DE19852757A1 - Promotoren zur Genexpression in Wurzeln von Pflanzen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Promotoren bereit, die eine wurzelspezifische Expression von ihnen kontrollierter codierender Nukleotidsequenzen bewirken und Expressionskassetten, rekombinante Vektoren und Mikroorganismen, die solche Promotoren umfassen. Ferner werden transformierte transgene Pflanzen beschrieben, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verfahren zur Isolierung wurzelspezifischer Promotoren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Promotoren, die eine wurzelspezifische Expression von ihnen kontrollierter codierender Nukleotidsequenzen bewirken, zur gewebespezifischen Genexpression in Pflanzen, Expressionskassetten, rekombinante Vektoren und Mikroorganismen, die solche Promotoren umfassen, damit transformierte transgene Pflanzen, ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen sowie ein Verfahren zur Isolierung wurzelspezifischer Promotoren.

Nachfolgend werden Dokumente aus dem Stand der Technik zitiert, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten ist.

Der Einsatz von Pflanzen, die mit Hilfe gentechnischer Verfahren in ihrem Erbgut verändert wurden, hat sich in vielen Bereichen der Landwirtschaft als vorteilhaft und oft als der einzige Weg erwiesen, bestimmte Eigenschaften auf Nutzpflanzen zu übertragen. Die vornehmlichen Ziele sind zum einen der Pflanzenschutz und zum anderen eine Qualitätssteigerung der erntbaren Produkte.

Es sind zahlreiche Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (vgl. u. a. Gasser und Fraley, Science 244 (1989), 1293-1299; Potrykus, Ann. Rev. Plant mol. Biol. Plant Physiol. 42 (1991), 205-225). Alle Verfahren basieren auf der Übertragung von Genkonstrukten, die in den meisten Fällen Neukombinationen von bestimmten codierenden Regionen von Strukturgenen mit Promotorregionen anderer Strukturgene, sowie Transkriptionsterminatoren darstellen.

Die Bereitstellung von Promotoren ist dabei von großer Bedeutung für die Herstellung von transgenen Pflanzen, da die Spezifität eines Promoters ausschlaggebend dafür ist, zu welchem Zeitpunkt, in welchen Gewebetypen und in welcher Intensität ein gentechnisch übertragenes Strukturgen exprimiert wird.

Eine Vielzahl von Promotoren, die die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern, ist bekannt. Der am häufigsten verwendete Promotor ist der 35S CaMV-Promotor (Franck et al., Cell 1 (1980), 285-294), der zu einer konstitutiven Expression des eingeführten Gens führt. Häufig werden aber auch induzierbare Promotoren eingesetzt (Wundinduktion, DE-A-38 43 628; chemische Induktion (Ward et al., Plant Molec. Biol. 22 (1993), 361-366), Lichtinduktion (Fluhr et al., Science 232 (1986), 1106-1112).

Auch die Verwendung zell- und gewebespezifischer Promotoren wurde beschrieben: schließzellenspezifische Genexpression, DE-A-42 07 358; samen-, knollen- und fruchtspezifische Genexpression, zusammengefaßt in Edwards and Coruzzi, Annu. Rev. Genet. 24 (1990), 275-303, DE-A-38 43 627); phloemspezifische Genexpression (Schmülling et al., Plant Cell 1 (1989), 665-670); wurzelknöllchenspezifische Genexpression (DE-A-37 02 497); meristemspezifische Genexpression (Ito et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 863-878).

Beispiele für Promotoren, die die Genexpression in Wurzel vermitteln, sind der Class-II- patatin-Promotor (Köster-Töpfer et al., Mol. Gen. Genet. 219, (1989) 390-396), der nach Fusion mit dem Reportergen des beta-Glucuronidase (GUS)-Gens eine hohe Expression in Kartoffelknollen und in bestimmten Zellschichten von Wurzelspitzen zeigt. Auch GUS- Fusionsexperimente mit dem Agropinesynthase-Promotor (ags) (Inoguchi et al., Plant Phys. 149 (1996) 73-78) zeigten eine hohe GUS-Aktivität vor allem in Wurzeln. Transgene Arabidopsis-Pflanzen enthaltend ein AKT1 (= Kaliumkanal)-GUS-Konstrukt (Lagarde et al., Plant J. 9 (1996), 195-203) führten vor allem zu einer Expression in äußeren Zellschichten reifer Wurzelabschnitte. Auch ein 636 bp langer Abschnitt des 5'-Bereiches des TobRB7 (= Wasserkanal)-Gens (Yamamoto et al., Plant Cell 3, (1991), 371-382) vermittelte eine wurzelspezifische GUS-Expression in transgenen Tabakpflanzen. Ferner wurden GUS- Fusionsexperimente mit dem Promotor eines Extensingens beschrieben, wobei GUS- Aktivität in Sojabohnenkeimlingen in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium im Hypocotyl und in der Wurzel bzw. spezifischen Zonen der Wurzel nachgewiesen werden konnte (Ahn et al., Plant Cell, 8, (1996), 1477-1490).

Die Verwendung der beschriebenen Promotoren ist oft problematisch. Promotoren, die eine konstitutive Expression der von ihnen kontrollierten Gene bewirken, können beispielsweise zur Erzeugung herbizidtoleranter und pathogenresistenter Pflanzen eingesetzt werden, haben aber den Nachteil, daß die Produkte der von ihnen kontrollierten Gene in allen Teilen der Pflanze vorliegen, auch in den geernteten Pflanzenteilen, was in manchen Fällen unerwünscht sein kann. Induzierbare Promotoren sind gleichfalls nicht unproblematisch, da die Induktionsbedigungen bei landwirtschaftlich genutzten Pflanzen im Freiland typischerweise schwer kontrollierbar sind.

Darüberhinaus ist es zur Bewältigung verschiedener Ansätze der genetischen Veränderung von Pflanzen erforderlich, Gene, die unterschiedlich reguliert werden sollen, unter die Kontrolle verschiedener Promotoren zu stellen. Es ist daher notwendig, verschiedene Promotorsysteme mit unterschiedlicher Spezifität zur Verfügung zu stellen.

Promotoren, die die Genexpression in Wurzeln regulieren sind bisher nur in begrenzter Zahl bekannt. Zur Bewältigung bestimmter Ansätze der genetischen Veränderung von Pflanzen ist es erforderlich, weitere, alternative Promotorsysteme zur Genexpression in Wurzeln zur Verfügung zu stellen, die im Vergleich zu den bekannten Systemen unterschiedlich reguliert sind.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel bereitzustellen, die eine organspezifische Genexpression von Pflanzen ermöglichen. Diese Mittel sollten beispielsweise zur Expression von Genen, die die Aufnahme von Nährstoffen aus dem Boden beeinflussen, und von Genen, die das Wurzelwachstum modifizieren, geeignet sein.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Promotor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• a) Promotoren, die die unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebene Nucleinsäuresequenz umfassen;
• b) Promotoren, die einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleinsäuresequenz umfassen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken;
• c) Promotoren, die eine Sequenz aufweisen, die mit einer der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten hybridisiert, und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; und
• d) Promotoren von Genen, die Proteine codieren deren Aminosäuresequenzen eine Homologie von mindestens 60% zu der unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweisen, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Promotoren solche von pflanzlichen Genen oder von solchen abgeleitet.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Promotor eine DNA- Sequenz verstanden, die den regulatorischen Anteil eines Gens, vorzugsweise eines Strukturgens, umfaßt. Unter dem regulatorischen Anteil eines Gens wird derjenige Anteil verstanden, der die Expression des Gens bestimmt. Ein regulatorischer Anteil besitzt ein Sequenzmotiv, an dem Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerase assemblieren und die Transkription des codierenden Anteils des Gens einleiten. Darüber hinaus kann der regulatorische Anteil ein oder mehrere positive regulatorische Elemente, sogenannte Enhancer umfassen. Er kann zusätzlich oder an deren Stelle aber auch negativ regulatorische Elemente, sogenannte Silencer enthalten. Unter einem Strukturgen wird eine genetische Einheit aus regulatorischem und codierendem Anteil verstanden, deren Genprodukt ein Protein ist. Die Information für die primäre Aminosäuresequenz des Proteins ist im codierenden Anteil des Strukturgens enthalten, während der regulatorische Anteil bestimmt, wann und in welchen Geweben zu welchen Mengen das Transkript des codierenden Anteils gebildet wird, nach dessen Vorlage das Genprodukt synthetisiert wird. Die erfindungsgemäßen Promotoren können beispielsweise aus pflanzlichen Genen stammen, durch rekombinante DNA-Techniken modifiziert sein und/oder synthetisch hergestellt werden.

Unter dem Begriff wurzelspezifisch versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß ein unter der Kontrolle eines erfindungsgemäßen Promotors stehendes Fremdgen in den Wurzeln exprimiert wird. Insbesondere ist Wurzelspezifität im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch dann gegeben, wenn der erfindungsgemäße Promoter die Expression eines Fremdgens in den Wurzeln, insbesondere in den Wurzelhaaren im Vergleich zu maturen Blättern begünstigt und in Wurzeln, insbesondere in Wurzelhaaren eine signifikant, wie beispielsweise mindestens 2- bis 5-fach, bevorzugt 5- bis 10-fach, besonders bevorzugt 10- bis 100-fach, erhöhte Expression bewirkt.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann Wurzelspezifität durch Reportergen-Experimente analysiert werden. Zur Testung einer isolierten Promotorsequenz auf Promotoraktivität in Wurzeln bzw. in Wurzelhaaren kann der Promotor beispielsweise in einer Expressionskassette bzw. in einen Vektor zur Pflanzentransformation operativ mit einem Reportergen, wie z. B. dem β-Glucuronidasegen aus E. coli, verknüpft werden. Dieses Konstrukt wird zur Transformation von Pflanzen verwendet. Anschließend wird die Expression der β-Glucuronidase in Wurzeln und/oder Wurzelhaaren im Vergleich zu maturen Blättern bestimmt, wie z. B. bei Martin et al. (The GUS Reporter System as a Tool to Study Plant Gene Expression in: GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Academic Press (1992), 23-43) beschrieben.

Der Begriff Wurzel ist dem Fachmann geläufig. Ergänzend sei verwiesen auf Strasburger (Lehrbuch der Botanik für Hochschulen: Begr. v. Eduard Strasburger u. a. Neubearb. v. Peter Sitte, Hubert Ziegler u. a. 34. Aufl. 1998, Fischer (Gustav)-Verlag, Stuttgart).

Wurzelhaare sind in der Regel schlauchförmige, sehr dünnwandige Ausstülpungen der Wurzelepidermiszellen (Rhizodermis). Ihre Länge schwankt. Sie vergrößern die wasseraufnehmende Oberfläche der Wurzel sehr wirksam (z. B. bei Pisum auf etwa das 12fache) und haben daher für das Wachstum und die Entwicklung höherer Pflanzen eine große Bedeutung. Durch umfangreiche elektrophysiologische und molekulare Untersuchungen verschiedener ionenselektiver Membrantransportsysteme der Wurzelhaare (Jones et al., Planta 197 (1995) 672-680; Lagarde et al., Plant J. 9 (1996), 195-203; Lauter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 8139-8144; Schiefelbein et al., Planta 187 (1992), 455-459) konnte gezeigt werden, daß die Wurzelhaare einen großen Einfluß auf die Wasser- und Nährstoffaufnahme aus dem Boden haben.

Bei vielen Arten liefert jede Rhizodermiszelle ihr eigenes Wurzelhaar, das in vielen Fällen gewöhnlich nicht genau in der Mitte der Zelle, sondern etwas in Richtung auf die Wurzelspitze verschoben hervortritt. In anderen Fällen entstehen auch die Wurzelhaare der Rhizodermis durch inäquale Zellteilungen aus dem zuvor einheitlichen meristematischen Protoderm. Die Inäqualität äußert sich zunächst darin, daß die potentiellen Haarbildner (Trichoblasten) kleiner sind, aber ein dichteres Plasma aufweisen als die normalen Rhizodermiszellen. Ihre Kerne sind oft stärker färbbar und durch Endomitosen polyploid.

Bei anderen Arten wechseln Trichoblasten und Atrichoblasten auf der Rhizodermis in regelmäßigem Muster ab. Die Trichoblasten offenbaren ihren Charakter als meristemoide manchmal durch erhöhte Teilungsaktivität, so daß die Wurzelhaare nicht einzeln, sondern zu mehreren gebüschelt auftreten.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein Promotor mit der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellten Nukleotidsequenz in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirkt.

Diese Beobachtung ist insbesondere überraschend, weil ein genomisches Fragment (s. Seq ID No. 13) der Promotorregion (s. Beispiel 2), welches im Vergleich zur Seq ID No. 1 um ca. 1000 bp verlängert ist, keine wurzelspezifische GUS-Expression vermitteln kann. Nur im Vergleich zum großen Fragment (s. Seq ID No. 13) verkürzte Promotorfragmente (s. SEQ ID No. 1 bis 6), die wie in Beispiel 3C beschrieben hergestellt wurden, führen zu einer wurzelspezifischen Genexpression einer vom Promotor kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz.

Untersucht man die Sequenz der cDNA (s. Seq. ID No. 7) so findet man im 5'-Bereich, upstream vom eigentlichen ATG (Seq ID No. 7 bp 256), weitere (1. ca. 210 bp upstream: s. bp 42 von Seq ID No. 7; 2. ca. 190 bp upstream: s. bp 65 von Seq ID No. 7; 3. ca. 110 bp upstream: s. bp 142 von Seq ID No. 7) Translations-Initiations-Codons (ATG), die zu mehreren upstream open reading frames (uORFs) führen. Die Anwesenheit solcher uORFs kann einen negativen Einfluß auf die Translationsrate spezifischer mRNAs haben. Die verschiedenen Promotorfragmente wurden daher so konstruiert, daß sie diesen 5'-upstream- Bereich (s. Seq. ID No. 7 bp 1-255) nicht umfassen.

Der erfindungsgemäße Promotor erlaubt nun eine wurzelspezifische Genexpression einer vom Promotor kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz. Er stellt eine interessante Alternative zu anderen wurzelspezifischen Promotoren dar, weil er die Genexpression in Wurzelhaaren vermitteln kann. Aufgrund der größeren Oberfläche der Wurzelhaare im Vergleich zur Wurzel kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Promotors die Expression von solchen Genen effektiver manipuliert werden, deren Genprodukte beispielsweise den Transport von Nährstoffen und Metaboliten durch die Wurzelhaarzellen vermitteln.

Vielfältige Verwendungsmöglichkeiten stehen für den erfindungsgemäßen Promotor zur Verfügung. Beispielsweise kann man sich die Herstellung transgener Pflanzen vorstellen, die aufgrund eines modifiziertem Wurzelhaarmetabolismus, der einen positiv Einfluß auf die Flora der Wurzelumgebung (Rhizosphäre) ausübt, einen erhöhten Ertrag zeigen. Darüberhinaus kann man die erfindungsgemäßen Promotoren zur wurzelspezifischen Expression solcher Gene verwenden, die die Aufnahme beispielsweise von Schwermetallionen aus kontaminierten Böden vermitteln. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Promotors wäre es somit möglich transgene Pflanzen herzustellen, die bei der Phytoremediation eingesetzt werden können.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erlauben die erfindungsgemäßen Promotoren die Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz in spezifischen Wurzelzellen, wie z. B. in Wurzelzellen der Primärwurzel, in Wurzelhaaren der Primärwurzel, in Wurzelzellen der Wurzelspitze oder in Wurzelhaaren der Primärwurzel unterhalb des Hypocotyls, zu bewirken.

Neben einem Promotor, der die gesamte unter Seq ID No. 1, Seq ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellten Sequenz aufweist, betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die einen funktionalen Teil dieser Sequenz aufweisen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.

Unter einem funktionalen Teil versteht man in diesem Zusammenhang solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nucleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, wie z. B. Promotoraktivität und Gewebe- oder Organspezifität besitzen. Ein Maß für die Promotoraktivität ist beispielsweise die für ein bestimmtes Markergen, das unter der regulativen Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors steht, ermittelte Expressionsrate. Beispiele für geeignete Markergene sind das beta-Glucuronidase-(GUS)-Gen aus E. coli oder das Green-Fluorescence-Protein-(GFP)-Gen (Baulcombe et al., Plant J. 7 (16) (1993), 1045-1053). Die Organ- bzw. Gewebespezifität läßt sich leicht durch Vergleich der an einzelnen Geweben bzw. Organen der Pflanze ermittelten Expressionsraten für obige Markergene bestimmen. Funktionale Teile der Promotorsequenzen umfassen im Rahmen der vorliegenden Erfindung natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an die Codon-Usage einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotidsequenzen.

Unter einem funktionalen Teil versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Promotorsequenz, welche weiterhin die gewünschten Funktionen zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen und/oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nukleotidsequenz erhalten kann. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Promotorsequenz, oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsschnittstellen sein.

Funktionale Teile einer Promotorsequenz umfassen auch solche Promotorvarianten, deren Promotoraktivität, verglichen mit dem Wildtyp, abgeschwächt oder verstärkt ist.

Prinzipiell wird die Aktivität eines eukaryontischen RNA-Polymerase II-Promotors durch das synergistische Zusammenwirken verschiedener trans-aktiver Faktoren (DNA- Bindeproteine) bedingt, welche an die verschiedenen im Promotor vorhandenen cis- regulatorischen DNA-Elemente binden. Diese Faktoren wechselwirken direkt oder indirekt mit einzelnen oder mehreren Faktoren der basalen Transkriptionsmaschinerie, was letztlich zur Ausbildung eines Präinitiationskomplexes in der Nähe der Transkriptionsstartstelle führt (Drapkin et al., 1993, Current Opinion in Cell Biology 5: 469-476). Man kann von einem modularen Aufbau eukaryontischer RNA-Polymerase II-Promotoren sprechen, wobei verschiedene cis-Elemente (Module) jeweils als Teilkomponenten die Gesamtaktivität des Promotors determinieren (Tjian und Maniatis, 1994, Cell 77, 5-8). Verdeutlicht wurde dieser modulare Aufbau beispielsweise durch Promotorstudien mit dem Blumenkohl-Mosaik- Virus-(CaMV)-35S-Promotor (Benfey und Chua, 1990 Science 250: 959-966, Benfey et al., 1990, EMBO J.9: 1677-1684 Benfey et al., 1990, EMBO J. 9: 1685-1696). Aufgrund der unterschiedlichen Gewebespezifität, die verschiedene Restriktions-Subfragmente des -343 bis +8 (relativ zur Transkriptionsstartstelle) Promotors in transgenen Tabakpflanzen vermitteln, wurde der Promotor in 6 Subdomänen aufgeteilt. Die starke, konstitutive Expression, die der vollständige Promotor vermittelt, ist also in gewebespezifische Teilaktivitäten sektionierbar.

Einzelne, potentiell Gewebespezifität vermittelnde Subdomänen des erfindungsgemäßen Promotors können beispielsweise durch Fusion mit einer Minimalpromotor-Reportergen- Kassette identifiziert werden. Unter einem Minimalpromotor versteht man eine DNA- Sequenz, die eine TATA-Box, die sich etwa 20 bis 30 Basenpaare stromaufwärts von der Transkriptionsstarstelle befindet, oder eine Initiatorsequenz (Smale und Baltimore, Cell 57, (1989), 103-113; Zawel und Reinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. 44, (1993), 67-108; Conaway und Conaway, Annu. Rev. Biochem 62 (1993), 161-190) umfaßt. Beispiele für Minimalpromotoren sind beispielsweise der -63 bis +8 Δ35S-Promotor (Frohberg 1994, Dissertation an der FU Berlin FB Biologie), der -332 bis +14 Minimal-Patatin-ClassI- Promotor sowie der -176 bis +4-Minimal-PetE-Promotor (Pwee et al., Plant J. 3, (1993), 437-449).

Desweiteren können solche Subdomänen bzw. cis-Elemente des erfindungsgemäßen Promotors auch über Deletionsanalysen bzw. Mutagenesen identifiziert werden (Kawagoe et al., 1994, Plant J. 5(6): 885-890). Der Test auf Funktionalität einer solchen Subdomäne oder cis-Elements kann in planta durch den Nachweis der Reportergenaktivität in transformierten Zellen erfolgen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht man unter dem funktionalen Teil der Promotorsequenz auch solche Subdomänen bzw. cis-Elemente der unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleotidsequenzen, die eine Wurzelspezifität vermitteln.

Ferner kann die Wirksamkeit einer Subdomäne oder eines cis-Elementes durch Multimerisierung deutlich verstärkt werden. Im Falle des CaMV-35S-Promotors führte beispielsweise die Dimerisierung eines 250 bp großen Fragmentes in Tandemanordnung zu einer Verzehnfachung der Promotoraktivität (Kay et al., 1987, Science 230: 1299-1302). Im Falle der Subdomäne B5 des CaMV-35S-Promotors zeigte sich eine deutliche Aktivitätssteigerung des Promotorkonstruktes für den Fall, daß diese Domäne als Tetramer und nicht als Monomer vorlag (Benfey et al., 1990, EMBO J. 9: 1685-1696).

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher insbesondere auch Di- und Multimere von Subdomänen bzw. cis-Elementen der unter SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleotidsequenzen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Erhöhung der Promotoraktivität im Vergleich zum Wildtyp durch die Kombination des erfindungsgemäßen Promotors mit einem sogenannten Enhancer erreicht.

In der Literatur sind verschiedene Enhancer beschrieben worden, die in der Regel eine gewebespezifische Erhöhung der Expression bewirken, wobei die Gewebespezifität in der Regel durch den jeweils verwendeten Enhancer determiniert wird (Benfey et al., Science 250, (1990), 959-966; Benfey et al., EMBO J 8, (1989), 2195-2202; Chen et al., EMBO J 7, (1988), 297-302; Simpson et al., Nature 323, (1986), 551-554).

Darüberhinaus gibt es auch Enhancer, wie z. B. den PetE Enhancer (Sandhu et al., Plant Mol. Biol. 37 (1998), 885-896), die nicht gewebespezifisch wirken und somit als reine quantitative Verstärkerelemente vor den erfindungsgemäßen Promotor gesetzt werden können, um die Expression in Wurzeln und/oder Wurzelhaaren quantitativ zu erhöhen, ohne die Qualität der Gewebespezifität des erfindungsgemäßen Promotors zu verändern.

Ein wurzelspezifischer Enhancer, der auf der Multimerisierung einer bestimmten Box (Box II) basiert, wurde beispielsweise beschrieben in "DNA-Protein Interactions in the Auxin regulated Promoter of T-DNA gene 5", Autor: Sirpa Nuotio, Acta Universitatis Ouluensis, A Scientiae Rerum Naturalium 299 (1997), Oulu University press, S. 38 ff.". Ferner können auch synthetische Enhancer verwendet werden, die beispielsweise von natürlich vorkommenden Enhancern abgeleitet sind und/oder durch Kombination verschiedener Enhancer erhalten werden.

Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die mit der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten Nucleotidsequenz hybridisieren und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken. Bevorzugt hybridisieren solche Sequenzen unter stringenten Bedingungen mit der unter unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 dargestellten Sequenz.

Der Ausdruck "stringente Bedingungen" bedeutet dabei vorzugsweise Hybridisierungsbedigungen, wie sie beispielsweise beschrieben sind in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Insbesondere findet Hybridisierung unter den folgenden Bedingungen statt:
Hybridisierungspuffer: 2 × SSC; 10 × Denhardt's Lösung (Fikoll 400 + PEG + BSA; Verhältnis 1 : 1 : 1); 0.1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na₂HPO₄; 250 µg/ml Heringsperma- DNA; 50 µg/ml tRNA; oder 0.25 M Natriumphosphatpuffer pH 7.2, 1 mM EDTA, 7% SDS
Hybridisierungstemperatur T = 65 bis 68°C
Waschpuffer 0.2 × SSC; 0.1% SDS
Waschtemperatur T = 65 bis 68°C

Vorzugsweise weisen derartige Promotoren eine Sequenzidentität von mindestens 30%, bervorzugt von mindestens 40%, bevorzugt von mindestens 50% besonders bevorzugt mindestens 60%, insbesondere bevorzugt von mindestens 70% und vorteilhafterweise von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90% und insbesondere bevorzugt mindestens 95% zu der unter Seq ID No. 1 gezeigten Promotorsequenz oder Teilen davon auf. Derartige Promotorsequenzen stammen vorzugsweise aus pflanzlichen Organismen, bevorzugt aus höheren Pflanzen, besonders bevorzugt aus dikotylen Pflanzen, insbesondere bevorzugt aus Pflanzen der Gattung Lycopersicon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der erfindungsgemäße Promotor, die gesamte unter Seq ID No. 3 (= ca. 1.4 kb-Fragment), Seq ID No. 4 (= ca. 1.1 kb- Fragment), SEQ ID No. 5 (= 0.9 kb-Fragment) oder SEQ ID No. 6 (= 0.55 kb-Fragment) dargestellten Sequenz auf.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Promotoren, die einen funktionalen Teil dieser Sequenzen aufweisen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der erfindungsgemäße Promotor die gesamte oder einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 4 (= 1.1 kb- Fragment) dargestellte Sequenz auf.

Ohne daran zu denken an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß der unter Seq ID No. 1, Seq ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigte Promotor von einem pflanzlichen Gen stammt, das zu einer Gruppe extensinähnlicher Proteine gehört.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Promotoren von Genen, die ein Protein, vorzugsweise aus der Gruppe der extensinähnlichen Proteine, codieren und die eine Homologie d. h. Identität von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 70%, bevorzugt von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere von mindestens 95% zu der gesamten unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweisen, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.

Die unter Seq ID No. 7 dargestellte Nucleotidsequenz codiert ein Polypeptid (SEQ ID No. 8) aus L. esculentum, von dem angenommen werden kann, daß es der Gruppe der extensinähnlichen Proteine zuzurechnen ist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem extensinähnlichen Protein ein pflanzliches Protein verstanden, dessen Aminosäuresequenz mindestens eines der folgenden Sequenzmotive aufweist: SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY, PPPPPYY, PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPXY, SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK, SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP.

Insbesondere solche pflanzlichen Proteine, die mindestens eines in der SEQ ID No. 8 enthaltenen SPPPP- und/oder (P)PPPPYY-Motive aufweist, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als extensinähnlich bezeichnet.

DNA-Sequenzen, die Homologie zu der unter Seq ID No. 7 gezeigten Sequenz aufweisen, können zum einen beispielsweise durch computergestütze Sequenzvergleiche mit bekannten Sequenzen identifiziert werden oder auch durch Durchmusterung von beispielsweise cDNA- oder genomischen Bibliotheken mit der unter Seq ID No. 7 dargestellten Sequenz oder Teilen davon. Derartige Techniken sind dem Fachmann bekannt (Siehe z. B. Sambrook et al (loc cit.)). Gleichalls können computergestützte Sequenzvergleiche auch auf Aminosäureebene mit der in Seq ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz oder Teilen davon durchgeführt werden.

Die Zellwand beeinflußt sowohl die Form als auch die Funktion der Zelle. Die Proteinfraktion der Zellwand enthält sowohl Enzyme als auch Strukturproteine. Zu den am besten charakterisierten Strukturproteinen der Zellwand gehören die sogenannten Extensine (Cassab und Varner, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 39 (1988), 321-353; Showalter, A. M., Plant Cell 5 (1993), 9-23). Extensine gehören zur Familie der hydroxyprolinreichen Glykoproteine (HRGPs). Gene und cDNAs codierend für Extensine konnten bisher charakterisiert werden aus Karotte (Chen und Varner, EMBO J 4 (1985), 2145-2151), Bohne (Corbin et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 4337-4344), Raps (Evans et al., Mol. Gen. Genet. 223 (1990), 273-287), Tomate (Showalter et al., Plant Mol. Biol. 16 (1991), 547-565) und Tabak (Memelink et al., EMBO J 6 (1987), 3579-3583).

Die Genexpression der Extensine ist entwicklungsabhängig und eher gewebespezifisch als konstitutiv reguliert (Sommer-Knudsen et al., Phytochemistry, 47 (1998), 483-497; Ye, Z. H. et al., Plant Cell 3 (1991), 23-37). Vergleicht man die Gewebespezifität verschiedender Extensingene unterschiedlicher Pflanzen, so stellt man fest, daß das Expressionsmuster von Extensingenen in Abhängigkeit von der Art der untersuchten Pflanze, vom Zelltyp und vom Gewebetyp deutlich variieren kann (Showalter et al., Plant Mol. Biol. 19 (1992), 205-215).

In Sojabohne werden HRGPs am stärksten in meristematischen Zellen exprimiert. Das HRGPnt3-Gen aus Tabak wird im Perizyklus und in der Endodermis, speziell in bestimmten Zellen, welche an der Bitdung von Seitenwurzeln beteiligt sind, exprimiert (Keller et al., Proc. Nat. Acad. Sci 86 (1989), 1529).

Es wurde beschrieben, daß die Genexpression der Extensine durch Umweltfaktoren reguliert werden kann, wie z. B. Licht, Pathogenbefall, Verwundung, Hitzestress (s. beispielsweise Cassab und Varner, Annu Rec Plant Physiol Plant Mol Biol 39 (1988), 321-353; Cortin, D. R. et al., Mol Cell Biol 7 (1987), 4337-4344; Niebel et al., Plant Cell 5 (1993) 1697-1710). Dies ist jedoch nicht für alle Extensine der Fall (Sommer-Knudsen et al., Phytochemistry, 47 (1998), 483-497).

Das mature Extensinprotein ist normalerweise reich an Hydroxyprolin (Hyp), Serin und an bestimmten Kombinationen der Aminosäuren Valin, Tyrosin, Lysin und Histidin.

Die Primärstruktur von Extensinen (für einen Überblick s. beispielsweise Sommer-Knudsen et al., Phytochemistry, 47 (1998), 483-497) ist in der Regel charakterisiert durch mindestens eine Ser-Pro_3-6-Peptideinheit, die auch wiederholt oder in Verbindung mit ähnlichen Sequenzen, wie z. B. folgenden Sequenzmotiven SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK, SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP auftreten kann (s. auch Sommer-Knudsen et al., loc. cit).

Extensine unterliegen einer starken post-translationalen Modifikation. Beim Karrotten- Extensin beispielsweise werden die meisten der Prolin-Reste durch Prolyl-Hydroxylasen hydroxyliert. Die Hydroxyprolinreste dienen als Angiffsstelle für Glykosylierungen (Lamport et al. Biochem J. 133 (1972), 125-132; van Holst, G. J., Plant Physiol. 74 (1984), 247-251). Die Kohlenhydrate, vornehmlich Galactose und Arabinose (Smith et al., Phytochemistry 25 (1986), 1021 ff.; Holst et al., Plant Physiol. 74 (1984), 247; Smith et al., Phytochemistry 23 (1984), 1233) dienen der Stabilisierung der Proteine (Showalter, Plant Cell 5 (1993), 9-23). Die Arabinose tritt hauptsächlich in der Hyp-Ara_1-4-, die Galaktose in der Ser-Gal-Form auf.

Darüberhinaus wurde eine Verknüpfung verschiedener Extensine über Isodityrosine- Bindungen diskutiert, was beispielsweise in Antwort auf Pathogenbefall zu einer weiteren Verstärkung der Zellwand führen kann (Brisson, L. F. et al., Plant Cell 6 (1994), 1703-1712; Epstein, J., Phytochemistry 23 (1984), 1241-1246). Intramolekulare Isodityrosinbindungen konnten in Extensinen nachgewiesen werden (Epstein et al., Phytochemistry, 23 (1984), 1241 ff.). Intermolekulare Isodityrosinbindungen konnten hingegen bisher nur in vitro nachgewiesen werden (Everdeen et al., Plant Physiol. 87 (1988), 616 ff.; Huystee et al., Plant Phys. Biochem. 33 (1995), 55 ff.).

Mit Hilfe des Prolin-Analogs 3,4-Dehydro-L-Prolin (Dhp) läßt sich die Prolyl-Hydroxylase selektiv inhibieren, so daß man die Biosynthese des Hydroxyprolins mit Hilfe von Dhp reduzieren kann. Für Wurzelscheiben der Möhre (Daucus carota) konnte nach Behandlung mit Dhp gezeigt werden, daß sie strukturell veränderte HRGPS synthetisieren. Auch die Behandlung von Tabakprotoplasten mit Dhp führte zur Regeneration von Zellwänden mit veränderter Struktur (Cooper, J. B., Plant Physiol. 104, (1994), 747-752).

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Expressionskassetten enthaltend einen erfindungsgemäßen Promotor. Unter dem Begriff Expressionskassette wird dabei die Kombination eines erfndungsgemäßen Promotors mit einer zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz verstanden. Diese Nucleinsäuresequenz kann beispielsweise eine ein Polypeptid codierende Sequenz sein, d. h. ein Strukturgen. Sie kann in sense-oder in antisense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft sein. Die Nucleinsäuresequenz kann auch eine nicht-translatierbare RNA, beispielsweise eine antisense-RNA oder ein Ribozym, codieren. Diese Nucleinsäuresequenzen können in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Promotor benutzt werden, um Pflanzen mit veränderten vorzugsweise verbesserten Phänotyp herzustellen. Weiterhin kann der Stoffwechsel der Pflanze in der Wurzel mittels des erfindungsgemäßen Promotors beeinflußt werden. Einige Beispiele zur heterologen (Über)expression und zur Antisense-Inhibierung mit dem Ziel, Stoffwechselflüsse in transgenen Pflanzen zu manipulieren sind in Herbers & Sonnewald (1996) TIBTECH 14, 198-205 zusammengefaßt. Ein Beispiel für Ribozyme wurde von Feyter (1996) Mol. Gen. Genet. 250, 329-228 publiziert. Vielfältige Anwendungsmöglichkeiten von transgenen Pflanzen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Promotoren und Vektoren erzeugt werden können, sind auch in TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology, 13 (1995), 312-397 beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können weiterhin eine Transkriptionsterminationssequenz stromabwärts des 3'-Endes der mit dem Promotor verknüpften Nucleinsäuresequenz enthalten. Unter einer Transkriptionsterminationssequenz wird dabei eine DNA-Sequenz verstanden, die am 3'-Ende eines codierenden Genabschnitts lokalisiert ist und in der Lage ist, die Beendigung der Transkription und ggf. die Synthese eines Poly-A-Schwanzes hervorzurufen. Ein Beispiel für eine solche Terminationssequenz ist die des Octopinsynthasegens.

Erfindungsgemäß können zwischen dem Promotor und der Nucleinsäuresequenz bzw. zwischen der Nucleinsäuresequenz und dem Terminator jeweils eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen liegen.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die mindestens einen erfindungsgemäßen Promotor enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Promotor in einem derartigen Vektor verknüpft mit einem Polylinker, der eine Integration beliebiger Sequenz stromabwärts des Promotors erlaubt. Dabei wird unter einem Polylinker eine DNA-Sequenz verstanden, die Erkennungssequenzen von mindestens einem Restriktionsenzym, vorzugsweise von zwei oder mehr Restriktionsenzymen, enthält.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält ein erfindungsgemäßer Vektor auch noch eine Sequenz für die Termination der Transkription, beispielsweise die des Octopinsynthasegens, stromabwärts des Promotors bzw. des Polylinkers.

Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die erfindungsgemäße Expressionskassetten enthalten. Vorteilhafterweise enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren Selektionsmarker, die geeignet sind Zellen die die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten zu identifizieren und gegebenenfalls selektionieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Vektoren geeignet zur Transformation von pflanzlichen Zellen und besonders bevorzugt zur Integration von Fremd- DNA in das pflanzliche Genom. Ein Beispiel für derartige Vektoren sind binäre Vektoren, die zum Teil auch bereits kommerziell erhältlich sind.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Promotor oder mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder Vektor genetisch modifiziert sind.

"Genetisch modifiziert" bedeutet dabei, daß die Wirtszelle einen erfindunggemäßen Promotor oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder Vektor enthält, vorzugsweise stabil ins Genom integriert, und der Promotor bzw. die Expressionskassette entweder in die Wirtszelle oder in einen Vorgänger dieser Zelle als Fremd-DNA eingebracht wurde. D. h. die erfindungsgemäßen Zellen können entweder selbst das unmittelbare Produkt eines Transformationsereignisses sein oder davon abstammende Zellen, die einen erfindungsgemäßen Promotor oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette enthalten. Als Wirtszellen kommen sowohl prokaryontische, insbesondere bakterielle, als auch eukaryontische Zellen in Frage. Eukaryontische Zellen können beispielsweise Pilzzellen sein, insbesondere der Gattung Saccharomyces, bevorzugt von der Art Saccharomyces cerevisiae.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Vektoren, erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder erfndungsgemäßen Wirtszellen zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen Pflanzenzellen, die im folgenden als transgene Pflanzenzellen bezeichnet werden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Pflanzen, die erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthalten. Diese können jeder beliebigen Pflanzenart, -gattung, -familie, -ordnung bzw. -klasse angehören. Es können sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen sein. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Pflanzen Nutzpflanzen, d. h. Pflanzen, die für den Menschen von agrarwirtschaftlichem, forstwirtschaftlichem und/oder gartenbauwirtschaftlichem Interesse sind. Bevorzugt sind dabei landwirtschaftliche Nutzpflanzen, wie z. B. Getreidearten, Mais, Reis, Kartoffeln, Rüben, Tabak, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblume, Raps oder Futter- und Weidegräser, wie Alfalfa, weißer Klee, roter Klee, Flachs, Baumwolle, Soja, Hirse, Bohne, Erbse etc. Gemüsepflanzen, wie z. B. Tomate, Gurke, Zucchini, Banane, Aubergine, Kohlarten, Artischocke, Chicoree etc. Obstbaumgewächse, Hopfen, Wein usw.. Von Interesse sind auch Kräuter und Heilpflanzen, wie z. B. Catharanthus roseus, Datura stramonium, Taxus SSP. I, Dioscorea deltoidea, Papaver somniferum, Atropa belladonna, Rauwolfia serpentina, Hyoscyamus niger, Digitalis lanata, Datura metel, Digitalis purpurea, Pilocarpus jaborandi, Cinchona ledgeriana, Aconitum napelles, Papaver somiferum.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder mit einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen Vektoren, erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder erfindungsgemäßen Wirtszellen zur Herstellung transgener hairy roots durch Agrobacterium rhizogenes.

Die erfindungsgemäßen Pflanzen können nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Transformation pflanzlicher Zellen oder Gewebe und Regeneration ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen bzw. dem Gewebe.

Verfahren zur Transformation dikotyler Pflanzen sind vielfach beschrieben (Siehe z. B. EP-A-120516; Hoekema in "The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; An et al., EMBO J 4 (1985), 277-287; Willmitzer in "Biotechnology, A Multi Volume Comprehensive Treatise Vol. 2" (1993), 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge). Die Erzeugung transgener hairy roots wurde beispielsweise beschrieben in "Gene Transfer to Plants", I. Potrykus, G. Spangenberg (Eds), Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995, S. 39 ff.; Savary et al., Plant Phys. 106(3), (1994), 1195-1204; Hamill et al., Biotechnology 5, (1987), 800-804.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen Pflanzen, das erfindungsgemäße Pflanzenzellen enthält. Der Begriff "Vermehrungsmaterial" umfaßt dabei insbesondere Samen, Früchte, Knollen, Wurzelstöcke, Stecklinge, Calluskulturen, Zellkulturen usw.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Promotoren, die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken, umfassend die folgenden Schritte:

• a) Hybridisierung einer pflanzlichen genomischen Bank mit einer cDNA, die für ein extensinähnliches Protein codiert;
• b) Isolierung positiver Klone
• c) Testung der isolierten Klone auf Promotoraktivität.

Die in Schritt a) durchgeführte Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter stringenten Bedingungen. Hierbei werden bekannte Sequenzen, die ein extensinähnliches Protein codieren, oder Teile davon zur Hybridisierung mit einer entsprechenden Bibliothek, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen eingesetzt. Bevorzugt wird die unter SEQ ID No. 7 aufgeführte Sequenz oder Teile davon eingesetzt. Die Methoden sind dem Fachmann bekannt und sind detailliert beschrieben, z. B. in Sambrook et al., loc cit.

Wie bereits vorstehend erwähnt, versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung unter einem extensinähnlichen Protein ein Protein dessen Aminosäuresequenz mindestens eines der folgenden Sequenzmotive SPPPPP, SPPPPYY, SPPPPY, SPPPPVY, PPPPPYY, PPPPPSY, PPPPPTY, PPPPPAY, PPPPPEY, PPPPPXY, SOOOO, SPPPPKH, SPPPPKK, SPPPPKKPYYPP, SPPPPSP, SPPPPSPKYVYK, SPPPPSPSPPPP, SPPPPYYYH, SPPPPYYYK, SOOOOTOVYK, SPPPPTPVYK, SOOOOVYK, SPPPPVYK, SPPPPVYSPPPP, SPPPPVHSPPPPVA, SPPPPVK, SPPPPVKSPPPP, SOOOOVKP aufweist und das eine Homologie von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 70%, bevorzugt von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und insbesondere von mindestens 95% zu der unter SEQ ID No. 7 angegebenen codierenden Region aufweist.

Die unter Schritt b) genannte Identifizierung positiver Klone und Isolierung der Promotorsequenz erfolgt nach Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und die beispielsweise beschrieben sind bei Sambrook et al., loc cit.

Die Expressionseigenschaften des isolierten Promotors können durch Reportergen- Experimente analysiert werden. Zur unter Schritt c) genannten Testung der isolierten Promotorsequenzen auf Promotoraktivität in Wurzelhaarzellen kann der Promotor beispielsweise in einer Expressionskassette bzw. in einen Vektor zur Pflanzentransformation operativ mit einem Reportergen, wie z. B. dem β-Glucuronidasegen aus E. coli, verknüpft werden. Dieses Konstrukt wird zur Transformation von Pflanzen verwendet. Anschließend wird die organspezifische Expression der β-Glucuronidase bestimmt, wie z. B. bei Martin et al. (The GUS Reporter System as a Tool to Study Plant Gene Expression in: GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Academic Press (1992), 23-43) beschrieben. Diejenigen Promotoren, die eine Wurzelhaarspezifität aufweisen, werden selektioniert und anschließend isoliert.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang die sequentielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiteren regulativen Elementen, wobei jedes der genannten Elemente seine Funktion bei der Genexpression bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Promotoren oder der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Promotoren zur wurzelhaarspezifischen Expression von Transgenen in Pflanzen.

Der Begriff "Transgen" bedeutet dabei eine in eine Pflanze künstlich eingeführte DNA- Sequenz.

Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfaßt durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur kann zu einer der oben angeführten Methoden, Mittel und Verwendungen, die im Sinne der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, dem Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der Benutzung von elektronischen Hilfsmitteln. Zu diesem Zweck bieten sich unter anderem öffentliche Datenbanken an wie die "Medline", die über Internet zur Verfügung stehen, z. B. unter der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen sind dem Fachmann geläufig und können aus dem Internet entnommen werden, z. B. unter der Adresse http://www.lycos.com. Eine Übersicht über Quellen und Informationen zu Patenten bzw. Patentanmeldungen in der Biotechnologie ist in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 gegeben.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Northern Blot Analyse von RNA aus Wurzeln

5 µg Gesamt-RNA von abgestreiften Wurzeln und Wurzelhaaren und 10 µg totaler RNA der angegebenen Tomatenorgane wurden für die "Northern blot" Analyse pro Spur aufgetragen. Hybridisierung der RNA mit radioaktiv markierter LeExt1 cDNA oder 25S rDNA cDNA. Die Transkriptgrößen sind zur rechten Seite angegeben. 25S rDNA diente als Kontrolle für gleichmässiges Beladen der Spuren und Transfer auf die Nylon Membran. Abgestreifte Wurzeln sind Wurzeln nach Wurzelhaarisolierung mit einer deutlich reduzierten Anzahl an Wurzelhaaren. Die Isolierung pflanzlicher RNA erfolgte nach der heißen Phenol Extraktion- Methode von Verwoerd et al. (Nucleic Acids Research, 17 (1989), 2362). Die RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit UV Bestrahlung daran fixiert. Nach Hybridisierung und Waschen wurde die radioaktive Membran auf Röntgenfilm exponiert. Dieser wurde nach einer übernacht-Exposition bei -80°C entwickelt. Die Intensität der Signale korreliert mit der Konzentration der spezifischen mRNA auf der Membran.

Fig. 2: Northern Blot Analyse zur Expression von LeExt1

10 µg Gesamt- RNA (5 µg im Falle der Spuren 3 und 4: 18 Tage und Erde) von 7, 14 und 18 Tage alten Keimlingen (7 Tage, 14 Tage, 18 Tage), auf Erde gewachsenen Wurzeln (Erde), Keimlingswurzeln, welche im Dunkeln (-Licht) oder im Licht (+Licht) inkubiert wurden und Kontrollen (Kontrolle), sowie verwundete Blätter (Verwundung) wurden für die RNA "Northern blot" Analyse verwendet. Radioaktiv markierte LeExt1 cDNA wurde für die Hybridisierung verwendet. Die Isolierung pflanzlicher RNA erfolgte nach Verwoerd et al. (1989) (s. o.). Die RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit UV Bestrahlung daran fixiert. Nach Hybridisierung und Waschen wurde die radioaktive Membran auf Röntgenfilm exponiert. Dieser wurde nach einer übernacht- Exposition bei -80°C entwickelt. Die Intensität der Signale korreliert mit der Konzentration der spezifischen mRNA auf der Membran.

Fig. 3: In situ Nachweis der LeExt1 mRNA

Lokalisation des LeExt1 Transkripts in Tomatenwurzeln. Lichtmikroskopische Aufnahmen von jungen Tomatenwurzeln unter sterilen Bedingungen. A, B In Paraffin eingebettete Schnitte wurden entsprechend der In Situ Hybridisierungsmethode wie in Daram et al. (Planta 206 (1998), 225-233) beschrieben mit nicht-radioaktiv markierter LeExt1 "antisense" RNA hybridisiert. A Junge Keimlingswurzel mit wachsenden Wurzelhaaren in der Differenzierungszone der Wurzel. B Wurzelhaarzone einer jungen Keimlingswurzel. Die Wurzelspitze ist auf der linken Seite lokalisiert. Die Größe des Balkens beträgt 200 µm.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung eines wurzelspezifischen Gens Pflanzenmaterial und Wurzelhaargewinnung

Als Pflanzenmaterial dienten verschiede Organe von auf Erde im Gewächshaus gewachsenen Tomatenpflanzen Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker. Für die Wurzel- und Wurzelhaargewinnung wurden 8000 oberflächensterilisierte Samen auf ein Metallgitter auf Papier (No. 0858, Schleicher & Schuell, Deutschland) unter sterilen Bedingungen in Petrischalen ausplattiert. Das Papier wurde vorgängig in 0.5x Hoagland Lösung angefeuchtet. Keimung geschah bei 22°C bei einem Tag/Nacht Zyklus von 16 h/8 h. Am Tage 3 nach der Keimung wurde das Netz um ca. 4 mm über das Papier angehoben, indem sterile Glaskugeln zwischen Netz und Papier geschoben wurden. Dies erlaubte vertikales Wachstum der Keimlingswurzeln und optimale Wurzelhaarbildung. Am Tage 5 wurden die Keimlinge mitsamt dem Netz in flüssigen Stickstoff getaucht und die Wurzeln wurden mit einem Spatel vom Netz weggekratzt. Die Wurzelhaare wurden daraufhin wie in Röhm, M. und Werner, D. (Physiologia Plantarum, 69 (1987), 129-136) beschrieben in flüssigem Stickstoff von den Wurzeln abgestreift und durch Filter über ein 250 µm Analysensieb gereinigt.

Für die "Northern blot" Analyse von Keimlingswurzeln unterschiedlichen Alters wurden die Keimlinge wie oben beschrieben während 7, 14 und 18 Tagen inkubiert und die Wurzeln entsprechend isoliert. Zur Isolierung von behaarten Wurzeln von auf Erde gewachsenen Pflanzen wurden dicht durchwachsene Pflanzentöpfe aus dem Gewächshaus vom Erdballen entfernt. Die an der seitlichen Oberfläche des Erdballens wachsenden Wurzeln wurden mit der Pinzette abgeerntet und unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren. Für Licht/Dunkel Versuche wurden Keimlinge wie oben beschrieben inkubiert in einem Tag/Nachtzyklus von 16 h/8 h Belichtung. 7 Tage alte Wurzeln wurden nach 4 stündiger Belichtung nach Beginn des Tagzyklus geerntet. Parallel dazu wurden Keimlinge während 7 Tagen im Dauerdunkeln inkubiert und danach deren Wurzeln ebenfalls geerntet. Tomatenblätter wurden wie in Peña. Cortés et al. (Planta 186, (1992) 495-502) beschrieben verwundet und nach 24 h geerntet. Als Kontrolle wurden unverwundete Blätter verwendet.

RNA Extraktion und Herstellung einer cDNA Bibliothek

Gesamt-RNA aus den angegebenen Organen wurde nach der Methode von Verwoerd et al., (Nucleic Acid Research 17, (1989), 2362) extrahiert. 7-60 µg totale RNA aus Wurzelhaaren wurde für die Isolierung der poly(A)⁺ RNA mittels dem Gebrauch von magnetischen oligodT Kügelchen (Dynabeads, Dynal, Deutschland) weiterverwendet. 700 ng poly(A)⁺ RNA wurden für die Herstellung doppelsträngiger cDNA verwendet (Pharmacia, Deutschland). Die cDNA wurde nach Anhängen eines EcoRI/NotI linkers in den Expressionsvektor λZAPII (Stratagene, Deutschland) kloniert. Verpackung in den λ Phagen erfolgte mit dem Gigapack II Gold Packaging Extract Kit von Stratagene (Deutschland).

Differentielles Durchmustern der Wurzelhaar-spezifischen cDNA Bibliothek

500,000 in Phagen verpackte cDNAs wurden auf YT Agar in Agarschalen ausplattiert und nach einem Standardprotokoll (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd ed. Cold Spring Harbour Press., Cold Spring Harbour, NY. Sambrook, 1989) mit 680 ng radioaktiv markierter revers transkribierter mRNA aus entweder Wurzelhaaren oder abgestreiften Wurzeln durchmustert. 100 putativ positive Plaques wurden einer zweiten Durchmusterung unterworfen, um Artefakte zu vermeiden. Letzlich wurden 76 positive Plaques für die in vivo Excision weiterverwendet. Die daraus folgenden Bakterienkulturen wurden in einer 96er Mikrotiter Platte in 2x YT Medium (Sambrook et al., s. o.) bei 28°C über Nacht geschüttelt. Plasmid DNA aus diesen Kulturen wurden für eine zweite Durchmusterung verwendet, indem eine Art reverser Southernmethode wie in Bucher et al. (Plant Molecular Biology, 35 (1997), 497-508) beschrieben, angewendet wurde. Nach EcoRI Verdau von vielversprechenden Plasmiden wurde die entsprechenden Inserts isoliert und für die "Northern blot" Analyse weiterverwendet.

"Northern blot" Analyse und DNA Sequenzierung

Fünf bis zehn Mikrogram totaler RNA aus den angegebenen Organen wurden nach Glyoxylierung auf ein 1.2prozentiges Agarose-Glyoxalgel geladen (Hull, R. (1985) Purification, biophysical and biochemical characterisation of viruses with special reference to plant viruses. In Mahy, B. (ed.) Virology. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK, pp. 1-24). "Northern blot" Analyse und Hybridiserungsbedingungen wurden Standardvorschriften entnommen (Sambrook et al., s. o.) Die Blots wurden bei 68°C hybridisiert. Detektion von LeExt1 mRNA wurde erreicht durch Verwendung der LeExt1 cDNA als radioaktive Sonde. Die letzte Waschung des Blots erfolgte mit 0.1 × SSC bei 68°C. Nach dem Waschen wurden die Blots auf Röntgenfilm (Kodak, Deutschland) exponiert bei -80°C. Die Transkriptgrößen wurden durch Vergleich mit glyoxylierter Marker DNA (BRL, Deutschland) bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Sequenzierung der LeExt1 cDNA (= SEQ ID. No. 7) erfolgte durch Verwendung der Dideoxysequenzierung mit T7 DNA Polymerase (Amersham, Deutschland). Sequenzanalyse erfolgte mit dem University of Wisconsin GCG Packet (Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies, O. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleid Acids Research, 12, 387-395).

Beispiel 2 Isolierung eines genomischen Fragments, das die Promotorregion des wurzelspezifischen Gens umfaßt

Eine genomische DNA Bibliothek aus Tomate (Clontech Laboratories, USA) wurde mit radioaktiv markierter LeExt1 cDNA (s. Beispiel 1) durchmustert. 500,000 Plaque formende Einheiten (PFE) der DNA Bibliothek wurden dazu auf YT Agar in Agarschalen ausplattiert, über 6 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert und auf Nylonmembranen (Hybond N, Amersham, Deutschland) transferiert (Sambrook et al., s. o.). Hybridisierungsbedingungen wurden Standardvorschriften entnommen (Sambrook et al., s. o.). 30 Plaques von der ersten Durchmusterung wurden für eine zweite Runde ausgewählt. Die Phagensuspensionen von zwei ausgewählten Plaques nach der zweiten Durchmusterung wurden erneut ausplattiert, um Phagenlysate herzustellen. Davon wurde λ DNA nach Lockett, T. (Analytical Biochemistry, 185, (1990), 230-234) präpariert. Je 600 ng λ DNA wurden daraufhin mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und die daraus resultierenden Fragmente auf einem Agarosegel mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Nach Southernblothybridisierung (Sambrook et al., s. o.) mit radioaktiv markierter LeExt1 cDNA wurde letzlich ein ungefähr 3.4 kb langes genomisches Fragment isoliert, welches mit LeExt1 cDNA hybridisiert hat und in ebenfalls mit Asp718 verdautes pBluescript II SK^- Plasmid kloniert. Das Fragment wurde durch Dideoxysequenzierung mit T7 DNA Polymerase (Amersham, Deutschland) zunächst partiell sequenziert. Dabei stellte sich heraus, daß das genomische Fragment über 204 Basenpaare mit der LeExt1 cDNA Sequenz überlappte und sich 5' aufwärts in den nichtcodierenden Bereich des LeExt1 Gens weitererstreckt.

Anschließend wurden beide Stränge des genomischen Fragments (ca. 3.4 kb) sequenziert (s. Seq ID No. 13).

Beispiel 3 Herstellung von GUS-Expressionskassetten zur Analyse der Funktionalität des Promotors

Es wurden insgesamt drei verschiedenartige GUS-Expressionskassetten hergestellt.

A Translationelle Fusion des 3.4 kb großen genomischen Fragments enthaltend ungefähr 200 Basenpaare codierende Sequenz der LeExt1 cDNA mit einer GUS Kassette. Das genomische Fragment wurde durch einen KpnI Verdau aus dem pBluescript II SK^- Plasmid herausgeschnitten, mittels einer Auffillreaktion mit der T7 DNA Polymerase geglättet (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., New York, (1998)) und in den mit SmaI verdauten und dephosphorylierten binären Vektor pBI101.3 kloniert (Clontech, USA). pBI101.3 ist ein Plasmid, das eine promotorlose GUS Kassette im binären Vektor pBIN19 enthält. Dieses Konstrukt wurde roh1 genannt.

B Transkriptionelle Fusion eines modifizierten genomischen Fragmentes mit einer GUS Kassette. Mit den Oligonukleotiden 42trx3 (5'- GAGAGTCGACGATATCGGGCGAATTGGGTACC-3' = Seq ID No. 9), enthaltend die Restriktionsschnittstelle von SaII, und 42trx4 (5'- GAGATCTAGAGGTACCGGACTTTATATAACATAAC-3' = Seq ID No. 10), enthaltend die Restriktionsschnittstelle von XbaI, wurde mittels PCR (30 sec bei 94°C Schmelzen der DNA, 1 min bei 60°C Anlagerung der Primer, 1 min bei 72°C mit 3 sec Extension pro Zyklus DNA Synthese mittels Taq DNA Polymerase [Fermentas, Litauen]) ein genomisches Fragment von ca. 3200 bp Länge synthetisiert, welchem der, mit der LeExt1 cDNA überlappende, ORF (open reading frame) fehlt. Das Fragment wurde mit SalI und XbaI verdaut und in das ebenso verdaute und dephosphorylierte pBluescript II SK^- Plasmid kloniert. Nach Isolation des Plasmids aus einer E. coli DHSa Kultur (Sambrook et al., s. o.) wurde das Fragment mittels SalI/XbaI Verdau isoliert und durch eine Auffüllreaktion mittels T7 DNA Polymerase geglättet. Das Endprodukt wurde daraufhin in den mit SmaI verdauten und dephosphorylierten binären Vektor pBI101.3 kloniert. Dieses Konstrukt wurde rohtrx genannt.

C Es wurde ein PCR Produkt von ca. 3270 bp mit Hilfe folgender Primer hergestellt: 42Xba (5'-GAGATCTAGACCATGGAGAAGAATTGG-3' = Seq ID No. 11) und 42Sal (5'- GAGAGTCGACGGGCGAATTGGGTACCG-3' = Seq ID No. 12). Die PCR Bedingungen waren: 20 sec bei 94°C Schmelzen der DNA, 45 sec bei 50°C Anlagerung der Primer, 2 min bei 72°C DNA Synthese mittels Pfu DNA Polymerase (Stratagene, Deutschland). Das PCR- Produkt wurde nach der Anleitung des Herstellers direkt in das Plasmid pCR-Script kloniert (Stratagene, Deutschland). Nach SalI/NotI Verdau wurde das PCR Produkt mit dem Klenow Enzym geglättet [Sambrook, 1989 #68] und in SmaI verdautes und dephosphoryliertes pBluescript II SK^- Plasmid kloniert. Nach Plasmidpreparation (Sambrook et al., s. o.) wurde das Plasmid mit BstXI verdaut und linearisiert. Durch serielle Verkürzung des PCR- Produktes mittels Exonuklease III und 51 Nuklease vom 5' Ende her gemäß dem Protokoll des Herstellers (Fermentas, Litauen) wurden verkürzte genomische Fragmente folgender ungefährer Länge hergestellt: 2.2 kb, 1.7 kb, 1.4 kb, 1.1 kb, 0.9 kb und 0.55 kb. Die AKTI- GUS-3'NOS Kassette aus dem Plasmid 5'AKT1-320.X Lagarde et al. (The Plant Journal, 9 (1996), 195-203) wurde mit SacI isoliert, mittels Mung Bean Nuclease Behandlung geglättet (New England BioLabs Inc., Bioconcept, Switzerland) und mit NcoI nachverdaut. Die so erhaltene GUS-3'NOS Kassette wurde in NcoI/EcoRV verdaute und dephosphorylierte pBluescript II SK Plasmide enthaltend die verkürzten genomischen Fragmente kloniert. Die so hergestellten Promotor-GUS-3'NOS Kassetten wurden durch Verdau mit SacI und SaII aus dem jeweiligen Plasmid isoliert und in SacIlSauI verdauten und dephosphorylierten binären Vektor Binl9 (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 12, (1984), 8711) kloniert. Die erhaltenenen Konstrukte wurden im folgenden BIN-Δgenx-GUS genannt, wobei x die jeweilige Fragmentlänge 2.2 kb (= Seq ID No. 1), 1.7 kb (= Seq ID No. 2), 1.4 kb (= Seq 1D No. 3), 1.1 kb (= Seq ID No. 4), 0.9 kb (= Seq ID No. 5) oder 0.55 (= Seq ID No. 6) kb bezeichnet.

Beispiel 4 Pflanzentransformation

Die beschriebenen Konstrukte enthaltend die verschieden großen Promotorfragmente wurden durch Elektroporation in den Agrobakteriumstamm C58C1 enthaltend das Plasmid pGV2260 (Deblaere et al., Nucleic Acids Research, 13, (1985), 4777-4788) eingeführt. Die Agrobakterien wurden auf YEB Medium (Vervliet et al., Journal of General Virology, 26, (1975), 33-48) kultiviert. Die Transformation von Tabak und Tomatenpflanzen erfolgte nach der Methode des durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfers, wie von Rosahl et al. (EMBO Journal, 6 (1987), 1155-1159) für Tabak und von Lillatti et al. (Biotechnology, 5, (1987), 726-730) für Tomate beschrieben, durchgeführt.

Darüberhinaus erfolgte die Transformation von Kartoffel wie bei Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8, (1989), 23-29).

Die Transformation von Mais erfolgte wie bei S. Omirulleh et al. (in "Gene Transfer to Plants", I. Potrykus, G. Spangenberg (Eds), Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995, S. 99 ff.) beschrieben.

Die oben beschriebenen Konstrukte wurden darüberhinaus durch Elektroporation in den A. rhizogenes Stamm 15834 (Jung et al., Biotechnol Lett 14, (1992), 695-700) eingeführt und anschließend zur Transformation von Catharanthus roseus mittels Agrobacterium rhizogenes in Anlehnung an Toivonen et al., Plant Cell Tissue Org. Cult. 18 (1988), 79 ff. verwendet.

In den hairy roots konnte eine starke GUS-Expression nachgewiesen werden. Die Transformation von Reis erfolgte mittels der particle bombardement-Methode, wie beispielsweise beschrieben bei Christou, Plant Mol. Biol. 35 (1997), 197-203.

Beispiel 5 Histochemische Lokalisierung der LeExt1 Promotoraktivität

Das Pflanzenmaterial wurde mit einer 0.1%igen X-Gluc Lösung (0.1 g X-Gluc in 1 ml Dimethylformamid vorlösen, 1 ml 10% Triton und 5 ml 1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7.2 dazugeben und mit Destwasser auf 100 ml auffüllen) vakuuminfiltriert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach dem Färben wurden die Pflanzen in Ethanol : Essigsäure (3 : 1) fixiert und in 100% Ethanol entfärbt. Dabei wurden grüne Pflanzenteile farblos, währenddem der blaue Farbstoff stabil bleibt; siehe Fig. 3.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (14)

1. Promotor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• a) Promotoren, die die unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebene Nucleinsäuresequenz umfassen;
• b) Promotoren, die einen funktionalen Teil der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 angegebenen Nucleinsäuresequenz umfassen und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken;
• c) Promotoren, die eine Sequenz aufweisen, die mit der unter Seq ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 6 gezeigten hybridisiert, und die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken; und
• d) Promotoren von Genen, die ein Protein codieren dessen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 60% zu der unter SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist, wobei diese Promotoren in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken.

2. Promotor nach Anspruch 1, der ein pflanzlicher Promotor ist.

3. Expressionskassetten enthaltend einen Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2.

4. Vektor enthaltend einen Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eine Expressionskassette nach Anspruch 3.

5. Vektor nach Anspruch 4, der zur Transformation von pflanzlichen Zellen geeignet ist.

6. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit einem Promotor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, mit einer Expressionskassette nach Anspruch 3 oder einem Vektor nach Anspruch 4 oder 5.

7. Wirtszelle nach Anspruch 6, die eine Pflanzenzelle ist.

8. Hairy roots enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.

9. Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.

10. Vermehrungs- oder Erntematerial von Pflanzen nach Ansprüch 9, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 7.

11. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten mit einem Vektor nach Anspruch 4 oder 5 oder mit einer Expressionskassette nach Anspruch 3 oder mit einer Wirtszelle nach Anspruch 6 transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert.

12. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Promotoren, die in Pflanzen eine wurzelspezifische Expression einer von ihnen kontrollierten codierenden Nucleotidsequenz bewirken, umfassend die folgenden Schritte:

• a) Hybridisierung einer pflanzlichen genomischen Bank mit einer cDNA, die für ein extensinähnliches Protein codiert;
• b) Isolierung positiver Klone;
• c) Testung der isolierten Klone auf Promotoraktivität.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die verwendete cDNA identisch mit einem Teil der unter SEQ ID No. 7 dargestellten Nukleotidsequenz ist.

14. Verwendung eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eines nach einem Verfahren nach den Ansprüchen 11 bis 13 identifizierten Promotors zur wurzelhaarspezifischen Expression von Transgenen in Pflanzen.