DE19852757A1 - Promotoren zur Genexpression in Wurzeln von Pflanzen - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung stellt Promotoren bereit, die eine wurzelspezifische Expression von ihnen kontrollierter codierender Nukleotidsequenzen bewirken und Expressionskassetten, rekombinante Vektoren und Mikroorganismen, die solche Promotoren umfassen. Ferner werden transformierte transgene Pflanzen beschrieben, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verfahren zur Isolierung wurzelspezifischer Promotoren.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Promotoren, die eine wurzelspezifische Expression von
ihnen kontrollierter codierender Nukleotidsequenzen bewirken, zur gewebespezifischen
Genexpression in Pflanzen, Expressionskassetten, rekombinante Vektoren und
Mikroorganismen, die solche Promotoren umfassen, damit transformierte transgene
Pflanzen, ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen sowie ein Verfahren zur
Isolierung wurzelspezifischer Promotoren.
Nachfolgend werden Dokumente aus dem Stand der Technik zitiert, deren
Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten ist.
Der Einsatz von Pflanzen, die mit Hilfe gentechnischer Verfahren in ihrem Erbgut verändert
wurden, hat sich in vielen Bereichen der Landwirtschaft als vorteilhaft und oft als der einzige
Weg erwiesen, bestimmte Eigenschaften auf Nutzpflanzen zu übertragen. Die vornehmlichen
Ziele sind zum einen der Pflanzenschutz und zum anderen eine Qualitätssteigerung der
erntbaren Produkte.
Es sind zahlreiche Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler
Pflanzen bekannt (vgl. u. a. Gasser und Fraley, Science 244 (1989), 1293-1299; Potrykus,
Ann. Rev. Plant mol. Biol. Plant Physiol. 42 (1991), 205-225). Alle Verfahren basieren auf
der Übertragung von Genkonstrukten, die in den meisten Fällen Neukombinationen von
bestimmten codierenden Regionen von Strukturgenen mit Promotorregionen anderer
Strukturgene, sowie Transkriptionsterminatoren darstellen.
Die Bereitstellung von Promotoren ist dabei von großer Bedeutung für die Herstellung von
transgenen Pflanzen, da die Spezifität eines Promoters ausschlaggebend dafür ist, zu
welchem Zeitpunkt, in welchen Gewebetypen und in welcher Intensität ein gentechnisch
übertragenes Strukturgen exprimiert wird.
Eine Vielzahl von Promotoren, die die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern, ist
bekannt. Der am häufigsten verwendete Promotor ist der 35S CaMV-Promotor (Franck et al.,
Cell 1 (1980), 285-294), der zu einer konstitutiven Expression des eingeführten Gens führt.
Häufig werden aber auch induzierbare Promotoren eingesetzt (Wundinduktion, DE-A-38 43 628;
chemische Induktion (Ward et al., Plant Molec. Biol. 22 (1993), 361-366),
Lichtinduktion (Fluhr et al., Science 232 (1986), 1106-1112).
Auch die Verwendung zell- und gewebespezifischer Promotoren wurde beschrieben:
schließzellenspezifische Genexpression, DE-A-42 07 358; samen-, knollen- und
fruchtspezifische Genexpression, zusammengefaßt in Edwards and Coruzzi, Annu. Rev. Genet. 24
(1990), 275-303, DE-A-38 43 627); phloemspezifische Genexpression (Schmülling
et al., Plant Cell 1 (1989), 665-670); wurzelknöllchenspezifische Genexpression (DE-A-37 02 497);
meristemspezifische Genexpression (Ito et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 863-878).
Beispiele für Promotoren, die die Genexpression in Wurzel vermitteln, sind der Class-II-
patatin-Promotor (Köster-Töpfer et al., Mol. Gen. Genet. 219, (1989) 390-396), der nach
Fusion mit dem Reportergen des beta-Glucuronidase (GUS)-Gens eine hohe Expression in
Kartoffelknollen und in bestimmten Zellschichten von Wurzelspitzen zeigt. Auch GUS-
Fusionsexperimente mit dem Agropinesynthase-Promotor (ags) (Inoguchi et al., Plant Phys. 149
(1996) 73-78) zeigten eine hohe GUS-Aktivität vor allem in Wurzeln. Transgene
Arabidopsis-Pflanzen enthaltend ein AKT1 (= Kaliumkanal)-GUS-Konstrukt (Lagarde et al.,
Plant J. 9 (1996), 195-203) führten vor allem zu einer Expression in äußeren Zellschichten
reifer Wurzelabschnitte. Auch ein 636 bp langer Abschnitt des 5'-Bereiches des TobRB7
(= Wasserkanal)-Gens (Yamamoto et al., Plant Cell 3, (1991), 371-382) vermittelte eine
wurzelspezifische GUS-Expression in transgenen Tabakpflanzen. Ferner wurden GUS-
Fusionsexperimente mit dem Promotor eines Extensingens beschrieben, wobei GUS-
Aktivität in Sojabohnenkeimlingen in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium im
Hypocotyl und in der Wurzel bzw. spezifischen Zonen der Wurzel nachgewiesen werden
konnte (Ahn et al., Plant Cell, 8, (1996), 1477-1490).
Die Verwendung der beschriebenen Promotoren ist oft problematisch. Promotoren, die eine
konstitutive Expression der von ihnen kontrollierten Gene bewirken, können beispielsweise
zur Erzeugung herbizidtoleranter und pathogenresistenter Pflanzen eingesetzt werden, haben
aber den Nachteil, daß die Produkte der von ihnen kontrollierten Gene in allen Teilen der
Pflanze vorliegen, auch in den geernteten Pflanzenteilen, was in manchen Fällen
unerwünscht sein kann. Induzierbare Promotoren sind gleichfalls nicht unproblematisch, da
die Induktionsbedigungen bei landwirtschaftlich genutzten Pflanzen im Freiland
typischerweise schwer kontrollierbar sind.
Darüberhinaus ist es zur Bewältigung verschiedener Ansätze der genetischen Veränderung
von Pflanzen erforderlich, Gene, die unterschiedlich reguliert werden sollen, unter die
Kontrolle verschiedener Promotoren zu stellen. Es ist daher notwendig, verschiedene
Promotorsysteme mit unterschiedlicher Spezifität zur Verfügung zu stellen.
Promotoren, die die Genexpression in Wurzeln regulieren sind bisher nur in begrenzter Zahl
bekannt. Zur Bewältigung bestimmter Ansätze der genetischen Veränderung von Pflanzen ist
es erforderlich, weitere, alternative Promotorsysteme zur Genexpression in Wurzeln zur
Verfügung zu stellen, die im Vergleich zu den bekannten Systemen unterschiedlich reguliert
sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel bereitzustellen, die
eine organspezifische Genexpression von Pflanzen ermöglichen. Diese Mittel sollten
beispielsweise zur Expression von Genen, die die Aufnahme von Nährstoffen aus dem
Boden beeinflussen, und von Genen, die das Wurzelwachstum modifizieren, geeignet sein.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen
charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Promotor, ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus
- a) Promotoren, die die unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebene Nucleinsäuresequenz umfassen;
- b) Promotoren, die einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleinsäuresequenz umfassen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken;
- c) Promotoren, die eine Sequenz aufweisen, die mit einer der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten hybridisiert, und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; und
- d) Promotoren von Genen, die Proteine codieren deren Aminosäuresequenzen eine Homologie von mindestens 60% zu der unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweisen, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Promotoren solche von
pflanzlichen Genen oder von solchen abgeleitet.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Promotor eine DNA-
Sequenz verstanden, die den regulatorischen Anteil eines Gens, vorzugsweise eines
Strukturgens, umfaßt. Unter dem regulatorischen Anteil eines Gens wird derjenige Anteil
verstanden, der die Expression des Gens bestimmt. Ein regulatorischer Anteil besitzt ein
Sequenzmotiv, an dem Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerase assemblieren und die
Transkription des codierenden Anteils des Gens einleiten. Darüber hinaus kann der
regulatorische Anteil ein oder mehrere positive regulatorische Elemente, sogenannte
Enhancer umfassen. Er kann zusätzlich oder an deren Stelle aber auch negativ regulatorische
Elemente, sogenannte Silencer enthalten. Unter einem Strukturgen wird eine genetische
Einheit aus regulatorischem und codierendem Anteil verstanden, deren Genprodukt ein
Protein ist. Die Information für die primäre Aminosäuresequenz des Proteins ist im
codierenden Anteil des Strukturgens enthalten, während der regulatorische Anteil bestimmt,
wann und in welchen Geweben zu welchen Mengen das Transkript des codierenden Anteils
gebildet wird, nach dessen Vorlage das Genprodukt synthetisiert wird. Die
erfindungsgemäßen Promotoren können beispielsweise aus pflanzlichen Genen stammen,
durch rekombinante DNA-Techniken modifiziert sein und/oder synthetisch hergestellt
werden.
Unter dem Begriff wurzelspezifisch versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung,
daß ein unter der Kontrolle eines erfindungsgemäßen Promotors stehendes Fremdgen in den
Wurzeln exprimiert wird. Insbesondere ist Wurzelspezifität im Rahmen der vorliegenden
Erfindung auch dann gegeben, wenn der erfindungsgemäße Promoter die Expression eines
Fremdgens in den Wurzeln, insbesondere in den Wurzelhaaren im Vergleich zu maturen
Blättern begünstigt und in Wurzeln, insbesondere in Wurzelhaaren eine signifikant, wie
beispielsweise mindestens 2- bis 5-fach, bevorzugt 5- bis 10-fach, besonders bevorzugt 10- bis
100-fach, erhöhte Expression bewirkt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann Wurzelspezifität durch
Reportergen-Experimente analysiert werden. Zur Testung einer isolierten Promotorsequenz
auf Promotoraktivität in Wurzeln bzw. in Wurzelhaaren kann der Promotor beispielsweise in
einer Expressionskassette bzw. in einen Vektor zur Pflanzentransformation operativ mit
einem Reportergen, wie z. B. dem β-Glucuronidasegen aus E. coli, verknüpft werden. Dieses
Konstrukt wird zur Transformation von Pflanzen verwendet. Anschließend wird die
Expression der β-Glucuronidase in Wurzeln und/oder Wurzelhaaren im Vergleich zu
maturen Blättern bestimmt, wie z. B. bei Martin et al. (The GUS Reporter System as a Tool
to Study Plant Gene Expression in: GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of
Gene Expression, Academic Press (1992), 23-43) beschrieben.
Der Begriff Wurzel ist dem Fachmann geläufig. Ergänzend sei verwiesen auf Strasburger
(Lehrbuch der Botanik für Hochschulen: Begr. v. Eduard Strasburger u. a. Neubearb. v. Peter
Sitte, Hubert Ziegler u. a. 34. Aufl. 1998, Fischer (Gustav)-Verlag, Stuttgart).
Wurzelhaare sind in der Regel schlauchförmige, sehr dünnwandige Ausstülpungen der
Wurzelepidermiszellen (Rhizodermis). Ihre Länge schwankt. Sie vergrößern die
wasseraufnehmende Oberfläche der Wurzel sehr wirksam (z. B. bei Pisum auf etwa das 12fache)
und haben daher für das Wachstum und die Entwicklung höherer Pflanzen eine große
Bedeutung. Durch umfangreiche elektrophysiologische und molekulare Untersuchungen
verschiedener ionenselektiver Membrantransportsysteme der Wurzelhaare (Jones et al.,
Planta 197 (1995) 672-680; Lagarde et al., Plant J. 9 (1996), 195-203; Lauter et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 8139-8144; Schiefelbein et al., Planta 187 (1992), 455-459)
konnte gezeigt werden, daß die Wurzelhaare einen großen Einfluß auf die Wasser- und
Nährstoffaufnahme aus dem Boden haben.
Bei vielen Arten liefert jede Rhizodermiszelle ihr eigenes Wurzelhaar, das in vielen Fällen
gewöhnlich nicht genau in der Mitte der Zelle, sondern etwas in Richtung auf die
Wurzelspitze verschoben hervortritt. In anderen Fällen entstehen auch die Wurzelhaare der
Rhizodermis durch inäquale Zellteilungen aus dem zuvor einheitlichen meristematischen
Protoderm. Die Inäqualität äußert sich zunächst darin, daß die potentiellen Haarbildner
(Trichoblasten) kleiner sind, aber ein dichteres Plasma aufweisen als die normalen
Rhizodermiszellen. Ihre Kerne sind oft stärker färbbar und durch Endomitosen polyploid.
Bei anderen Arten wechseln Trichoblasten und Atrichoblasten auf der Rhizodermis in
regelmäßigem Muster ab. Die Trichoblasten offenbaren ihren Charakter als meristemoide
manchmal durch erhöhte Teilungsaktivität, so daß die Wurzelhaare nicht einzeln, sondern zu
mehreren gebüschelt auftreten.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein Promotor mit der unter Seq ID No. 1,
SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6
dargestellten Nukleotidsequenz in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von
ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirkt.
Diese Beobachtung ist insbesondere überraschend, weil ein genomisches Fragment (s. Seq
ID No. 13) der Promotorregion (s. Beispiel 2), welches im Vergleich zur Seq ID No. 1 um
ca. 1000 bp verlängert ist, keine wurzelspezifische GUS-Expression vermitteln kann. Nur im
Vergleich zum großen Fragment (s. Seq ID No. 13) verkürzte Promotorfragmente (s. SEQ ID
No. 1 bis 6), die wie in Beispiel 3C beschrieben hergestellt wurden, führen zu einer
wurzelspezifischen Genexpression einer vom Promotor kontrollierten codierenden
Nucleotidsequenz.
Untersucht man die Sequenz der cDNA (s. Seq. ID No. 7) so findet man im 5'-Bereich,
upstream vom eigentlichen ATG (Seq ID No. 7 bp 256), weitere (1. ca. 210 bp upstream: s.
bp 42 von Seq ID No. 7; 2. ca. 190 bp upstream: s. bp 65 von Seq ID No. 7; 3. ca. 110 bp
upstream: s. bp 142 von Seq ID No. 7) Translations-Initiations-Codons (ATG), die zu
mehreren upstream open reading frames (uORFs) führen. Die Anwesenheit solcher uORFs
kann einen negativen Einfluß auf die Translationsrate spezifischer mRNAs haben. Die
verschiedenen Promotorfragmente wurden daher so konstruiert, daß sie diesen 5'-upstream-
Bereich (s. Seq. ID No. 7 bp 1-255) nicht umfassen.
Der erfindungsgemäße Promotor erlaubt nun eine wurzelspezifische Genexpression einer
vom Promotor kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz. Er stellt eine interessante
Alternative zu anderen wurzelspezifischen Promotoren dar, weil er die Genexpression in
Wurzelhaaren vermitteln kann. Aufgrund der größeren Oberfläche der Wurzelhaare im
Vergleich zur Wurzel kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Promotors die Expression von
solchen Genen effektiver manipuliert werden, deren Genprodukte beispielsweise den
Transport von Nährstoffen und Metaboliten durch die Wurzelhaarzellen vermitteln.
Vielfältige Verwendungsmöglichkeiten stehen für den erfindungsgemäßen Promotor zur
Verfügung. Beispielsweise kann man sich die Herstellung transgener Pflanzen vorstellen, die
aufgrund eines modifiziertem Wurzelhaarmetabolismus, der einen positiv Einfluß auf die
Flora der Wurzelumgebung (Rhizosphäre) ausübt, einen erhöhten Ertrag zeigen.
Darüberhinaus kann man die erfindungsgemäßen Promotoren zur wurzelspezifischen
Expression solcher Gene verwenden, die die Aufnahme beispielsweise von
Schwermetallionen aus kontaminierten Böden vermitteln. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Promotors wäre es somit möglich transgene Pflanzen herzustellen, die bei der
Phytoremediation eingesetzt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erlauben die erfindungsgemäßen
Promotoren die Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz in
spezifischen Wurzelzellen, wie z. B. in Wurzelzellen der Primärwurzel, in Wurzelhaaren der
Primärwurzel, in Wurzelzellen der Wurzelspitze oder in Wurzelhaaren der Primärwurzel
unterhalb des Hypocotyls, zu bewirken.
Neben einem Promotor, der die gesamte unter Seq ID No. 1, Seq ID No. 2, SEQ ID No. 3,
SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellten Sequenz aufweist, betrifft die
vorliegende Erfindung auch Promotoren, die einen funktionalen Teil dieser Sequenz
aufweisen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen
kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
Unter einem funktionalen Teil versteht man in diesem Zusammenhang solche Sequenzen,
welche trotz abweichender Nucleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, wie z. B.
Promotoraktivität und Gewebe- oder Organspezifität besitzen. Ein Maß für die
Promotoraktivität ist beispielsweise die für ein bestimmtes Markergen, das unter der
regulativen Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors steht, ermittelte Expressionsrate.
Beispiele für geeignete Markergene sind das beta-Glucuronidase-(GUS)-Gen aus E. coli oder
das Green-Fluorescence-Protein-(GFP)-Gen (Baulcombe et al., Plant J. 7 (16) (1993), 1045-1053).
Die Organ- bzw. Gewebespezifität läßt sich leicht durch Vergleich der an einzelnen
Geweben bzw. Organen der Pflanze ermittelten Expressionsraten für obige Markergene
bestimmen. Funktionale Teile der Promotorsequenzen umfassen im Rahmen der
vorliegenden Erfindung natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen
Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an die Codon-Usage
einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotidsequenzen.
Unter einem funktionalen Teil versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche
Mutationen einer ursprünglich isolierten Promotorsequenz, welche weiterhin die
gewünschten Funktionen zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen,
Deletionen, Vertauschungen und/oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit
werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit
umfaßt, welche man durch Modifikation der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3,
SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nukleotidsequenz erhalten
kann. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin
enthaltenen Promotorsequenz, oder z. B. auch die Einfügung weiterer
Restriktionsschnittstellen sein.
Funktionale Teile einer Promotorsequenz umfassen auch solche Promotorvarianten, deren
Promotoraktivität, verglichen mit dem Wildtyp, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Prinzipiell wird die Aktivität eines eukaryontischen RNA-Polymerase II-Promotors durch
das synergistische Zusammenwirken verschiedener trans-aktiver Faktoren (DNA-
Bindeproteine) bedingt, welche an die verschiedenen im Promotor vorhandenen cis-
regulatorischen DNA-Elemente binden. Diese Faktoren wechselwirken direkt oder indirekt
mit einzelnen oder mehreren Faktoren der basalen Transkriptionsmaschinerie, was letztlich
zur Ausbildung eines Präinitiationskomplexes in der Nähe der Transkriptionsstartstelle führt
(Drapkin et al., 1993, Current Opinion in Cell Biology 5: 469-476). Man kann von einem
modularen Aufbau eukaryontischer RNA-Polymerase II-Promotoren sprechen, wobei
verschiedene cis-Elemente (Module) jeweils als Teilkomponenten die Gesamtaktivität des
Promotors determinieren (Tjian und Maniatis, 1994, Cell 77, 5-8). Verdeutlicht wurde dieser
modulare Aufbau beispielsweise durch Promotorstudien mit dem Blumenkohl-Mosaik-
Virus-(CaMV)-35S-Promotor (Benfey und Chua, 1990 Science 250: 959-966, Benfey et al.,
1990, EMBO J.9: 1677-1684 Benfey et al., 1990, EMBO J. 9: 1685-1696). Aufgrund der
unterschiedlichen Gewebespezifität, die verschiedene Restriktions-Subfragmente des -343
bis +8 (relativ zur Transkriptionsstartstelle) Promotors in transgenen Tabakpflanzen
vermitteln, wurde der Promotor in 6 Subdomänen aufgeteilt. Die starke, konstitutive
Expression, die der vollständige Promotor vermittelt, ist also in gewebespezifische
Teilaktivitäten sektionierbar.
Einzelne, potentiell Gewebespezifität vermittelnde Subdomänen des erfindungsgemäßen
Promotors können beispielsweise durch Fusion mit einer Minimalpromotor-Reportergen-
Kassette identifiziert werden. Unter einem Minimalpromotor versteht man eine DNA-
Sequenz, die eine TATA-Box, die sich etwa 20 bis 30 Basenpaare stromaufwärts von der
Transkriptionsstarstelle befindet, oder eine Initiatorsequenz (Smale und Baltimore, Cell 57,
(1989), 103-113; Zawel und Reinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. 44, (1993), 67-108; Conaway
und Conaway, Annu. Rev. Biochem 62 (1993), 161-190) umfaßt. Beispiele für
Minimalpromotoren sind beispielsweise der -63 bis +8 Δ35S-Promotor (Frohberg 1994,
Dissertation an der FU Berlin FB Biologie), der -332 bis +14 Minimal-Patatin-ClassI-
Promotor sowie der -176 bis +4-Minimal-PetE-Promotor (Pwee et al., Plant J. 3, (1993),
437-449).
Desweiteren können solche Subdomänen bzw. cis-Elemente des erfindungsgemäßen
Promotors auch über Deletionsanalysen bzw. Mutagenesen identifiziert werden (Kawagoe et
al., 1994, Plant J. 5(6): 885-890). Der Test auf Funktionalität einer solchen Subdomäne oder
cis-Elements kann in planta durch den Nachweis der Reportergenaktivität in transformierten
Zellen erfolgen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht man unter dem
funktionalen Teil der Promotorsequenz auch solche Subdomänen bzw. cis-Elemente der
unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ
ID No. 6 angegebenen Nucleotidsequenzen, die eine Wurzelspezifität vermitteln.
Ferner kann die Wirksamkeit einer Subdomäne oder eines cis-Elementes durch
Multimerisierung deutlich verstärkt werden. Im Falle des CaMV-35S-Promotors führte
beispielsweise die Dimerisierung eines 250 bp großen Fragmentes in Tandemanordnung zu
einer Verzehnfachung der Promotoraktivität (Kay et al., 1987, Science 230: 1299-1302). Im
Falle der Subdomäne B5 des CaMV-35S-Promotors zeigte sich eine deutliche
Aktivitätssteigerung des Promotorkonstruktes für den Fall, daß diese Domäne als Tetramer
und nicht als Monomer vorlag (Benfey et al., 1990, EMBO J. 9: 1685-1696).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher insbesondere
auch Di- und Multimere von Subdomänen bzw. cis-Elementen der unter SEQ ID No. 1, SEQ
ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen
Nucleotidsequenzen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Erhöhung der Promotoraktivität
im Vergleich zum Wildtyp durch die Kombination des erfindungsgemäßen Promotors mit
einem sogenannten Enhancer erreicht.
In der Literatur sind verschiedene Enhancer beschrieben worden, die in der Regel eine
gewebespezifische Erhöhung der Expression bewirken, wobei die Gewebespezifität in der
Regel durch den jeweils verwendeten Enhancer determiniert wird (Benfey et al., Science
250, (1990), 959-966; Benfey et al., EMBO J 8, (1989), 2195-2202; Chen et al., EMBO J 7,
(1988), 297-302; Simpson et al., Nature 323, (1986), 551-554).
Darüberhinaus gibt es auch Enhancer, wie z. B. den PetE Enhancer (Sandhu et al., Plant Mol. Biol. 37
(1998), 885-896), die nicht gewebespezifisch wirken und somit als reine
quantitative Verstärkerelemente vor den erfindungsgemäßen Promotor gesetzt werden
können, um die Expression in Wurzeln und/oder Wurzelhaaren quantitativ zu erhöhen, ohne
die Qualität der Gewebespezifität des erfindungsgemäßen Promotors zu verändern.
Ein wurzelspezifischer Enhancer, der auf der Multimerisierung einer bestimmten Box (Box
II) basiert, wurde beispielsweise beschrieben in "DNA-Protein Interactions in the Auxin
regulated Promoter of T-DNA gene 5", Autor: Sirpa Nuotio, Acta Universitatis Ouluensis, A
Scientiae Rerum Naturalium 299 (1997), Oulu University press, S. 38 ff.". Ferner können
auch synthetische Enhancer verwendet werden, die beispielsweise von natürlich
vorkommenden Enhancern abgeleitet sind und/oder durch Kombination verschiedener
Enhancer erhalten werden.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die eine Nukleotidsequenz
aufweisen, die mit der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4,
SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten Nucleotidsequenz hybridisieren und die in
Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden
Nucleotidsequenz bewirken. Bevorzugt hybridisieren solche Sequenzen unter stringenten
Bedingungen mit der unter unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4,
SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellten Sequenz.
Der Ausdruck "stringente Bedingungen" bedeutet dabei vorzugsweise
Hybridisierungsbedigungen, wie sie beispielsweise beschrieben sind in Sambrook et al.
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY). Insbesondere findet Hybridisierung unter den folgenden
Bedingungen statt:
Hybridisierungspuffer: 2 × SSC; 10 × Denhardt's Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1 : 1 : 1); 0.1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 µg/ml Heringsperma- DNA; 50 µg/ml tRNA; oder 0.25 M Natriumphosphatpuffer pH 7.2, 1 mM EDTA, 7% SDS
Hybridisierungstemperatur T = 65 bis 68°C
Waschpuffer 0.2 × SSC; 0.1% SDS
Waschtemperatur T = 65 bis 68°C
Hybridisierungspuffer: 2 × SSC; 10 × Denhardt's Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1 : 1 : 1); 0.1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 µg/ml Heringsperma- DNA; 50 µg/ml tRNA; oder 0.25 M Natriumphosphatpuffer pH 7.2, 1 mM EDTA, 7% SDS
Hybridisierungstemperatur T = 65 bis 68°C
Waschpuffer 0.2 × SSC; 0.1% SDS
Waschtemperatur T = 65 bis 68°C
Vorzugsweise weisen derartige Promotoren eine Sequenzidentität von mindestens 30%,
bervorzugt von mindestens 40%, bevorzugt von mindestens 50% besonders bevorzugt
mindestens 60%, insbesondere bevorzugt von mindestens 70% und vorteilhafterweise von
mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens
95% zu der unter Seq ID No. 1 gezeigten Promotorsequenz oder Teilen davon auf. Derartige
Promotorsequenzen stammen vorzugsweise aus pflanzlichen Organismen, bevorzugt aus
höheren Pflanzen, besonders bevorzugt aus dikotylen Pflanzen, insbesondere bevorzugt aus
Pflanzen der Gattung Lycopersicon.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der erfindungsgemäße Promotor,
die gesamte unter Seq ID No. 3 (= ca. 1.4 kb-Fragment), Seq ID No. 4 (= ca. 1.1 kb-
Fragment), SEQ ID No. 5 (= 0.9 kb-Fragment) oder SEQ ID No. 6 (= 0.55 kb-Fragment)
dargestellten Sequenz auf.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die einen funktionalen Teil
dieser Sequenzen aufweisen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von
ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der erfindungsgemäße
Promotor die gesamte oder einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 4 (= 1.1 kb-
Fragment) dargestellte Sequenz auf.
Ohne daran zu denken an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß
der unter Seq ID No. 1, Seq ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder
SEQ ID No. 6 gezeigte Promotor von einem pflanzlichen Gen stammt, das zu einer Gruppe
extensinähnlicher Proteine gehört.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Promotoren von Genen, die ein Protein,
vorzugsweise aus der Gruppe der extensinähnlichen Proteine, codieren und die eine
Homologie d. h. Identität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 70%,
bevorzugt von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere
von mindestens 95% zu der gesamten unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz
aufweisen, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische einer von ihnen
kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
Die unter Seq ID No. 7 dargestellte Nucleotidsequenz codiert ein Polypeptid (SEQ ID No. 8)
aus L. esculentum, von dem angenommen werden kann, daß es der Gruppe der
extensinähnlichen Proteine zuzurechnen ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem extensinähnlichen
Protein ein pflanzliches Protein verstanden, dessen Aminosäuresequenz mindestens eines der
folgenden Sequenzmotive aufweist: SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY, PPPPPYY,
PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPXY, SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK,
SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH,
SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK,
SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP.
Insbesondere solche pflanzlichen Proteine, die mindestens eines in der SEQ ID No. 8
enthaltenen SPPPP- und/oder (P)PPPPYY-Motive aufweist, werden im Rahmen der
vorliegenden Erfindung als extensinähnlich bezeichnet.
DNA-Sequenzen, die Homologie zu der unter Seq ID No. 7 gezeigten Sequenz aufweisen,
können zum einen beispielsweise durch computergestütze Sequenzvergleiche mit bekannten
Sequenzen identifiziert werden oder auch durch Durchmusterung von beispielsweise cDNA-
oder genomischen Bibliotheken mit der unter Seq ID No. 7 dargestellten Sequenz oder
Teilen davon. Derartige Techniken sind dem Fachmann bekannt (Siehe z. B. Sambrook et al
(loc cit.)). Gleichalls können computergestützte Sequenzvergleiche auch auf
Aminosäureebene mit der in Seq ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz oder Teilen
davon durchgeführt werden.
Die Zellwand beeinflußt sowohl die Form als auch die Funktion der Zelle. Die
Proteinfraktion der Zellwand enthält sowohl Enzyme als auch Strukturproteine. Zu den am
besten charakterisierten Strukturproteinen der Zellwand gehören die sogenannten Extensine
(Cassab und Varner, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 39 (1988), 321-353; Showalter,
A. M., Plant Cell 5 (1993), 9-23). Extensine gehören zur Familie der hydroxyprolinreichen
Glykoproteine (HRGPs). Gene und cDNAs codierend für Extensine konnten bisher
charakterisiert werden aus Karotte (Chen und Varner, EMBO J 4 (1985), 2145-2151), Bohne
(Corbin et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 4337-4344), Raps (Evans et al., Mol. Gen. Genet. 223
(1990), 273-287), Tomate (Showalter et al., Plant Mol. Biol. 16 (1991), 547-565) und
Tabak (Memelink et al., EMBO J 6 (1987), 3579-3583).
Die Genexpression der Extensine ist entwicklungsabhängig und eher gewebespezifisch als
konstitutiv reguliert (Sommer-Knudsen et al., Phytochemistry, 47 (1998), 483-497; Ye, Z. H.
et al., Plant Cell 3 (1991), 23-37). Vergleicht man die Gewebespezifität verschiedender
Extensingene unterschiedlicher Pflanzen, so stellt man fest, daß das Expressionsmuster von
Extensingenen in Abhängigkeit von der Art der untersuchten Pflanze, vom Zelltyp und vom
Gewebetyp deutlich variieren kann (Showalter et al., Plant Mol. Biol. 19 (1992), 205-215).
In Sojabohne werden HRGPs am stärksten in meristematischen Zellen exprimiert. Das
HRGPnt3-Gen aus Tabak wird im Perizyklus und in der Endodermis, speziell in bestimmten
Zellen, welche an der Bitdung von Seitenwurzeln beteiligt sind, exprimiert (Keller et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci 86 (1989), 1529).
Es wurde beschrieben, daß die Genexpression der Extensine durch Umweltfaktoren reguliert
werden kann, wie z. B. Licht, Pathogenbefall, Verwundung, Hitzestress (s. beispielsweise
Cassab und Varner, Annu Rec Plant Physiol Plant Mol Biol 39 (1988), 321-353; Cortin,
D. R. et al., Mol Cell Biol 7 (1987), 4337-4344; Niebel et al., Plant Cell 5 (1993) 1697-1710).
Dies ist jedoch nicht für alle Extensine der Fall (Sommer-Knudsen et al., Phytochemistry, 47
(1998), 483-497).
Das mature Extensinprotein ist normalerweise reich an Hydroxyprolin (Hyp), Serin und an
bestimmten Kombinationen der Aminosäuren Valin, Tyrosin, Lysin und Histidin.
Die Primärstruktur von Extensinen (für einen Überblick s. beispielsweise Sommer-Knudsen
et al., Phytochemistry, 47 (1998), 483-497) ist in der Regel charakterisiert durch mindestens
eine Ser-Pro3-6-Peptideinheit, die auch wiederholt oder in Verbindung mit ähnlichen
Sequenzen, wie z. B. folgenden Sequenzmotiven SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK,
SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH,
SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK,
SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP
auftreten kann (s. auch Sommer-Knudsen et al., loc. cit).
Extensine unterliegen einer starken post-translationalen Modifikation. Beim Karrotten-
Extensin beispielsweise werden die meisten der Prolin-Reste durch Prolyl-Hydroxylasen
hydroxyliert. Die Hydroxyprolinreste dienen als Angiffsstelle für Glykosylierungen
(Lamport et al. Biochem J. 133 (1972), 125-132; van Holst, G. J., Plant Physiol. 74 (1984),
247-251). Die Kohlenhydrate, vornehmlich Galactose und Arabinose (Smith et al.,
Phytochemistry 25 (1986), 1021 ff.; Holst et al., Plant Physiol. 74 (1984), 247; Smith et al.,
Phytochemistry 23 (1984), 1233) dienen der Stabilisierung der Proteine (Showalter, Plant
Cell 5 (1993), 9-23). Die Arabinose tritt hauptsächlich in der Hyp-Ara1-4-, die Galaktose in
der Ser-Gal-Form auf.
Darüberhinaus wurde eine Verknüpfung verschiedener Extensine über Isodityrosine-
Bindungen diskutiert, was beispielsweise in Antwort auf Pathogenbefall zu einer weiteren
Verstärkung der Zellwand führen kann (Brisson, L. F. et al., Plant Cell 6 (1994), 1703-1712;
Epstein, J., Phytochemistry 23 (1984), 1241-1246). Intramolekulare Isodityrosinbindungen
konnten in Extensinen nachgewiesen werden (Epstein et al., Phytochemistry, 23 (1984),
1241 ff.). Intermolekulare Isodityrosinbindungen konnten hingegen bisher nur in vitro
nachgewiesen werden (Everdeen et al., Plant Physiol. 87 (1988), 616 ff.; Huystee et al., Plant
Phys. Biochem. 33 (1995), 55 ff.).
Mit Hilfe des Prolin-Analogs 3,4-Dehydro-L-Prolin (Dhp) läßt sich die Prolyl-Hydroxylase
selektiv inhibieren, so daß man die Biosynthese des Hydroxyprolins mit Hilfe von Dhp
reduzieren kann. Für Wurzelscheiben der Möhre (Daucus carota) konnte nach Behandlung
mit Dhp gezeigt werden, daß sie strukturell veränderte HRGPS synthetisieren. Auch die
Behandlung von Tabakprotoplasten mit Dhp führte zur Regeneration von Zellwänden mit
veränderter Struktur (Cooper, J. B., Plant Physiol. 104, (1994), 747-752).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Expressionskassetten enthaltend einen
erfindungsgemäßen Promotor. Unter dem Begriff Expressionskassette wird dabei die
Kombination eines erfndungsgemäßen Promotors mit einer zu exprimierenden
Nucleinsäuresequenz verstanden. Diese Nucleinsäuresequenz kann beispielsweise eine ein
Polypeptid codierende Sequenz sein, d. h. ein Strukturgen. Sie kann in sense-oder in
antisense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft sein. Die Nucleinsäuresequenz kann
auch eine nicht-translatierbare RNA, beispielsweise eine antisense-RNA oder ein Ribozym,
codieren. Diese Nucleinsäuresequenzen können in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen
Promotor benutzt werden, um Pflanzen mit veränderten vorzugsweise verbesserten Phänotyp
herzustellen. Weiterhin kann der Stoffwechsel der Pflanze in der Wurzel mittels des
erfindungsgemäßen Promotors beeinflußt werden. Einige Beispiele zur heterologen
(Über)expression und zur Antisense-Inhibierung mit dem Ziel, Stoffwechselflüsse in
transgenen Pflanzen zu manipulieren sind in Herbers & Sonnewald (1996) TIBTECH 14,
198-205 zusammengefaßt. Ein Beispiel für Ribozyme wurde von Feyter (1996) Mol. Gen. Genet. 250,
329-228 publiziert. Vielfältige Anwendungsmöglichkeiten von transgenen
Pflanzen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Promotoren und Vektoren erzeugt werden
können, sind auch in TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology, 13 (1995), 312-397
beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können weiterhin eine
Transkriptionsterminationssequenz stromabwärts des 3'-Endes der mit dem Promotor
verknüpften Nucleinsäuresequenz enthalten. Unter einer Transkriptionsterminationssequenz
wird dabei eine DNA-Sequenz verstanden, die am 3'-Ende eines codierenden Genabschnitts
lokalisiert ist und in der Lage ist, die Beendigung der Transkription und ggf. die Synthese
eines Poly-A-Schwanzes hervorzurufen. Ein Beispiel für eine solche Terminationssequenz
ist die des Octopinsynthasegens.
Erfindungsgemäß können zwischen dem Promotor und der Nucleinsäuresequenz bzw.
zwischen der Nucleinsäuresequenz und dem Terminator jeweils eine oder mehrere
Restriktionsschnittstellen liegen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die mindestens einen
erfindungsgemäßen Promotor enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Promotor in einem
derartigen Vektor verknüpft mit einem Polylinker, der eine Integration beliebiger Sequenz
stromabwärts des Promotors erlaubt. Dabei wird unter einem Polylinker eine DNA-Sequenz
verstanden, die Erkennungssequenzen von mindestens einem Restriktionsenzym,
vorzugsweise von zwei oder mehr Restriktionsenzymen, enthält.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält ein erfindungsgemäßer Vektor
auch noch eine Sequenz für die Termination der Transkription, beispielsweise die des
Octopinsynthasegens, stromabwärts des Promotors bzw. des Polylinkers.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die erfindungsgemäße
Expressionskassetten enthalten. Vorteilhafterweise enthalten die erfindungsgemäßen
Vektoren Selektionsmarker, die geeignet sind Zellen die die erfindungsgemäßen Vektoren
enthalten zu identifizieren und gegebenenfalls selektionieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Vektoren geeignet zur
Transformation von pflanzlichen Zellen und besonders bevorzugt zur Integration von Fremd-
DNA in das pflanzliche Genom. Ein Beispiel für derartige Vektoren sind binäre Vektoren,
die zum Teil auch bereits kommerziell erhältlich sind.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen
Promotor oder mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder Vektor genetisch
modifiziert sind.
"Genetisch modifiziert" bedeutet dabei, daß die Wirtszelle einen erfindunggemäßen
Promotor oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder Vektor enthält,
vorzugsweise stabil ins Genom integriert, und der Promotor bzw. die Expressionskassette
entweder in die Wirtszelle oder in einen Vorgänger dieser Zelle als Fremd-DNA eingebracht
wurde. D. h. die erfindungsgemäßen Zellen können entweder selbst das unmittelbare Produkt
eines Transformationsereignisses sein oder davon abstammende Zellen, die einen
erfindungsgemäßen Promotor oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette enthalten.
Als Wirtszellen kommen sowohl prokaryontische, insbesondere bakterielle, als auch
eukaryontische Zellen in Frage. Eukaryontische Zellen können beispielsweise Pilzzellen
sein, insbesondere der Gattung Saccharomyces, bevorzugt von der Art Saccharomyces
cerevisiae.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von
erfindungsgemäßen Vektoren, erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder
erfndungsgemäßen Wirtszellen zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben
oder -teilen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen
Pflanzenzellen, die im folgenden als transgene Pflanzenzellen bezeichnet werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Pflanzen, die erfindungsgemäße
Pflanzenzellen enthalten. Diese können jeder beliebigen Pflanzenart, -gattung, -familie, -ordnung
bzw. -klasse angehören. Es können sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen
sein. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Pflanzen Nutzpflanzen, d. h. Pflanzen, die
für den Menschen von agrarwirtschaftlichem, forstwirtschaftlichem und/oder
gartenbauwirtschaftlichem Interesse sind. Bevorzugt sind dabei landwirtschaftliche
Nutzpflanzen, wie z. B. Getreidearten, Mais, Reis, Kartoffeln, Rüben, Tabak, Zuckerrohr,
Zuckerrübe, Sonnenblume, Raps oder Futter- und Weidegräser, wie Alfalfa, weißer Klee,
roter Klee, Flachs, Baumwolle, Soja, Hirse, Bohne, Erbse etc. Gemüsepflanzen, wie z. B.
Tomate, Gurke, Zucchini, Banane, Aubergine, Kohlarten, Artischocke, Chicoree etc.
Obstbaumgewächse, Hopfen, Wein usw.. Von Interesse sind auch Kräuter und Heilpflanzen,
wie z. B. Catharanthus roseus, Datura stramonium, Taxus SSP. I, Dioscorea deltoidea,
Papaver somniferum, Atropa belladonna, Rauwolfia serpentina, Hyoscyamus niger, Digitalis
lanata, Datura metel, Digitalis purpurea, Pilocarpus jaborandi, Cinchona ledgeriana,
Aconitum napelles, Papaver somiferum.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur
Herstellung von transgenen Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen, -gewebe
oder -teile oder Protoplasten mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder mit einer
erfindungsgemäßen Expressionskassette oder mit einem erfindungsgemäßen
Mikroorganismus transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder
Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur
Pflanzen regeneriert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von
erfindungsgemäßen Vektoren, erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder
erfindungsgemäßen Wirtszellen zur Herstellung transgener hairy roots durch Agrobacterium
rhizogenes.
Die erfindungsgemäßen Pflanzen können nach dem Fachmann bekannten Verfahren
hergestellt werden, z. B. durch Transformation pflanzlicher Zellen oder Gewebe und
Regeneration ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen bzw. dem Gewebe.
Verfahren zur Transformation dikotyler Pflanzen sind vielfach beschrieben (Siehe z. B. EP-A-120516;
Hoekema in "The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V.,
Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; An et al., EMBO
J 4 (1985), 277-287; Willmitzer in "Biotechnology, A Multi Volume Comprehensive Treatise
Vol. 2" (1993), 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge). Die Erzeugung
transgener hairy roots wurde beispielsweise beschrieben in "Gene Transfer to Plants", I. Potrykus,
G. Spangenberg (Eds), Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995, S. 39 ff.; Savary
et al., Plant Phys. 106(3), (1994), 1195-1204; Hamill et al., Biotechnology 5, (1987), 800-804.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen
Pflanzen, das erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthält. Der Begriff "Vermehrungsmaterial"
umfaßt dabei insbesondere Samen, Früchte, Knollen, Wurzelstöcke, Stecklinge,
Calluskulturen, Zellkulturen usw.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung
von Promotoren, die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen
kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Hybridisierung einer pflanzlichen genomischen Bank mit einer cDNA, die für ein extensinähnliches Protein codiert;
- b) Isolierung positiver Klone
- c) Testung der isolierten Klone auf Promotoraktivität.
Die in Schritt a) durchgeführte Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter stringenten
Bedingungen. Hierbei werden bekannte Sequenzen, die ein extensinähnliches Protein
codieren, oder Teile davon zur Hybridisierung mit einer entsprechenden Bibliothek,
vorzugsweise unter stringenten Bedingungen eingesetzt. Bevorzugt wird die unter SEQ ID
No. 7 aufgeführte Sequenz oder Teile davon eingesetzt. Die Methoden sind dem Fachmann
bekannt und sind detailliert beschrieben, z. B. in Sambrook et al., loc cit.
Wie bereits vorstehend erwähnt, versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung unter einem extensinähnlichen Protein ein Protein dessen Aminosäuresequenz
mindestens eines der folgenden Sequenzmotive SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY,
PPPPPYY, PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPXY, SOOOO, SPPPPKH,
SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP,
SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK,
SPPPPVYK, SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP,
SOOOOVKP aufweist und das eine Homologie von mindestens 60%, vorzugsweise von
mindestens 70%, bevorzugt von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90%
und insbesondere von mindestens 95% zu der unter SEQ ID No. 7 angegebenen codierenden
Region aufweist.
Die unter Schritt b) genannte Identifizierung positiver Klone und Isolierung der
Promotorsequenz erfolgt nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und die
beispielsweise beschrieben sind bei Sambrook et al., loc cit.
Die Expressionseigenschaften des isolierten Promotors können durch Reportergen-
Experimente analysiert werden. Zur unter Schritt c) genannten Testung der isolierten
Promotorsequenzen auf Promotoraktivität in Wurzelhaarzellen kann der Promotor
beispielsweise in einer Expressionskassette bzw. in einen Vektor zur Pflanzentransformation
operativ mit einem Reportergen, wie z. B. dem β-Glucuronidasegen aus E. coli, verknüpft
werden. Dieses Konstrukt wird zur Transformation von Pflanzen verwendet. Anschließend
wird die organspezifische Expression der β-Glucuronidase bestimmt, wie z. B. bei Martin et
al. (The GUS Reporter System as a Tool to Study Plant Gene Expression in: GUS Protocols:
Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Academic Press (1992), 23-43)
beschrieben. Diejenigen Promotoren, die eine Wurzelhaarspezifität aufweisen, werden
selektioniert und anschließend isoliert.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang die sequentielle
Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiteren
regulativen Elementen, wobei jedes der genannten Elemente seine Funktion bei der
Genexpression bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen
Promotoren oder der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Promotoren
zur wurzelhaarspezifischen Expression von Transgenen in Pflanzen.
Der Begriff "Transgen" bedeutet dabei eine in eine Pflanze künstlich eingeführte DNA-
Sequenz.
Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und
umfaßt durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung.
Weiterführende Literatur kann zu einer der oben angeführten Methoden, Mittel und
Verwendungen, die im Sinne der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, dem
Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der
Benutzung von elektronischen Hilfsmitteln. Zu diesem Zweck bieten sich unter anderem
öffentliche Datenbanken an wie die "Medline", die über Internet zur Verfügung stehen, z. B.
unter der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken
und Adressen sind dem Fachmann geläufig und können aus dem Internet entnommen
werden, z. B. unter der Adresse http://www.lycos.com. Eine Übersicht über Quellen und
Informationen zu Patenten bzw. Patentanmeldungen in der Biotechnologie ist in Berks,
TIBTECH 12 (1994), 352-364 gegeben.
Die Figuren zeigen:
5 µg Gesamt-RNA von abgestreiften Wurzeln und Wurzelhaaren und 10 µg totaler RNA der
angegebenen Tomatenorgane wurden für die "Northern blot" Analyse pro Spur aufgetragen.
Hybridisierung der RNA mit radioaktiv markierter LeExt1 cDNA oder 25S rDNA cDNA.
Die Transkriptgrößen sind zur rechten Seite angegeben. 25S rDNA diente als Kontrolle für
gleichmässiges Beladen der Spuren und Transfer auf die Nylon Membran. Abgestreifte
Wurzeln sind Wurzeln nach Wurzelhaarisolierung mit einer deutlich reduzierten Anzahl an
Wurzelhaaren. Die Isolierung pflanzlicher RNA erfolgte nach der heißen Phenol Extraktion-
Methode von Verwoerd et al. (Nucleic Acids Research, 17 (1989), 2362). Die RNA wurde
elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit UV Bestrahlung
daran fixiert. Nach Hybridisierung und Waschen wurde die radioaktive Membran auf
Röntgenfilm exponiert. Dieser wurde nach einer übernacht-Exposition bei -80°C entwickelt.
Die Intensität der Signale korreliert mit der Konzentration der spezifischen mRNA auf der
Membran.
10 µg Gesamt- RNA (5 µg im Falle der Spuren 3 und 4: 18 Tage und Erde) von 7, 14 und 18
Tage alten Keimlingen (7 Tage, 14 Tage, 18 Tage), auf Erde gewachsenen Wurzeln (Erde),
Keimlingswurzeln, welche im Dunkeln (-Licht) oder im Licht (+Licht) inkubiert wurden und
Kontrollen (Kontrolle), sowie verwundete Blätter (Verwundung) wurden für die RNA
"Northern blot" Analyse verwendet. Radioaktiv markierte LeExt1 cDNA wurde für die
Hybridisierung verwendet. Die Isolierung pflanzlicher RNA erfolgte nach Verwoerd et al.
(1989) (s. o.). Die RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran
transferiert und mit UV Bestrahlung daran fixiert. Nach Hybridisierung und Waschen wurde
die radioaktive Membran auf Röntgenfilm exponiert. Dieser wurde nach einer übernacht-
Exposition bei -80°C entwickelt. Die Intensität der Signale korreliert mit der Konzentration
der spezifischen mRNA auf der Membran.
Lokalisation des LeExt1 Transkripts in Tomatenwurzeln. Lichtmikroskopische Aufnahmen
von jungen Tomatenwurzeln unter sterilen Bedingungen. A, B In Paraffin eingebettete
Schnitte wurden entsprechend der In Situ Hybridisierungsmethode wie in Daram et al.
(Planta 206 (1998), 225-233) beschrieben mit nicht-radioaktiv markierter LeExt1 "antisense"
RNA hybridisiert. A Junge Keimlingswurzel mit wachsenden Wurzelhaaren in der
Differenzierungszone der Wurzel. B Wurzelhaarzone einer jungen Keimlingswurzel. Die
Wurzelspitze ist auf der linken Seite lokalisiert. Die Größe des Balkens beträgt 200 µm.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Als Pflanzenmaterial dienten verschiede Organe von auf Erde im Gewächshaus gewachsenen
Tomatenpflanzen Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker. Für die Wurzel- und
Wurzelhaargewinnung wurden 8000 oberflächensterilisierte Samen auf ein Metallgitter auf
Papier (No. 0858, Schleicher & Schuell, Deutschland) unter sterilen Bedingungen in
Petrischalen ausplattiert. Das Papier wurde vorgängig in 0.5x Hoagland Lösung
angefeuchtet. Keimung geschah bei 22°C bei einem Tag/Nacht Zyklus von 16 h/8 h. Am Tage
3 nach der Keimung wurde das Netz um ca. 4 mm über das Papier angehoben, indem sterile
Glaskugeln zwischen Netz und Papier geschoben wurden. Dies erlaubte vertikales
Wachstum der Keimlingswurzeln und optimale Wurzelhaarbildung. Am Tage 5 wurden die
Keimlinge mitsamt dem Netz in flüssigen Stickstoff getaucht und die Wurzeln wurden mit
einem Spatel vom Netz weggekratzt. Die Wurzelhaare wurden daraufhin wie in Röhm, M.
und Werner, D. (Physiologia Plantarum, 69 (1987), 129-136) beschrieben in flüssigem
Stickstoff von den Wurzeln abgestreift und durch Filter über ein 250 µm Analysensieb
gereinigt.
Für die "Northern blot" Analyse von Keimlingswurzeln unterschiedlichen Alters wurden die
Keimlinge wie oben beschrieben während 7, 14 und 18 Tagen inkubiert und die Wurzeln
entsprechend isoliert. Zur Isolierung von behaarten Wurzeln von auf Erde gewachsenen
Pflanzen wurden dicht durchwachsene Pflanzentöpfe aus dem Gewächshaus vom Erdballen
entfernt. Die an der seitlichen Oberfläche des Erdballens wachsenden Wurzeln wurden mit
der Pinzette abgeerntet und unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren. Für
Licht/Dunkel Versuche wurden Keimlinge wie oben beschrieben inkubiert in einem
Tag/Nachtzyklus von 16 h/8 h Belichtung. 7 Tage alte Wurzeln wurden nach 4 stündiger
Belichtung nach Beginn des Tagzyklus geerntet. Parallel dazu wurden Keimlinge während 7
Tagen im Dauerdunkeln inkubiert und danach deren Wurzeln ebenfalls geerntet.
Tomatenblätter wurden wie in Peña. Cortés et al. (Planta 186, (1992) 495-502) beschrieben
verwundet und nach 24 h geerntet. Als Kontrolle wurden unverwundete Blätter verwendet.
Gesamt-RNA aus den angegebenen Organen wurde nach der Methode von Verwoerd et al.,
(Nucleic Acid Research 17, (1989), 2362) extrahiert. 7-60 µg totale RNA aus Wurzelhaaren
wurde für die Isolierung der poly(A)+ RNA mittels dem Gebrauch von magnetischen oligodT
Kügelchen (Dynabeads, Dynal, Deutschland) weiterverwendet. 700 ng poly(A)+ RNA
wurden für die Herstellung doppelsträngiger cDNA verwendet (Pharmacia, Deutschland).
Die cDNA wurde nach Anhängen eines EcoRI/NotI linkers in den Expressionsvektor
λZAPII (Stratagene, Deutschland) kloniert. Verpackung in den λ Phagen erfolgte mit dem
Gigapack II Gold Packaging Extract Kit von Stratagene (Deutschland).
500,000 in Phagen verpackte cDNAs wurden auf YT Agar in Agarschalen ausplattiert und
nach einem Standardprotokoll (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Mannual, 2nd ed. Cold Spring Harbour Press., Cold Spring Harbour, NY. Sambrook, 1989)
mit 680 ng radioaktiv markierter revers transkribierter mRNA aus entweder Wurzelhaaren
oder abgestreiften Wurzeln durchmustert. 100 putativ positive Plaques wurden einer zweiten
Durchmusterung unterworfen, um Artefakte zu vermeiden. Letzlich wurden 76 positive
Plaques für die in vivo Excision weiterverwendet. Die daraus folgenden Bakterienkulturen
wurden in einer 96er Mikrotiter Platte in 2x YT Medium (Sambrook et al., s. o.) bei 28°C
über Nacht geschüttelt. Plasmid DNA aus diesen Kulturen wurden für eine zweite
Durchmusterung verwendet, indem eine Art reverser Southernmethode wie in Bucher et al.
(Plant Molecular Biology, 35 (1997), 497-508) beschrieben, angewendet wurde. Nach EcoRI
Verdau von vielversprechenden Plasmiden wurde die entsprechenden Inserts isoliert und für
die "Northern blot" Analyse weiterverwendet.
Fünf bis zehn Mikrogram totaler RNA aus den angegebenen Organen wurden nach
Glyoxylierung auf ein 1.2prozentiges Agarose-Glyoxalgel geladen (Hull, R. (1985)
Purification, biophysical and biochemical characterisation of viruses with special reference
to plant viruses. In Mahy, B. (ed.) Virology. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK,
pp. 1-24). "Northern blot" Analyse und Hybridiserungsbedingungen wurden
Standardvorschriften entnommen (Sambrook et al., s. o.) Die Blots wurden bei 68°C
hybridisiert. Detektion von LeExt1 mRNA wurde erreicht durch Verwendung der LeExt1
cDNA als radioaktive Sonde. Die letzte Waschung des Blots erfolgte mit 0.1 × SSC bei
68°C. Nach dem Waschen wurden die Blots auf Röntgenfilm (Kodak, Deutschland)
exponiert bei -80°C. Die Transkriptgrößen wurden durch Vergleich mit glyoxylierter Marker
DNA (BRL, Deutschland) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt.
Sequenzierung der LeExt1 cDNA (= SEQ ID. No. 7) erfolgte durch Verwendung der
Dideoxysequenzierung mit T7 DNA Polymerase (Amersham, Deutschland). Sequenzanalyse
erfolgte mit dem University of Wisconsin GCG Packet (Devereux, J., Haeberli, P. and
Smithies, O. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX.
Nucleid Acids Research, 12, 387-395).
Eine genomische DNA Bibliothek aus Tomate (Clontech Laboratories, USA) wurde mit
radioaktiv markierter LeExt1 cDNA (s. Beispiel 1) durchmustert. 500,000 Plaque formende
Einheiten (PFE) der DNA Bibliothek wurden dazu auf YT Agar in Agarschalen ausplattiert,
über 6 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert und auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham,
Deutschland) transferiert (Sambrook et al., s. o.). Hybridisierungsbedingungen wurden
Standardvorschriften entnommen (Sambrook et al., s. o.). 30 Plaques von der ersten
Durchmusterung wurden für eine zweite Runde ausgewählt. Die Phagensuspensionen von
zwei ausgewählten Plaques nach der zweiten Durchmusterung wurden erneut ausplattiert,
um Phagenlysate herzustellen. Davon wurde λ DNA nach Lockett, T. (Analytical
Biochemistry, 185, (1990), 230-234) präpariert. Je 600 ng λ DNA wurden daraufhin mit
verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und die daraus resultierenden Fragmente auf
einem Agarosegel mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Nach Southernblothybridisierung
(Sambrook et al., s. o.) mit radioaktiv markierter LeExt1 cDNA wurde letzlich ein ungefähr
3.4 kb langes genomisches Fragment isoliert, welches mit LeExt1 cDNA hybridisiert hat und
in ebenfalls mit Asp718 verdautes pBluescript II SK- Plasmid kloniert. Das Fragment wurde
durch Dideoxysequenzierung mit T7 DNA Polymerase (Amersham, Deutschland) zunächst
partiell sequenziert. Dabei stellte sich heraus, daß das genomische Fragment über 204
Basenpaare mit der LeExt1 cDNA Sequenz überlappte und sich 5' aufwärts in den
nichtcodierenden Bereich des LeExt1 Gens weitererstreckt.
Anschließend wurden beide Stränge des genomischen Fragments (ca. 3.4 kb) sequenziert (s.
Seq ID No. 13).
Es wurden insgesamt drei verschiedenartige GUS-Expressionskassetten hergestellt.
A Translationelle Fusion des 3.4 kb großen genomischen Fragments enthaltend ungefähr
200 Basenpaare codierende Sequenz der LeExt1 cDNA mit einer GUS Kassette. Das
genomische Fragment wurde durch einen KpnI Verdau aus dem pBluescript II SK- Plasmid
herausgeschnitten, mittels einer Auffillreaktion mit der T7 DNA Polymerase geglättet
(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., New
York, (1998)) und in den mit SmaI verdauten und dephosphorylierten binären Vektor
pBI101.3 kloniert (Clontech, USA). pBI101.3 ist ein Plasmid, das eine promotorlose GUS
Kassette im binären Vektor pBIN19 enthält. Dieses Konstrukt wurde roh1 genannt.
B Transkriptionelle Fusion eines modifizierten genomischen Fragmentes mit einer GUS
Kassette. Mit den Oligonukleotiden 42trx3 (5'-
GAGAGTCGACGATATCGGGCGAATTGGGTACC-3' = Seq ID No. 9), enthaltend die
Restriktionsschnittstelle von SaII, und 42trx4 (5'-
GAGATCTAGAGGTACCGGACTTTATATAACATAAC-3' = Seq ID No. 10), enthaltend
die Restriktionsschnittstelle von XbaI, wurde mittels PCR (30 sec bei 94°C Schmelzen der
DNA, 1 min bei 60°C Anlagerung der Primer, 1 min bei 72°C mit 3 sec Extension pro
Zyklus DNA Synthese mittels Taq DNA Polymerase [Fermentas, Litauen]) ein genomisches
Fragment von ca. 3200 bp Länge synthetisiert, welchem der, mit der LeExt1 cDNA
überlappende, ORF (open reading frame) fehlt. Das Fragment wurde mit SalI und XbaI
verdaut und in das ebenso verdaute und dephosphorylierte pBluescript II SK- Plasmid
kloniert. Nach Isolation des Plasmids aus einer E. coli DHSa Kultur (Sambrook et al., s. o.)
wurde das Fragment mittels SalI/XbaI Verdau isoliert und durch eine Auffüllreaktion mittels
T7 DNA Polymerase geglättet. Das Endprodukt wurde daraufhin in den mit SmaI verdauten
und dephosphorylierten binären Vektor pBI101.3 kloniert. Dieses Konstrukt wurde rohtrx
genannt.
C Es wurde ein PCR Produkt von ca. 3270 bp mit Hilfe folgender Primer hergestellt: 42Xba
(5'-GAGATCTAGACCATGGAGAAGAATTGG-3' = Seq ID No. 11) und 42Sal (5'-
GAGAGTCGACGGGCGAATTGGGTACCG-3' = Seq ID No. 12). Die PCR Bedingungen
waren: 20 sec bei 94°C Schmelzen der DNA, 45 sec bei 50°C Anlagerung der Primer, 2 min
bei 72°C DNA Synthese mittels Pfu DNA Polymerase (Stratagene, Deutschland). Das PCR-
Produkt wurde nach der Anleitung des Herstellers direkt in das Plasmid pCR-Script kloniert
(Stratagene, Deutschland). Nach SalI/NotI Verdau wurde das PCR Produkt mit dem Klenow
Enzym geglättet [Sambrook, 1989 #68] und in SmaI verdautes und dephosphoryliertes
pBluescript II SK- Plasmid kloniert. Nach Plasmidpreparation (Sambrook et al., s. o.) wurde
das Plasmid mit BstXI verdaut und linearisiert. Durch serielle Verkürzung des PCR-
Produktes mittels Exonuklease III und 51 Nuklease vom 5' Ende her gemäß dem Protokoll
des Herstellers (Fermentas, Litauen) wurden verkürzte genomische Fragmente folgender
ungefährer Länge hergestellt: 2.2 kb, 1.7 kb, 1.4 kb, 1.1 kb, 0.9 kb und 0.55 kb. Die AKTI-
GUS-3'NOS Kassette aus dem Plasmid 5'AKT1-320.X Lagarde et al. (The Plant Journal, 9
(1996), 195-203) wurde mit SacI isoliert, mittels Mung Bean Nuclease Behandlung geglättet
(New England BioLabs Inc., Bioconcept, Switzerland) und mit NcoI nachverdaut. Die so
erhaltene GUS-3'NOS Kassette wurde in NcoI/EcoRV verdaute und dephosphorylierte
pBluescript II SK Plasmide enthaltend die verkürzten genomischen Fragmente kloniert. Die
so hergestellten Promotor-GUS-3'NOS Kassetten wurden durch Verdau mit SacI und SaII
aus dem jeweiligen Plasmid isoliert und in SacIlSauI verdauten und dephosphorylierten
binären Vektor Binl9 (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 12, (1984), 8711) kloniert. Die
erhaltenenen Konstrukte wurden im folgenden BIN-Δgenx-GUS genannt, wobei x die
jeweilige Fragmentlänge 2.2 kb (= Seq ID No. 1), 1.7 kb (= Seq ID No. 2), 1.4 kb (= Seq 1D
No. 3), 1.1 kb (= Seq ID No. 4), 0.9 kb (= Seq ID No. 5) oder 0.55 (= Seq ID No. 6) kb
bezeichnet.
Die beschriebenen Konstrukte enthaltend die verschieden großen Promotorfragmente wurden
durch Elektroporation in den Agrobakteriumstamm C58C1 enthaltend das Plasmid pGV2260
(Deblaere et al., Nucleic Acids Research, 13, (1985), 4777-4788) eingeführt. Die
Agrobakterien wurden auf YEB Medium (Vervliet et al., Journal of General Virology, 26,
(1975), 33-48) kultiviert. Die Transformation von Tabak und Tomatenpflanzen erfolgte nach
der Methode des durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfers, wie von
Rosahl et al. (EMBO Journal, 6 (1987), 1155-1159) für Tabak und von Lillatti et al.
(Biotechnology, 5, (1987), 726-730) für Tomate beschrieben, durchgeführt.
Darüberhinaus erfolgte die Transformation von Kartoffel wie bei Rocha-Sosa et al. (EMBO
J. 8, (1989), 23-29).
Die Transformation von Mais erfolgte wie bei S. Omirulleh et al. (in "Gene Transfer to
Plants", I. Potrykus, G. Spangenberg (Eds), Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995, S. 99 ff.)
beschrieben.
Die oben beschriebenen Konstrukte wurden darüberhinaus durch Elektroporation in den A.
rhizogenes Stamm 15834 (Jung et al., Biotechnol Lett 14, (1992), 695-700) eingeführt und
anschließend zur Transformation von Catharanthus roseus mittels Agrobacterium rhizogenes
in Anlehnung an Toivonen et al., Plant Cell Tissue Org. Cult. 18 (1988), 79 ff. verwendet.
In den hairy roots konnte eine starke GUS-Expression nachgewiesen werden. Die
Transformation von Reis erfolgte mittels der particle bombardement-Methode, wie
beispielsweise beschrieben bei Christou, Plant Mol. Biol. 35 (1997), 197-203.
Das Pflanzenmaterial wurde mit einer 0.1%igen X-Gluc Lösung (0.1 g X-Gluc in 1 ml
Dimethylformamid vorlösen, 1 ml 10% Triton und 5 ml 1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7.2
dazugeben und mit Destwasser auf 100 ml auffüllen) vakuuminfiltriert und über Nacht bei
37°C inkubiert. Nach dem Färben wurden die Pflanzen in Ethanol : Essigsäure (3 : 1) fixiert
und in 100% Ethanol entfärbt. Dabei wurden grüne Pflanzenteile farblos, währenddem der
blaue Farbstoff stabil bleibt; siehe Fig. 3.
Claims (14)
1. Promotor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) Promotoren, die die unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebene Nucleinsäuresequenz umfassen;
- b) Promotoren, die einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleinsäuresequenz umfassen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken;
- c) Promotoren, die eine Sequenz aufweisen, die mit der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten hybridisiert, und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; und
- d) Promotoren von Genen, die ein Protein codieren dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 60% zu der unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.
2. Promotor nach Anspruch 1, der ein pflanzlicher Promotor ist.
3. Expressionskassetten enthaltend einen Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2.
4. Vektor enthaltend einen Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eine
Expressionskassette nach Anspruch 3.
5. Vektor nach Anspruch 4, der zur Transformation von pflanzlichen Zellen geeignet ist.
6. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit einem Promotor nach einem der
Ansprüche 1 oder 2, mit einer Expressionskassette nach Anspruch 3 oder einem
Vektor nach Anspruch 4 oder 5.
7. Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine Pflanzenzelle ist.
8. Hairy roots enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.
9. Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.
10. Vermehrungs- oder Erntematerial von Pflanzen nach Ansprüch 9, enthaltend
Pflanzenzellen nach Anspruch 7.
11. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen nach Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten mit
einem Vektor nach Anspruch 4 oder 5 oder mit einer Expressionskassette nach
Anspruch 3 oder mit einer Wirtszelle nach Anspruch 6 transformiert, die
transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem
Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert.
12. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Promotoren, die in Pflanzen eine
wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden
Nucleotidsequenz bewirken, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Hybridisierung einer pflanzlichen genomischen Bank mit einer cDNA, die für ein extensinähnliches Protein codiert;
- b) Isolierung positiver Klone;
- c) Testung der isolierten Klone auf Promotoraktivität.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die verwendete cDNA identisch mit einem Teil
der unter SEQ ID No. 7 dargestellten Nukleotidsequenz ist.
14. Verwendung eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eines nach
einem Verfahren nach den Ansprüchen 11 bis 13 identifizierten Promotors zur
wurzelhaarspezifischen Expression von Transgenen in Pflanzen.
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