DE69433238T2

DE69433238T2 - Pflanzenpromoter, microorganismen und pflanzenzellen mit einer expressionseinheit für ein gewünschtes protein, das besagten promoter enthält

Info

Publication number: DE69433238T2
Application number: DE69433238T
Authority: DE
Inventors: Yves Marco; Dominique Roby; Michel Schneider; Alain Toppan
Original assignee: Biogemma SAS
Current assignee: Biogemma SAS
Priority date: 1993-03-23
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2014-03-24
Also published as: EP0689595A1; FR2703054B1; DE69433238D1; FR2703054A1; WO1994021793A1; ES2210251T3; AU6378994A; US5792932A; EP0689595B1; ATE252152T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Pflanzenpromotor und Mikroorganismen und Pflanzenzellen, die eine Expressionseinheit für ein Protein von Interesse mit diesem Promotor enthalten. Der erfindungsgemäße Promotor ist ein starker konstitutiver Promotor, der die Expression dieses Proteins in den Mikroorganismen und in den Pflanzenzellen unabhängig vom Entwicklungsstadium der Pflanze ermöglicht.
Ein spezielles Anwendungsgebiet für den erfindungsgemäßen Promotor ist der Bereich des Pflanzenschutzes durch Gentechnik und insbesondere das Gebiet der Abwehr der Pflanzen in einer Stresssituation.
In den letzten Jahren haben die Anwendungen für die Transformation von Pflanzen zugenommen. Es wurden zahlreiche, insbesondere für Proteine kodierende Gene prokaryontischer oder eukaryontischer Herkunft (tierisch oder pflanzlich), die bei ihrer Expression zu einer neuen agronomischen Eigenschaft führen, isoliert und dann auf Pflanzen übertragen.
In sehr vielen Fällen sind die Gene, die durch Gentechnik in die Pflanzen eingebracht werden, chimäre Gene, die Regulationselemente unterschiedlicher Herkunft vereinen. Das für ein interessierendes Protein kodierende Gen wird daher meistens unter die Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors gestellt, der die Expression des Proteins in der gesamten Pflanze (oder dem größten Teil der Pflanze) während ihres gesamten Lebens unabhängig vom Entwicklungsstadium ermöglicht. Der Transkriptionspromotor 35S des Blumenkohl mosaikvirus (35S CaMV), der meistens in chimären Genkonstrukten eingesetzt wird, entspricht dieser Beschreibung.
Für einige Anwendungen ist es nicht erforderlich, dass das Gen, das für das Protein von Interesse, dem Träger der agronomischen Eigenschaft, kodiert, kontinuierlich oder überall in der gesamten Pflanze exprimiert wird. Solche Fähigkeiten können sogar in manchen Fällen die günstigen Wirkungen des transferierten Gens beeinträchtigen oder aufheben. Durch die kontinuierliche Expression eines Proteins auf hohem Niveau kann sich nämlich ein Teil des Metabolismus gegen diese Expression richten und letztlich zu einem Verlust der Ausbeute führen.
Es wurde schon sehr früh mit der Suche nach einer spezifischeren Genexpression begonnen; sie führte beispielsweise dazu, dass gewebe- oder organspezifische Promotoren isoliert wurden.
Es kann interessant sein, die Expression eines gegebenen Gens lediglich in einer speziellen Situation zu induzieren oder besser während des ganzen Lebens einer Pflanze ein Grundniveau der Expression sicherzustellen und gleichzeitig in einer gegebenen Situation eine Überexpression des Gens zu ermöglichen.
Es wurden bereits mehrere induzierbare Promotoren beschrieben, wobei einige gleichzeitig auf die Infektion mit pathogenen Mikroorganismen und auf chemische Verbindungen oder Pflanzenhormone, wie Ethylen (Roby et al., 1990, Plant Cell 2, 999) oder Auxin, reagieren.
Ein aus Tabak isolierter Pflanzenpromotor wurde von Takahashi et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8013–8016 beschrieben.
Diese Autoren führen in einer anderen Publikation aus, dass dieser Promotor spezifisch nur auf Auxine und nicht auf andere Hormone oder auf Stress reagiert (Takahashi et al., The Plant Journal, 1991, 1(3), 327–332).
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Promotor, unter dem in den verschiedenen Organen und Geweben einer Pflanze, insbesondere in den Wurzeln und dem Meristem einer Pflanze, auf einem beständigen Niveau exprimiert wird und der in Stresssituationen in sehr hohem Maße induzierbar ist, wie insbesondere nach Temperaturschock, Verletzungen, Hormonschock, biotischen oder abiotischen Elicitoren oder Bakterien-, Pilz- oder Virusinfektionen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Pflanzenzellen mit Ausnahme von natürlich vorkommenden Pflanzenzellen, Mikroorganismen (Bakterien) und Zellen von Mikroorganismen, in die eine Expressionseinheit eines Proteins von Interesse integriert wurde, wobei diese Einheit den erfindungsgemäßen Promotor enthält.
Sie bezieht sich ferner auf Pflanzen oder Teile von Pflanzen sowie Samen, die erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthalten.
Sie bezieht sich schließlich auch auf die Verwendung einer oben beschriebenen Pflanze oder eines Teils einer oben beschriebenen Pflanze für die Selektion von Molekülen mit phytosanitärer Aktivität, die befähigt sind, natürliche Abwehrreaktionen der Pflanzen gegen phytopathogene oder phytophage Organismen (Pilze, Bakterien, Viren, Insekten und Nematoden) auszulösen.
Der erfindungsgemäße Promotor enthält die DNA-Sequenz (B) (SEQ ID NO: 4] oder eine Sequenz, die mit der Sequenz (B) einen Homologiegrad von mindestens 80% aufweist.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung enthält der erfindungsgemäße Promotor stromaufwärts von der Sequenz (B) eine Sequenz (C) [SEQ ID NO: 5] oder eine Sequenz, die einen hohen Homologiegrad mit der Sequenz (C) aufweist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der erfindungsgemäße Promotor stromaufwärts von der Sequenz (B) eine Sequenz (D) [SEQ ID NO: 6] oder eine Sequenz, die einen hohen Homologiegrad mit der Sequenz (D) aufweist.
Ein hoher Homologiegrad bedeutet hier eine Homologie (Verhältnis der identischen Nukleotide und der Gesamtzahl der Nukleotide) von mindestens 70% und vorzugsweise mindestens 80% der Nukleotidsequenzen, wenn sie gemäß der Methode des optimalen Sequenz-Alignment nach Needleman und Wunsch, 1970; J. Mol. Biol. 48, 443– 453 nach der maximalen Homologie aligned sind. Dieses Verfahren wird insbesondere in der Software UWGCG der Universität von Wisconsin eingesetzt: Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387–395 – Option GAP.
Die für das Funktionieren des Promotors und die Expression seiner Charakteristika erforderlichen Elemente (transaktivierende Faktoren und dergleichen) liegen in anderen Pflanzen (Dikotyledonen oder Monokotyledonen) vor. Ihre Gegenwart ermöglicht die Verwendung dieses Promotors in zahlreichen kultivierten pflanzlichen Organsimen, beispielsweise insbesondere Pflanzen (Tabak, Kartoffel, Tomate, Mais, Sonnenblume, Gerste und Raps) oder anderen pflanzlichen Organismen, wie Hefen und Pilzen.
Alle DNA-Sequenzen, die für interessierende Proteine kodieren, können unter die Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors gestellt werden, insbesondere Sequenzen, die für Proteine kodieren, die den Schutz eines pflanzlichen Organismus wie einer Pflanze gegen Virusinfektionen, Bakterieninfektionen oder Pilzinfektionen oder gegen andere Stresssituationen gewährleisten können. Als Beispiele für derartige Proteine können insbesondere die Tomaten-Tabak-Endochitinasen angegeben werden, beispielsweise die in EP-A-493 581 beschriebene Endochitinase, deren kodierende Sequenz [SEQ ID NO 16] ist.
Der erfindungsgemäße Promotor wurde durch Screening einer Genombank von Tabak mit Hilfe einer DNA-Sonde erhalten, die die Sequenz [SEQ ID NO: 1] besitzt.
Ein Klon mit der Sequenz [SEQ ID NO: 1] wurde durch differentielles Screening von cDNA-Klonen aus Poly (A)⁺mRNA erhalten, die im Laufe der Infektion von Tabakblättern Nicotiana tabacum mit dem Stamm Pseudomonas solanacearum GMI 1000 spezifisch synthetisiert wurden. Dieser Bakterienstamm ist dafür bekannt, dass er an Tabak der Sorte Bottom special eine Hypersensibilisierungsreaktion hervorruft. Hierzu kann auf Message et al., 1978, Proc. 4th. Intl. Conf. of plant Pathogenic Bacteria, S. 823–833 verwiesen werden. Der Klon mit der Sequenz [SEQ ID NO: 1] wird im Folgenden als 'Klon 246' bezeichnet.
Mit dem Klon 246 konnte dann durch Screening einer Genombank von Tabak ein im Folgenden als Klon 246 C bezeichneter Klon [SEQ NO: 7] isoliert werden, der die DNA-Sequenz (D) [SEQ ID NO: 6], die DNA-Sequenz (C) [SEQ ID NO: 5], die DNA-Sequenz (B) [SEQ ID NO 4] und eine Sequenz enthält, die zwei durch ein Intron getrennte, offene Leserahmen umfasst.
Durch Kombination des Promotors (Sequenzen B + C + D) mit dem β-Glucuronidasegen wurde gemäß der in dem nachstehenden Abschnitt 9 beschriebenen Vorgehensweise der Expressionsvektor pSG 123 erhalten. Der Promotor mit den Sequenzen B + C + D wird als Promotor 246C bezeichnet.
Der Expressionsvektor pSG 123 wurde dazu verwendet, die transiente Expression des Glucuronidasegens in Protoplasten von Tabak zu testen, wobei die Protoplasten entweder durch Infektion mit Pseudomonas solanacearum oder durch Behandlung mit einem Elicitor oder einem Hormon einer Stresssituation ausgesetzt wurden.
Ausgehend von dem Expressionsvektor pSG 123 wurde nach der in Abschnitt 13 beschriebenen Vorgehensweise ein in Pflanzenzellen stabiler Expressionsvektor hergestellt, der binäre Vektor pSG 246.
Der binäre Vektor pSG 246 wurde in Zellen von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes transferiert, die dann dazu verwendet wurden, transgene Tabakpflanzen, transgene Rapspflanzen und transgene Sonnenblumen herzustellen. Für die Transformation der Gewebe der Monokotyledonen (Gerste und Mais) wurde der Expressionsvektor pSG 123 verwendet. Das Verhalten dieser Pflanzen oder Gewebe in Stresssituationen wurde untersucht.
Der erfindungsgemäße Promotor, der die Sequenz (B), (C) und (D) enthält, wurde auch mit einem Gen kombiniert, das für die Tomaten-Tabak-Chitinase kodiert. Die resultierenden chimären Gene wurden zur Transformation von Agrobacterium-Zellen verwendet.
Die DNA-Sequenz [SEQ ID NO: 1] kann in einfacher Weise nach Verfahren synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind (L. J. Mac PRIDE und H. M. CARUTHURS, Tetrahydron letters (1983), Bd. 24: 245).
Durch die Untersuchung der nach Transformation von Pflanzen mit Hilfe der oben erhaltenen Agrobacterium-Zellen erhaltenen transgenen Pflanzen konnte die Basisaktivität des erfindungsgemäßen Promotors und die Überexpression der interessierenden Proteine (β-Glucuronidase und Chitinase) in Stresssituationen gezeigt werden.
Die Ergebnisse, die im nachstehenden beschreibenden Teil dargestellt sind, zeigen eindeutig, dass der erfindungsgemäße Promotor eine Basisaktivität besitzt, die stark erhöht wird, wenn die transgenen Pflanzen, die diesen Promotor und ein Gen enthalten, das für ein interessierendes Protein kodiert, Stresssituationen ausgesetzt werden: Temperaturschock, Verletzungen, Infektion mit Pathogenen (Pilze, Bakterien), Elicitoren (biotisch und abiotisch).
Verschiedene Deletionen des Plasmids pSG 123, die mit Hilfe von Restriktionsenzymen und/oder der 3-Exonuclease in der 5'-Region des Promotors erfolgten, führten zu den Vektoren pSG 251 und pSG 33, deren Sequenzen sind: die Sequenz (B) (pSG 33) [SEQ ID NO: 4] bzw. die Sequenz (B), die stromaufwärts die Sequenz (C) aufweist (pSG 251) [SEQ ID NO: 5].
Da die Expression der Glucuronidase oder ihre Überexpression im Falle einer Induktion des erfindungsgemäßen Promotors optisch leicht nachgewiesen werden kann (Jefferson et al., 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387), können die Pflanzen, die dieses chimäre Gen exprimieren, zur Selektion von induzierenden Molekülen verwendet werden.
Die Pflanzen besitzen Abwehrmechanismen gegenüber Angriffen und insbesondere parasitären Angriffen (Pilze, Bakterien, Viren oder Insekten); diese von Induktionsphänomenen abhängigen Mechanismen sind wenig bekannt und sie setzen häufig zu spät ein, um wirksam zu sein. Durch ein frühes Auslösen dieser Mechanismen (Roby et al., 1988, Physiol. Molec. Plant. Pathol., 33, 409) insbesondere durch Verbindungen vom Typ der Elicitoren in Kaskadenreaktionen kann die Pflanze den Angriffen widerstehen.
Es wurden bereits Fungizide der zweiten Generation auf den Markt gebracht, die auf die Abwehr der Pflanze einwirken, jedoch an den Parasiten inaktiv sind.
Pflanzen, die die Glucuronidase unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors frühzeitig und spezifisch induziert während einer Hypersensibilitätsreaktion auf eine Bakterieninfektion exprimieren, sind geeignete Werkzeuge, um Moleküle auszuwählen, die befähigt sind, die Expression oder Überexpression des Abwehrgens zu induzieren.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beschreibung, die in Abschnitte unterteilt ist, die experimentelle Ergebnisse und eine Dis kussion der Ergebnisse umfassen, besser verständlich. Einige Abschnitte betreffen Experimente, die durchgeführt wurden, um die Erfindung zu realisieren, andere Beispiele für erfindungsgemäße Ausführungsformen, die natürlich nur zur Erläuterung dienen.
Ein Großteil der gesamten nachstehend beschriebenen Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wird detailliert in dem Buch von Sambrook et al.: "Molecular Cloning: a Laboratory manual", dargelegt, das 1989 von Cold Spring Harbor Press in New York (2. Ausgabe) herausgegeben wurde.

Das biologische Material (Stämme, Phagen, Plasmide oder Pflanzen), das in den nachfolgenden Abschnitten verwendet wird, ist im Handel erhältlich und/oder in den folgenden Druckschriften beschrieben worden:

– binärer Vektor pBIN 19:	BEVAN et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711–8721; von Clontech erhalten (Palo Alto Kalifornien, USA)
– Vektor 101.3:	JEFFERSON, 1987, Plant. Molec. Biol. Reporter 5, 387– 405, von Clontech bezogen
– Vektor pBI 221:	JEFFERSON, 1987, Plant. Molec. Biol. Reporter 5, 387– 405, von Clontech bezogen
– Vektor pBI 121:	JEFFERSON, 1987, Plant. Molec. Biol. Reporter 5, 387– 405, von Clontech bezogen
– Stamm Pseudomonas solanacearum	MESSAGE et al., 1978, Proc. 4th Intl. Conf. of Plant Patho
GMI 1000	genic Bacteria, S. 823–833
– Stamm Pseudomonas solanacearum:	genic Bacteria, S. 823–833

GMI 1178	genic Bacteria, S. 823–833
– Stamm Pseudomonas solanacearum:	genic Bacteria, S. 823–833
K 60	genic Bacteria, S. 823–833
– NOS-Terminator:	Nopalin-Synthase-Terminator
– Vektor pTZ 19R:	von Pharmacia
– Stamm E. coli MC 1061:	MANIATIS et al., 1982, Molecular cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, von Clontech erhalten
– Stamm E. coli HB 101:	MANIATIS et al., 1982, Molecular cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, von Clontech erhalten
– Stamm Agrobacterium tumefaciens:	LBA4404, von Clontech bezogen, HOEKEMA et al., 1983, NATURE, 303, 179–180;
– Stamm Agrobacterium rhizogenes:	pRIA4
– Pflanze Nicotiana tabacum:	Varietät Wisconsin Havana 38: SCHNEIDER M., 1990, Plant Molec. Biol., 14, 935– 947;
– Pilz Chalara elegans:	R. E. RAWLINGS, 1940, Ann. Mo. Bot. Gdn., 27, 561–598;
– Pilz Alternaria brassicae:	BAINS und TEWARI, 1987, Physiol. Mol. Plant. Pathol. 30: 259;
– Pflanze Nicotiana tabacum:	Varietät Paraguay 49, vom Institut du tabac, Bergerac, France bezogen,
– Pflanze Brassica napus:	Frühjahrsformen Brutor und Westar und Winterform (Selektionsform Rustica Samen)

– Pathogen Rhizoctonia Solani:	ACHRRYA et al., 1984, Can. J. Plant. Pathol. 6, 325–328
– Sonnenblumenpflanzen:	Genotyp 2603B (Selektionsform, Rustica Samen)
– Mais:	Linie LH 132
– Gerste:	Varietät GERBEL, vom Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Paris, France, bezogen

– Die Stämme GMI 1000 und K 60 können von der Collection Nationale des Bacteries Phytopathogenes (CNBP) INRA, Pathologie Vegetale, Rue Georges MOREL, 49070 BEAUCOUZE, FRANCE, bezogen werden;
– der Stamm GMI 1178 kann von INRA, Pathologie Vegetale, Chemin de Borde-Rouge AUZEVILLE BP 27, 31326 CASTANET TOLOSAN Cedex, FRANCE, bezogen werden.

In den nachstehenden Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

32P-dCTP:	Desoxycytidin-5'-³²P-triphosphat, von AMERSHAM unter der Referenz 10205 erhältlich;
2 SSC:	NaCl 0,3 mM, Trinatriumcitrat 30 mM; pH 7,0 (von MANIATIS et al. beschrieben, siehe oben);
SDS:	Natriumdodecylsulfat
FPLC:	Fast Protein Liquid Chromatography;
PVDF:	Polyvinylidendifluorid;
EDTA:	Ethylendiamintetraessigsäure;
DEPC:	Diethylpyrocarbonat,
NAD:	Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid.

Die folgende Beschreibung ist in Bezug auf die 1 bis 3 leichter verständlich.
Die 1 zeigt die Klonkarte der genomischen DNA 246C, die mit Hilfe der dargestellten Restriktionsenzyme erstellt wurde.
Die 2 zeigt das Alignment nach der Methode des optimalen Alignment von Needleman und Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443– 453 unter Verwendung der Software UWGCG der Universität Wisconsin (Devereux et al., 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 387–395), Option GAP, des 3'-Bereichs von 700 pb des Promotors von Gen 246C und des Promotors, der von Takahashi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8013) beschrieben wurde.
In 3 sind die verschiedenen getesteten Expressionsvektoren dargestellt, die im Vergleich mit dem Plasmid pSG 123 mit der gesamten Länge eine variable Deletion im 5'-Bereich des Promotors aufweisen.
Abschnitt 1: Infektion des Tabaks Nicotiana tabacum mit zwei Stämmen des pathogenen Bakteriums Pseudomonas solanacearum
Bakterien des Stamms Pseudomonas solanacearum werden 72 h auf BG-Agar (Boucher et al., 1985, J. Gen Microbiol 131, 2449) kultiviert; eine Kolonie wird entnommen, um 40 ml des gleichen Mediums anzuimpfen. Nach 16 bis 24 h Inkubation bei 28°C wird die Bakteriensuspension 10 min bei 6000 g und einer Temperatur von 4°C zentrifugiert; der Überstand wird entfernt, wobei die Polysaccharidschicht an der Oberfläche des Bodensatzes nicht verworfen wird. Nach Waschen mit sterilem Wasser werden die Bakterien in 20 ml Wasser suspendiert. Ihre Konzentration wird dann durch Densitometrie ermittelt.
Junge Tabakpflanzenblätter werden von der Pflanze abgenommen, mit destilliertem Wasser gewaschen und in einem Exsikkator, der 1,2 1 Bakteriensuspension in einer Konzentration von 3 × 106 Bakterien/ml enthält, untergetaucht. Während 10 min wird mit einer Wasserstrahlpumpe Vakuum erzeugt, dann wird langsam belüftet. Jedes befallene Blatt wird in ein Becherglas gegeben, das Natriumphosphatpuffer 10 mM pH 6,0 enthält, und in eine Kulturkammer eingebracht. Die Blätter werden nach verschiedenen Inkubationszeiten entnommen und bei –70°C aufbewahrt.
Es wurden zwei Bakterienstämme verwendet: Der Stamm GMI 1000, der an Tabak der Varietät Bottom Special eine Hypersensibilitätsreaktion hervorruft, und der Stamm GMI 1178 (Message et al., 1978, Proc. 4th Intl. Conf. of Plant Pathogenic Bacteria, S. 823–833), ein aus dem zuvor genannten Stamm hervorgegangener Mutant, der die Fähigkeit verloren hat, an Tabak die Hypersensibilitätsreaktion hervorzurufen.
Abschnitt 2: Extraktion und Isolierung der Gesamt-RNA von Nicotiana tabacum (infiziert mit den Stämmen von Pseudomonas solanacearum)
10 g Pflanzenmaterial wird in Gegenwart von flüssigem Stickstoff zerkleinert und dann in einem Gemisch von 3 ml Phenol, 3 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1, V : V) und 6 ml Lysepuffer der Zusammensetzung Tris-HCl 200 mM pH 7,0, EDTA 200 mM und SDS 1% aufgenommen.
Nach Rühren mit einem Vortex-Rührer können die Phasen durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 6000 g und 4°C aufgetrennt werden. Die wässrige Phase wird entnommen und mit 6 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (25 : 24 : 1, V : V) und anschließend mit 6 ml Phenol extrahiert. Zu der wässrigen Phase werden 16 ml Ethanol absolut und 400 μl Natriumacetat 3 M pH 5,5 gegeben. Das Gemisch wird 2 h bei –20°C gefällt. Das erhaltene Sediment wird in 5 ml sterilem Wasser, das 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) enthält, gelöst, worauf die RNA nach Zugabe von 5 ml LiCl 4 M 12 h bei 4°C gefällt wird. Nach 20-minütigem Zentrifugieren bei 6000 g wird der RNA-Bodensatz mit Ethanol von 75% gewaschen, getrocknet und in 800 μl sterilem destilliertem Wasser, die 0,1% DEPC enthalten, aufgenommen. Die Lösung wird nach Zugabe von 0,1 Vol Natriumacetat 3 M pH 5,5 und 2,5 Vol Ethanol absolut 2 h bei –20°C gefällt. Nach Zentrifugieren während einer Zeitspanne von 15 min bei 12.000 g wird das RNA-Sediment mit Ethanol von 75% gewaschen und in 200 μl destilliertem Wasser, die 0,1% DEPC enthalten, gelöst.
Die Gesamt-RNA wird dann photospektrometrisch bei 260 nm quantitativ bestimmt.
Abschnitt 3: Herstellung von poly(A)⁺mRNA
1 g Oligo(dT)-Cellulosegel (Collaborative Research Inc.) wird in 2 ml Tris-HCl-Puffer 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 0,4 M, SDS 0,1% suspendiert. Das Gel wird in eine Pasteurpipette eingebracht, deren Ende mit Glaswolle verschlossen ist. Die RNA-Lösung wird 4 min auf 65°C erwärmt und anschließend langsam auf Raumtemperatur zurückkommen gelassen. Die Endkonzentration von 0,4 M NaCl wird durch Zugabe einer NaCl-Lösung 5 M eingestellt.
Dann wird die Lösung der Gesamt-RNA auf das Oligo-d(T)-Cellulosegel aufgegeben. Dieses wird anschließend mit etwa 12 ml Puffer der Zusammensetzung Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, SDS 0,5% gespült.
Die poly(A)⁺mRNA wird mit 7 ml Puffer der Zusammensetzung Tris-HCl 10 mM pH 7,4, SDS 0,1% eluiert und dann über Nacht bei –20°C nach Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol von 95% und 0,1 Volumen Natriumacetat 3,3 M pH 5,5 gefällt. Der Bodensatz aus poly(A)⁺RNA, der durch Zentrifugieren bei 35000 g während einer Zeitspanne von 1 h erhalten wird, wird 3 mal mit Ethanol von 75% gewaschen, getrocknet, in 0, 5 ml sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und nochmals unter den oben beschriebenen Bedingungen gefällt. Nach Zentrifugieren wird der Bodensatz mit Ethanol von 75% gewaschen, getrocknet und in sterilem destilliertem Wasser gelöst. Die poly(A)⁺ RNA wird anschließend photospektrometrisch bei 260 nm quantitativ bestimmt.
Abschnitt 4: Synthese von doppelsträngiger DNA aus poly(A)⁺-Messenger-RNA, die aus Blättern von mit dem Stamm GMI 1000 von Pseudomonas solanacearum infiziertem Tabak isoliert wurde, und Klonierung in E. coli
Diese Synthese erfolgt nach der Gubler-Hoffman-Methode (1983, Gene 25, 263) mit Hilfe des Kits D. Scribe der Firma Genofit (Genf, Schweiz) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Erststrang-Synthese:
2,5 μg poly(A)⁺RNAs, die aus Tabakblättern isoliert wurden, die mit dem Stamm GMI 1000 von Pseudomonas solanacearum infiziert und 6 h nach der Inokulation entnommen wurden, werden bei 44°C 30 bis 60 min in Gegenwart von Tris HCl 40 mM, pH 8,3, NaCl 80 mM, MgCl₂ 6 mM, DTT 5 mM, dATP 0, 5 mM, dTTP 0, 5 mM, dGTP 0, 5 mM, dCTP 0,5 mM, 1,5 μg Oligo (d) (pT) 12–18 und 10 bis 15 Einheiten reverser Transkriptase aus AMV (Avian-Myeloblastosis-Virus) in einem Gesamtvolumen von 25 μl inkubiert.
Zweitstrang-Synthese:
Das Reaktionsmedium aus der Erststrang-Synthese wird mit 100 μl Puffer der Zusammensetzung Tris HCl 40 mM pH 7,5, MgCl₂ 10 mM, NaCl 80 mM verdünnt; es werden zwei Einheiten RNase H zugegeben und das Gemisch wird bei 37°C 5 min inkubiert.
Nach Abkühlen auf 12°C werden 25 Einheiten DNA-Polymerase I, 0,5 Weiss-Einheiten Ligase (E. coli) und NAD in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben.
Nachdem 60 min bei 12°C und dann 60 min bei 18°C inkubiert wurde, wird die Reaktion durch Zugabe von EDTA und SDS in Endkonzentrationen von 20 mM bzw. 1% gestoppt, worauf 2 min auf 60°C erwärmt wird.
Reinigung der cDNA:
Die Reinigung erfolgt durch Chromatographie an einer Sephadex-Säule G100 in dem Puffer Tris HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM. Durch Zugabe von α-³²P-dCTP bei der Synthese können die durch die Chromatographie erhaltenen Fraktionen, die die dop pelsträngige DNA enthalten, leichter ausfindig gemacht werden. Die DNA wird durch Zugabe von Ammoniumacetat (Endkonzentration 0,3 M) und 2,5 Vol Ethanol absolut gefällt.
Verdau mit Nuclease S1:
Der erhaltene Niederschlag wird mit Ethanol von 75% gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser aufgenommen. Die cDNA wird dann mit Nuclease S1 in einem Gesamtvolumen von 300 μl 10 min bei 30°C in Gegenwart von 20 U Enzym in einem Puffer mit der Zusammensetzung Natriumacetat 30 mM pH 4,4, NaCl 0,25 M, ZnCl₂ 1 mM behandelt.
Nach Abschluss der Reaktion wird das Gemisch einmal mit einem Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (50-48-2, V : V), und dann dreimal mit Ethylether extrahiert, bevor es mit Ethanol gefällt wird.
Der nach Zentrifugieren erhaltene DNA-Niederschlag wird anschließend getrocknet und in 20 μl sterilem Wasser aufgenommen.
Addition eines Poly-dC-Endes am 3'-Ende (dC-Tailing)
Zu der cDNA-Lösung werden allmählich 10 μl Terminale-Transferase-Puffer mit Kaliumcacodylat 70 mM pH 7,2, CoCl₂ 0,5 mM, Dithiothreitol 0,5 mM, 2 μl α dCTP 0,25 mM, 5 μl α 32P dCTP (370 MBq/ml), 12 μl H₂O und 1,2 μl Terminale-Transferase (18 Einheiten) gegeben.
Die Tailing-Reaktion erfolgt durch Inkubieren bei 37°C während 30 min und wird dann durch Zugabe von 30 μl EDTA, 0,25 M pH 8,0 gestoppt.
Reinigung der doppelsträngigen cDNA nach Tailing:
Das nach dem dC-Tailing erhaltene Gemisch wird mit Ethanol gefällt und dann zentrifugiert. Der cDNA-Bodensatz wird in 10 μl Puffer der Zusammensetzung Tris HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 5% Glycerin, 0,02% Bromphenolblau aufgenommen. Die Lösung wird auf eine Biogel A-Säule 0,5 M (1 ml Träger) gegeben. Die Elution der Säule erfolgt mit dem Puffer der Zusammensetzung Tris HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; die Fraktionen werden gewonnen, ihre Radioaktivität wird bestimmt und die Größe der cDNA, die sie enthalten, wird mittels Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Die Fraktionen, die cDNA mit einer Größe über 500 Basenpaaren enthalten, werden vereinigt, die cDNA wird mit Ethanol gefällt.
Hybridisierung mit pBR 322-dG
Die nach dem Fällen erhaltene cDNA wird in 50 μl Zirkularisierungspuffer der Zusammensetzung Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM gelöst. 4 μl Lösung von pBR 322-dG (21 ng, Clontech) und 46 μl Wasser werden zugegeben.
Nach Inkubieren bei 65°C während 15 min und anschließend 57°C während 2 h wird die Hybridisierung durch Agarosegel-Elektrophorese kontrolliert.
Die erhaltene doppelsträngige cDNA wird an der Stelle PstI des Plasmids pBR 322 inseriert. Nach Ligation wird die erhaltene DNA dazu verwendet, kompetente Zellen des Stamms E. coli HB 101 zu transformieren. Nach Verteilen und Kultur der transformierten kompetenten Zellen in Petrischalen werden rekombinante Bakterienkolonien erhalten.
Abschnitt 5: Selektion von cDNA-Klonen, die von poly(A)⁺-mRNAs stammen, die im Laufe der Bakterieninfektion mit dem Stamm Pseudomonas solanacearum GMI 1000 spezifisch synthetisiert wurden, durch differentielles Screening
Die DNA der rekombinanten Bakterienkolonien, die durch Klonieren der cDNA, die ausgehend von den poly(A)⁺-Messenger-RNA-Molekülen aus Tabakblättern, die mit dem Stamm GMI 1000 infiziert wurden, synthetisiert wurde, werden gemäß den Angaben des Herstellers auf eine Nylonmembran Biodyne (Pall Corporation, EUA) transferiert. Die DNA-Moleküle werden dann mit Hilfe von 2 radioaktiven Sonden hybridisiert, die durch cDNA-Synthese in Gegenwart von alpha-³²P dCTP aus gereinigten mRNAs hergestellt wurden, welche aus mit den Stämmen GMI 1000 bzw. GMI 1178 infizierten Pflanzen erhalten wurden.
Nach Waschen und Autoradiographie der Membranen werden die Bakterienkolonien ausgewählt, die mit der Sonde, die aus den mit dem Stamm GMI 1000 angeimpften Blättern isoliert wurde, das stärkste Hybridisierungssignal ergeben. Die plasmidische DNA dieser Kolonien wird hergestellt, die cDNA-Inserts dieser Plasmide werden abgetrennt, mit α-32dCTP markiert und dann als Sonde verwendet, um gemäß der Dot-Blot-Technik und anschließender Northern-Blot-Analyse die äquivalenten Mengen der entsprechenden mRNA sichtbar zu machen, die aus der Gesamt-DNA von mit den Stämmen GMI 1000 oder GMI 1178 angeimpften Tabakblättern durch Reinigung erhalten wurde.
Die Kolonien, deren als Sonde verwendetes Insert bei dem Sichten der Gesamt-DNA, die aus mit dem Stamm GMI 1000 angeimpften Tabak blättern durch Reinigung erhalten wurde, zu einem starken Signal führen, werden aufbewahrt.
Abschnitt 6: Charakterisierung eines cDNA-Klons aus einer mRNA, die spezifisch im Laufe der Bakterieninfektion mit dem Stamm Pseudomonas solanacearum GMI 1000 synthetisiert wurde.
14 Bakterienklone wurden aus der cDNA-Bank isoliert, die ausgehend von Messenger-RNA aus Tabakblättern konstruiert wurde, die mit dem Stamm Pseudomonas solanacearum GMI 1000 infiziert wurden.
Von diesen konnte ein als 246 bezeichneter Klon, der eine Insertlänge von 750 Basenpaaren aufweist, im Northern-Blot ein Transkript von etwa 800 Nucleotiden erkennen lassen. Die Akkumulierung dieses Transkript beginnt 4 bis 9 h nach der Inokulation und erreicht nach 12 bis 15 h ein Maximum. In den mit dem Stamm GMI 1178 infizierten Tabakblättern wird eine leichte Akkumulierung des Transkripts nach 12 bis 15 h beobachtet.
Die Untersuchung der cDNA-Sequenz des Klons 246 [SEQ ID NO: 1] zeigt die Existenz eines ersten unvollständigen offenen Leserahmens, der für ein Peptid mit 59 Aminosäuren kodiert, und eines zweiten potentiellen Rahmens, der für ein Peptid mit 88 Aminosäuren kodiert. Die Sequenz dieser beiden Peptide ist in [SEQ ID NO: 2] dargestellt. Zwischen diesen beiden Leserahmen liegen Konsensus-Sequenzen zum Spleißen eines Introns vor (Brown, 1986, Nucl. Ac. Res., 14, 9549). Es wurde also wahrscheinlich eine cDNA aus einer unreifen mRNA kloniert. Die cDNA-Sequenz des Klons 246 ohne Intron ist die Sequenz A₁ [SEQ ID NO: 3].
Abschnitt 7: Sichten einer Tabak-Genombank mit Hilfe der charakterisierten cDNA
Durch partiellen Verdau von DNA, die aus Keimen von Nicotiana tabacum Varietät NK 326 erhalten wurde, mit Hilfe des Enzyms MboI und Klonieren von Restriktionsfragmenten in der Phage EMBL-3 (Clontech) wurde eine genomische DNA-Bank von Tabak erzeugt. 500000 rekombinante Phagen wurden nach Verteilen in einer Menge von 10000 Phagen pro Petrischale nach der Technik, die dem Fachmann bekannt ist und von Sambrook et al. beschrieben wurde (Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), gesichtet.
Die Phagen-DNA wird auf eine Nitrocellulose-Membran (BA 85 Schleicher und Schüll) überführt, 2 min in einer Lösung NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M denaturiert und dann 5 min in eine Neutralisationslösung NaCl 1,5 M, Tris HCl 0,5 M pH 7,4 getaucht. Nach schnellem Spülen in 2 SSC (NaCl 0,3 M, Natriumcitrat 30 mM) werden die Filter 30 min bei 37°C getrocknet; anschließend wird die DNA durch Behandlung bei 80°C während 1,5 h unter Vakuum fixiert.
Anschließend werden die Membranen 4 h bei 37°C in einem Puffer mit der Zusammensetzung 5 SSC (NaCl 0,75 M, Natriumcitrat 75 mM), 50% Formamid, 0,3% entrahmte Milch prähybridisiert.
Die Hybridisierung erfolgt in dem gleichen Puffer während 18 h bei 37°C nach Zugabe der mit alpha 32P-dCTP markierten Sonde, die aus dem Insert von 750 Basenpaaren des cDNA-Klons 246 besteht.
Die Membranen werden anschließend 3 mal 20 min bei 37°C in einer Lösung von 5 SSC, SDS 0,1% und dann 2 mal während 30 min bei 37°C in einer Lösung von 2 SSC, SDS 0,1% und schließlich 30 min bei 42°C in einer Lösung von 2 SSC, SDS 0,1% gewaschen; dann werden sie autoradiographiert.
Nach Entwickeln der Autoradiogramme wird jeder Plaque, der ein positives Signal darstellt, abgetrennt, die Phagen werden in SM-Medium (NaCl 100 mM, Tris HCl 50 mM, pH 7,5, MgSO₄ 5 mM, Gelatine 0,01%) eluiert und dann für ein erneutes Sichten gereinigt, das unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wird.
Auf diese Weise werden 12 Klone abgetrennt und gereinigt. Die DNA jedes Klons wurde nach dem Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, produziert und gereinigt und anschließend mit dem Enzym SalI verdaut, mit dem nach Elektrophorese an Agarosegel das Insert der genomischen DNA isoliert werden kann.
Der Transfer auf eine Nylonmembran und die anschließende Hybridisierung mit der Sonde, die aus der cDNA des Klons 246 besteht, ergibt ein positives Signal, das die Gegenwart einer zur cDNA 246 komplementären Sequenz in dieser genomischen DNA bestätigt.
Die Klone werden anschließend unter Verwendung einer Reihe von Restriktionsenzymen kartographiert. Von diesen wurde ein Klon behalten, der in der zentralen Region des in die Phagen-DNA inserierten Fragments ein Hybridisierungssignal aufweist. Dieser Klon wird als 246C bezeichnet.
Abschnitt 8: Sequenzierung und Sequenzanalyse des Klons mit genomischer DNA 246C
Ein Fragment des in dem Phagen enthaltenen Insert wird durch Verdau mit Hilfe des Enzyms SstI isoliert und dann in dem Phagen pBluescript^® 11 KS +/– (Stratagene) unter Erhalt des Phagemid pKS246 kloniert. Es wird eine Kartierung durchgeführt, wobei die Karte in der 1 dargestellt ist. Die Sequenz dieses Inserts [SEQ ID NO 7] wird dann nach der Methode von Sanger et al. (PNAS-USA, 14, 5463, 1977) nach fortschreitender Deletionsbildung mit Hilfe der Enzyme Exo III, Mung Bean und Nuclease S 1 nach der Technik von Henikoff (Gene, 28, 351, 1984) ermittelt.
Dieses Insert von 3046 Basenpaaren, das als Gen 246C bezeichnet wird, besteht aus einer kodierenden Region von 853 bp, die mit ATG in Position 2146 beginnt und mit einem Codon TGA in Position 2998 endet; diese Region wird von einem Intron unterbrochen, das in Position 2464 anfängt und in Position 2653 aufhört. Durch Primer Extension gemäß der von Sambrook et al. (siehe Literaturstelle oben, 1989) beschriebenen Technik wurden drei potentielle Stellen für die Initiation der Transkription ermittelt, wobei die wahrscheinlichste Stelle die Position 2068 ist.
Die Promotorregion des Gens 246C stromaufwärts der Position 2146 wird als Promotor 246C bezeichnet. Die Untersuchung der Sequenz des Promotors 246C zeigt die Gegenwart mehrerer Einheiten, die für ihre Beteiligung an der Genregulation bekannt sind.
Zwei Konsensus-Sequenzen CAAT, die dem Regulationselement der Transkription von eukaryontischen Genen entsprechen, sowie eine komplementäre und inverse Sequenz ATTG liegen in den Positionen 2051, 2101 und 1967 vor.
Zwei Konsensus-Sequenzen TATAA befinden sich in den Positionen 2089 und 2111 und eine komplementäre Sequenz AATAT in der Position 2020. Alle drei Einheiten befinden sich 10 bis 50 Basenpaare stromabwärts der Einheiten CAAT und 30 bis 50 Basenpaare stromaufwärts der potentiellen Transkriptionsstellen.
In der Position 1950 wurde eine TGACG-Sequenz identifiziert; diese Sequenz, die in dem Promotor 35S von CaMV gezeigt werden konnte, scheint für die Expression von chimären Genen in den Wurzeln und Blättern verantwortlich zu sein (LAM et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86, 7890).
Drei Regionen zeigen eine hohe Homogenität mit den Einheiten HSE (Hitzeschockelemente, Heat Shock Elements) von Pflanzen (GURLEY und KEY, 1991, Biochemistry, 30, 1). Diese Regionen sind zu der Konsensus-Sequenz GAANNGAANNTTCNNTTC oder TTCNNTTCNNGAANNGAA homolog; sie liegen in der Nähe der TATA-Box und der CAAT-Box und sind dupliziert [SEQ ID NO: 17 und NO 18).
Eine zur Einheit CCGTCC homologe Sequenz, die als bei der Antwort auf Elicitoren aus Pilzen beteiligt charakterisiert wurde (LOIS et al., 1989, EMBO J., 8, 1641) ist in der Position 1822 lokalisiert.
Der Promotor der Gens 246C weist auf etwa 30% seiner Länge eine hohe Homologie (> 90%) an 700 Basenpaaren mit dem aus Tabak isolierten pflanzlichen Promotor mit der Sequenz [SEQ ID NO: 8] auf, der von TAKAHASHI et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87, S. 8013–8016 beschrieben wurde. In der 2 ist ein Alignment der DNA-Sequenz dieses Promotors [SEQ ID NO: 9, 10, 11] (obere Zeile) mit dem entsprechenden Teil der DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Promotors [SEQ ID NO: 12 und 13] (untere Zeile) angegeben.
Abschnitt 9: Konstruktion des Expressionsvektors pSG 123, in dem der Promotor des Gens 246C mit dem Gen der β-Glucuronidase kombiniert ist.
Ausgehend von dem Phagemid pKS 246 kann durch Verdau mit den Enzymen HindIII und BalI ein Insert von etwa 2200 Basenpaaren isoliert werden, das den Promotorbereich des Gens 246C, das Startcodon der Translation und 11 Codons, die für den Amino-terminalen Bereich des Proteins kodieren, enthält.
Das Plasmid pBI 101.3 (Clontech) wird mit den Enzymen HindIII und EcoRI verdaut; das Fragment von etwa 2100 Basenpaaren, das das Gen der β-Glucuronidase enthält, die von dem uidA-Locus in E. coli kodiert wird, gefolgt von dem Terminator der Nopalin-Synthase von Agrobacterium tumefaciens, wird in dem Plasmid pUC 19 ligiert, das an diesen Stellen offen ist, wodurch ein Plasmid entsteht, das als Plasmid pBI 201.3 bezeichnet wird.
Das HindIII-BalI-Insert mit den Promotorsequenzen des Gens 246C wird in dem Plasmid pBI201.3, das an den HindIII- und SmaI-Stellen offen ist, kloniert.
Der als pSG 123 bezeichnete erhaltene Vektor enthält also das Gen der Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors des Gens 246C. Die Nucleotidsequenz des vollständigen chimären Gens ist die Sequenz [SEQ ID NO: 14].
Abschnitt 10: Protokoll der transienten Expression des Gens der Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors des Gens 246C in Tabak-Protoplasten
Herstellung der Tabak-Protoplasten
Blätter von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum, Var Samsun NN) werden im Alter von 4 bis 5 Wochen entnommen, in Streifen geschnitten und in dem Medium T.0 (Tabelle 1, adaptiert von Chupeau et al., 1974, C. R. Acad Sci (Paris), 278 D, 1565), das 1 g/l Cellulase Onozuka R 100, 200 mg/l Macerocym Onozuka (Yakult Honsha, Nishinoniya, Japan) und 500 mg/l Pectolyase Y23 (Sheishin Pharmaceutical Ind. Japan) enthält, 15 h bei 22°C inkubiert.
Die Protoplasten werden durch Sieben an einem Nylonsieb mit einer Maschenweite von 85 μm und 5-minütigem Zentrifugieren bei 50 g in einer Saccharoselösung von 19% (Gewicht/Volumen) von den Zellrückständen abgetrennt. Die Protoplasten, die auf dem Medium schwimmen, werden einmal in dem Medium T.0 gewaschen und ausgezählt; ihre Anzahl wird auf eine Dichte von 1,5 × 10⁶ Protoplasten/ml eingestellt.
Herstellung des Vektors pSG 123
Der E. coli-Stamm, der den Vektor pSG 123 enthält, wird in Luria-Medium (Gibco) mit 50 mg/l Ampicillin kultiviert. Die Amplifikation des Plasmids erfolgt nach der von Sambrook et al. 1989 beschriebenen Vorgehensweise (oben genannte Literaturstelle). Das Plasmid pSG 123 wird dann durch Zentrifugieren in einem Cäsiumchlorid-Gradienten und zwei aufeinanderfolgende Fällungen mit Ethanol gereinigt. Der Plasmidbodensatz wird anschließend in Puffer Tris-HCl 10 mM pH 8,0 wieder solubilisiert.
Transformation mit Polyethylenglykol
Die Protoplastensuspensionen (320 μl pro Aliquot) werden bei 45°C 5 min inkubiert und dann schnell auf Eis abgekühlt. Dann werden 50 μl Plasmid pSG 123 und 160 μl einer Polyethylenglykollösung (40% Polyethylenglykol, 0,4 M Mannit, 30 mM MgCl₂, 0,1% Mes pH 5,8) zugegeben. Nach 10 min werden die Protoplasten durch Zentrifugieren gewonnen und unter mäßigem Rühren in 500 μl Puffer T0 wieder suspendiert und in der Dunkelheit bei 28°C inkubiert.
Messung der transienten Expression
Nach 24-stündiger Inkubation werden die Protoplasten nach Zugabe von 50 μl Extraktionspuffer 10X der β-Glucuronidase durch Gefrieren auf –80°C und anschließendem Auftauen bei 37°C lysiert (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).
Der nach dem Zentrifugieren bei 10000 g erhaltene Überstand wird verwendet, um die β-Glucuronidaseaktivität durch Fluorimetrie zu ermitteln (Jefferson, 1987, Plant Molec. Biol. Reporter, 5, 387).

Parallel hierzu wird die Proteinmenge, die in den Extrakten enthalten ist, nach der Methode von Bradford mit dem Kit Bio Rad (Bio Rad. Lab.) ermittelt. Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums T0 (auf 1 Liter)

NH₄NO₃	825 mg
KNO₃	950 mg
CaCl₂·2H₂O	220 mg
MgSO₄·7H₂O	185 mg
KH₂PO₄	85 mg
H₃BO₃	1 mg
MnSO₄, 4H₂O	100 μg
ZnSO₄, 7H₂O	1 mg
Kl	100 μg
AlCl₃	30 μg
NiCl₂, 6H₂O	30 μg
CuSO₄, 5H₂O	30 μg
FeSO₄, 7H₂O	27,8 mg
Na₂EDTA, H₂O	37,2 mg
Thiamin	100 μg
Nicotinsäure	200 μg
Pyridoxin	1 mg
Biotin	10 μg
Ca-Panthotenat	1 mg
Saccharose	20 g
Inosit	100 mg
Mannit	80 mg
2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES)	200 mg

pH vor der Autoklavierung auf 5,8 eingestellt
Abschnitt 11: Transiente Expression des Gens der Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors des Gens 246C in Protoplasten von Tabak, die mit Pseudomonas solanacearum infiziert sind.
Die transiente Expression, die nach der Vorgehensweise des Abschnitts 10 ermittelt wird, wird nach 24-stündiger Inkubation der Protoplasten gemessen, die nach der oben beschriebenen Vorgehensweise in dem Medium T0 (in Abschnitt 10 beschrieben) hergestellt wurden, das eine wie in Abschnitt 1 beschrieben hergestellte Suspension von Bakterien Pseudomonas solanacearum (10 Bakterien/Protoplast) enthält.
Die β-Glucuronidase-Aktivität wird in pmol gebildetes Methylumbelliferon/min/mg Protein ausgedrückt.
In dem Protoplasten der Pflanzen, die keine DNA des Vektors pSG 123 aufgenommen haben, wird keinerlei Aktivität festgestellt. Eine Aktivität von 450 pmol/min/mg Protein wird an Protoplasten gemessen, die mit dem Vektor pBI221 (Clontech) behandelt wurden, der das Gen der β-Glucuronidase unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors 35S CaMV enthält; diese Aktivität wird nach Infektion mit Stämmen von Pseudomonas solanacearum GMI 1000 und GMI 1178 auf 300 pmol/min/mg Protein vermindert.
Eine Aktivität von 600 pmol/min/mg Protein wird an Protoplasten gemessen, die mit dem Plasmid pSG 123 behandelt wurden; diese Aktivität ist nach Animpfen mit dem Stamm GMI 1178 kaum verändert, sie steigt nach Animpfen mit dem Stamm GMI 1000 auf einen Wert von 1000 pmol/min/mg Protein.
Der Promotor des Gens 246C ermöglicht also eine hohe Grundexpression des Gens der Glucuronidase, wobei die Expression höher ist als die Expression unter dem Promotor 35S von CaMV, der hier als Kontrolle dient.
Dieser Promotor ist außerdem stark induzierbar, da die Expression der β-Glucuronidase nach Infektion mit dem Bakterienstamm GMI 1000 um 40% ansteigt.
Abschnitt 12: Transitorische Expression des Gens der Glucuronidase unter der Kontrolle des Gens 246C durch Tabak-Protoplasten, die mit einem Elicitor (Chitinheptasaccaride) oder einem Hormon behandelt wurden.
Die Expression wird ermittelt, nachdem die Protoplasten 24 h, wie oben beschrieben, in dem Medium T0 inkubiert wurden, das einen Elicitor in einer Konzentration von 25 μm oder ein Hormon, das 2-4-D (2-4-Dichlorphenoxyessigsäure) in einer Konzentration von 4 μm enthält. Die verwendeten Elicitoren (glykosidische Verbindungen aus der Wand von pathogenen Pilzen) sind Chitinheptasaccharide, die die Eigenschaft aufweisen, in Pflanzen Abwehrreaktionen zu induzieren (Roby et al., 1987, BBRC, 143, 885).
In den unbehandelten Protoplasten, die als Kontrolle dienen, wurde keinerlei Aktivität festgestellt. Eine Aktivität in der Größenordnung von 400 pmol gebildetes Methylumbelliferon/min/mg Protein wird an Protoplasten ermittelt, die die DNA des Vektors pBI 221 erhalten haben, wobei diese Aktivität durch die Behandlung (Elicitoren oder Hormon) nicht beeinträchtigt wird.
Protoplasten, die die DNA des Vektors pSG 123 erhalten haben, weisen eine Aktivität von 450 pmol/min/mg Protein auf; diese Aktivität steigt um 50% an, wenn die Protoplasten mit dem Hormon 2-4-D behandelt werden, und um 70%, wenn die Protoplasten mit dem Chitinheptasaccharid behandelt werden.
Die Eigenschaften dieses Promotors, die bei der Infektion der Protoplasten mit dem Bakterienstamm GMI 1000 (hohes Grundniveau und Induzierbarkeit) gezeigt werden konnten, können reproduziert werden, wenn ein Induktor aus der Wand phytopathogener Pilze verwendet wird.
Abschnitt 13: Konstruktion eines in Pflanzenzellen stabilen Expressionsvektors: binärer Vektor pSG246
Aus dem Vektor pSG 123 kann durch Schneiden mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und EcoRI und anschließender Elektrophorese an Agarosegel das chimäre Gen abgetrennt werden, das den Promotor 246C in Kombination mit dem kodierenden Bereich für die β-Glucuronidase und den NOS-Terminator enthält. Das chimäre Gen wird in den binären Vektor pBIN 19 (Clontech), der vorab an den Stellen HindIII und EcoRI gespalten wurde, eingeführt und ligiert, wodurch der Vektor pSG246 gebildet wird. Dieser binäre Vektor besitzt zwei Resistenzgene gegenüber Kanamycin, wobei eines in Bakterien exprimiert werden kann und das andere, das sich unmittelbar stromaufwärts von dem vollständigen rekombinanten Gen befindet (Bevan, 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711), auf Pflanzenzellen übertragen werden kann. Das Resistenzgen gegenüber Kanamycin dient bei den Schritten der Transformation und der Analyse der Abstammung der transformierten Pflanzen als Selektionsmarker.
Der als pSG246 bezeichnete, erhaltene Vektor wird in dem Stamm E. coli DH5 α kloniert.
Abschnitt 14: Transfer des Plasmids pSG246, das die β-Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors des Gens 246C von Tabak enthält, in Agrobacterium
a) Transfer in Agrobacterium tumefaciens
Der Transfer erfolgt durch Transformation gemäß der in Plant Molecular Biology Manual (Gelvin et al., Hrsg. Kluwer Academic Publishers, 1988) beschriebenen Einfrieren/Auftauen-Methode, die nachstehend zusammengefasst wird.
Kompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens (Stamm LBA 4404, Clontech) werden durch schnelles Abkühlen einer Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase in Eis präpariert. Die Bakterien werden dann in CaCl₂ 20 mM suspendiert. Aliquote Teile der Suspension werden in Eppendorf-Röhrchen verteilt und anschließend in flüssigem Stickstoff gefroren.
Zu den gefrorenen Zellen, die in einem Eppendorf-Röhrchen enthalten sind, wird 1 μg Plasmid pSG246 gegeben. Dann wird die Suspension bei 37°C 5 min inkubiert. 1 ml Luria-Medium (Gibco) wird anschließend zugegeben, worauf das Röhrchen 4 h bei 28°C inkubiert wird. Aliquote Teile werden auf Petrischalen verteilt, die ein in Plant Molecular Biology Manual (oben angegebene Literaturstelle) beschriebenes Agar-haltiges Minimalmedium in Gegenwart von 100 mg Rifampicin und 25 mg/l Kanamycin enthalten. Unter diesen Bedingungen wachsen nur Kolonien von Agrobacterium tumefaciens, die das Plasmid pSG246 integriert haben. Diese enthalten das chimäre Gen in einem Kontext, das seine Replikation ermöglicht.
Die Resistenz der selektierten Kolonien gegenüber zwei Antibiotika wird überprüft, indem sie in Folge zweimal auf das gleiche Selektionsmedium überimpft werden. Die Gegenwart des chimären Gens, in dem der Promotor 246C mit dem kodierenden Bereich der β-Glucuronidase kombiniert ist, in Agrobacterium tumefaciens wird durch die Southern-Blot-Methode mit einem Präparat der Gesamt-DNA bestätigt (Lyse der Zellen, Reinigung der DNA durch Extraktion mit einem Phenol/Chloroform-Gemisch, nach der von Gelvin in dem oben erwähnten Buch beschriebenen Vorgehensweise, Schneiden der gereinigten DNA mit Restriktionsenzymen, Agarose-Gel-Elektrophorese, Transfer auf Hybridisierungsmembranen nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind).
b) Transfer in Agrobacterium rhizogenes
Dieser Transfer wird in gleicher Weise wie der unter a) beschriebene Transfer in Agrobacterium tumefaciens mit dem Stamm Agrobacterium rhizogenes A4 durchgeführt, der von Guerche et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 206, 382 beschrieben wurde.
Abschnitt 15: Gewinnung von Tabakpflanzen, die mit das Plasmid pSG246 enthaltenden Agrobacterium tumefaciens transformiert wurden.
Tabak Nicotiana tabacum, der in-vitro kultiviert wurde, wurde mit Agrobacterium tumefaciens, die das Plasmid pSG246 enthalten, nach dem Verfahren von Horsch et al., das dem Fachmann bekannt ist (R. B. Horsch et al., 1985, Science 227, 1229–1231) infiziert, wobei die Hauptschritte im Folgenden dargelegt werden.
Pflanzenscheiben von axenischen Tabakpflanzen Nicotiana tabacum (Varietät Bottom Special) werden in einer Kultur von A. tumefaciens inkubiert, die das Plasmid pSG246 enthalten. Die auf Whatman-Papier abgetropften Scheiben werden auf Kulturmedien in Petrischalen überführt, um die transformierten Zellen so zu vermehren, dass Kallus erhalten wird (Murashige und Skoog, 1962, Physiol. Plant., 15, 473) und dann in Gegenwart von Cefotaxim (500 μg/ml) zur Beseitigung von Agrobacterium tumefaciens und von Kanamycin (100 μg/ml) Triebe erzeugt werden.
Parallel hierzu wurden Transformationen mit Stämmen von Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 vorgenommen, die die folgenden Vektoren enthalten:

– pBI 101 (Clontech), der aus dem kodierenden Bereich der Glucuronidase vor dem Nopalinsynthase-Terminator in dem binären Vektor pB14 besteht. Dieses Konstrukt, das als Konstrukt pBI 101 bezeichnet wird, enthält keinen Promotor;
– pBI 221 (Clontech), der aus einem Fragment von 800 Basenpaaren des Promotors 35S des Blumenkohlmosaikvirus besteht, der vor dem kodierenden Bereich der Glucuronidase in den Vektor pBI 101 inseriert wurde. Dieses Konstrukt wird nachfolgend als Konstrukt pBI 221 bezeichnet.

Die gegenüber Kanamycin resistenten Triebe werden dann in ein Medium überführt, auf dem in Gegenwart von Carbenicillin und Kanamycin Wurzeln induziert werden können. Die Keimlinge werden dann in Pflanzschalen in ein Substrat verpflanzt, das aus Torf und Düngererde besteht, und im Gewächshaus gezogen. Alle transformierten Pflanzen (Generation R0), die bei den Schritten der Regenerierung und Akklimatisierung im Glashaus überlebt haben, erweisen sich als morphologisch normal und fruchtbar. Sie sind selbstbefruchtend und führen zu Samen (Generation R1).
Abschnitt 16: Analyse der genomischen DNA von Tabakpflanzen, die mit Agrobacterium tumefaciens, die das Plasmid pSG246 enthalten, transformiert wurden (Generation R0) nach der Southern-Blot-Technik
Die genomische Tabak-DNA mit hohem Molekulargewicht wird nach dem in dem oben bereits erwähnten Buch "Plant Molecular Biology Manual" beschriebenen Verfahren der Extraktion mit Hilfe von Cetyltrimethylammoniumbromid und Reinigung durch Fällen aus reifen Blättern von transgenen Pflanzen der Generation R0 isoliert.
10 μg der genomischen DNA werden über Nacht bei 37°C mit 20 Einheiten der Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI verdaut. Die erhaltenen Restriktionsfragmente werden durch Elektrophorese auf Agarosegel (1%) getrennt. Die DNA wird nach der Southern-Blot-Methode auf ein Nylonfilter (Hybond N⁺ Amersham) überführt und mit einer Nucleotidsonde hybridisiert, die einen Teil der Sequenz des rekombinanten Gens, markiert durch Kupplung mit Peroxidase (Kit ECL, Amersham) enthält. Die Membranen werden anschließend gewaschen und nach dem von Amersham angegebenen Protokoll entwickelt.
Aus der Analyse der Filme können die folgenden Schlüsse gezogen werden:

– Manche Pflanzen besitzen keine Kopien des transferierten rekombinanten Gens (kein Signal),
– die meisten getesteten Pflanzen enthalten mindestens eine Kopie des Konstrukts ohne Neuordnung, enthaltend: Promotor 246C – für β-Glucuronidase kodierende Sequenz – NOS-Terminator, wobei dieses Konstrukt im Folgenden als Konstrukt pSG 246 bezeichnet wird;
– einige Profile legen nahe, dass in diesem Konstrukt interne Neuordnungen vorkommen, diese Ereignisse sind jedoch selten.

Abschnitt 17: Untersuchung der Aktivierungseigenschaften des Promotors 246C in den transgenen Tabakpflanzen
Diese Untersuchung wurde an Pflanzen der Generation R1 durchgeführt, die vorab in vitro auf Murashige-Skoog-Agarmedium mit 500 μg/ml Kanamycin selektiert wurden.
10 wegen ihrer Resistenz gegenüber Kanamycin selektierten Nachkommen der transformierten Pflanze wurden in Düngererde verpflanzt und anschließend 4 bis 5 Wochen in Kulturkammern kultiviert.
a) Aktivierung durch das phytopathogene Bakterium Pseudomonas solanacearum
Inokulation durch Infiltration
Die Inokulationstests wurden gemäß der in Abschnitt 1 beschriebenen Vorgehensweise an vier Blättern durchgeführt, die von 2 verschiedenen Pflanzen stammen. Die Messungen der Glucuronidase-Aktivität werden nach dem von Jefferson (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987) beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 4-Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass:

– die Pflanzen, die das Konstrukt pBI 101 enthalten, keine nachweisbare Glucuronidase-Aktivität besitzen,
– die Pflanzen, die das Konstrukt pBI 121 enthalten, eine Glucuronidase-Aktivität im Bereich von 5000 bis 70000 pmol Methylumbilliferon/min/mg Protein aufweisen, entsprechend einer konstitutiven Expression, die für dieses Konstrukt zu erwarten ist. Als Antwort auf den Stress bei der Infiltration konnte für einige Transformanten eine leichte Aktivierung festgestellt werden,
– die Pflanzen, die das Konstrukt pSG246 enthalten, in den nicht inokulierten Pflanzen eine geringe Glucuronidase-Aktivität im Bereich von 2000 bis 5000 pmol/mg Protein aufweisen. Als Antwort auf die bakterielle Infektion ist eine starke Induktion festzustellen, und zwar unabhängig von dem verwendeten Bakterienstamm (GMI 1000 oder K60 (Sequeira et al., Physiol. Plant. Pathol., 10, 43, 1977, kompatibler, Symptome hervorrufender Stamm). Der Induktionsfaktor (Verhältnis der vor der Inokulation gemessenen Aktivität und der nach der Inokulation gemessenen Aktivität) liegt in der Größenordnung von 20-fach und die Aktivitätswerte übersteigen zuweilen die Werte, die mit den Pflanzen erhalten werden, die das Konstrukt pBI 121 exprimieren.

Lokale bakterielle Infektion:
Eine lokale bakterielle Infektion wird durch Aufbringen eines Tropfens der Bakteriensuspension von Pseudomonas solanacearum (3 μl mit 3 × 10⁵ Bakterien, wie in Abschnitt 1 beschrieben hergestellt) auf eine Verletzung realisiert, die durch Perforation eines Blatts mit der Nadel einer Spritze erzeugt wurde.
Der Promotor 246C wird um die durch die Infektion gebildete Läsion herum und auch in allen Teilen der infizierten Pflanze aktiviert (inokuliertes Blatt, obere und untere Blätter der Pflanze und Wurzeln). Diese systemische Aktivierung tritt bereits in den ersten Stunden nach der Inokulation auf.
An den Pflanzen der Generation R1, die von mit den Konstrukten pBI 101 und pBI 121 transformierten Pflanzen abstammen, ist keinerlei Aktivierung zu beobachten.
Die gleiche Art von lokaler Infektion, die an den Wurzeln von in vitro kultivierten Tabakpflanzen durchgeführt wurde, führt ebenfalls zu einer starken Aktivierung des Promotors an der Inokulationsstelle, jedoch auch in der gesamten Wurzel und dem oberirdischen Teil der Pflanze.
b) Aktivierung durch den pathogenen Pilz Chalara elegans
In-vitro Untersuchung
10 bis 15 ml flüssiges Murashige-Skoog-Medium werden in eine Petrischale gegossen, die eine 3 Wochen alte Kultur von Chalara elegans im Verlauf der Sporenbildung enthält (Kultur auf Kartoffel-Dextrose-Agar PDA, Difco).
Durch Abkratzen der Oberfläche der Kultur können die Sporen gewonnen werden. Nach Auszählen können durch eine geeignete Verdünnung Suspensionen von 104 und 105 Sporen pro ml hergestellt werden.
Aliquote Teile von 7 ml werden in Magenta-Schalen (Sigma) verteilt. Eine transgene Tabakpflanze (Alter etwa 3 Wochen, in sterilem Medium kultiviert), die mit dem β-Glucuronidase-Gen unter der Kontrolle des Promotors 246C transformiert wurde, wird in jede Schale gegeben, wobei ihre Wurzeln in die Sporensuspension eintauchen. Die Pflanzen werden dann entnommen und gefroren, und die Glucuronidase-Aktivität wird bestimmt. Bei der Infektion beträgt die spezifische Aktivität 20000 pmol Methylumbelliferon pro mg Protein. Im Vergleich mit nicht inokulierten Vergleichsproben, die den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind, steigt die Aktivität für Infektionen mit 10⁴ bzw. 10⁵ Sporen pro ml bereits 4 Tage nach Inokulation um den Faktor 8 bzw. 8, 5 an.
Untersuchung im Gewächshaus
10 Pflanzen pro Abkömmling des Transformanten, die wegen ihrer Resistenz gegenüber Kanamycin selektiert wurden, werden in Töpfe mit Abmessungen von 3 × 3 cm verpflanzt. Sobald das 5. Blatt erscheint, werden die Pflanzen inokuliert, indem im Bereich des Keimstängels eine Suspension von 5 × 10⁵ offener Konidienträger von Chalara elegans aufgebracht wird.
c) Aktivierung mit dem pathogenen Pilz Sclerotinia sclerotiorum
Untersuchung an Blattscheiben
Blattscheiben von 20 mm Durchmesser, die von Pflanzen stammen, die das Konstrukt pSG246 exprimieren, werden in einem geeigneten flüssigen Medium am Überleben gehalten. Auf jede dieser Scheiben wird ein Agar-Agar-Würfel mit etwa 5 mm Seitenlänge gegeben, der das Mycel von Sclerotinia sclerotiorum enthält. Die Glucuronidase-Aktivität, die in Abhängigkeit von der Zeit gemessen wird, zeigt, dass die Gegenwart des Mycels die Glucuronidase-Aktivität nach 7 Stunden Kontakt induziert. Nach 24 h ist die Aktivität im Vergleich mit der Aktivität von Blattscheiben, die nicht mit dem Mycel in Kontakt gekommen sind, um den Faktor 4 gestiegen. Das gleiche Experiment, das an Blattscheiben aus Tabak-Vergleichspflanzen (die das Konstrukt pSG246 nicht exprimieren) durchgeführt wurde, führt lediglich zu einer Glucuronidase-Aktivität, die mit einem Grundrauschen vergleichbar ist.
d) Aktivierung durch Elicitoren
Es wurden zwei Typen von Elicitoren verwendet, ein Elicitor vom biotischen Typ, der Molekülen entspricht, die von natürlichen Molekülen oder Makromolekülen abgeleitet sind, der andere Elicitor vom abiotischen Typ, entsprechend chemischen Molekülen.
d1. Biotische Elicitoren bakterieller Herkunft oder aus Pilzen
Die verwendeten Elicitoren sind Harpin, bei dem es sich um ein aus Erwinia amylovora isoliertes Protein handelt, und ein Protein, das aus dem Überstand einer Pseudomonas solanacearum-Kultur isoliert wurde. Es wurden auch proteinartige Elicitoren getestet, beispielsweise das Cryptogein, das aus Pseudomonas cryptogea isoliert wurde, und das Capsicein aus Pseudomonas capsici (Ricci et al. 1989, Eur. J. Biochem. 183: 555–563).
In allen Fällen wurden geeignete Konzentrationen der Elicitoren mit einer Nadel unter die untere Epidermis der Tabakblätter, die das Konstrukt pSG246 exprimieren, infiltriert. Die Induktion der Aktivität erfolgt in allen Fällen durch die Gegenwart des Elicitors in einem Ring von etwa 5 mm unmittelbar angrenzend an die Infiltrationszone. Die Stimulation ist 24 h nach der Infiltration ganz offensichtlich, jedoch nach 6 h sichtbar. Die Aktivität nach 24 h ist im Vergleich mit den Aktivitäten der Vergleichspflanzen (Pflanzen, die das Konstrukt pSG246 exprimieren, jedoch ohne dass unter die Epidermis Elicitoren injiziert wurden) häufig 5 bis 6 mal höher.
d2. Abiotische Elicitoren: Salicylsäure, Kupfersulfat
Tabakblätter, die das Konstrukt pSG246 exprimieren und von der Pflanze abgenommen wurden, werden in Lösungen mit einer Konzentration von 1 bis 10 μg/ml Salicylsäure oder von 0,025 bis 0,25 mM Kupfersulfat eingetaucht.
In Gegenwart der Salicylsäure steigt die Glucuronidase-Aktivität nach 6 h auf das 5-Fache und nach 24 Stunden auf das 10-Fache. Im Falle des Kupfersulfat erhöht sich die Glucuronidase-Aktivität bei 0,025 mM um den Faktor 17 und bei 0,25 mM um den Faktor 11, wenn man die Aktivität mit den unbehandelten Blättern der Vergleichspflanzen vergleicht.
d3. Induktion durch Wachstumsregulatoren
In Konzentrationen von 1,5 und 10 μM wurde ein Auxin in Form von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) aufgebracht. Beim Eintauchen der Blattstiele von abgelösten Tabakblättern, die das Konstrukt pSG246 exprimieren, stellt sich heraus, dass die Induktion in dem Blatt 6 h nach dem Aufbringen des Auxins in einer Konzentration von 5 μm beginnt und im Vergleich mit den Blättern der Vergleichspflanzen, die nicht mit dem Auxin behandelt wurden, nach 12 h 18-fach stimuliert ist.
Die Glucuronidase-Aktivität wird beim Auftreten der Krankheitssymptome, d. h. etwa 15 Tage nach der Inokulation, gemessen.
Die Ergebnisse der an den oberirdischen Teilen der gesamten Pflanze gemessenen Aktivität zeigen, dass:

– die Pflanzen, die das Konstrukt pBI 101 enthalten, keine nachweisbare Glucuronidase-Aktivität zeigen,
– die mit dem Konstrukt pBI 121 transformierten Pflanzen eine Aktivität von 12000 bis 60000 pmol Methylumbilliferon/ min/mg Protein aufweisen. Diese Aktivität schwankt nach der Inokulation wenig,
– die mit dem Konstrukt pSG246 transformierten Pflanzen an den gesunden Pflanzen eine geringe Glucuronidase-Aktivität zeigen. Die Aktivität steigt in den Pflanzen, die Symptome zeigen, beträchtlich an und erreicht 85000 pmol gebildetes Methylumbelliferon/min/mg Protein.

e) Aktivierung durch eine Verletzung
Diese Aktivierung wurde an Blättern von Pflanzen der Generation R1 mit dem Konstrukt pSG246 untersucht, die etwa 5 Wochen alt waren und zuvor für ihre Resistenz gegenüber Kanamycin selektiert wurden.
Ein einfacher Schnitt an einem Blatt führt zu einer langsamen und geringen Aktivierung des Promotors, gleichzeitig in dem Blatt und der Pflanze; eine Risswunde an einem Blatt führt jedoch zu einer starken (5-fach) und extrem schnellen (30 min) Erhöhung der Glucuronidase-Aktivität in dem zerrissenen Blatt.
f) Aktivierung durch einen thermischen Schock
Tabakpflanzen der Generation R1, die das Konstrukt pSG246 enthalten, die etwa 5 Wochen alt sind und zuvor wegen ihrer Resistenz gegenüber Kanamycin selektiert wurden, werden 2 oder 4 h in eine Kammer von 40°C eingebracht, um einen thermischen Schock hervorzurufen. Unmittelbar nach der Behandlung werden die Pflanzen in flüssigem Stickstoff gefroren und ihre β-Glucuronidase-Aktivität wird an der gesamten oberirdischen Pflanze ermittelt.
Die gleiche Vorgehensweise wird auf mit dem Konstrukt pBI 121 transformierte Pflanzen angewandt; die Aktivität dieser Pflanzen wird durch den thermischen Schock nicht verändert.
Die Pflanzen, die das Konstrukt pSG246 enthalten, zeigen dagegen eine starke Erhöhung der Glucuronidase-Aktivität nach dem thermischen Schock; der mittlere Faktor der Stimulierung, der an mehreren Pflanzen ermittelt wurde, beträgt etwa 12.
g) Expression im Laufe der Entwicklung und räumliche Verteilung der Expression in der Pflanze
Durch die Verwendung eines histochemischen Substrats zum Nachweis der Glucuronidase-Aktivität, Cyclohexylammonium-5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-gluc), nach dem von Jefferson beschriebenen Verfahren (Plant Molecular Biology Reporter, 5, 387, 1987) kann die Lokalisierung der Aktivität in den Geweben der Pflanze sichtbar gemacht werden.
Keimung der Samen:
Bei der Keimung der Tabaksamen der Generation R1, die die Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors 246C exprimieren, ist die Expression in den Kotyledonen nicht nachweisbar, in der gesamten Wurzel hoch und in den Meristemen der Wurzeln und Stängel sehr stark. In der entwickelten Pflanze konnte die Glucuronidase-Aktivität in den gesamten getesteten Geweben, einschließlich der trockenen Samenkörner, detektiert werden.
Abschnitt 18: Gewinnung von Rapspflanzen, die mit Agrobacterium rhizogenes transformiert wurden, die das Plasmid pSG246 enthalten
Die Transformation erfolgt nach dem Protokoll von P. Guerche et al. (P. Guerche et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 206, 382). Die verschiedenen Kulturmedien sind die von Pelletier et al. beschriebenen (Pelletier et al., 1983, Mol. Gen. Genet., 191, 244). Ihre Zusammensetzung ist in der folgenden Tabelle gezeigt (Tabelle 2).
a) Gewinnung von transformierten Wurzeln
Segmente der Sprossachse werden an dem apikalen Ende von Rapspflanzen (Brassica napus: Frühlingsvarietäten Brutor und Westar und Wintervarietät) von etwa 1 m Höhe entnommen. Die Segmente werden an der Oberfläche sterilisiert, mit sterilem Wasser gespült, in Segmente von etwa 1,5 cm Länge geschnitten und in ein Röhrchen mit Medium A gegeben.
Die Inokulation des Endes dieses Segments erfolgt durch Aufbringen einer Suspension des Stamms Agrobacterium rhizogenes, der das Plasmid pSG 246 enthält
Nach 1 bis 2 Wochen treten an dem Stielsegment transformierte Wurzeln auf; sie werden entnommen und in Agarmedium B (15 g/l) mit 500 μg Cefotaxim/ml gegeben.
b) Regenerierung von transformierten Pflanzen
Wurzelfragmente werden 15 Tage in Medium D mit 3 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure inkubiert und anschließend für die Induktion der Sprosse in das Medium RCC gegeben. Die bewurzelten Pflanzen werden dann erhalten, indem die Sprosse auf die Medien F und G gegeben werden. Tabelle 2: Zusammensetzung der verschiedenen verwendeten Medien für die Gewinnung der transformierten Rapspflanzen

NAA: Naphthalinessigsäure
BA: 6-Benzylaminopurin
2,4D: 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
IPA: N⁶-(2-Isopentyl)-adenin
GA₃: Gibberellinsäure
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure

Abschnitt 19: Expressionseigenschaften des Glucuronidasegens unter der Kontrolle des Promotors 246C in Rapspflanzen
a) Aktivierung durch eine Verletzung
Die Blätter von Rapspflanzen der Generation R1, die die Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors 246C enthalten, wurden geschnitten oder geschnitten und zerrissen.
Es wird eine geringe Aktivierung der Glucuronidase-Aktivität in den geschnittenen Blättern beobachtet; eine sehr starke Aktivierung (6 mal über der Grundaktivität) und eine sehr schnelle Aktivierung (etwa 30 min) ist die Folge der Risswunde.
b) Infektion mit phytopathogenen Pilzen
Blattparasit (Alternaria brassicae):
Rapspflanzen der Generation R1, die das Konstrukt pSG246 besitzen, werden etwa 3 Wochen im Topf auf Düngererde kultiviert. Dann werden die Pflanzen lokal mit einer Sporensuspension (10 ml mit 1000 Sporen, die nach Kultur auf Agar-PDA erhalten wurden) des pathogenen Pilzes Alternaria brassicae inokuliert, wobei die Sporen auf eine mit einer Nadel zugefügten Verletzung aufgebracht werden. Um die Verletzung herum entsteht eine Nekrose.
Man beobachtet dann eine starke Stimulierung der Glucuronidase-Aktivität (mit dem X-gluc-Test nachgewiesen, Abschnitt 17e) in dem inokulierten Blatt um den nekrotischen Bereich herum.
Wurzelparasit (Rhizoctonia solani)
Rapssamen der Generation R1, die mit dem Konstrukt pSG246 transformiert wurden, werden auf einem Substrat ausgesät, das aus einem Gemisch von Torf, Vermiculit und Sand (10 : 10 : 5, v : v) besteht und in einem 1 Liter-Topf enthalten ist. Die Samen werden mit einer 1 cm-Schicht des Substrats bedeckt, welches 10000 lebensfähige Propagula von Rhizoctonia solani pro Gramm enthält. Die Propagula werden durch 15-tägige Kultur eines Rhizoctonia-Stamms in einem Kulturkolben nach Roux auf Reiskörnern und anschließendem Zerkleinern auf eine Größe unter 1 mm erhalten.
Während ihrer Entwicklung werden die Rapspflanzen an der Wurzel angegriffen.
Man beobachtet im Vergleich mit der Aktivität, die an den Wurzeln der Kontrollpflanzen gemessen wurde (gleiche Abkömmlinge R1 der transformierten Pflanzen, jedoch nicht infiziert) eine starke Stimulierung der Glucuronidase-Aktivität (mit dem X-gluc-Test, Abschnitt 17e, nachgewiesen) in den Wurzeln der infizierten Pflanzen. Außerdem wird in den oberirdischen Pflanzenteilen systemisch die Glucuronidase-Aktivität stark stimuliert.
c) Aktivierung der Rapspflanzen der Generation R 1 durch einen thermischen Schock
Rapspflanzen der Generation R1, die das Konstrukt pSG246 enthalten, werden im Alter von etwa 5 Wochen 2 oder 4 h in eine Kammer von 40°C eingebracht, um einen thermischen Schock hervorzurufen. Nach dieser Behandlung werden die Pflanzen sofort in flüssigem Stickstoff gefroren und ihre β-Glucuronidase-Aktivität wird an dem ganzen oberirdischen Teil bestimmt.
Die gleiche Vorgehensweise wird auf mit dem Konstrukt pBI 121 transformierte Pflanzen angewandt; die Aktivität dieser Pflanzen wird durch den thermischen Schock nicht verändert.
Die Pflanzen, die das Konstrukt pSG246 enthalten, zeigen dagegen eine starke Erhöhung der Glucuronidase-Aktivität nach dem thermischen Schock; der mittlere Faktor der Stimulierung, der an mehreren Pflanzen bestimmt wurde, liegt in der Gegend von 12.
d) Expression im Laufe der Entwicklung
Im Laufe der Keimung der Rapssamen der Generation R1, die die Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors 246C enthalten, wird eine Expression dieses Proteins in den Kotyledonen, eine hohe Expression in der gesamten Wurzel und eine sehr starke Expression in den Meristemen der Wurzeln und der Stängel beobachtet.
Es wurde auch eine sehr starke Expression in den Wurzeln und dem transformierten Kallusgewebe im Laufe der Regenerierung der transgenen Pflanzen sowie den verschiedenen Teilen der Pflanzen (einschließlich der reifen Samen) beobachtet.
Abschnitt 20: Gewinnung von Sonnenblumen-Kallusgewebe, das mit Agrobacterium rhizogenes transformiert wurde, die das Plasmid pSG246 enthalten.
Die Transformation erfolgt nach der Vorgehensweise von Guerche et al. (Mol. (Gen. Genet., 206, 382, 1987), das ursprünglich für die Transformation von Raps entwickelt wurde. Die verschiedenen Kulturmedien wurden von Pelletier et al. (Mol. Gen. Genet. 191, 244, 1983) beschrieben, ihre Zusammensetzung wurde bereits gezeigt (Tabelle 2).
Die Sonnenblumen-Hypokotylen werden durch Keimung von Samen auf Vermiculit während 7 bis 10 Tagen erhalten. Die Samen werden in eine Kulturkammer gegeben, 16 h unter Beleuchtung bei 20°C/8 h in der Dunkelheit bei 17°C. Die Hypokotylen werden an der Oberfläche sterilisiert, mit sterilem Wasser gespült und in ein Röhrchen gegeben, das Murashige-Skoog-Medium enthält, dessen Konzentration an Makroelementen um die Hälfte reduziert ist.
Die Inokulation des Segmentendes wird durch Aufbringen einer Suspension des Stamms Agrobacterium rhizogenes, der das Plasmid pSG246 enthält, durchgeführt.
Transformierte Wurzeln erscheinen nach einem Monat; sie werden entnommen und 4 Wochen auf das Agarmedium B (15 g/l) mit 500 μg Cefotaxim/ml aufgebracht, wobei wöchentlich verpflanzt wird. Sie werden dann in dem gleichen flüssigen Medium unter Rühren (100 U/min) kultiviert und jeden Monat verpflanzt. Durch Überführen der Wurzeln in das Medium D kann das Kallusgewebe aus den transformierten Wurzeln gebildet werden.
Die Glucuronidase-Aktivität der in dem flüssigen Medium B kultivierten Wurzeln und dem in dem Medium D kultivierten Kallusgewebe, die durch Fluorimetrie abgeschätzt wird, zeigt sehr hohe Werte im Bereich von 104 bis 105 pmol gebildetes Methylumbelliferon/min/mg Proteine.
Abschnitt 21: Transiente Expression des Glucuronidasegens unter der Kontrolle des Promotors des Gens 246C in unreifen Sonnenblumen-Embryonen
Unreife Embryonen von Mutterpflanzen des Genotyps 105 werden entnommen und 14 Tage in dem Medium I (Tabelle 3) bei 25°C in der Dunkelheit kultiviert. Die Embryonen werden dann 3 Tage auf dem Medium II bei 25°C unter einer Photoperiode von 16 h pro Tag/8 h pro Nacht kultiviert. Ungefähr 20 Embryonen werden dann nebeneinander auf das Medium III gelegt.
Herstellung des Vektors pSG 123:
Die Herstellung erfolgt nach der in Abschnitt 10 beschriebenen Vorgehensweise.
Transformation des pflanzlichen Materials:
Plasmidische DNA (Vektor pSG 123) wird in die Pflanzenzellen unter Verwendung einer Partikelkanone eingebracht, die nach dem von Zumbrunn beschriebenen Prinzip konstruiert wurde (Zumbrunn et al. 1989 Technique 1(3) 204–216). Die plasmidische DNA wird in einer Menge von 4 μg/mg Wolfram auf Wolfram-Mikropartikeln adsorbiert. 2,5 mg des Wolfram/DNA-Gemisches wird dann auf ein Makroprojektil aufgebracht, das durch Explosion einer Patrone beschleunigt wird.
Durch Aufplatzen des Makroprojektils auf einer Lochplatte können die Mikropartikel aus Wolfram und DNA in die Zellen geschleudert werden.
Messung der transienten Expression:
Die auf den Wolframmikropartikeln adsorbierte DNA, die in die Pflanzenzellen eingedrungen ist, wird freigesetzt; das chimäre Gen, das den Promotor des Gens 246C mit der Glucuronidase kombiniert, wird anschließend transkribiert und dann übersetzt. Die erhaltene Glucuronidase wird durch den histochemischen Test, der von JEFFERSON et al., 1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387 beschrieben wurde, unter Verwendung des Substrats Cyclohexylammonium-5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-gluc) sichtbar gemacht. Die Zellen, die das Gen exprimieren, haben eine blaue Färbung.
Durch Auszählen der pro Petrischale im Laufe eines Versuchs zur transienten Expression erhaltenen blauen Zellen kann die Anzahl der transformierten Zellen ermittelt und die Expression des getesteten chimären Konstrukts abgeschätzt werden.
Die 48 h nach Beschuss mit der Mikropartikelkanone unter Verwendung des Substrats X-gluc ermittelte transiente Expression zeigt, dass das β-Glucuronidasegen in unreifen Sonnenblumenembryonen exprimiert wird.
Die Intensität ist im Vergleich mit der unter Verwendung des Plasmids pBI221 (Clontech) induzierten Intensität höher, wobei in dem Plasmid pBI221 das Glucuronidasegen unter die Kontrolle des Promotors 35S des Blumenkohlmosaikvirus gestellt ist.
Die Anzahl der transformierten Zellen, die das Glucuronidasegen unter der Kontrolle des Promotors des Gens 246C exprimieren, liegt in der Gegend von 140 pro Schale (Mittelwert von 4 Experimenten), wohingegen die Anzahl der transformierten Zellen in Gegenwart des Plasmids pBI221, worin das Glucuronidasegen unter die Kontrolle des Promotors 35S des Blumenkohlmosaikvirus gestellt ist, 60 pro Schale beträgt (Mittelwert aus 4 Experimenten).
Die Embryonen werden anschließend auf sterilem Filterpapier abgetropft und in der Dunkelheit während 3 Tagen auf Medium II kultiviert. Die Embryonen werden anschließend kurz mit flüssigem Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962, Physiol. Plant 15 473), das 500 mg/l Antibiotikum Cefotaxim enthält, gespült. Sie werden dann auf sterilem Filterpapier abgetropft und auf dem Medium III, das 250 mg/l Cefotaxim, 250 mg/l Carbenicillin und 50 mg/l Paromomycin enthält, kultiviert. Die Kultur erfolgt bei 25°C mit einer Fotoperiode von 16 h Tag/8 h Nacht; das Pflanzengewebe wird alle 21 Tage auf das gleiche Medium verpflanzt.
Die aus diesem Gewebe neu gebildeten Sprosse werden unter den gleichen Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Fotoperiode auf Medium IV überführt.
Die bewurzelten Pflanzen werden dann im Gewächshaus gezogen.
Abschnitt 22: Expression der β-Glucuronidase unter der Kontrolle des Promotors 246C in transformierten Sonnenblumenpflanzen.
Die Pflanzen, die das Konstrukt pSG246 exprimieren, weisen eine Glucuronidaseexpression auf, die mindestens der Expression entspricht, die bei den mit Hilfe des Konstrukts pBI 121 transformierten Pflanzen erhalten wird.
Tabelle 3: Zusammensetzung der verschiedenen, für die Gewinnung der transformierten Sonnenblumenpflanzen verwendeten Medien
Abschnitt 23: Protokoll der Expression des β-Glucuronidasegens unter der Kontrolle des Promotors 246C in Geweben von Monokotyledonen
Gewinnung des Pflanzenmaterials:
Genotyp-Samen der Gerste GERBEL werden im Gewächshaus auf Vermiculit zum Keimen gebracht. Nach 7 Tagen werden die Blätter und Wurzeln für die Experimente der transienten Expression entnommen und in eine Petrischale gegeben, die Murashige-Skoog-Agarmedium enthält.
Unreife Embryonen von Mais werden 10 bis 14 Tage nach der Bestäubung aus den im Gewächshaus kultivierten Mutterpflanzen (Linie LH 132) entnommen. Die Embryonen werden auf der Seite der embryonalen Achse mit dem Induktionsmedium (in nachstehender Tabelle 4 angegebene Zusammensetzung) in Kontakt gebracht und dann 3 Wochen später auf das Erhaltungsmedium (Tabelle 5) gegeben. Das erhaltene Kallusgewebe wird jede Woche umgesetzt. Die Experimente der transienten Expression werden einige Stunden nach dem Umsetzen durchgeführt.
Herstellung des Vektors pSG 123:
Die Herstellung erfolgt nach der in Abschnitt 10 beschriebenen Vorgehensweise.
Transformation des Pflanzenmaterials:
Die plasmidische DNA (Vektor pSG 123) wird unter Verwendung der nach dem von Zumbrunn beschriebenen Prinzip konstruierten Partikelkanone in die Pflanzenzellen eingeführt (Zumbrunn et al., 1989, Technique 1 (3) 204–216). Die plasmidische DNA wird auf Wolframmikropartikeln in einer Menge von 4 μg/mg Wolfram adsorbiert. 2,5 mg des Wolfram/DNA-Gemisches werden dann auf ein Makroprojektil aufgebracht, das durch Explosion einer Patrone beschleunigt wird.
Durch das Zerplatzen des Makroprojektils auf einer mit einem Loch versehenen Prallplatte können die Mikropartikel aus Wolfram und DNA in die Zellen geschleudert werden.
Bestimmung der transienten Expression:
Die auf den Wolframmikropartikeln adsorbierte DNA, die in die Pflanzenzellen eingedrungen ist, wird freigesetzt; das chimäre Gen, in dem der Promotor des Gens 246C mit der Glucuronidase kombiniert ist, wird dann transkribiert und anschließend übersetzt. Die erhaltene Glucuronidase wird durch den von JEFFERSON et al., 1987 Plant Molecular Biology Reporter 5, 387, beschriebenen histochemischen Test unter Verwendung des Substrats Cyclohexylammonium-5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-gluc) sichtbar gemacht. Die Zellen, die das Gen exprimieren, sind dann blau gefärbt.
Durch das Auszählen der Anzahl der pro Petrischale im Laufe eines Experiments zur transienten Expression erhaltenen blauen Zellen kann die Zahl der transformierten Zellen bestimmt und die Expression des getesteten chimären Konstrukts abgeschätzt werden.
TABELLE 4: Induktionsmedium für Mais-Kallusgewebe aus unreifen Embryonen (in mg pro 1 Liter)
TABELLE 5: Erhaltungsmedium für Mais-Kallus (in mg pro 1 Liter)
Abschnitt 24: Transiente Expression des β-Glucuronidasegens unter der Kontrolle des Promotors des Gens 246C in Gerstengewebe und Mais-Kallus
Die unter Verwendung des Substrats X-gluc 48 h nach Beschießen mit der Mikropartikelkanone gemessene transiente Expression zeigt, dass das β-Glucuronidasegen in den Blättern und den Wurzeln der Gerste und auch in dem Mais-Kallusgewebe exprimiert wird.
Die Intensität der Expression ist genauso groß wie die durch die Verwendung des Plasmids pBI 221 (Clontech) induzierte Intensität, wobei in dem Plasmid pBI 221 das Glucuronidasegen unter die Kontrolle des Promotors 35S des Blumenkohlmosaikvirus gestellt ist.
Der Promotor des Gens 246C aus Tabak ist also befähigt, die Expression eines Gens in Monokotyledonen zu lenken.
Abschnitt 25: Konstruktion eines Plasmids, in dem das Tomaten-Tabak-Chitinase-Gen unter die Kontrolle des induzierbaren Promotors gestellt ist, und Expression des Gens in Tabak
a) Herstellung der Promotorsequenz
Das oben beschriebene Plasmid pSG 123 wird mit den Endonucleasen Hind III und Sca I verdaut. Nach Agarose-Gel-Elektrophorese wird das Hind III-Sca I-Fragment mit 2088 Basenpaaren, das den gesamten induzierbaren Promotor mit Ausnahme der 57 Basenpaare unmittelbar stromaufwärts von ATG enthält, gereinigt.
Die Ligation des gereinigten Fragments, des synthetischen Sca I-Bam HI-Oligonucleotids mit 62 Basenpaaren der Sequenz [SEQ ID NO: 15] und des Vektors pTZ 19R (Pharmacia), der mit Hilfe der Endonucleasen Hind III und Bam HI linearisiert wurde, führt zu dem Plasmid pPH 111.
Aus dem Plasmid pPH 111 wird das Hind III-Bam HI-Fragment mit 2150 Basenpaaren, das den gesamten induzierbaren Promotor enthält, durch Schneiden mit den Endonucleasen Hind III-Bam HI und anschließender Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert.
b) Herstellung eines Fragments, das ein Hybridgen enthält, das für ein Protein mit Endochitinaseaktivität kodiert
Das BamHI-EcoRI-Fragment, das aus dem Plasmid pBR1 stammt, das in der Patentanmeldung EP 493 581 , Beispiel 1, beschrieben wurde, und das ein chimäres Gen enthält, welches für ein Protein mit Endochitinaseaktivität kodiert [SEQ ID NO: 16], und das die Sequenz aufweist, die für ein Tomate-Tabak-Endochitinase-Hybrid (in Position 438–1587) und den NOS-Terminator enthält, wird gereinigt.
c) Klonieren in dem binären Vektor pBIN 19
Mit Hilfe der DNA-Ligase T4 wird die Promotorsequenz (siehe oben), die für die Chitinase kodierende Sequenz und die Terminatorsequenz in den binären Vektor pBIN 19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12, 8711–8721) ligiert, welcher mit Hilfe der Endonucleasen Hind III und EcoRI geöffnet wurde. Der Vektor enthält zwei Resistenzgene gegen Kanamycin, einen, der in Bakterien exprimiert werden kann, und einen anderen, der sich unmittelbar stromaufwärts von dem vollständigen rekombinanten Gen befindet und in Pflanzenzellen transferiert werden kann.
Der erhaltene Vektor, der als pBR 20 bezeichnet wird, wird in dem Stamm E. coli HB 101 (Clontech) kloniert.
2) Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Die Transformation des Stamms Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Clontech) wird nach der Einfrieren/Auftauen-Methode, die in Plant Molecular Biology Manual (Gelvin et al., oben genannte Literaturstelle) (in Abschnitt 14 dargelegt) beschrieben ist, ausgehend von 1 mg Plasmid pBR20 durchgeführt.
3) Transformation von Tabak
In-vitro kultivierter Tabak Nicotiana tabacum wurde mit Agrobacterium tumefaciens, das das Plasmid pBR 20 enthält, nach der Vorgehensweise von Horsch et al. infiziert, die dem Fachmann bekannt ist (R. B. Horsch et al., 1985 Science 227, 1229–1231), deren hauptsächliche Schritte im Folgenden erläutert werden.
Blattscheiben von axenischen Tabakpflanzen Nicotiana tabacum (Varietät Wisconsin Havana 38) werden in einer Kultur von A. tumefaciens inkubiert, welche das Plasmid pBR 20 enthalten. Die auf Whatman-Papier abgetropften Scheiben werden in Petrischalen auf Kulturmedien kultiviert, um die transformierten Zellen so zu vermehren, dass Kallusgewebe erhalten wird. Das Kallusgewebe wird dann auf ein Medium mit 500 mg/ml Cefotaxim, das dazu dient, das Pflanzengewebe zu entseuchen (Entfernen von Agrobacterium tumefaciens), und 100 mg/ml Kanamycin zur Selektionierung des transgenen Materials überführt.
Nachweis der Expression des Proteins mit Endochitinaseaktivität in transgenem Tabak
a) Herstellung der Rohextrakte der Proteine aus transformiertem Tabak
Die Rohextrakte der Proteine werden aus verschiedenen Pflanzengeweben (Wurzel, Stiel, Blätter und dergleichen) hergestellt. Die Gewebefragmente werden in flüssigem Stickstoff gefroren, in Pulverform zerkleinert und bei –20°C aufbewahrt. Das Pulver wird bei 4°C in Gegenwart von Ammoniumacetatpuffer 0,1 M pH 5,2 extrahiert und bei 10000 g zentrifugiert. Die Gesamtkonzentration der Proteine wurde an den Überständen, die im Folgenden als Rohextrakte der Proteine bezeichnet werden, nach dem Verfahren von Bradford (M. M. Bradford, 1976 Anal. Biochem., 72, 248–254) ermittelt.
b) Nachweis des Chitinasehybrids durch Immun-Blotting (Western Blot)
Die Rohextrakte der Proteine werden einem Western-Blot unterzogen, eine Technik, die dem Fachmann bekannt ist und von H. Towbin et al. beschrieben wurde (Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 76, 1979, 4350–4354).
Die Immunodetektion des interessierenden Proteins erfolgt mit einem Immunserum, das polyklonale Antikörper enthält, die das Hybridprotein mit Chitinaseaktivität erkennen können (vgl. EP-493 581, Abschnitt 5).
Der Antigen-Antikörper-Komplex wird dann mit dem Kit RPN 23 vom Amersham ("Blotting detection kit") nach den Angaben des Herstellers mit einem mit Alkaliphosphatase konjugierten Streptavidin-Biotin-System entwickelt.
Der erhaltene Blot zeigt für die mit dem Plasmid pBR 20 transformierten Tabakpflanzenblätter die Gegenwart eines Proteins mit einer Molmasse von etwa 26 ± 6 kDa, das von den polyklonalen Antikörpern erkannt wird und in den Blättern der Vergleichstabakpflanzen fehlt. Dieses Protein hat das gleiche Molekulargewicht wie das Hybridprotein mit Chitinaseaktivität, das in der Patentanmeldung EP-493 581 beschrieben ist.
Abschnitt 26: Lokalisierung der minimalen Sequenzen des Promotors 246C, die für die beschriebenen Eigenschaften verantwortlich sind
An dem Vektor pSG123, in dem der Promotor des Gens 246C mit dem β-Glucuronidasegen kombiniert ist, wurden verschiedene Deletionen in der 5'-Region des Promotors erzeugt. Diese wurden entweder durch Verwendung von Restriktionsenzymen und/oder 3-Exonuclease erhalten. Der genaue Umfang der Deletionen wurde durch Sequenzierung nach der Sanger-Methode ermittelt. In der 3 sind die verschiedenen Vektoren dargestellt, die mit Hilfe dieser Deletionen des 5'-Bereichs des Promotors ausgehend von der Initiationsstelle der Transkription in Position 2068 erhalten wurden.
a. Untersuchung der Stärke des Promotors 246C durch transiente Expression in Tabakprotoplasten.

Diese Vektoren wurden für die transiente Expression in Tabakprotoplasten verwendet, die keinen Effektor erhalten haben. Die Ana lyse der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Expression mit den Vektoren pSG 251 und pSG 33 erhalten wird, die 30000 pmol gebildetes Methylumbelliferon/min/mg Protein erreicht. Die umfangreicheren Deletionen, die an dem Promotor durchgeführt wurden (entsprechend den Vektoren pSG29, pSG23, pSG451, pSG2, pSG24, pSG3, pSG1) führten als Konsequenz zu einer Verminderung der Expression der Glucuronidase, die umso größer ist, je umfangreicher die Deletion ist (siehe nachstehende Tabelle).

Deletionen in pSG123	GUS-Aktivität (pmol/min/mg)
Vergleich	0
pBI221	~1000
pSG 123	5000
pSG251	29000
pSG33	31000
pSG29	26000
pSG23	22000
pSG451	10000
pSG2	4000
pSG 14	1000
pSG3	0
pSG1	0

Die Vektoren pSG251 und pSG33 entsprechen den Promotoren mit der Sequenz (B) [Vektor pSG 33) bzw. der Sequenz (C) [Vektor pSG 251].
b. Untersuchung der Stärke des Promotors durch stabile Expression der chimären Konstrukte, die die deletierten Promotoren enthalten, in transgenem Tabak.
Für jeden der in 3 beschriebenen Vektoren wurde das chimäre Gen, das den Promotor (vollständig oder bruchstückhaft), den für die Glucuronidase kodierenden Bereich und den NOS-Terminator in Kombination enthält, nach Schneiden mit den Restriktionsendonukleasen Hind III und EcoRI auf Agarosegel gereinigt. Für jeden Fall wurde das chimäre Gen in den binären Vektor pBIN 19 (Clontech) eingebracht und ligiert, welcher vorab an den Stellen Hind III und EcoRI (Abschnitt 13) geöffnet wurde.
Der in-vitro kultivierte Tabak Nicotiana tabacum wurde mit Agrobacterium tumefaciens infiziert, die die oben beschriebenen verschiedenen Konstrukte enthielten. Die Vorgehensweise entspricht der in Abschnitt 15 beschriebenen Vorgehensweise.
Die Glucuronidaseaktivität ist der Mittelwert der an 10 bis 20 Transformanten durchgeführten unabhängigen Messungen. In Abwesenheit des Induktors wird die Glucuronidase-Grundaktivität der verschiedenen Genotypen mit den Konstrukten pSG251 bis pSG451 durch die Deletionen nicht wesentlich beeinträchtigt: Sie entspricht im Wesentlichen der Aktivität der Genotypen mit dem Konstrukt pSG123 (3). Für die Konstrukte pSG2, pSG24, pSG3 und pSG1 ist die Expression dagegen umso geringer, je kürzer der Promotor ist: Bei pSG3 und pSG1 findet keine Expression statt.
In Gegenwart von bakteriellen Induktoren (siehe Abschnitt 17) weisen die Pflanzen mit den Konstrukten pSG251 und pSG33 eine im Vergleich mit dem Konstrukt pSG 123 um einen Faktor 3 erhöhte Expression auf. Dies zeigt, dass der deletierte Teil, der der Sequenz D [SEQ ID NO: 6] entspricht, eine Sequenz enthält, die die Induzierbarkeit des Promotors 246 C im Vergleich mit der Sequenz B [SEQ ID NO: 4] alleine vermindert oder in Gegenwart der Sequenz C [SEQ ID NO: 5] eine höhere Induzierbarkeit möglich ist als bei der Sequenz des Promotors 246 C (Sequenzen B + C + D).
Die Expression ist dagegen für die Genotypen mit den Konstrukten pSG29 und pSG23 im Vergleich mit den Genotypen, die die Konstrukte pSG123 enthalten, unverändert.
Für die Genotypen mit den Konstrukten pSG451, pSG2, pSG24, pSG3 und pSG1 liegt die Induzierbarkeit systematisch unter der der Genotypen mit dem Konstrukt pSG 123: Sie ist umso geringer, je kürzer der Promotor ist und ist für Pflanzen mit den Konstrukten pSG3 und pSG 1 nicht mehr vorhanden.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Sequenz D [SEQ ID NO: 6] eine Information vom Typ "Silencer" enthält, die die Induzierbarkeit des vollständigen Promotors (Sequenzen B + C + D) teilweise inhibiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pflanzenpromotor, dadurch gekennzeichnet, dass er die nachstehende Sequenz (B) [SEQ ID NO: 4]
oder eine Sequenz mit einem Homologiegrad von mindestens 80% mit der Sequenz (B) aufweist.
Promotor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er stromaufwärts der Sequenz (B) die nachstehende Sequenz (C) [SEQ ID NO: 5]:
oder eine Sequenz mit einem hohen Homologiegrad mit der Sequenz (C) aufweist.
Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er stromaufwärts der Sequenz (B) die nachstehende Sequenz (D) [SEQ ID NO: 6]:
oder eine Sequenz mit einem hohen Homologiegrad mit der Sequenz (D) aufweist.
Verwendung eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Erzielung einer Überexpression eines Proteins von Interesse in einer Pflanze in einer Stress-Situation, wobei dieses Protein zur Unterstützung von Pflanzen bei der Überwindung eines Stress-Zustands bestimmt sein kann.
Pflanzenzellen mit Ausnahme von natürlich vorkommenden Pflanzenzellen, Mikroorganismen (Bakterien) oder Zellen von Mikroor ganismen mit einer integrierten Expressionseinheit eines Proteins, die den Pflanzenpromotor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
Pflanze oder Pflanzenteil, dadurch gekennzeichnet, dass sie bzw. er Pflanzenzellen nach Anspruch 5 enthält.
Samen, dadurch gekennzeichnet, dass er Pflanzenzellen nach Anspruch 5 enthält.
Verwendung einer Pflanze oder eines Pflanzenteils nach den Ansprüchen 6 und 7 zur Selektionierung von Molekülen mit phytosanitärer Aktivität, die natürliche Verteidigungsreaktionen von Pflanzen gegen phytopathogene oder phytophage Organismen (Pilze, Bakterien, Viren, Insekten und Nematoden) induzieren können.