enthielt, gegeben und bei etwa 25°C im Dunkeln inkubiert wurden.
  • Beispiel 80: Regeneration transformierter Dactylis glomerata L.-Pflanzen
    • A. Dactylis glomerata L.-Kallus (wie oben gewonnen), der aus Protoplasten stammte, wurde auf verfestigtem SH-30-Medium aufgezogen und alle zwei Wochen subkultiviert. Alle gebildeten Embryos wurden entnommen und auf Keimungsmedium (SH-0) plattiert und dem Licht ausgesetzt (3800 bis 4600 1x). Die Keimung dieser Embryos erfolgte in ein bis vier Wochen und die erhaltenen Pflänzchen wurden auf SH-O-Medium unter Licht gesetzt, so dass sich die Wurzelsysteme ausbildeten. Im Sechs-bis-Zwölf-Blatt-Stadium wurden sie ins Gewächshaus überführt und allmählich abgehärtet.
    • B. Kallus (wie oben gewonnen), der von Protoplasten abstammte, wurde auf mit 0,24% Gelrite® verfestigtem SH-0-Medium im Licht (3800 bis 4600 1x) aufgezogen und alle zwei Wochen subkultiviert. Die erhaltenen Pflänzchen wurden auf 1 : 1 Gemisch aus SH-0 und OMS-Medium, welches mit einer Kombination aus 0,12% Gelrite und 0,4% Agar verfestigt worden war, unter Lichteinfluss gegeben, so dass sich die Wurzelsysteme ausbilden konnten. Im Sechs- bis Zwölf-Blatt-Stadium wurden sie ins Gewächshaus überführt und allmählich abgehärtet.
    • C. Kleine Pflänzchen wurden wie in den Beispielen 44A und 44B beschrieben gewonnen und auf mit 0,8% Agar verfestigtes OMS-Medium unter Einfluss von Licht gegeben, so dass sich die Wurzelsysteme ausbildeten. Sie wurden im Sechs- bis Zwölf-Blatt-Stadium ins Gewächshaus überführt und allmählich abgehärtet.
    • D. Kleine Pflänzchen, die wie oben in Beispiel 44A beschrieben gewonnen wurden, wurden auf ein 1 : 1 Gemisch aus SH-0 und OMS-Medium, welches mit einer Kombination aus 0,12% Gelrite® und 0,4% Agar verfestigt worden war, unter Licht gegeben, so dass sich die Wurzelsysteme ausbildeten. Sie wurden im Sechs- bis Zwölf-Blatt-Stadium ins Gewächshaus überführt und langsam abgehärtet.
  • Beispiel 81: Einführung von DNA in Protoplasten aus N. tabacum durch Behandlung mit PEG
    • A. Die Herstellung von Protoplasten aus N. tabacum kann gemäß Paszkowski et al. (1984); GB 2 159 173, EP 0 129 668 ; Shillito und Potrykus (1987) oder durch andere auf dem Gebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden.
    • B. DNA wurde durch eine Modifikation des Verfahrens von Negrutiu et al. (1987) in Protoplasten eingeführt. Die Protoplasten wurden wie beschrieben hergestellt und nach dem letzten Waschschritt in einer Lösung aus 0,4 M Mannitol, 15 bis 30 mM CaCl2, 0,1% MES bei einer Dichte von 1,6 bis 2 x 106 pro ml resuspendiert. Die Protoplastensuspension wurde als 0,5-ml-Aliquots in 10-ml-Kunststoff-Zentrifugenröhrchen verteilt. Die DNA wurde in 10 μl steriles Wasser gegeben, wie von Paszkowski et al. (1984) beschrieben sterilisiert und dann wurden 0,5 ml der PEG-Lösung (40% PEG MW 8000 in 0,4 M Mannitol, 0,1 M Ca(NO3)2, pH 7,0, zugegeben). Die Lösungen wurden vorsichtig gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 24°C) und gelegentlichem Schütteln inkubiert. 1 ml der Waschlösung wurde dann zugegeben und der Inhalt des Röhrchens vorsichtig gemischt. Die Waschlösung bestand aus 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM Glucose, pH bis 6,0 mit KOH. Weitere Aliquots aus 2 ml, 3 ml und 4 ml der Waschlösung wurden nacheinander in 5-Minuten-Abständen zugegeben, wobei nach jeder Zugabe gemischt wurde. Das Röhrchen wurde dann bei 10 bis 100 x g etwa 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die abgesetzten Protoplasten wurden in ausreichend K3-Kulturmedium mit 0,3 M Glucose als Osmotikum und ohne Sucrose aufgenommen, so dass man eine Enddichte von 105 pro ml erhielt und sie wurden in einer 10-cm-Petrischale kultiviert.
    • C. Das obige wurde mit ein oder mehreren der nachstehenden Modifikationen wiederholt:
    • (1) Der pH-Wert der Waschlösung wurde auf 5,6 oder 7,0 eingestellt.
    • (2) Das verwendete PEG war PEG mit einem MW von 4000.
    • (3) Das Waschmedium bestand aus 0,2 M CaCl2, 0,1% MES, pH 6,0 mit KOH oder aus 0,2 M CaCl2, 7 mM Tris/HCl, pH 9,0 mit KOH.
    • (4) 50 μg Kalbthymus-DNA, die Scherkräften ausgesetzt worden war, in 25 μl sterilem Wasser wurden zusammen mit der Plasmid-DNA zugegeben.
    • (5) Die Plasmid-DNA wurde vor der Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsnzym (z. B. BamHI) linearisiert.
  • Beispiel 82: Einführung von DNA in Protoplasten aus N. tabacum durch Elektroporation
    • A. Die DNA wurde in Protoplasten von N. tabacum eingeführt, indem man die Protolasten in Gegenwart der geeigneten DNA gemäß einer Modifikation des Verahrens von Fromm et al. (1987) und Shillito und Potrykus (1987) mit einem elektrischen Puls behandelte.
  • Die Protoplasten wurden wie beschrieben isoliert. Die Protoplasten wurden nach dem letzten Waschen in nachstehender Lösung resuspendiert: 0,2 M Mannitol, 0,1 % MES, 72 mM NaCl, 70 mM CaCl2, 2,5 mM KCl, 2,5 mM Glucose, pH 5,8 mit KOH bei einer Dichte von 1,6 bis 2 × 106 pro ml. Die Protoplastensuspension wurde in 1-ml-Aliquots in Einwegküvetten aus Kunststoff verteilt und es wurden 10 μg DNA, wie beschrieben, zugegeben. Der Widerstand der Lösung an diesem Punkt, wenn man ihn zwischen den 1 Elektroden des 471-Elektrodensets und des Elektroporationsapparats, wie nachstehend beschrieben, bestimmte, lag im Bereich von 6 Ω .
  • Die DNA wurde in 10 μl sterilem destilliertem Wasser, welches wie von Paszkowski et al. (1984) sterilisiert worden war, zugegeben. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und i dann bei Raumtemperatur (24 bis 28°C) einem Puls von 400 Vcm–1 ausgesetzt mit einer exponentiellen Verfallskonstante von 10 ms, und zwar mit Hilfe eines BTX-Transfector-300-Elektroporationsgeräts und der 471-Elektrodenanordnung. Die Protoplasten ließ man 5 Minuten ungestört liegen, gab sie dann in eine Petrischale und es wurde K3-Medium, wie beschrieben, zugegeben, um die Dichte der Protoplasten auf 105 pro ml zu bringen.
    • B. Das obige wurde mit ein oder mehreren der nachstehenden Modifikationen wiederholt:
    • (1) Die verwendete Spannung betrug 200 Vcm–1 oder lag zwischen 100 Vcm–1' und 800 Vcm–1.
    • (2) Die exponentielle Verfallskonstante betrug 5 ms, 15 ms oder 20 ms.
    • (3) 50 μg gescherte Kalbsthymus-DNA in 25 μl sterilem Wasser wurden zusammen mit der Plasmid-DNA zugegeben.
    • (4) Die Plasmid-DNA wurde vor der Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (z. B. BamHI) linearisiert.
  • Beispiel 83: Einführung von DNA in Protoplasten aus Zea mays Linie 2717
  • Protoplasten der Mais-Inzuchtlinie Funk 2717 wurden wie in den Beispielen 67 bis 69 beschrieben hergestellt und in einer der zur Resuspension von N. tabacum-Protoplasten beschriebenen Lösungen in einer Dichte über 107 pro ml resuspendiert. Die Transformation erfolgte im wesentlichen wie oben beschrieben. Die Protoplasten wurden nach der Transformation in einer Dichte von 2 × 106 pro ml in KM-8p-Medium, dem kein Verfestigungsmittel zugegeben wurde und welches 1 mg pro 12,4-D enthielt, kultiviert.
  • Beispiel 84: Einführung von DNA in Protoplasten aus Sorhum bicolor
  • Protoplasten der Sorghum-Suspension FS562 wurden im wesentlichen wie oben für Zea Mays beschrieben hergestellt und in einer der für die Resuspension von N. tabacum-Protoplasten beschriebenen Lösungen mit einer Dichte von 107 pro ml resuspendiert. Die Transformation wurde durchgeführt. Die Protoplasten wurden nach der Transformation in einer Dichte von 2 × 106 pro ml in KM-8p-Medium, dem kein Verfestigungsmittel zugegeben worden war, kultiviert.
  • Beispiel 85: Einführung von DNA in Protoplasten aus N. plumbaginifolia, Petunia hybrida und Lolium multiflorum
  • Protoplasten aus N. plumbaginifolia, P. hybrida und L. multiflorum wurden wie in Shillito und Potrykus (1987) beschrieben hergestellt und wie oben beschrieben behandelt. Sie wurden in dem von Shillito und Potrykus (1987) beschriebenen Medium ohne die Zugabe von Agarose oder einem anderen Gelierungsmittel kultiviert.
  • Beispiel 86: Einführung von DNA in Protoplasten aus Glycien max
  • Protoplasten aus Glycine max wurden nach den von Tricoli et al. (1986) oder von Chowhury und Widholm (1985) oder Klein et al. (1981) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die DNA wurde im wesentlichen wie oben beschrieben in diese Protoplasten eingeführt. Die Protoplasten wurden wie in Klein et al. (1981), Chowhury und Widholm (1986) oder Tricoli et al. (1986) beschrieben ohne die Zugabe von Alginat, um das Medium zu verfestigen, kultiviert.
  • ABSCHNITT B. ANALYSE DER TRANSGENEN PFLANZEN
  • In dem vorstehenden Abschnitt wurde die Herstellung transgener Pflanzen, welche chimäre krankheitsresistente Gene exprimieren, beschrieben. In diesem Abschnitt wird die Entwicklung transgener Samenlinien und die Charakterisierung dieser Linien in Bezug auf die chimäre Genexpression erklärt. Im wesentlichen umfasst dieses Charakterisierungsverfahren ein vorläufiges Screenen der transgenen Pflanzen auf die Expression des chimären Gens, die Segregation des. chimären Gens zu einer stabilen homozygoten Linie und ferner die Charakterisierung der Genexpression.
  • Beispiel 87: Entwicklung transgener T3-Samenlinien
  • Die Genotypbestimmungen der transgenen Pflanzen, wie hier verwendet, entsprechen nachstehendem Übereinkommen: die ursprüngliche Pflanze, die aus dem Transformationsereignis stammt und aus der Gewebekultur gewachsen ist, wird als T1-Pflanze bezeichnet. Pflanzen, die aus der Selbstbestäubung natürlicher Blüten der T1-Pflanze stammen, werden als T2 bezeichnet und haben ihren neuen Genotyp während des normalen Meioseverfahrens erworben. Gleichermaßen werden Samen, die aus der Selbstbestäubung der natürlichen Blüten von T2-Pflanzen stammen (d. h. aus T2-Samen gewachsen sind) als T3 bezeichnet, usw.
  • Transgene Pflanzen (T1) wurden bis zur Reife aufgezogen. Die Blüten konnten sich selbst bestäuben und die Samenhülsen wurden nach dem normalen Trocknen gewonnen. Samen aus jeder einzelnen Pflanze wurden gewonnen und separat aufbewahrt. Jede Samencharge wurde durch genetische Ausscheidungsanalyse untersucht, um die Anzahl der Mendel'schen Loci, die ein Kanamycin-Resistenzmerkmal enthalten, zu bestimmen. T2-Samen wurden durch mehrfaches Waschen in 2% Hypochlorid, enthaltend 0,02% (v/v) Tween-20 und anschließendes Spülen in sterilem Wasser oberflächensterilisiert. Etwa 150 Samen wurden auf ein mit 0,2 x MS-Salzen (Murashige und Skoog, 1962) gesättigtes Filterpapier, welches 150 μg/ml Kanamycin enthielt, gelegt. Nach der Keimung und Expansion der Kotyledonen auf etwa 5 nun wurde das Verhältnis von normal-grünen (kan-r) gegenüber gebleichten (kan-s) Kotyledonen bestimmt. Nur diejenigen T2-Samenchargen, die ein Verhältnis von 3 : 1 (kan-r : kan-s) zeigten, würden für weitere Untersuchungen zurückbehalten; dieses Ausscheidungsverhältnis ist ein Anzeichen für einen einzelnen Mendel'schen Lokus, der ein Kanamycin-Markergen enthält.
  • Vier von zehn Pflanzen wurden aus jeder T2-Samencharge bis zur Reife aufgezogen (wobei die gleichen Bedingungen wie oben beschrieben verwendet wurden) und sie konnten sich selbst bestäuben. Die T3-Samensammlung, Samensterilisation und Samenkeimung erfolgte wie oben für die T2-Samen beschrieben. Bei den T3-Samenchargen, bei denen 100% der untersuchten Samen (n = 150) den kan-r-Phenotyp zeigten, war anzunehmen, dass sie für dieses Merkmal homozygot waren (d. h. sie stammten aus einer homozygoten T2-Elternpflanze) und sie wurden zur Phenotypuntersuchung aufbewahrt.
  • Beispiel 88: Test zur Analyse von transgenem Pflanzengewebe, welches Sense- oder Antisense-PR-1 exprimiert Die Expression von PR-1a, entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung, wurde in transgenem Pflanzenmaterial entweder mit einem ELISA-Assay für das PR-1a-Protein oder einem Primerverlängerungs-Assay für PR-1-mRNA beschrieben.
  • A. ELISA für PR-1-Protein. Der Test erfolgte mit Immunolon-II-Microtiterplatten (Dynatech), welche man mit Ethanol ausspülte und an der Luft trocknen ließ. Tabakblattmaterial wurde mit einem Kunststoff-Gewebehomogenisator (Kontes) in einem Puffer, welcher aus 50 mM Tris-HCl, pH 8,5; 200 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM PMSF (Sigma), 2 mM BAM (Sigma), 10 mM ACA (Sigma) und 0,048% Leupeptin (Hemisulfatsalz) (Sigma) bestand, gemahlen, wobei 3 ml Extraktionspuffer pro Gramm Blattgewebe eingesetzt wurden. Eine ausreichende Probe Extrakt aus gesunden Blättern, (unbehandelter Tabak) wurde so hergestellt, dass eine 1/10-Verdünnung dieses Extrakts als Verdünnungsmittel für die anderen Proben verwendet werden konnte. Die Extrakte wurden in einer Mikrozentrifuge in 1,5-ml-Polypropylenröhrchen bei 12000 × g (maximal) 15 Minuten zentrifugiert, um Debris zu entfernen. Die Wells wurden mit einer Lösung eines monoklonalen Antikörpers, der für das PR-1-Protein (Tabak) spezifisch war, beschichtet. Nach dem Waschen wurden die Wells 30 bis 120 Minuten mit einer Lösung aus 1% BSA blockiert und dann wieder gewaschen. Die unbekannten Proben und die Proben für die Standardkurve, verdünnt auf geeignete Konzentrationen mit einer 1/10-Lösung des Extrakts aus gesunden Pflanzen, wurden in die Wells gegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert (eine Eichkurve wurde mit Hilfe von hoch gereinigtem PR-1a-Protein hergestellt). Nach dem Waschen wurde ein polyklonales Hase-Antiserum (5 μg/ml), welches spezifisch für PR-1 war, in die Wells gegeben und eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend wurden die Wells wieder gewaschen. Ein Ziege-Anti-Hase-IgG-Antikörper (133 ng/ml), an den das Indikator-Enzym Alkalische Phosphatase (Promega) konjugiert war, wurde zugegeben und die Indikatorreaktion wurde entsprechend den Herstellerempfehlungen entwickelt. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten durch Zugabe von NaOH gestoppt und die Adsorption wurde bei 405 nm gemessen.
  • B. Primerverlängeruns-Test für PR-1. RNA wurde aus Tabakblattgewebe durch ein zuvor beschriebenes Verfahren (Ecker und Davis, 1987) extrahiert. Primerverlängerungsassays wurden wie in Beispiel 6 mit einem synthetischen Oligonukleotid der Sequenz
    Figure 01140001
    durchgeführt. Das Komplement zu dieser Sequenz kommt sowohl in PR-1a- als auch PR1b-mRNA vor, so dass in diesem Test beide mRNA-Typen geprimt werden. Die Primerverlängerungsprodukte des chimären Genprodukts wurden von den anderen Produkten der endogenen PR-1-Gene mittels PAGE unterschieden. Das chimäre PR-1a-Transkript, das durch den Promotor der kleinen Untereinheit von Tabak RUBISCO von pCGN1509-Derivaten erzeugt wurde, führt zu einem Primerverlängerungsprodukt, welches 90 bp länger war als das endogene Pr-1a-Gen, während das chimäre PR-lb-Transkript, welches durch den Promotor der kleinen Untereinheit von Tabak-RUBISCO von pCGN1509-Derivaten erzeugt wurde, ein Primerverlängerungsprodukt erzeugt, welches 95 bp länger war als das endogene PR-1b-Gen. Das von dem doppelten 35S-Promotor von pCGN1761-Derivaten erzeugte chimäre PR-1a-Transkript führte zu einem Produkt, welches 4 bp länger war als das endogene PR-1a-Gen, während das von dem doppelten 35S-Promotor von pCGN1761-Derivaten erzeugte chimäre PR-1b-Transkript zu einem Produkt führte, welches 10 bp länger war als das endogene PR-1b-Gen.
  • Beispiel 89: Analyse von Samenlinien, die aus der Transformation von Tabak mit Vektoren aus den pCGN1755- und pCGN1756-Serien stammten (RUBISCO SSU/PR-1a oder PR-lb/ocs-3')
  • Eine Blattgewebeprobe wurde von T1-Pflanzen entnommen, die tranformiert worden waren mit entweder: pCGN1754 oder pCGN1760 (als Kontrollen mit leerer Kassette); einem binären Vektor der pCGN1755-Reihe (SSU-Promotor/PR-1a in allen Orientierungen); einem binären Vektor der pCGN1756-Reihe (SSU-Promotor/PR-1b). Die Expression des PR-1-Proteins in diesem Gewebe wurde durch ELISA für das PR-1-Protein bestimmt und in manchen Fällen wurde der RNA-Spiegel durch einen Primerverlängerungstest überwacht.
  • Es wird vorausgesagt, dass mit den Kontrollplasmiden, pCGN1754 und pCGN1760 (leere Kassetten) transformiertes Gewebe einen bestimmten Grundgehalt PR-1-Protein aufweist, der auf die endogene Synthese zurückgeht. Gewebe, welches mit den Plasmiden pCGN1755A, pCGN1755C, pCGN1756A oder pCGN1756C (PR-1a oder PR-lb in Sense-Orientierung) transformiert wurde, sollte Pflanzen erzeugen, die PR-1 in wesentlich höheren Mengen exprimieren als der Grundmenge. Gewebe, welches mit pCGN1755B, pCGN1755D, pCGN1756B oder pCGN1756D (PR-1a oder PR-lb in Antisense-Orientierung) transformiert wurde, sollte wesentlich geringere Mengen PR-1-Protein als die Kontrolle erzeugen. Die Pflanzen, die beim Screenen des transformierten T1-Gewebes nach PR-1-Protein mittels ELISA die Erwartungen bestätigten, wurden einer T2-Analyse unterworfen. Der Grund für dieses Screening war es, diejenigen Trans formanten auszuschließen, die das chimäre PR-1-Gen nicht mit dem Antibiotika-Resistenzgen cotransformierten. Viele Pflanzen aus jeder Transformation erfüllten die Erwartungen nicht, und das Proteinergebnis wurde durch Primerverlängerungsassays der RNA bestätigt, um sicherzustellen, dass der höhere Expressionsgrad in Sense-Pflanzen auf die Expression des chimären Gens zurückgeht.
  • Die Tests wurden mit der T2-Generation wiederholt und an diesem Punkt wurden mehrere Linien zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Die Linien wurden ausgewählt auf Basis von: (1) einer 3 : 1-Auswahl der Antibiotikaresistenz, was auf eine Mendel'sche vererbte (einzelnes Insertionsereignis) Eigenschaft hinweist; (2) hohe Expressionswerte von PR-1 für Sense-Konstrukte, niedrige Werte für Antisense-Konstrukte und mittlere Werte für Kontrollpflanzen. Die zur weiteren Untersuchung ausgewählten Linien und die Daten der PR-1-Expression und -Segregation sind nachstehend gezeigt.
  • Figure 01160001
  • Die Nomenklatur der Samenlinie wurde so ausgewählt, dass das transformierende Plasmid zuerst genannt und die jeweilige Transformante als zweites genannt wird.
  • 1755A-4 steht beispielsweise für eine transgene Pflanze, die aus der Transformation mit dem Plasmid pCGN1755A stammt und dies ist der vierte unabhängig ausgewählte Transformant. In vielen dieser Versuche scheint der Kontrollspiegel der PR-1-Expression künstlich hoch (d. h. 1754–12 mit einem Wert über 300 ng/ml ist etwa 30-mal höher als normal). Dieser Wert nimmt in der Kontrolle ab, nicht jedoch in den Versuchspflanzen der nachfolgenden Generationen.
  • Die obigen T2-Samenlinien sind Misch-Genotypen hinsichtlich des chimären PR-1-Gens. So sind beispielsweise einige der Pflanzen aus einer Samenlinie homozygot und andere heterozygot bezüglich eines Merkmals. Um die heterozygoten Samenlinien zu isolieren, wurden vier bis zehn Pflanzen aus jeder Linie selbst bestäubt und konnten Samen entwickeln. Dieser Samen wurde eingesammelt und die Segregation wie oben erklärt bestimmt. Die Segegationsdaten für mehrere Linien sind nachstehend gezeigt.
    T3-Samenlinie Segregation
    (% Kan-R)
    1754-12-10 100
    1755A-4-2 100
    1755B-2-1 100
    1755B-3-1 100
    1760-1 ND
  • Diese homozygoten Samenlinien wurden dann auf die allgemeine Krankheitsresistenz wie nachstehend beschrieben untersucht. Die allgemeine Schlussfolgerung aus dieser Untersuchung bei einer Reihe von Pflanzen ist, dass die Sense-Konstrukte (sowohl PR-1a als auch PR-lb) die 6- bis 150-fache Menge von PR-1 in gesundem Tabakgewebe erzeugen und die Antisense-Konstrukte üblicherweise viel weniger PR-1 erzeugen als gesunder Tabak.
  • Beispiel 90: Analyse von Samenlinien, die aus der Transformation von Tabak mit den Vektoren der pCGN1764-, pCGN1765-, pCGNl774- und pCGN1775-Reihen stammen (doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-1a)
  • Die Entwicklung von Samenlinien in diesem Beispiel umfasst die Transformationen von Tabak mit dem doppelten CaMV-35S-Promotor, der an PR-1a (pCGN1764- und pCGN1774-Reihen) in Sense- und Antisense-Orientierung gekoppelt ist, und dem doppelten CaMV-35S-Promotor, welcher an PR-lb (pCGN1765- und pCGN1775-Reihen) in Sense- und Antisense-Orientierung geknüpft ist. Der Unterschied zwischen dem pCGN1764/pCGN1765- und dem pCGN1774/pCGN1775-Konstrukt ist, dass die binären Vektoren unterschiedlich sind (siehe oben die relevanten Beispiele). Kontrollen mit einer leeren Kassette für pCGN1764 und pCGN17G5 waren pCGN1766 und pCGN1767. Die Kontrolle mit einer leeren Kassette für pCGN1774 und pCGN1775 war pCGN1789.
  • Die PR-1-Protein-Expression in den „Sense"-T1-Pflanzen (alle Ereignisse) reicht von nicht-nachweisbaren Mengen bis etwa 13000 ng/ml Extrakt; dieser Maximalwert liegt im zweifachen Bereich der Werte, die mit hoch infizierten primären Blättern mit vielen Läsionen gewonnen wurden. Die in sekundärem Gewebe gefundenen Werte, selbst unter optimalen Bedingungen, sind mehrfach niedriger als dieser. Der durchschnittliche Expressionsgrad für alle „Sense"-T1-Pflanzen beträgt etwa 4200 ng/ml, was über 20-fach höher ist als der Durchschnitt für die transgenen Pflanzen bezüglich der kleinen Untereinheit von PR-1.
  • Keine wesentlichen Unterschiede in den Expressionswerten der chimären Gene wurden bei dem binären Vektor pCGN783 beobachtet (der pCGN1764- und der pCGN1765-Reihe). Beide Sätze Pflanzen haben einen breiten Bereich für den Expressionsgrad, wie es für transgene Versuche dieses Typs üblich ist. Die höchste Expression in beiden Typen ist ähnlich und die Anzahl Pflanzen, die in einem geringen Grad exprimieren, ist etwa gleich. Der Durchschnitt der binären Pflanzen pCGN783 ist höher als der Durchschnitt der transgenen Pflanzen mit der kleinen Untereinheit von PR-1.
  • Es wurden kein wesentlicher Unterschied im Expressionsgrad des chimären Gens zwischen dem binären Vektor pCGN783 (der pCGN1764- und der pCGN17065-Reihe) und dem binären Vektor pCGN1540 (der pCGNl774- und der pCGN1775-Reihe) gesehen. Der Durchschnitt bei den binären Pflanzen pCGN783 betrug 3955 ng/ml und bei den binären Pflanzen pCGN1540 betrug er 4415 ng/ml; betrachtet man jedoch die Abweichung, ist dieser Unterschied nicht signifikant. In ähnlicher Weise hat die Orientierung der Gene in den binären Vektoren keine wesentliche Auswirkung auf die Expression. Die „C"-Orientierung (Kopf zu Schwanz) liefert drei der vier am höchsten exprimierenden Pflanzen, führt jedoch auch zu mehr gering exprimierenden Pflanzen. Die Pflanzen mit der „A"-Orientierung (Kopf zu Kopf) neigen eher dazu, sich in einem mittleren Expressionsbereich anzusammeln, aber wiederum wird durch die Abweichung und die kleine Probengröße verhindert, dass bei diesen Unterschieden eine statistische Signifikanz erreicht wird. Die Primerverlängerungsanalyse einer begrenzten Anzahl Proben zeigte, dass die chimäre Gen-mRNA die dominante oder die einzig vorliegende PR-1-mRNA ist.
  • Die Schlussfolgerung aus den T1-Daten ist, dass der Gehalt an PR-1-Protein in Pflanzen, welche mit dem Doppelter CaMV-35S-Promotor/PR-1a- oder -PR-1b-Sensekonstrukt transformiert wurden, mehrere hundert-fach höher ist als der Gehalt in Kontrollpflanzen. Der Expresssionsgrad von PR-1 in Pflanzen, die mit dem Antisensekonstrukt transformiert wurden, ist sehr gering. Der für die Transformation verwendete binäre Vektor (pCGN783 oder pCGN1540) beeinflusst den Grad der PR-1-Expression in transgenen Pflanzen nicht entscheidend. Gleichermaßen hat die Orientierung der Expressionskassette in dem Vektor keinen wesentlichen Einfluss auf den PR-1-Expressionsgrad. Daher wurde zur weiteren Entwicklung eine Linie ausgewählt, welche PR-1a aufgrund der Sense-Expression in hohen Mengen produziert und eine, die PR-1a aufgrund der Antisense-Expression in geringen Mengen herstellt. Eine Kontrolllinie mit einer leeren Kassette wurde mitgeführt. Die Ergebnisse der PR-1-Expression und der Antikörper-Segregation für die ausgewählten Linien sind nachstehend gezeigt.
  • Figure 01180001
  • Homozygote T3-Samenlinien wurden aus jeder der ausgewählten Linien wie in vorstehendem Beispiel beschrieben, hergestellt. Die Ergebnisse der Segregationsanalyse sind nachstehend gezeigt.
    T3-Samenlinie Segregation
    (% Kan-R)
    1774A-10-1 100
    1774-3-2 100
    1789-10-3 100
  • Diese homozygoten Samenlinien wurden anhand der PR-1-Expression und der Krankheitsresistenz wie nachstehend beschrieben ausgewertet.
  • Beispiel 91: Analyse von Samenlinien, welche aus der Transformation von Tabak mit der Reihe der pCGNl779-Plasmide stammten (doppelter CaMV-35S-Promotor/Gurkenchitinase/Lysozym)
  • Eine Blattgewebeprobe wurde aus T1-Pflanzen, welche mit einem der binären Vektoren pCGN1779C oder pCGN1779D transformiert worden waren, genommen. Der Gehalt des Gurkenchitinase/Lysozym-Proteins wurde mit Hilfe eines ELISA-Tests bestimmt, im wesentlichen wie oben beschrieben, außer dass die monoklonalen und polyklonalen Antikörper gegen das Gurkenchitinase/Lysozym-Protein gerichtet waren.
  • Acht von dreizehn T1-„Sense"-Pflanzen erzeugten sehr hohe Mengen (> 10000 ng/ml Extrakt) des fremden Gurkenchitinase-Genprodukts. Wieder wurde ein großer Bereich, von nicht-nachweisbaren bis zu 31500 ng/ml Extrakt, beobachtet, wobei der Durchschnitt bei 12500 ng/ml Extrakt lag.
  • Aus den T1-Daten lässt sich schließen, dass die transformierten T1-Pflanzen mehrere tausendfach mehr transgenes Protein produzieren als in Kontrollpflanzen vorliegt. T3-Samenlinien stammen von den hoch-exprimierenden T1-Pflanzen, wie in Beispiel 87 beschrieben, ab und diese T3-Samenlinien erhalten ihre hohen Werte der Chitinase/Lysozym-Expression.
  • Beispiel 91B: Analyse von Samenlinien die aus der Transformation von Tabak mit der pCGN1782-Plasmidreihe abstammen (doppelter CaMV-35S-Promotor/ basische Tabakchitinase)
  • Eine Blattgewebeprobe wurde aus T1-Pflanzen entnommen, die mit einem der binären Vektoren pCGN1782C oder pCGN1782D transformiert worden waren. Der Gehalt des basischen Tabak-Chitinase-Proteins wurde durch eine Immunoblot-Technik (Towbin et al., 1979) und nach der Modifizierung von Johnson et al. (1984) und anschließender SDS- PAGE (Laemmli, 1970) abgeschätzt. Die verwendeten Antikörper wurden durch übliche Verfahren gegen das basische Tabakchitinase-Protein gerichtet und waren spezifisch für das basische Tabakchitinase-Protein. T1-Pflanzen mit dem pCGN1782C-Plasmid (welche die Sense-Expressionskassette enthielten), die erhöhte Expressionsgrade in Bezug auf Kontroll- und Antisense-Pflanzen zeigen, wurden wie in Beispiel 87 beschrieben, zu T3-Samenlinien fortgeführt. Homozygote T2-Pflanzen, welche diese T3-Samen erzeugten, exprimierten das Protein weiterhin in hohen Mengen. T1-Pflanzen, die mit dem pCGN1782D-Plasmid (welches die Antisense-Expressionskassette enthielt) transformiert worden waren und einen niedrigen Expressionsgrad zeigten, wurden auch wie in Beispiel 87 beschrieben zu T3-Samen weiterentwickelt.
  • Beispiel 91C: Analyse von Samenlinien, die aus der Transformation von Tabak mit der pCGN1781-Plasmidreihe stammten (dopelter CaMV-35S-Promotor/basische Tabaklutanase)
  • Eine Blattgewebeprobe wurde aus T1-Pflanzen entnommen, die mit einem der binären Vektoren pCGN1781C oder pCGN1781D transformiert worden waren. Der Gehalt des basischen Tabak-Glucanase-Proteins wurde durch ein in Beispiel 91B beschriebenes Immunoblot-Verfahren abgeschätzt. Die Antikörper wurden durch übliche Verfahren gegen das basische Tabakglucanase-Protein gerichtet und waren spezifisch für das basische Tabakglucanase-Protein. T1-Pflanzen mit dem pCGN1781C-Plasmid (welches die Sense-Expressionskassette enthielt), das einen hohen Expressionsgrad in Bezug auf Kontroll- und Antisense-Pflanzen zeigte, wurde wie in Beispiel 87 beschrieben, zu T3-Samenlinien weiterentwickelt. Homozygote T2-Pflanzen, welche diese T3-Samen erzeugten, exprimierten das Protein weiterhin in hohen Mengen. T1-Pflanzen, die mit dem pCGN1781D-Plasmid (welches die Antisense-Expressionskassette enthielt) transformiert worden waren und einen niedrigen Expressionsgrad zeigten, wurden auch wie in Beispiel 87 beschrieben zu T3-Samen weiterentwickelt.
  • ABSCHNITT 9: AUSWERTUNG DES PHENOTYPS
  • Die Entwicklung stabiler transgener Samenlinien von Tabak, welche chimäre PRP-Gene in Sense- und Antisense-Orientierung exprimieren, ist in den Abschnitten 1 bis 8 beschrieben. Sobald die Samenlinien entwickelt waren, wurden sie quantitativ auf ihre Resistenz gegen verschiedene Krankheiten ausgewertet.
  • Beispiel 92: Auswertung von transgenem Tabak, welcher PR-1 in Sense- und Antisense-Orientierung exprimiert, auf Krankheitsresistenz
  • Die Samenlinien 1755A-4-2 und 1755B-2-1 wurden auf ihre Resistenz gegen TMV untersucht. Das Ergebnis dieser Versuche war, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Läsionsgröße oder Läsionszahl aufgrund eines entweder erhöhten oder verringerten Spiegels an PR-1-Protein gab.
  • Die Samenlinien 1755A-4-2 und 1755B-2-1 wurden auf ihre Resistenz gegen das Pilzpathogen Peronospora nicotiana (falscher Blauschimmel-Ei-Mehltau) untersucht, indem man eine Sporensuspension auf die Blätter der Pflanzen sprühte und diese 7 Tage unter üblichen Bedingungen inkubierte. Die Pflanzen wurden dann auf die Resistenz gegen Blauschimmel untersucht und zwar beruhend auf dem Prozentsatz der Blattoberfläche, die durch das Pathogen infiziert war. Sechs Pflanzen der 1755A-4-2-Linie, welche durchschnittlich 1454 ng/ml PR-1-Protein exprimierten, zeigten eine 98 ± 3%-ig infizierte Oberfläche. Sechs Pflanzen der 1755B-2-1-Linie, welche durchschnittlich 370 ng/ml PR-1-Proteine exprimierten, zeigten eine infizierte Oberfläche von 45% 26%. Sechs Pflanzen, die von dem nicht-transformierten Xanthi.nc-Tabak abstammten, welcher 559 ng/ml PR-1-Protein exprimierte, zeigten eine infizierte Oberfläche von 99% ± 1%. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Antisense-Expression von PR-1a zu einer signifikanten und wertvollen Resistenz gegen falschen Mehltau in transgenen Pflanzen führt.
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Claims (59)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem krankheitsresistenten Phänotyp, umfassend: (a) Transformieren von Pflanzengewebe oder Zellen mit einer chimären DNA-Sequenz, die eine erste DNA-Sequenz mit einem Promotor, welcher in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz dient und operativ an eine zweite DNA-Sequenz geknüpft ist, welche eine kodierende Sequenz umfasst, die für ein induzierbares, Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, wobei das Pathogenese-bezogene Protein keine Chitinase ist; (b) konstitutives Exprimieren des Pathogenese-bezogenen Proteins in einer ausreichenden Menge, um einen krankheitsresistenten Phänotyp der gemäß Schritt (a) transformierten Pflanze bereitzustellen; und (c) Auswählen derjenigen Pflanzen, die einen krankheitsresistenten Phänotyp zeigen, wobei die Krankheit durch pathogene Pilze hervorgerufen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste DNA-Sequenz von heterologem Ursprung in Bezug auf die zweite DNA-Sequenz ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste DNA-Sequenz aus einem Gen hergestellt wird, welches für die kleine Untereinheit der Tabak-Ribulose-Bisphosphatcarboxylase (RUBISCO) kodiert.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die aus dem CaMV-Genom hergestellte erste DNA-Sequenz einen doppelten CaMV-35S-Promotor enthält.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite DNA-Sequenz aus einer DNA-Bank erhältlich ist, welche aus einem Pflanzengewebe hergestellt ist, das mit Hilfe biologischer Induktoren dazu induziert wurde, eine systemisch erworbene Resistenz oder eine lokal erworbene Resistenz zu entfalten.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite DNA-Sequenz für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, welches aus der Gruppe aus: von Sequenz 1 kodiertem PR-1A, von Sequenz 2 kodiertem PR-1B, von Sequenz 3 kodiertem PR-1C, von Sequenz 4 kodiertem PR-R-Haupt, PR-R-Neben, von Sequenz 6 kodiertem PR-P, von Sequenz 5 kodiertem PR-Q, von Sequenz 8 kodiertem PR-2, PR-N, PR-O, von Sequenz 7A kodiertem PR-O', von Sequenz 9 kodiertem SAR8.2a, von Sequenz 10 kodiertem SAR8.2b, von . Sequenz 12 kodierter basischer Gurken-Peroxidase und basischer Tabak-Glukanase ausgewählt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste und die zweite DNA-Sequenz in einer Weise verknüpft sind, dass die zweite DNA-Sequenz in Bezug auf die erste DNA-Sequenz so ausgerichtet ist, dass die erste DNA-Sequenz als Promotor für die Transkription vom kodierenden Strang der zweiten DNA-Sequenz dient.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chimäre DNA-Sequenz ferner eine dritte DNA-Sequenz umfasst, welche ein pflanzenselektierbarer Genmarker ist.
  10. Transgene Pflanze, einschließlich die Abkömmlinge davon, welche mit einem chimären DNA-Molekül, umfassend einen Promotor, welcher in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz dient und operativ an eine kodierende Sequenz geknüpft ist, welche für ein induzierbares, Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, transformiert wurde, wobei das Pathogenese-bezogene Protein keine Chitinase ist, so dass in konstitutiver Weise ein Pathogenese-bezogenes Protein in einer ausreichenden Menge exprimiert wird, um einen krankheitsresistenten Phänotyp bereitzustellen, wobei die Abkömmlinge dieses chimäre DNA-Molekül umfassen und die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  11. Transgene Pflanze nach Anspruch 10, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  12. Transgene Pflanze nach Anspruch 10, worin das Pflanzenpathogenese-bezogene Protein aus der Gruppe aus: von Sequenz 1 kodiertem PR-1A, von Sequenz 2 kodiertem PR-1B, von Sequenz 3 kodiertem PR-1C, von Sequenz 4 kodiertem PR-R-Haupt, PR-R-Neben, von Sequenz 6 kodiertem PR-P, von Sequenz 5 kodiertem PR-Q, von Sequenz 8 kodiertem PR-2, PR-N, PR-O, von Sequenz 7A kodiertem PR-O', von Sequenz 9 kodiertem SAR8.2a, von Sequenz 10 kodiertem SAR8.2b, von Sequenz 12 kodierter basischer Gurken-Peroxidase und basischer Tabak-Glukanase ausgewählt ist.
  13. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 11 oder 12, welches eine Pflanze ist, die aus der Gruppe aus Tabak, Karotte, Sonnenblume, Tomate, Baumwolle, Sorghum, Petunie und Glycine ausgewählt ist.
  14. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 11 oder 12, welches eine Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe aus Zea Mays, Dactylis und Lolium, ist.
  15. Transgene Pflanze nach Anspruch 14, welches eine Maispflanze ist.
  16. Transgener Pflanzensamen, der von einer Pflanze nach einem der Ansprüche 10 bis 15 gewonnen wurde, wobei der Samen das chimäre DNA-Molekül enthält.
  17. Nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellte krankheitsresistente Pflanze, wobei die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  18. Krankheitsresistente Pflanze nach Anspruch 17, wobei die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  19. Nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 9 hergestellte krankheitsresistente Pflanze, worin die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  20. Krankheitsresistente Pflanze nach Anspruch 19, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  21. Pflanzengewebe, welches auf konstitutive Weise induzierte Mengen Pflanzenpathogenese-bezogener Proteine exprimiert oder auf konstitutive Weise eine Menge Pathogenese-bezogener Proteine exprimiert, so dass ein krankheitsresistenter Phänotyp bereitgestellt wird, mit der Vorgabe, dass die Pathogenesebezogenen Proteine von heterologem Ursprung mit Bezug auf die zu transformierende Pflanze sind und keine Chitinase sind, wobei die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  22. Pflanzengewebe nach Anspruch 21, wobei die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  23. Verfahren zum Schutz einer Pflanze vor Schädigung durch eine Pflanzenkrankheit, umfassend Transformieren von Pflanzengewebe oder Zellen mit einer chimären DNA-Sequenz, welche eine erste DNA-Sequenz enthält, die in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer zweiten DNA-Sequenz dient, und eine zweite DNA-Sequenz, welche die kodierende Sequenz eines induzierbaren, Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins oder eine kodierende Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu der kodierenden Sequenz eines induzierbaren, Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins umfasst, so dass die transformierte Pflanze einen krankheitsresistenten Phänotyp zeigt, und Anpflanzen der transformierten Pflanze in einer Umgebung, wo die Erkrankung auftreten kann, wobei das Pathogenese-bezogene Protein keine Chitinase ist und die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, worin die zweite DNA-Sequenz für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein, ausgewählt aus der Gruppe aus: von Sequenz 1 kodiertem PR-1A, von Sequenz 2 kodiertem PR-1B, von Sequenz 3 kodiertem PR-1C, von Sequenz 4 kodiertem PR-R-Haupt, PR-R-Neben, von Sequenz 6 kodiertem PR-P, von Sequenz 5 kodiertem PR-Q, von Sequenz 8 kodiertem PR-2, PR-N, PR-O, von Sequenz 7A kodiertem PR-O', von Sequenz 9 kodiertem SAR8.2a, von Sequenz 10 kodiertem SAR8.2b, von Sequenz 12 kodierter basischer Gurken-Peroxidase und basischer Tabak-Glukanase ausgewählt ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  26. Verfahren nach Anspruch 23, worin die zu schützende Pflanze eine Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 20 ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, worin die zu schützende Pflanze eine Pflanze aus der Gruppe aus Tabak, Karotte, Sonnenblume, Tomate, Baumwolle, Sorghum, Petunie und Glycine ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, worin die zu schützende Pflanze eine aus der Gruppe aus Zea Mays, Dactylis und Lolium ausgewählte Pflanze ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die zu schützende Pflanze eine Maispflanze ist.
  30. Patentensprüche
  31. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einem krankheitsresistenten Phänotyp, umfassend: (a) Transformieren von Pflanzengewebe oder Zellen mit einer chimeren DNA-Sequenz, die eine erste DNA-Sequenz mit einem Promotor, welcher in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz dient und operativ an eine zweite DNA-Sequenz geknüpft ist, welche eine kodierende Sequenz umfasst, die für ein induzierbares, Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, wobei das Pathogenese-bezogene Protein keine Chitinase ist; (b) konstitutives Exprimieren des Pathogenese-bezogenen Proteins in einer ausreichenden Menge, um einen krankheitsresistenten Phänotyp der gemäß Schritt (a) transformierten Pflanze bereitzustellen; und (c) Auswählen derjenigen Pflanzen, die einen krankheitsresistenten Phänotyp zeigen, wobei die Krankheit durch pathogene Pilze hervorgerufen wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 1, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  33. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste DNA-Sequenz von heterologem Ursprung in Bezug auf die zweite DNA-Sequenz ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste DNA-Sequenz aus einem Gen hergestellt wird, welches für die kleine Untereinheit der Tabak-Ribulose-Bisphosphatcarboxylase (RUBISCO) kodiert.
  35. Verfahren nach Anspruch 1, worin die aus dem CaMV-Genom hergestellte erste DNA-Sequenz einen doppelten CaMV-35S-Promotor enthält.
  36. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite DNA-Sequenz aus einer DNA-Bank erhältlich ist, welche aus einem Pflanzengewebe hergestellt ist, das mit Hilfe biologischer Induktoren dazu induziert wurde, eine systemisch erworbene Resistenz oder eine lokal erworbene Resistenz zu entfalten.
  37. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweite DNA-Sequenz für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, welches aus der Gruppe aus: von Sequenz 1 kodiertem PR-1A, von Sequenz 2 kodiertem PR-1B, von Sequenz 3 kodiertem PR-1C, von Sequenz 4 kodiertem PR-R-Haupt, PR-R-Neben, von Sequenz 6. kodiertem PR-P, von Sequenz 5 kodiertem PR-Q, von Sequenz 8 kodiertem PR-2, PR-N, PR-O, von Sequenz 7A kodiertem PR-O', von Sequenz 9 kodiertem SAR8.2a, von Sequenz 10 kodiertem SAR8.2b, von Sequenz 12 kodierter basischer Gurken-Peroxidase und basischer Tabak-Glukanase ausgewählt ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste und die zweite DNA-Sequenz in einer Weise verknüpft sind, dass die zweite DNA-Sequenz in Bezug auf die erste DNA-Sequenz so ausgerichtet ist, dass die erste DNA-Sequenz als Promotor für die Transkription vom kodierenden Strang der zweiten DNA-Sequenz dient.
  39. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chimere DNA-Sequenz ferner eine dritte DNA-Sequenz umfasst, welche ein pflanzenselektierbarer Genmarker ist.
  40. Transgene Pflanze, einschließlich die Abkömmlinge davon, welche mit einem chimeren DNA-Molekül, umfassend einen Promotor, welcher in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer assoziierten DNA-Sequenz dient und operativ an eine kodierende Sequenz geknüpft ist, welche für ein induzierbares, Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein kodiert, transformiert wurde, wobei das Pathogenese-bezogene Protein keine Chitinase ist, so dass in konstitutiver Weise ein Pathogenese-bezogenes Protein in einer ausreichenden Menge exprimiert wird, um einen krankheitsresistenten Phänotyp bereitzustellen, wobei die Abkömmlinge dieses chimere DNA-Molekül umfassen und die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  41. Transgene Pflanze nach Anspruch 10, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  42. Transgene Pflanze nach Anspruch 10, worin das Pflanzenpathogenese-bezogene Protein aus der Gruppe aus: von Sequenz 1 kodiertem PR-1A, von Sequenz 2 kodiertem PR-1B, von Sequenz 3 kodiertem PR-1C, von Sequenz 4 kodiertem PR-R-Haupt, PR-R-Neben, von Sequenz 6 kodiertem PR-P, von Sequenz 5 kodiertem PR-Q, von Sequenz 8 kodiertem PR-2, PR-N, PR-O, von Sequenz 7A kodiertem PR-O', von Sequenz 9 kodiertem SAR8.2a, von Sequenz 10 kodiertem SAR8.2b, von Sequenz 12 kodierter basischer Gurken-Peroxidase und basischer Tabak-Glukanase ausgewählt ist.
  43. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 11 oder 12, welches eine Pflanze ist, die aus der Gruppe aus Tabak, Karotte, Sonnenblume, Tomate, Baumwolle, Sorghum, Petunie und Glycine ausgewählt ist.
  44. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 11 oder 12, welches eine Pflanze, ausgewählt aus der Gruppe aus Zea Mays, Dactylis und Lolium, ist.
  45. Transgene Pflanze nach Anspruch 14, welches eine Maispflanze ist.
  46. Transgener Pflanzensamen, der von einer Pflanze nach einem der Ansprüche 10 bis 15 gewonnen wurde, wobei der Samen das chimere DNA-Molekül enthält.
  47. Nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellte krankheitsresistente Pflanze, wobei die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  48. Krankheitsresistente Pflanze nach Anspruch 17, wobei die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  49. Nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 9 hergestellte krankheitsresistente Pflanze, worin die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  50. Krankheitsresistente Pflanze nach Anspruch 19, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  51. Pflanzengewebe, welches auf konstitutive Weise induzierte Mengen Pflanzenpathogenese-bezogener Proteine exprimiert oder auf konstitutive Weise eine Menge Pathogenese-bezogener Proteine exprimiert, so dass ein krankheitsresistenter Phänotyp bereitgestellt wird, mit der Vorgabe, dass die Pathogenesebezogenen Proteine von heterologem Ursprung mit Bezug auf die zu transformierende Pflanze sind und keine Chitinase sind, wobei die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  52. Pflanzengewebe nach Anspruch 21, wobei die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  53. Verfahren zum Schutz einer Pflanze vor Schädigung durch eine Pflanzenkrankheit, umfassend Transformieren von Pflanzengewebe oder Zellen mit einer chimeren DNA-Sequenz, welche eine erste DNA-Sequenz enthält, die in einer Pflanze als Promotor für die konstitutive Transkription einer zweiten DNA-Sequenz dient, und eine zweite DNA-Sequenz, welche die kodierende Sequenz eines induzierbaren, Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins oder eine kodierende Sequenz mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu der kodierenden Sequenz eines induzierbaren, Pflanzenpathogenese-bezogenen Proteins umfasst, so dass die transformierte Pflanze einen krankheitsresistenten Phänotyp zeigt, und Anpflanzen der transformierten Pflanze in einer Umgebung, wo die Erkrankung auftreten kann, – wobei das Pathogenese-bezogene Protein keine Chitinase ist und die Erkrankung durch pathogene Pilze verursacht wird.
  54. Verfahren nach Anspruch 23, worin die zweite DNA-Sequenz für ein Pflanzenpathogenese-bezogenes Protein, ausgewählt aus der Gruppe aus: von Sequenz 1 kodiertem PR-1A, von Sequenz 2 kodiertem PR-1B, von Sequenz 3 kodiertem PR-1C, von Sequenz 4 kodiertem PR-R-Haupt, PR-R-Neben, von Sequenz 6 kodiertem PR-P, von Sequenz 5 kodiertem PR-Q, von Sequenz 8 kodiertem PR-2, PR-N, PR-O, von Sequenz 7A kodiertem PR-O', von Sequenz 9 kodiertem SAR8.2a, von Sequenz 10 kodiertem SAR8.2b, von Sequenz 12 kodierter basischer Gurken-Peroxidase und basischer Tabak-Glukanase ausgewählt ist.
  55. Verfahren nach Anspruch 23, worin die pathogenen Pilze aus der Gruppe aus Phytophtora und Peronospora ausgewählt sind.
  56. Verfahren nach Anspruch 23, worin die zu schützende Pflanze eine Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 20 ist.
  57. Verfahren nach Anspruch 26, worin die zu schützende Pflanze eine Pflanze aus der Gruppe aus Tabak, Karotte, Sonnenblume, Tomate, Baumwolle, Sorghum, Petunie und Glycine ist.
  58. Verfahren nach Anspruch 27, worin die zu schützende Pflanze eine aus der Gruppe aus Zea Mays, Dactylis und Lolium ausgewählte Pflanze ist.
  59. Verfahren nach Anspruch 28, worin die zu schützende Pflanze eine Maispflanze ist.
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