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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zum Erzeugen einer transgenen Pflanze, die Resistenz
gegen wenigstens eine Erkrankung entfaltet. Insbesondere bezieht
sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren beim Herstellen
einer transgenen Pflanze, welches eine Expressionskassette umfasst,
einschließend
ein Thioningen, und welche in der Lage ist, das Thioningen zu exprimieren
und die Resistenz gegen wenigstens eine Erkrankung entfaltet.
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Auf dem Gebiet der landwirtschaftlichen
Produktion bestand ein allgemeines Bedürfnis für eine stabile Erzeugung hochqualitativer
Pflanzen und einer Reduktion der Abhängigkeit von landwirtschaftlichen
Chemikalien. Demgemäß wurden
Pflanzenarten, die eine Resistenz gegen Schädlinge und pathogene Mikroben
zeigen, nachdrücklich
verbessert, gezüchtet
und entwickelt durch die Verwendung nützlicher Techniken der Pflanzenbiotechnologie,
z. B. Pflanzenzellfusionstechniken und rekombinante DNS-Techniken.
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In der Tat wurden bereits eine transgene
Pflanze, die Resistenz gegen Herbizide zeigt (japanische Offenlegungsschrift
Nr. 2-186925), eine transgene Pflanze, die Resistenz gegen Viren
zeigt (japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-330233) und eine transgene
Pflanze, die Resistenz gegen Schädlinge
zeigt (japanische Offenlegungsschrift Nr. 3-247220) durch die Verwendung
rekombinanter DNS-Techniken erzeugt.
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Weiterhin wurden etliche Arten an
transgenen Pflanzen, die Resistenz gegen pathogene Pflanzenmikroben
entfalten, erzeugt, z. B. eine transgene Pflanze, die Resistenz
gegen pathogene Fadenpilze zeigt, durch das Einführen eines Gens, das ein Enzym
kodiert, welches die durch pathogene Fadenpilze erzeugten Toxine inaktiviert
(Anne S. Ponstein et al., Plant Physiology, 104: 109–118, 1994),
und eine transgene Pflanze, die Resistenz gegen wenigstens eine
pathogene Mikrobe zeigt, durch die Einführung eines Gens, das ein antimikrobielles
Protein aus einem Insekt kodiert (japanische Offenlegungsschrift
Nr. 7-250685).
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Die Erfinder isolierten aus Blättern von
Avena sativa ein neues Thionin, welches ein antimikrobielles Protein
ist, sequenzierten mit einem bekannten Verfahren ein Gen, welches
das Thionin kodiert, und versuchten, die Transformation einer Tabakpflanze
unter Verwendung des Thioningens (japanische Offenlegungsschrift
Nr. 8-266279). Durch diesen Ansatz wurde eine transformierte, redifferenzierte
Tabakpflanze erhalten.
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Es ist jedoch nicht garantiert, dass
alle transgenen Pflanzen zu praktischen und nützlichen Pflanzen werden, die
eine hohe Resistenz gegen Erkrankung zeigen, da Faktoren, wie z.
B. die Art der Pflanze, Transformationsverfahren, exprimierte Menge
und Expressionsstellen der eingeführten Gene und Einflüsse der Genprodukte
auf die Pflanze die Erkrankungsresistenz variieren oder das Wachstum
beschleunigen können. Weiterhin
ist bekannt, dass es situationsabhängig ist, ob die erworbene
Erkrankungsresistenz stabil an Nachfahren weitergegeben werden wird
oder nicht. Aus diesen Gründen
war es gewünscht,
eine praktische und nützliche
Pflanze, die eine hohe Resistenz gegen Erkrankung zeigt, zu erzeugen.
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es,
eine Pflanze zu erzeugen, die eine Expressionskassette umfasst, einschließend ein
Thioningen, und die in der Lage ist, das Thioningen zu exprimieren,
wobei eine Pflanze bereitgestellt wird, die eine hohe Resistenz
gegen wenigstens eine Erkrankung entfaltet. Eine weitere Aufgabe der
Erfindung ist es, eine Pflanze bereitzustellen und Saatgut, die
es erlauben, solche Eigenschaften in Nachfahren stabil zu bewahren.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Verfahren bereitzustellen, die zuvor genannte Pflanze, die eine
hohe Resistenz zeigt, zu gewinnen.
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Das Verfahren zur Erzeugung einer
gegen eine Erkrankung resistenten Pflanze der vorliegenden Erfindung
ist ein Verfahren, umfassend die Schritte des Konstruierens eines
Expressionsvektors, der eine Expressionskassette enthält, umfassend
ein Thioningen von Avena sativa, wobei die Expressionskassette in
der Lage ist, das Thioningen zu exprimieren; Transformieren einer
Pflanzenzelle mit dem Expressionsvektor; und Regenerieren einer
Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle, worin die transgene
Pflanze eine erhöhte Resistenz
gegen wenigstens eine Erkrankung hat im Vergleich zu nicht transgenen
Pflanzen, und wobei es sich bei der Erkrankung um bakteriellen Blattmehltau
beim Reis, dem bakteriellen Samenmehltau beim Reis oder bakterielle
Samenfäule
beim Reis, verursacht von einem pflanzenpathogenen Bakterium, handelt
oder worin die Erkrankung die Braunfäule an Kartoffeln (späte Kartoffelfäule) ist,
verursacht von einem für
Pflanzen pathogenen Fadenpilz.
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In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung wird das Thionin aus einem Blatt von
Avena sativa gewonnen wird.
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In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ist die erkrankungsresistente Pflanze
eine Pflanze der Poaceae oder eine Pflanze der Solanaceae.
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In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ist die mit der erkrankungsresistenten
Pflanze verknüpfte
Erkrankung eine Erkrankung, die von einer pflanzenpathogenen Mikrobe
verursacht wird, z. B. eine Erkrankung, die von einem pflanzenpathogenen
Bakterium verursacht wird (z. B. ein Bakterium, das den bakteriellen
Blattmehltau beim Reis verursacht, oder ein Bakterium, das den bakteriellen
Samenmehltau beim Reis verursacht) oder eine Erkrankung, die von
einem pflanzenpathogenen Fadenpilz (z. B. einem Pilz, der die Braunfäule an Kartoffeln
verursacht) verursacht wird.
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Folglich ermöglicht die hierin beschriebene
Erfindung die Vorteile des (1) Erzeugens einer Pflanze, die eine
Expressionskassette umfasst, einschließend ein Thioningen, und die
in der Lage ist, das Thioningen zu exprimieren, wobei eine Pflanze
bereitgestellt wird, die eine hohe Resistenz gegen wenigstens eine
Erkrankung zeigt; (2) des Bereitstellens einer Pflanze und von Saatgut,
die es ermöglichen,
solche Eigenschaften in Nachfahren stabil zu erhalten; und (3) des
Bereitstellens eines Verfahrens zur Gewinnung der zuvor genannten Pflanze,
die eine hohe Erkrankungsresistenz zeigt.
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Diese und andere Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden Fachleuten offenbar werden nach dem Lesen und Verstehen
der folgenden detaillierten Beschreibung mit Bezug auf die begleitenden
Figuren.
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1 ist
ein Diagramm, das die Resistenzen einiger transgener Reislinien
(2-1, 11-2 und 13-3) gegen bakteriellen Blattmehltau von Reis zeigen,
basierend auf ihren Erkrankungsindizes, wo ein Thioningen in jede der
transgenen Reispflanzen eingeführt
worden war.
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2 ist
eine Fotografie, die die Ergebnisse des Resistenztests für die transgene
Reislinie 2-1 gegen bakteriellen Blattmehltau von Reis zeigt, worin
ein Thioningen in die transgene Reislinie 2-1 eingeführt worden war.
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3 ist
eine Fotografie, die die Ergebnisse des Resistenztests für die transgene
Reislinie 2-1.1 gegen bakteriellen Samenmehltau von Reis zeigt,
wor ein Thioningen in die transgene Reislinie 2-1.1 eingeführt worden
war. Die Pflanze auf der linken Seite (positive Kontrolle) ist ein
Wildtyp-Reis, der nicht mit dem Bakterium, das den bakteriellen
Samenmehltau von Reis verursacht, geimpft worden war; die Pflanze
in der Mitte ist eine transgene Reislinie 2-1.1, welche mit dem
Bakterium geimpft worden war, das den bakteriellen Samenmehltau
von Reis verursacht; und die Pflanze auf der rechten Seite (negative
Kontrolle) ist ein Wildtyp-Reis, der mit dem Bakterium, das bakteriellen
Samenmehltau von Reis verursacht, geimpft worden war.
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4 ist
ein Diagramm, das die Resistenzen der transgenen Tabaklinien (4,
5, 15, 18, 41 und 44) gegen die Braunfäule an Kartoffeln erläutert, basierend
auf ihren erkrankten Fleckgebieten, worin ein Thioningen in jede
der transgenen Tabakpflanzen eingeführt worden war.
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5 ist
eine Fotografie, die die Ergebnisse des Resistenztests für die transgenen
Tabaklinien (M7TH4 und M7TH5) gegen die Braunfäule an Kartoffeln zeigt, worin
ein Thioningen in jede der transgenen Tabakpflanzen eingeführt worden
war.
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Als Erstes werden die Definitionen
der hierin verwendeten Begriffe erläutert werden, um das Verständnis der
vorliegenden Erfindung zu erleichtern.
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Der Begriff "Erkrankung", wie er hierin verwendet wird, bezieht
sich auf eine Erkrankung, die von einer pflanzenpathogenen Mikrobe
verursacht wird, einschließlich
einem pflanzenpathogenen Bakterium oder einem pathogenen Fadenpilz.
Beispiele von durch pflanzenpathogene Bakterien verursachte Erkrankungen schließen ein:
bakteriellen Blattmehltau von Reis, bakteriellen Samenmehltau von
Reis, bakterielle Sämlingsfäule von
Reis, Hohlstängelerkrankung
von Tabak und Tabak-Wildfeuer, ebenso wie Nassfäule, bakterielle Fleckerkrankung
und bakterielle Welke von Gemüsen.
Beispiele an von pathogenen Fadenpilzen verursachte Erkrankungen
schließen
ein: Rice-Blast-Krankheit
des Reises, Blattscheidenbrand an Reis, Samen und Keimlingsfäule von
Reis, Umfallkrankheit von Reis, Bakanae-Krankheit, Falscher Mehltau
von Reis, Braunfleckenerkrankung von Reis, Rost von Weizen, Gerste,
Roggen, Hafer oder Ähnlichem,
Echter Mehltau von Weizen, Gerste, Roggen, Hafer oder Ähnlichem,
Braunfäule
an Kartoffeln, Waterhouse-Variante der Blattfleckenkrankheit von
Tabak, Tabakgrauschimmel, Umfallkrankheit von Tabak, Rost an Gräsern, Take-All-Disease,
Schneeschimmel, Lemics-Krankheit von Gemüsen, Falscher Mehltau, Echter
Mehltau, Anthraknose, Keimlingsfäule, Kohlhernie,
Welkekrankheit der Nelke und Rost von Chrysanthemum. Die Erkrankungen,
gegen welche die vorliegende Erfindung besonders nützlich ist
beim Verleihen von Resistenz sind bakterieller Blattmehltau von Reis,
bakterieller Samenmehltau von Reis und Braunfäule an Kartoffeln.
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Der Begriff "Thionin", wie er hierin verwendet wird, bezieht
sich auf ein basisches Protein, das verschiedene pharmakologische
Wirkungen hat, wie z. B. antimikrobielle Wirkungen und Blutdruck
senkende Wirkungen, und welches stabil gegen Säuren und Hitze ist. Es ist
im Allgemeinen bekannt, dass Thionin ein Protein ist, das aus Pflanzen
gewonnen wird (z. B. Weizen, Gerste, Roggen, Hafer und Avena sativa),
z. B. ein cysteinreiches Protein, bestehend aus 46 Aminosäureresten
und aufweisend ein Molekulargewicht von ungefähr 5 Kilo Dalton (kDa). Der
Begriff "Thionin", wie er hierin verwendet
wird, umfasst auch jedes Protein, bei dem wenigstens eine Aminosäure hinzugefügt, entfernt
oder substituiert wurde und welches die zuvor genannten Eigenschaften
bewahrt. Vorzugsweise bezieht sich "Thionin" auf das von den Blättern von Avena sativa abgeleitete
Thionin in der vorliegenden Erfindung.
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Der Begriff "transgene Pflanze", wie er hierin verwendet wird, bezieht
sich auf eine Pflanze mit einem von außen eingeführten Gen, die in der Lage
ist, das Gen stabil oder vorübergehend
zu exprimieren, um ein Genprodukt (z. B. ein Polypeptid wie z. B.
ein Enzym) mit einer spezifischen biologischen Funktion zu erzeugen.
Die Expression kann konstitutiv oder induzierbar sein (das heißt in Antwort
auf eine spezifische Stimulation, z. B. durch Temperatur und/oder
ein Agens). Das einzuführende
Gen wird aus einer zu transformierenden Pflanze gewonnen, einer
Pflanze, die zu derselben Art oder zu einer anderen Art wie die
zu transformierende Pflanze gehört,
oder aus einer anderen Organismenart (z. B. Tieren wie z. B. Insekten,
oder Mikroben). Gene, die durch die Kombination von Teilen solcher
Gene wieder hergestellt werden, sind ebenso umfasst wie das einzuführende Gen,
solange das Genprodukt (z. B. Enzym) seine biologische Funktion
bewahrt.
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Der Begriff "Gen",
wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Polymer, bei
dem Nucleotide, die die Aminosäuren
kodieren, die ein Polypeptid (z. B. Enzym) bilden, zu einer linearen
Struktur, die eine Richtung aufweist, zusammengefügt sind.
Das "Gen" kann einzelsträngig (z.
B. RNS) oder doppelsträngig
(z. B. DNS) sein. DNS kann z. B. cDNS sein, die aus einer transkribierten
RNS (mRNS), aus genomischer DNS aus Chromosomen oder aus chemisch
synthetisiertren DNS enzymatisch zubereitet ist. Solche Gene können einen
Promotorbereich zum Regulieren der Transkription eines kodierenden
Bereichs, einen Enhancerbereich, der den Promotorbereich beeinflusst,
und andere regulatorische Bereiche (z. B. eine Terminationssequenz
und einen Poly-A-Bereich) ebenso wie ein Intron oder Ähnliches
einschließen,
zusätzlich
zu einer Sequenz, die einem kodierenden Bereich oder einem translatorischen
Bereich, der ein Polypeptid (z. B. Enzym) kodiert. Es ist im Stand
der Technik bekannt, dass Modifikationen dieser Gene, z. B. Addition,
Deletion, Substitution, durchgeführt
werden können,
solange die modifizierten Gene die Aktivitäten der zuvor genannten Bereiche
bewahren.
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Der Begriff "Expressionskassette", wie er hierin verwendet wird, bezieht
sich auf ein DNS-Fragment, in dem ein Gen, das ein Protein (z. B.
Thionin) kodiert, und zahlreiche regulatorische Elemente (z. B.
Promotoren und Enhancer) für
die Regulation seiner Expression miteinander gekoppelt sind, um
in einer Wirtszelle operabel zu sein.
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Der Begriff "Vektor" wie er hierin verwendet wird, bezieht
sich auf eine DNS zum Übertragen
der zuvor genannten Expressionskassette in eine Wirtszelle. Es ist
im Stand der Technik bekannt, dass die Art eines solchen Vektors
und die Arten der zu verwendenden regulatorischen Elemente in Übereinstimmung
mit jeder Wirtszelle variiert werden können. Ein bevorzugter Vektortyp
ist ein Plasmidvektor und ist allgemein ein Vektor, der fähig ist,
die zuvor genannte Expressionskassette in eine Mikrobe, eine Tierzelle
oder eine Pflanzenzelle zu übertragen.
Jene, die in der Lage sind, die zuvor genannte Expressionskassette
in eine Pflanzenzelle zu übertragen,
sind besonders zu bevorzugen.
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Nachfolgend wird die vorliegende
Erfindung im Detail beschrieben werden. Solange nicht anderweitig bestimmt,
kann die vorliegende Erfindung unter Verwendung bekannter Techniken
auf dem Gebiet der Molekularbiologie, Biochemie, Genetik, Gentechnologie
und/oder Pflanzenzüchtung
in die Praxis umgesetzt werden.
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Die durch das Verfahren der vorliegenden
Erfindung zu transformierende Pflanze kann eine Pflanze von entweder
den Monocotyledoneae oder den Dicotyledoneae sein. Zu bevorzugende
Pflanzen der Monocotyledoneae in der vorliegenden Erfindung schließen Pflanzen
der Poaceae ein. Beispiele der Pflanzen der Poaceae schließen ein
Pflanzen von Phyllostachys, Sasa, Sasamorpha, Pleioblastus, Oryza,
Poa, Glyceria, Melica, Avena, Agrostis, Bromus, Agropyron, Hordeum,
Triticum, Aegilopus, Secale, Phragmites, Eragrostis; Eleusine, Calamaglostis,
Zoysia, Panicum, Echinochloa, Setaria, Digitaria, Saccharum, Miscanthus,
Imperata, Sorghum, Coix, Zea und Ähnliche. Eine Pflanze der Oryza
ist besonders zu bevorzugen. Zu bevorzugende Pflanzen der Dicotyledoneae
in der vorliegenden Erfindung schließen Pflanzen der Solanaceae
ein. Beispiele der Pflanzen der Solanaceae schließen Pflanzen
von Lycium, Scopolia, Physalis, Solanum, Lycopersicon, Capsicum,
Nicotiana, Datura und Petunia ein. Eine Pflanze der Nicotiana ist
besonders zu bevorzugen.
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Das zu verwendende Thioningen kann
ein Gen sein, das ein Thionin kodiert, welches aus dem Endosperm
oder den Blättern
von z. B. Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Avena sativa und Ähnlichen
stammt. Alternativ könnte
ein Gen, das ein Thionin kodiert, welches ein zu dem Thionin von
Weizen oder Ähnlichen ähnliches
Protein ist, z. B. ein Gen, das ein Viscotoxin von Mistel kodiert,
ein Gen, das ein Crambin von den Ölsaaten von Crambe abyssinica
kodiert oder ein Gen, das ein thioninähnliches Protein aus den Blättern und
Beeren von Pyrularia pubera (eine parasitische Pflanze der Santalaceae)
kodiert (Wada und Ozaki, Plant Cell Technology, 3(3): 200–207, 1991),
verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird ein Thioningen
aus den Blättern
von Avena sativa verwendet.
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Die oben besonders genannten Thioningene
wurden isoliert und die Nucleotidsequenzen davon sind bekannt. Die
Nucleotidsequenzen sind in einer Gensequenzregistrierungseinrichtung
wie z. B. GenBankTM registriert. Fachleute
können
die Nucleotidsequenzen der Thioningene erhalten, indem sie eine
Recherche in den Gensequenzregistrierungseinrichtungen oder in verschiedenen
Datenbanken (z. B. DNASISTM), die auf den
Sequenzen basieren, die in solchen Gensequenzregistrierungseinrichtungen
registriert sind, durchführen.
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Ein Thioningen kann direkt aus verschiedenen
Pflanzen isoliert werden, basierend auf einer bekannten Nucleotidsequenz,
unter Verwendung eines Verfahrens, das Fachleuten bekannt ist. Alternativ
kann ein Thioningen verwendet werden, das bereits isoliert und in
einen Vektor kloniert wurde. Alternativ kann ein Thioningen verwendet
werden, das chemisch synthetisiert wurde, basierend auf einer bekannten
Nucleotidsequenz.
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Kurz erläutert, die Isolierung der Thioningene
aus verschiedenen Pflanzen kann durchgeführt werden z. B. durch die
Isolierung von mRNS aus den Thionin exprimierenden Zellen der Pflanze,
der Konstruktion einer Gen-(cDNS)-Bibliothek aus der isolierten
mRNS und dem Durchsuchen der Genbank mittels eines Hybridisierungsverfahrens.
Für die
Hybridisierung kann ein Polynucleotid verwendet werden, das chemisch
synthetisiert worden war, basierend auf einer bekannten Nucleotidsequenz,
oder es kann ein bereits kloniertes Thioningen in seiner vollen
Länge oder
ein Fragment davon als eine Hybridisierungssonde verwendet werden.
Teile dieser Tätigkeiten
können
durchgeführt
werden unter Verwendung verschiedener im Handel erhältlicher
Kits, die für
die jeweiligen Tätigkeitsschritte
ausgelegt sind. Die Bedingungen und das Vorgehen für solch
eine Reihe an Tätigkeiten
sind beschrieben in Standard-Versuchshandbüchern im Stand der Technik,
z. B. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Auflage, (Sambrook,
J. et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), und
Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.),
John Wiley & Sons,
1987) oder sie sind beschrieben in der Bedienungsanleitung, die
jedem Kit beigefügt
ist.
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Ein Teil oder ein Bereich der Sequenz
des demzufolge erhalten Thioningens kann modifiziert werden, um
seine Aktivität
oder Spezifität
zu verändern
oder um die anschließenden
Genrekombinierungstätigkeiten zu
erleichtern, sofern notwendig. Eine solche Modifikation kann durch
Verfahren durchgeführt
werden, die Fachleuten wohl bekannt sind, z. B. durch ortsgerichtete
Mutagenese oder Polymerasekettenreaktion (PCR). Es würde von
Fachleuten geschätzt
werden, dass solche Modifikation der Nucleotidsequenzen in der Änderung
einer oder mehrerer Aminosäure(n)
oder Bereich(e) der Aminosäuresequenz
resultiert. Diese Bedingungen liegen im Fachwissen von Fachleuten.
Diese Standardverfahren sind in den zuvor genannten Versuchshandbüchern beschrieben.
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Eine Expressionskassette für das wirksame
Exprimieren eines Thioningens in Pflanzenzellen schließt einen
kodierenden Bereich eines Thioningens ein und einen Promotorbereich,
um das Thioningen zu mRNS zu transkribieren, und wahlweise einen
Enhancerbereich, um auf den Promotor einzuwirken, um dessen Transkriptionsaktivität zu regulieren,
und einen Terminatorbereich, um die Stabilität der transkribierten mRNS
zu beeinflussen.
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Die vorliegende Erfindung stellt
keinerlei Grenzen hinsichtlich der Art des Promotors bereit, solange
er fähig
ist, das Thioningen zu mRNS in der Pflanzenzelle, in welche das
Thioningen eingeführt
worden ist, zu transkribieren. Solch ein Promotor kann ein Promotor
sein, der nicht von Pflanzen gewonnen ist (z. B. ein Promotor für die Blumenkohlmosaikvirus-35S-(CaMV
35S)-RNS, Nopalinsynthase (nos) oder Octopinsynthase (ocs)) oder
es kann ein Promotor sein, der aus Pflanzen stammt (z. B. ein Promotor
für ein
Enzym, das in den Sekundärstoffwechsel
involviert ist, wie z. B. eine Chalconsynthase, oder ein Promotor
für ein
Speicherprotein wie z. B. Glycinin). Indem ein Promotor angemessen
gewählt
wird, wird es möglich,
eine Pflanze zu erzeugen, die eine hohe Resistenz gegen Erkrankung
zeigt. Ein Beispiel eines zu bevorzugenden Promotors, um die Thioningenexpression
in einer Pflanze zu ermöglichen,
ist eine CaMV 35S-Promotor.
Der CaMV 35S-Promotor wurde in Vektoren wie z. B. pBI121 (Clontech),
pBI221 (Clontech) und pCaMVCN (Pharmacia) kloniert. In der vorliegenden
Erfindung wird der CaMV 35S-Promotor vorzugsweise verwendet, um
ein Thioningen in den Zellen einer transgenen Pflanze zu exprimieren.
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Das Expressionsmaß des eingeführten Thioningens
kann erhöht
werden durch Einführen
eines Enhancerbereichs. Ein Enhancerbereich ist eine spezifische
Region innerhalb eines nicht translatierten Bereiches (z. B. Intron)
oder innerhalb eines Promotorbereichs. Ein Enhancerbereich kann
an dem 5'- und/oder 3'-Ende des zu verwendenden
Promotorbereichs angeordnet werden. Beispiele für Enhancerbereiche schließen ein:
einen Bereich von –343
bis –90
innerhalb des CaMV 35S-Promotors (Kar, R. et al., Science, 236: 1299–1302, 1987);
den 5' nicht translationierten
Bereich des Tabakmosaikvirus, bekannt als eine Ω-Sequenz (Gallie, D. R. et al., Nucl.
Acids. Res., 15: 3257–3272,
1987); den 5' nicht
translationierten Bereich des Alfalfamosaikvirus (Jobling, S. A.
et al., Nature, 325: 622–625,
1987); und eine Intronsequenz für
Phaseolin aus Phaseolus vulgaris (Slightom, J. L. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 80: 1897–1901,
1983). Solch ein Enhancerbereich kann allein oder in Kombination
miteinander verwendet werden.
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Weiterhin kann eine Vielzahl dieser
Enhancerbereiche verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung
kann die Ω-Sequenz
des Tabakmosaikvirus, ein Bereich innerhalb des CaMV 35S-Promotors,
oder die Intronsequenz für
Phaseolin aus Phaseolus vulgaris bevorzugt verwendet werden; noch
bevorzugter wird eine Kombination all derer verwendet. In dem Fall
des Verwendens solcher Enhancersequenzen in Kombination mit dem
CaMV 35S-Promotor werden die Ω-Sequenz
und die Intronsequenz für
Phaseolin aus Phaseolus vulgaris bevorzugt an dem 3'-Ende des Kernbereichs
(–90 bis –1) des
CaMV 35S-Promotors angeordnet, während
der Enhancerbereich innerhalb des CaMV 35S-Promotors an dem 5'-Ende des Kernbereichs (–90 bis –1) des CaMV
35S-Promotors angeordnet wird. Die Anzahl der zu verwendenden Enhancersequenzen
hängt von
der zu transformierenden Pflanze ab.
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Die exprimierte Menge (translatierte
Menge) des Thionins hängt
von dem 3'-Nicht-Translationsbereich (das
heißt
Terminationssequenz) ab, der sich an dem 3'-Ende des Thioningens befindet. Durch
das Einführen einer
Terminationssequenz, einschließlich
einer polyadenylierten Signalstelle an dem 3'-Ende des kodierenden Bereichs, wird
die transkribierte mRNS so stabilisiert, dass die translatierte
Menge des Thionins geändert wird.
Beispiele solcher Terminationssequenzen schließen ein, ohne Beschränkung, die
CaMV 35S-Terminationssequenz, die Terminationssequenz für die Nopalinsynthase
(nos-Terminationssequenz)
und die Terminationssequenz für
Octopinsynthase (ocs- Terminationssequenz).
In der vorliegenden Erfindung wird die nos-Terminationssequenz vorzugsweise
verwendet.
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Der in der vorliegenden Erfindung
verwendete Thioninexpressionsvektor schließt nicht nur das Thioningen,
sondern auch ein Gen ein, das Eigenschaften verleiht, die als ein
selektierbarer Marker für
das Erleichtern der Selektion der transformierten Pflanzenzellen
(oder Pflanze) dienen. Solche Gene können z. B. ein Neomycinphosphotransferase-(NPTII)-Gen, um Resistenz
gegen beide Antibiotika, sowohl Kanamycin als auch Neomycin, zu
verleihen, und ein Hygromycinphosphotransferase-(HPT)-Gen sein,
um Resistenz gegen Hygromycin zu verleihen. Solch ein selektierbares
Markergen kann alleine verwendet werden; alternativ können zwei oder
mehr solcher selektierbarer Markergene in Kombination verwendet
werden. In der vorliegenden Erfindung schließt der Thioninexpressionsvektor
vorzugsweise das NPTII-Gen und das HPT-Gen als selektierbare Markergene
ein. Diese Gene stehen ebenfalls unter der Regulierung des CaMV
35S-Promotors und
schließen eine
nos-Terminationssequenz an ihrem 3'-Ende ein. Den resultierenden transgenen
Pflanzen wird Resistenz gegen sowohl Kanamycin als auch Neomycin
verliehen.
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Der in der vorliegenden Erfindung
verwendete Thioninexpressionsvektor kann weiterhin einschließen, falls
nötig:
einen Bereich, um den Einbau eines Bereiches, der ein Thioningen
enthält,
das der stabilen Expression in einer Pflanzenzelle fähig ist,
und der ein selektierbares Markergen enthält, in den Chromosomen einer Pflanzenzelle
(z. B. ein RB-Sequenzbereich
und ein LB-Sequenzbereich aus einem Ti-Plasmid, die bei der Induktion
von Tumoren auf Grund der Infektion mit dem Bodenbakterium Agrobacterium
tumefaciens verwickelt sind) zu ermöglichen; und einen Bereich,
der benötigt
wird für
die Replikation in Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens
wird verwendet für
das Einführen
des Expressionsvektors in eine Pflanzenzelle.
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Weiterhin kann solch ein Expressionsvektor
einen Genbereich für
die Replikation in E. coli und einen Markergenbereich (z. B. für Ampicillinresistenz)
einschließen,
um die anschließende
Auswahl zu ermöglichen, um
die rekombinierende Tätigkeit
des Gens auf diesem Vektor zu erleichtern. Der in der vorliegenden
Erfindung verwendete Expressionsvektor schließt vorzugsweise eine Thioningen,
ein Arzneimittelresistenzgen zum Erleichtern der Selektion, einen
RB-Sequenz- und einen LB-Sequenzbereich, um den Einbau in die Chromosomen
einer Pflanzenzelle zu erleichtern, einen Bereich, der benötigt wird
für die
Replikation in Agrobacterium tumefaciens, einen Genbereich für die Replikation
in E. coli und einen Markergenbereich, um die anschließende Selektion
zu ermöglichen,
ein.
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Solch ein Expressionsvektor kann
konstruiert werden durch Verwenden eines Expressionsvektors für Pflanzen,
die die obigen Bereiche enthalten, z. B. pBI121 (Clontech) aus dem
Ti-Plasmid. pBI121 (Clontech) schließt zwei Expressionseinheiten,
nämlich
das β-Glucuronidase-(GUS)-Gen
und das NPTII-Gen (die jeweils unter der Regulation des CaMV 35S-Promotors
und des nos-Promotors stehen), innerhalb eines Bereichs ein, der
zwischen einer LB-Sequenz und einer RB-Sequenz eingefügt ist.
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Ein in der vorliegenden Erfindung
zu verwendender Thioninexpressionsvektor kann gewonnen werden durch
z. B. Ersetzen einer GUS-Region in pBI121 (Clontech) durch einen
Thionin kodierenden Bereich. Kurz, solch ein Expressionsvektor kann
konstruiert werden durch Einfügen
eines Thionin kodierenden Bereichs (erhalten durch Verdauung mit
den Restriktionsenzymen BamHI und SacI) in pBI121 (Clontech), aus
dem der GUS-Bereich
entfernt wurde durch Verdauen mit dem Restriktionsenzym BamHI und
SacI. Eine Enhancersequenz kann erhalten werden aus z. B. pL11A-A25 (Nishiguchi, M. et al., Nucl. Acids
Res., 13: 5585–5590,
1985) und dem zuvor genannten pBI121 (Clontech) nach Verdauen mit
Restriktionsenzymen oder durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)
unter Verwendung der obigen Vektoren als Matrizen unter Verwendung
eines geeigneten Primers. Anschließend können diese Sequenzen z. B.
an dem 5'-Ende des
CaMV 35S-Promotors
unter Verwendung der HindIII-Stelle und/oder an dem 3'-Ende des CaMV 35S-Promotors unter Verwendung
der BamHI-Stelle eingefügt
werden.
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Alternativ kann ein spezifischer
Anteil der notwendigen Bereiche (z. B. ein Promotorbereich, einschließend einen
Enhancerbereich, einen Bereich, der einen kodierenden Bereich mit
einem Promotorbereich und/oder einem Terminatorbereich kombiniert,
oder einen Teil solch eines Bereiches) in einem in der vorliegenden
Erfindung zu verwendenden Thioninexpressionsvektor auf einem anderen
Klonierungsvektor (z. B. pUC18 und pBluescriptTM (Stratagene))
konstruiert werden. Durch Einführen
solch eines Teilbereichs in einen Expressionsvektor für eine Pflanzenzelle
(z. B. pBI121 (Clontech)) durch Ersetzen oder Ähnliches kann schließlich ein
Thioninexpressionsvektor von Interesse, der in eine Pflanzenzelle
eingeführt
werden soll, konstruiert werden. Das Verfahren für die Konstruktion solch eines
Expressionsvektors ist nicht auf jenes oben beschriebene beschränkt, sondern
kann innerhalb des Fachwissens von Fachleuten variieren.
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Die Einführung einer konstruierten Thioninexpressionskassette
in einen Thioninexpressionsvektor kann durchgeführt werden unter Verwendung
eines Verfahrens unter Verwendung eines Bodenbakteriums mit infektiösen Eigenschaften
für Pflanzen,
z. B. Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rizogenes, wobei das
Verfahren Elektroporation oder Ähnliches
verwendet.
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Ein Verfahren, das Agrobacterium
tumefaciens verwendet, benötigt
das Einführen
eines konstruierten Expressionsvektors in Agrobacterium tumefaciens,
bevor eine Pflanzenzelle damit infiziert wird. Das Einführen des
konstruierten Vektors in Agrobacterium tumefaciens wird durch Verfahren
durchgeführt,
die ähnliche
sind zu jenen, die an E. coli angewendet werden, z. B. Einführung durch
Calciumbehandlung, eine Einfrier- und Auftaumethode oder ein Elektroporationsverfahren.
Die Kultivierung von Agrobacterium tumefaciens, in welches der konstruierte
Vektor eingeführt
werden soll, kann unter geeigneten Bedingungen (z. B. 25 bis 30°C für 24 bis
36 Stunden) durchgeführt
werden unter Verwendung eines Mediums wie z. B. LB-Medium oder YEB-Medium.
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Das Einführen eines Expressionsvektors
in eine Pflanzenzelle durch die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens
kann. durchgeführt
werden, indem einem Samen oder einem Gewebestück (z. B. einem Stück eines
Blattes und/oder Stiels) einer Pflanze ermöglicht wird, mit Agrobacterium
tumefaciens (in der Form von Bakterien oder einer Kulturlösung davon),
das den Expressionsvektor enthält,
für eine
vorbestimmte Zeitdauer in Kontakt zu treten. Ein Verfahren unter
Verwendung eines Blattstückes
ist Fachleuten bekannt als das Leaf-Disk-Verfahren (z. B. Horsch,
R. B. et al., Science 227: 1229, 1985). Der Infektionsbereich und
die Infektionswirksamkeit für
die mit Agrobacterium tumefaciens infizierbaren Pflanzen hängt von
jedem Stamm ab. Zum Beispiel infiziert der Agrobacterium tumefaciens-Stamm
LBA4404 leicht eine Dicotyledone, insbesondere Tabak, infiziert
jedoch kaum eine Monocotyledone wie z. B. Reis. Auf der anderen
Seite hat der Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA 101 eine ausreichend
hohe Infektionswirksamkeit für
Monocotyledonen im Vergleich zu jener des Stammes LBA4404.
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Um die Infektion mit Agrobacterium
tumefaciens sicherzustellen, wird der Pflanzensame oder das Gewebestück auf einem
festen Medium nach der Infektion damit platziert. Eine Kombination
aus Cytokinin und Auxin wird zu diesem Medium für die Differenzierung/Induktion
und für
das Wachstum der Pflanzenzelle zu einem Pflanzenkörper hinzugefügt. Als
Cytokinin wird beispielsweise Kinetin, Benzyladenin, Zeatin oder
2-Isopentenyladenin gewöhnlich
in einer Konzentration von 0,1 bis 10 Teile auf eine Million Teile
(ppm) verwendet. Als Auxin wird z. B. Indolessigsäure, Indolbuttersäure, 2-Naphthalenessigsäure oder
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
in einer Konzentration von 1 bis 10 ppm verwendet. Die Kombination
dieser Substanzen und ihrer jeweiligen Konzentrationsspiegel variiert
in Abhängigkeit
von der Pflanze und deren zu verwendendes Gewebe, Fachleute können aber
solche Parameter bestimmen, indem sie auf Versuchshandbücher (unten
erwähnt) oder Ähnliches
Bezug nehmen.
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Genauer werden eine Kulturlösung von
Agrobacterium tumefaciens (z. B. Stamm EHA 101), das den Expressionsvektor
enthält,
und ein durch die Kultur eines Samens gewonnener Kallus miteinander
vermischt und sanft gerührt
(z. B. 15 Minuten (Min.)). Danach wird, um den Kallus in einem Pflanzenkörper zu
differenzieren/induzieren der Kallus beispielsweise auf das Agarmedium
eines Pflanzengewebekulturmediums (z. B. Murashige-und-Skoog's-(MS-)-Medium, Linsmaier-und-Skoog's-(LS-)-Medium oder
Gamborg's-B5-Medium) platziert,
zu dem 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
und Zucker (gewöhnlich
3% Sucrose) hinzugefügt
worden waren und anschließend
für drei
Tage bei 27°C
z. B. kultiviert. Es wird von Fachleuten anerkannt werden, dass die
Zusammensetzung des zu verwendenden Mediums variiert, in Abhängigkeit
von der Pflanze und ihrem zu transformierenden Gewebe.
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Anschließend wird die Selektion der
infizierten Zellen, die das Thioningen enthalten, durchgeführt, gleichzeitig
mit dem Entfernen von Agrobacterium tumefaciens, das für das Infizieren
der Zellen verwendet worden war.
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Das Entfernen von Agrobacterium tumefaciens
wird wie folgt erreicht. Der zuvor genannte Kallus wird auf einem
Medium kultiviert, das durch das weitere Hinzufügen eines Antibiotikums (z.
B. 500 ppm Carbenicillin oder Ähnliches)
zu dem vorgenannten festen Medium erhalten wurde. Die Selektion
des Kallus, der den Expressionsvektor darin eingebaut hat, findet
auf einem Medium statt, zu dem Antibiotika, die den selektierbaren Markergenen,
die in dem Expressionsvektor vorhanden sind, entspricht, hinzugefügt werden.
Zum Beispiel werden in dem Fall, wo die Kalli kanamycin- oder hygromycinresistent
sind, 100 ppm Kanamycin bzw. 30 ppm Hygromycin verwendet.
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Die Kalli werden auf ein neues Selektionsmedium
alle 2 oder 3 Wochen für
die Entfernung des Bakteriums und die Selektion des Kallus, ebenso
wie die Differenzierung/Induktion der Adventivknospen übertragen. Um
das vollständige
Entfernen von Agrobacterium tumefaciens sicherzustellen, kann Carbenicillin
weiterhin in einem frühen
Kulturstadium zu dem Selektionsmedium hinzugefügt werden. Die Kulturtemperatur
liegt gewöhnlich
zwischen 20 und 30°C.
Ein typischerweise verwendeter Hell/Dunkel-Zustand ist 16 Stunden
Lichtdauer und 9 Stunden Dauer der Dunkelheit. Es wird von Fachleuten
erkannt werden, dass die Kulturbedingung in Abhängigkeit von der Pflanze variiert.
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Jede Adventivknospe, die sich gebildet
hat, wird extrahiert, auf ein Selektionsmedium, das weder Auxin
noch Cytokinin enthält, übertragen
und weiterhin unter denselben Bedingungen wie oben kultiviert bis
zum Wurzeln. Das folglich erhaltene Pflänzchen wird akklimatisiert,
so dass es fähig
wird, in normaler Erde in einer natürlichen oder künstlichen
Umgebung zu wachsen.
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In einem anderen Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung kann das Einführen einer Expressionskassette,
die ein Thioningen einschließt,
in eine Pflanzenzelle (Infektion) erreicht werden unter Verwendung
eines aus Pflanzengewebe (z. B. einem Blatt) zubereiteten Protoplasten
(z. B. Marton, L. et al., Nature, 277: 1229, 1979), anstelle eines
Samens. In dem Falle der Verwendung eines Protoplasten kann ein
Expressionsvektor, einschließend
ein Thioningen, sogar direkt in eine Pflanzenzelle durch Elektroporation
eingeführt werden,
falls gewünscht.
Der Protoplast, in den der Expressionsvektor eingeführt worden
war, wird unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um Zellwände zu regenerieren.
Das anschließende
Vorgehen für
die Differenzierung/Induktion der Pflanze ist dasselbe Vorgehen,
wie jenes, das in der obigen Beschreibung des aus Samen gewonnenen
Kallus verwendet wird.
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Solch ein Vorgehen für die Pflanzentransformation
ist in Versuchshandbüchern
beschrieben, z. B. Plant Genetic Transformation and Gene Expression,
A Laboratory Manual (Draper, J. et al. (Hrsg.), Blackwell Scientific
Publications, 1988) und DNA Cloning, A Practical Approach (Glover,
D. M. et al. (Hrsg.), Band 2, IRL Press, 1985).
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Das in eine transgene Pflanze gemäß der vorliegenden
Erfindung eingeführte
Gen kann qualitativen und quantitativen Analysen durch das folgende
Verfahren unterzogen werden.
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Zum Beispiel wird mRNS wieder gewonnen
durch ein Verfahren, einschließend
das Sammeln von Pflanzenblättern,
in welche eine Thioningen eingeführt
worden war, Einfrieren der Blätter
in flüssigem
Stickstoff und Homogenisieren der Blätter (Verwoerd et al., Nucl.
Acids Res., 17: 2362, 1989). Die Analysen für die Expression des eingeführten Thioningens
können
durch eine Northern Blot Analyse durchgeführt werden, wo die wieder gewonnene
mRNS durch Elektrophorese abgetrennt wird, auf eine Nitrocellulosemembran
oder Ähnliches übertragen
wird und wo ihr erlaubt wird, mit einer markierten DNS- oder RNS-Sonde
zu reagieren, die spezifisch mit der mRNS des Thioningens hybridisiert.
Es wird von Fachleuten anerkannt werden, dass das Verfahren der
Wiedergewinnung der mRNS und die Bedingungen für die Northern Blot Analyse
variieren in Abhängigkeit
von dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung.
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Alternativ können die Analysen für die Produktion
von Thionin durch eine Western Blot Analyse durchgeführt werden,
wo das Protein von transgenen Pflanzen durch ein bekanntes Verfahren
wieder gewonnen wird, aufgetrennt wird durch Elektrophorese, übertragen
wird auf eine Nitrocellulosemembran oder Ähnliches und ihm ermöglicht wird,
an einen Antikörper
zu binden, der spezifisch ist für
ein Thionin, wobei der Antikörper detektiert
wird unter Verwendung eines markierten Antikörpers (125I-markierter
Antikörper
oder ein Peroxidase-konjugierter Anti-IgG-Antikörper), der spezifisch ist für jenen
Antikörper.
Die qualitativen und quantitativen Analysen des in einer transgenen
Pflanze gemäß der vorliegenden
Erfindung eingeführten
Gens sind nicht beschränkt
auf jene durch die oben beschriebenen Verfahren durchgeführten.
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Die Erkrankungsresistenz einer transgenen
Pflanze gemäß der vorliegenden
Erfindung kann wie folgt bestimmt werden.
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Zum Beispiel werden die Blätter einer
resultierenden transgenen Pflanze mit einer Nadel oder einem Messer
vernarbt (Mock-Behandlung), wo sie mit einer Lösung, enthaltend eine pathogene
Mikrobe, inokuliert wird. Das Gebiet des Bereichs, der durch die
Infektion geschädigt
wurde, wird mit jenem einer Wildtyp-Pflanze verglichen, die derselben
Behandlung unterzogen wurde, wobei die Resistenz der transgenen
Pflanze bestimmt wird. Es wird von Fachleuten erkannt werden, dass
die Testbedingungen variieren können
in Abhängigkeit
von der zu untersuchenden Pflanzenart und/oder der verwendeten Art
der pathogenen Mikrobe. Auf den Test hin kann der Vergleich weiter
erleichtert werden durch Färben
des Gewebes oder der Zelle in einem fixierten oder lebenden Zustand
mit einem Farbstoff wie z. B. Anilinblau (Eschrich W. und Currier
H. B., Stain Technology, 39: 303– 307, 1964).
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Alternativ werden von einer transgenen
Pflanze gewonnene Samen in eine Lösung getaucht, die eine pathogene
Mikrobe enthält,
bevor sie auf einer Erde ausgesät
werden, gefolgt von dem Keimen und Wachsen lassen. Dann kann die
Anzahl der Pflanzen, die ein normales Wachstum durchmachen, mit
der Anzahl an Pflanzen verglichen werden, die ein normales Wachsmachen
durchmachen, aus den Samen einer Wildtyp-Pflanze, die derselben
Behandlung unterzogen worden war, wobei die Resistenz der transgenen
Pflanze bestimmt wird.
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Alternativ können transformierte Pflanzenzellen
und nicht transformierte Pflanzenzellen in einem Medium kultiviert
werden, zu dem eine pathogene Mikrobe für eine vorbestimmte Zeitdauer
(z. B. 3 Tage) hinzugefügt
worden war, und die Anzahl der überlebenden
Individuen kann miteinander verglichen werden, wobei die Resistenz
der transgenen Pflanze bestimmt wird.
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Es wird erkannt werden von Fachleuten,
dass das Nachweisverfahren für
die Erkrankungsresistenz der transgenen Pflanze gemäß der vorliegenden
Erfindung nicht auf jene oben beschriebenen begrenzt ist.
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Weiterhin ist es möglich, unter
Verwendung des oben beschriebenen Differenzierungs-/Induktionsvorgehens
für das
Erhalten eines Pflanzenkörpers
aus einer infizierten Zelle, weitere transgene Pflanzenkörper durch
Kultivieren der Gewebe (z. B. Wurzel, Stiel oder Blätter) oder
Organe (z. B. Wachstumspunkt oder Pollen) der transgenen Pflanze
zu erhalten, nicht über
den gewöhnlichen
Reproduktionsvorgang (das heißt
Samen). Solche Techniken und Vorgehen sind Fachleuten bekannt. Allgemeine
Verfahren für
die Gewebekultur werden in verschiedenen Versuchshandbüchern beschrieben.
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Anschließend wird die vorliegende Erfindung
im Wege besonderer Beispiele beschrieben werden; die vorliegende
Erfindung ist jedoch nicht auf solche Beispiele beschränkt.
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(Beispiel 1)
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Herstellung eines transgenen
Reises (cv. Chiyohonami)
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(1) Zubereitung eines
Thioningens
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Ein Thioningen wurde durch PCR erhalten
unter Verwendung eines cDNS-Klons eines als LTH92 bezeichneten Thioningens
(japanische Offenlegungsschrift Nr. 8-266279, supra) und unter Verwendung
eines Primerpaars, in den zusätzliche
Restriktionsstellen für
BamHI und SacI jeweils an jedes Ende einer Thionin-cDNS hinzugefügt worden
waren. Die Primer hatten die als SEQ ID Nrn. 1 und 2 gezeigten Sequenzen, die
basierend auf konservierten Bereichen (5'-Bereich und saurer Proteinbereich)
einer bekannten Thioninbasensequenz synthetisiert wurden:
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Ein System, das 0,5 Mikroliter (μl) Taq-Polymerase
(5 Einheiten pro Milliliter (U/ml)), 5 μl 10 × -Puffer (100 Millimolar (mM)
Tris (pH 8,3), 500 mM KCl, 1% TritonX100), 4 μl 2,5 mM MgCl2,
4 μl 10
mM dNTPs, 1,25 μl
jeder der obigen Primer (10 Picomol (pmol)) und ungefähr 500 Nanogramm
(ng) cDNS enthält
und das auf 50 μl
mit destilliertem Wasser aufgefüllt
wurde, wurde als das PCR-Reaktionssystem verwendet. Die Reaktionsbedingungen
der PCR waren wie folgt: Nach einer einzigen Denaturierungsreaktion
für 2 Minuten
bei 94°C wurde
ein Reaktionszyklus 25-mal wiederholt, wobei der Reaktionszyklus
eine Denaturierungsreaktion für
1 Minute bei 94°C,
eine Doppelstrangbildungsreaktion für 1 Minute bei 50°C und eine
Verlängerungsreaktion
für 2 Minuten
bei 72°C
umfasste. Schließlich
wurde eine zusätzliche
Verlängerungsreaktion
für 5 Minuten
bei 72°C durchgeführt.
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(2) Konstruktion einer
Thioninexpressionskassette und eines Thioninexpressionsvektors
-
Ein Promotorkassettenteil wurde erhalten
durch Verdauen von pE7133GUS (Mitsuhara I. et al., Plant Cell Physiol.,
37(1): 49–59,
1996) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI, Auftrennen
durch Agaroseelektrophorese und unter Verwendung von Gene Clean
II (BIO 101). Ein Vektoranteil wurde gewonnen durch Verdauen von
pBI121 (Clontech) mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI,
Auftrennen durch Agaroseelektrophorese und unter Verwendung von
Gene Clean II (BIO 101). Diese Teile wurden ligiert unter Verwendung
eines Takara Ligation Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), um pBE7133GUS
zu gewinnen.
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Als Nächstes wurde pFF19 (Timmermans,
M. C. P. et al., J. Biotechnol., 14: 333–344, 1990) mit den Restriktionsenzymen
BamHI und SacI verdaut, um ein Hygromycinphosphotransferase-(HPT)-Gen
zu isolieren, einschließend
einen CaMV 35S-Promotor
und eine CaMV S35-Terminationssequenz. Nach Behandlung des resultierenden
HPT-Genfragmentes, um stumpfe Enden zu haben, wurde eine SmaI-Linkersequenz
an das stumpf endende Fragment ligiert. Dann wurde das resultierende
HPT-Genfragment mit einem Restriktionsenzym, Cfr9I, verdaut, das
ein Isoschizomer von SmaI ist. Daran anschließend wurde dieses HPT-Genfragment
an die Cfr9I-Stelle, die am 3'-Ende
des GUS-Gens in
pBE7133GUS lokalisiert ist, eingefügt, wobei pBE7133GUS-HPT erhalten
wurde.
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Als Nächstes wurde pBE7133GUS-HPT
mit den Restriktionsenzymen BamHI und SacI verdaut, um den GUS-kodierenden
Bereich zu entfernen und das, wie oben beschrieben, erhaltene Thioningen
wurde eingefügt,
um einen Thioninexpressionsvektor pBE7133H-Thionin zu erhalten. Ein Teil innerhalb
von pBE7133H-Thionin, der sich von dem CaMV S35-Promotor (für die Regulation
des NPTII-Gens) bis zu der nos-Terminationssequenz (am 3'-Ende des HPT-Gens
belegen) erstreckt und der das Thioningen zwischen dem Promotor
und der Terminationssequenz enthält,
wird als eine Thioninexpressionskassette definiert.
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(3) Einführen der
Thioninexpressionskassette in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101
-
Der Agrobacterium tumefaciens-Stamm
EHA101 (E. Hood et al., Journal of Bacteriology, 168(3): 1291–1301, 1986)
wurde unter Schütteln über Nacht
in 5 Milliliter (ml) YEB-Medium
(0,1% Hefeextrakt, 0,5% Nährlösung, 0,5%
Pepton, 0,5% Sucrose, 0,05% MgSo4·7H2O) bei 30°C
kultiviert. Dann wurden 5 ml dieser Kultur zu 200 ml YEB-Medium in einem 1-Liter-Kolben
hinzugefügt
und weiterhin für
5 bis 6 Stunden bei 30°C kultiviert.
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Die Bakterien wurden gesammelt durch
Zentrifugation bei 4000 rpm für
5 Minuten und in 100 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert. Eine
weitere Zentrifugation wurde mit der Suspension durchgeführt und
die gesammelten Bakterien wurden in 2 ml YEB-Medium suspendiert.
In einem Mikrozentrifugenröhrchen
wurden 200 μl
dieser Suspension und 100 μl
einer DNS-Lösung,
enthaltend 0,5 μg
pBE7133H-Thionin, vermischt und in einem Bad aus Trockeneis und
Ethanol für
5 Minuten eingefroren. Dann wurde die Mischung in einem warmen Bad,
das bei 37°C
gehalten wurde, aufgetaut und für
25 Minuten gehalten.
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Anschließend wurden 2 ml YEB-Medium
zu der Mischung hinzugefügt
und die Mischung wurde unter Schütteln
bei 30°C
für 1 Stunde
kultiviert. 100 μl
der Kultur wurden übertragen
auf YEB-Medium, enthaltend Kanamycin (50 μg/ml) und Hygromycin (50 μg/ml), und
bei 30°C
für ungefähr 36 Stunden
kultiviert, wobei ein resistenter Stamm des Agrobacterium tumefaciens-Stamms
EHA101 erhalten wurde.
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Die Thioninexpressionskassette in
dem Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101 wurde durch ein alkalisches
SDS-Verfahren isoliert; die Existenz und die Struktur davon wurden
bestätigt
durch eine Restriktionsenzymanalyse.
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(4) Transformation von
Reis
-
Sterilisierte Reissamen wurden bei
27°C für 2 Wochen
auf MS-Medium kultiviert (Murashige T. et al., Physiol. Plant.,
15: 473, 1962), das 2 Milligramm pro Milliliter (mg/ml) 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (auf
die anschließend
Bezug genommen wird als "2,4-D") enthielt, wobei
Kallus gebildet wurde. Der Kallus wurde auf ein Co-Kultivierungsmedium
(das heißt
ein MS-Medium, enthaltend 2 mg/ml 2,4-D und 1 g/l Casaminosäure) übertragen
und bei 27°C
kultiviert.
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Am dritten Kulturtag wurde dem Agrobacterium
tumefaciens-Stamm EHA101, einschließlich der oben beschriebenen
Thioninexpressionskassette, ermöglicht,
in YEB-Medium zu
proliferieren, enthaltend Kanamycin und Hygromycin, und zentrifugiert.
Nachdem die Pellets der Bakterien in LB-Medium suspendiert worden waren,
wurde Acetosyringon zu der Suspension hinzugefügt, wobei eine Lösung zubereitet
wurde, die eine Agrobacterium tumefaciens-Stamm-EHA101-Lösung für die Infektion
enthielt. Diese Bakterienlösung
wurde bei 30°C
für 20
Minuten inkubiert.
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Der zuvor genannte Kallus wurde zu
der Lösung,
die den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA101 enthielt, für die Infektion
am vierten Kulturtag hinzugefügt
und sanft für
15 Minuten bei 30°C
gerührt,
wobei dem Kallus ermöglicht
wurde, infiziert zu werden. Nach Rühren für 15 Min. wurde der Kallus
gesammelt und auf einem Co-Kultivierungsmedium
platziert. Der Kallus wurde für
3 Tage mit 16 Stunden Licht pro Tag bei 27°C kultiviert und auf LB-Medium,
enthaltend Carbenicillin, bei 30°C
für 1 Stunde
kultiviert. Danach wurde nur der Kallus gesammelt und auf einem
Selektions-(Wachstums-)Medium
(das heißt
einem Co-Kultivierungsmedium, enthaltend 500 mg/l Carbenicillin
und 50 mg/l Hygromycin) platziert. Der Kallus wurde bei 27°C für 2 Wochen mit
16 Stunden Licht pro Tag kultiviert.
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Der neu gewachsene, blassgelbe Kallus
wurde auf ein Selektionsmedium (Medium zur Vorbehandlung vor der
Differenzierung) übertragen
(das heißt
ein N6-Medium, enthaltend 1 mg/l 2,4-D, 0,5 mg/l BAP, 2 g/l Casaminosäure, 20
g/l Sucrose, 30 g/l Sorbitol, 500 mg/l Carbenicillin und 100 mg/l
Hygromycin) und für
ungefähr 2
Wochen kultiviert. Anschließend
wurde der Kallus auf ein Selektions-(Redifferenzierungs-) Medium übertragen
(das heißt
ein N6-Medium, enthaltend 0,01 mg/l β-Naphthalenessigsäure (NAA), 0,1 mg/l BAP, 1
g/l Casaminosäure,
500 mg/l Carbenicillin und 100 mg/l Hygromycin). Als ein Ergebnis
wurden in ungefähr
2 bis 3 Wochen redifferenzierte transgene Reispflanzen erhalten.
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(Beispiel 2)
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Resistenztest für Reis (cv.
Chiyohonami) gegen bakteriellen Blattmehltau von Reis
-
Der Resistenztest gegen bakteriellen
Blattmehltau von Reis wurde durchgeführt unter Verwendung der Blätter aus
den ersten Generationen selbstbefruchtender Pflanzen (bezeichnet
als Linie 2-1, Linie 11-2 und Linie 13-3) von transgenem Reis, erhalten
durch Selektion unter Verwendung von Hygromycin, ebenso wie unter Verwendung
der Blätter
eines Wildtyp-Reises. Die Reisblätter
wurden an zwei Punkten mit einer kurzen Nadel vernarbt und mit einem
Bakterium beimpft, das bakteriellen Blattmehltau des Reises verursacht
(das heißt Xanthomonas
campestris pv. oryzae) unter Verwendung einer Bakteriensuspension,
die 1 × 107 cfu/ml Bakterien enthält, die den bakteriellen Blattmehltau
von Reis verursachen. Nach zweiwöchiger
Kultivierung wurden die Gebiete der jeweiligen Blätter, die
durch Infektion mit dem Bakterium, das bakteriellen Blattmehltau
an Reis verursacht, beschädigt
worden waren, auf Sicht untersucht. Als ein Index der Resistenz
gegen bakteriellen Blattmehltau von Reis wurde ein Erkrankungsindex
von bakteriellem Blattmehltau von Reis basierend auf der Blattspreiten-Nadelinokulierung
durch Noda et al. ("HOKURIKU
NOUSHI HOUKOKU" 1989)
verwendet.
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Der Wildtyp-Reis, der mit dem Bakterium,
das bakteriellen Blattmehltau von Reis verursacht, beimpft worden
war, hatte einen Erkrankungsindex von 4,4 wohingegen die Linie 2-1,
Linie 11-2 und Linie 13-3 der ersten Generationen der selbstbefruchtenden
Pflanzen des transgenen Reises, der mit dem Bakterium, das bakteriellen
Blattmehltau von Reis verursacht, beimpft worden war, Erkrankungsindizes
von 1,8, 0,8 bzw. 2,2 hatten.
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Folglich zeigte der transgene Reis
eine hohe Erkrankungsresistenz gegen bakteriellen Blattmehltau von
Reis.
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Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 gezeigt.
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1 ist
ein Diagramm, das die Resistenz gegen bakteriellen Blattmehltau
von Reis erläutert,
basierend auf Erkrankungsindizes des bakteriellen Blattmehltaus
von Reis. Acht Blätter
wurden von jedem Individuum getestet, um seinen Erkrankungsindex
des bakteriellen Blattmehltaus von Reis zu bestimmen, und ein Durchschnittswert
davon ist in dem Diagramm gezeigt.
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2 ist
eine Fotografie, die die Ergebnisse des Resistenztests zeigt. Das
obere Blatt ist ein Blatt der ersten Generation der selbstbefruchtenden
Pflanzenlinie 2-1 des transgenen Reises, beimpft mit dem Bakterium,
das bakteriellen Blattmehltau von Reis verursacht, wohingegen das
untere Blatt ein Blatt eines Wildtyp-Reises ist, beimpft mit dem
Bakterium, das bakteriellen Blattmehltau von Reis verursacht.
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(Beispiel 3)
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Resistenztest für Reis (cv.
Chiyohonami) gegen bakteriellen Samenmehltau von Reis
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Der Resistenztest gegen bakteriellen
Samenmehltau von Reis wurde durchgeführt unter Verwendung der Samen
der zweiten Generationen der selbstbefruchtenden Pflanzen (bezeichnet
Linie 2-1.1 und Linie 11-2.1) des transgenen Reises, ebenso wie
die Samen eines Wildtyp-Reises. Die Reissamen wurden dem Saugen
in einer Suspension, enthaltend 1 × 106 cfu/ml
des Bakteriums, das bakteriellen Samenmehltau von Reis (das heißt Pseudomonas
plantarii) verursacht, für
1 Stunde ausgesetzt, darin für
3 Stunden eingetaucht und über
Nacht bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Das Eintauchen der Samen
wurde bei 20°C
für 3 Tage
in einer doppelten Menge an ionenausgetauschtem Wasser bewirkt und
die Keimung wurde für
1 Tag bei 37°C unter
Bedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit forciert. Danach wurden die
Samen (24 Samen/Kleinschale) auf einer Erde für das Züchten von rohem Reis ausgesät. Die Keimung
wurde ermöglicht
für 3 Tage
unter hoher Luftfeuchtigkeit und bei dunklen Bedingungen bei 30°C und anschließend wurden
die Keimlinge in einem geschlossenen Gewächshaus kultiviert. Die Resistenz
wurde ungefähr
10 Tage nach dem Aussäen
untersucht durch Vergleichen der Anzahl der Individuen aus diesen
Samen, die ein normales Wachstum durchmachen, ebenso wie durch die
Rate der Keimlingserrichtung.
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In dem Fall, wo die Samen des Wildtyp-Reises
mit dem Bakterium infiziert wurden, das bakteriellen Samenmehltau
von Reis verursacht, verwelkten sämtliche Individuen bald nach
der Keimung. Auf der anderen Seite zeigten, in dem Fall, wo die
Samen der zweiten Generation der selbstbefruchtenden Pflanzenlinie
2-1.1 des transgenen Reises mit dem Bakterium, das bakteriellen
Samenmehltau von Reis verursacht, infiziert worden waren, die ausgesäten Samen
eine Keimlingserrichtungsrate von 75% und durchliefen ein normales Wachstum.
Auch in dem Fall, wo die zweite Generation die selbstbefruchtende
Pflanzenlinie 11-2.1 des transgenen Reises war, zeigten die ausgesäten Samen
eine Sämlingserrichtungsrate
von 96% und durchliefen ein ähnlich
normales Wachstum. Folglich zeigte der transgene Reis eine hohe
Erkrankungsresistenz gegen bakteriellen Samenmehltau von Reis.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
und 3 gezeigt.
-
3 ist
eine Fotografie, welche die Ergebnisse des Resistenztests zeigt.
Die Pflanze auf der linken Seite (positive Kontrolle) ist ein Wildtyp-Reis,
der nicht mit dem Bakterium, das bakteriellen Samenmehltau von Reis
verursacht, beimpft worden war; die Pflanze in der Mitte ist eine
transgene Reislinie 2-1.1, die mit dem Bakterium beimpft worden
war, das bakteriellen Samenmehltau von Reis verursacht; und die
Pflanze auf der rechten Seite (negative Kontrolle) ist ein Wildtyp-Reis,
der mit dem Bakterium, das bakteriellen Samenmehltau von Reis verursacht,
beimpft worden war.
-
Tabelle
1
Resistenz des transgenen Reises, der das Thionin gegen bakteriellen
Samenmehltau von Reis exprimiert
-
(Beispiel 4)
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Erzeugung von transgenem
Tabak (Nicotiana tabacum Sammsun NN)
-
Ein Thioningen wurde zubereitet und
eine Thioninexpressionskassette und ein Thioninexpressionsvektor
wurden auf dieselbe An und Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben,
konstruiert.
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(1) Einführung einer
Thioninexpressionskassette in Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404
-
Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404
(Clontech) wurde bei 28°C
in LB-Medium (10 g/l Bactotripton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl
(pH 7,2)), enthaltend 250 μg/ml
Streptomycin und 50 μg/ml
Rifampicin, kultiviert. Eine Bakteriensuspension des Agrobacterium
tumefaciens-Stamm LBA4404 wurde zubereitet unter Befolgung des Verfahrens
von Nagel et al. (Microbiol. Lett., 67, 325 (1990)) und der in Beispiel
1(2) zubereitete Thioninexpressionsvektor pBE7133H-Thionin wurde
in diesem Bakterienstamm durch Elektroporation eingeführt.
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Die Thioninexpressionskassette im
Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 wurde isoliert durch ein
basisches SDS-Verfahren; die Existenz und Struktur davon wurden
bestätigt
durch eine Restriktionsenzymanalyse.
-
(2) Transformation von
Tabak
-
Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404,
der die Thioninexpressionskassette einschloss und der wie oben beschrieben
erhalten wurde, wurde unter Schütteln über Nacht
in YEB-Medium bei 28°C
kultiviert. Ein Blatt einer Tabakpflanze, das vollständig ausgebreitet
war, wurde abgeschnitten und sterilisiert. Das sterilisierte Blatt
wurde mit einem Locher geschnitten, wobei eine Blattscheibe hergestellt
wurde.
-
Die Blattscheibe wurde in die zuvor
genannte Kulturmediumlösung
(20 × mit
sterilisiertem Wasser verdünnt)
eingetaucht und es wurde ihr ermöglicht,
für 1 bis
2 Minuten sanft einzudringen. Nach dem Eindringen wurde die Blattscheibe
in MS-Medium bei
27°C für 2 Tage
kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Blattscheibe auf MS-Agarmedium übertragen,
enthaltend Carbenicillin, und unter Belichtung bei 26°C für 1 Woche
kultiviert, wobei der Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 von
der Blattscheibe entfernt wurde.
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Die Blattscheibe, von welcher der
Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 entfernt worden war, wurde
alle 2 Wochen auf einem MS-Agarmedium, enthaltend Carbenicillin,
Kanamycin und Hygromycin, subkultiviert und eine transformierte
Blattscheibe wurde selektiert. Ein Kallus wurde in dieser transformierten
Blattscheibe durch ein gewöhnliches
Verfahren induziert und in einen Tabakpflanzenkörper redifferenziert.
-
(Beispiel 5)
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Resistenztest für Tabak
(Nicotiana tabacum Sammsun NN) gegen die Braunfäule an Kartoffeln
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Der Resistenztest gegen die Braunfäule an Kartoffeln
wurde durchgeführt
unter Verwendung der Blätter
der transgenen Tabakpflanzen (bezeichnet als Linien 4, 5, 15, 18,
41 und 44), erhalten wie oben beschrieben, ebenso wie die Blätter einer
Wildtyp-Tabakpflanze.
Ein Pilz, der die Braunfäule
an Kartoffeln verursacht (das heißt Phytophthora infestans),
wurde auf PDA-Medium (Tifco) bei 18°C bis 20°C für ungefähr 1 Woche kultiviert und die
resultierenden Kolonien wurden mit einem Korkstecher (engl.: cork
bowler) (Durchmesser: 3 mm) ausgestochen, wobei Agarblocks zubereitet
wurden mit dem Pilz, der die Braunfäule an Kartoffeln verursacht.
Der Agarblock wurde auf dem obigen Blatt in solch einer Weise platziert,
dass die Kolonie und das Blatt in Kontakt miteinander waren, wobei
dem Blatt ermöglicht
wurde, mit dem Pilz, der die Braunfäule an Kartoffeln verursacht,
beimpft zu werden, und bei 27°C
gehalten. Nach 2 oder 3 Tagen wurde das Gebiet des erkrankten Flecks
auf dem Blatt auf Sicht untersucht.
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Der erkrankte Fleckbereich auf dem
Blatt des Wildtyp-Tabaks, der mit dem Pilz, der die Braunfäule an Kartoffeln
verursacht, beimpft worden war, betrug 976 mm2.
Das erkrankte Fleckgebiet auf dem Blatt des transgenen Tabaks, das
mit dem Pilz, der die Braunfäule
an Kartoffeln verursacht, beimpft worden war, betrug 48 mm2 für
die Linie 4,57 mm2 für die Linie 44 und 40 mm2 für
die Linie 18. Weiterhin erfuhren die Linien 5,15 und 41 im Wesentlichen
keine Schädigung
durch den Pilz, der die Braunfäule
an Kartoffeln verursacht. Folglich zeigten die transgenen Tabakpflanzen
eine hohe Erkrankungsresistenz gegen Braunfäule an Kartoffeln.
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Die Ergebnisse sind in den 4 und 5 gezeigt.
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4 ist
ein Diagramm, das die Resistenz gegen Braunfäule an Kartoffeln erläutert, basierend
auf dem erkrankten Fleckgebiet. Vier Punkte wurden auf dem Blatt
von jedem Individuum untersucht und ein Mittelwert des erkrankten
Fleckgebiets, wegen dem Pilz, der die Braunfäule an Kartoffeln verursacht,
ist in de, Diagramm gezeigt.
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5 ist
eine Fotografie, die die Ergebnisse des Resistenztests zeigt, wobei
die Zustände
der jeweiligen Individuen 3 Tage nach der Beimpfung mit dem Pilz,
der die Braunfäule
an Kartoffeln erzeugt, erläutert werden.
Die beiden Blätter
auf der linken Seite sind Blätter
einer Wildtyp-Tabakpflanze, beimpft mit dem Pilz, der die Braunfäule an Kartoffeln
verursacht, wohingegen die beiden Blätter auf der rechten Seite
die jeweiligen Blätter
der transgenen Tabaklinien 4 (M7TH4) und 5 (M7TH5) sind, die mit
dem Pilz, der durch Braunfäule
an Kartoffeln erzeugt, beimpft wurden.
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Ein Verfahren für die Erzeugung einer Pflanze
ist durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Die vorliegende
Erfindung kann eine Anzahl an hochqualitativen Pflanzenarten, die
gewöhnlich
für Erkrankungen empfänglich waren,
mit einer hohen Erkrankungsresistenz ergeben, wobei die stabile
Produktion hochqualitativer Pflanzenarten erleichtert wird. Die
verbesserte Erkrankungsresistenz macht es auch möglich, das Verlassen auf landwirtschaftliche
Chemikalien für
die Ausrottung pathogener Mikroben zu reduzieren. Folglich trägt die vorliegende
Erfindung stark zur landwirtschaftlichen Produktion bei.
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