DE69635890T2

DE69635890T2 - Genetische kontrolle des blühens

Info

Publication number: DE69635890T2
Application number: DE69635890T
Authority: DE
Inventors: John Innes Centre Caroline DEAN; Colin Richard MACKNIGHT; John Innes Centre Ian BANCROFT; Katharine Clare LISTER
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: WO1996038560A3; WO1996038560A2; CA2221092C; GB9511196D0; AU709423B2; ATE319828T1; ES2260770T3; CA2221092A1; DE69635890D1; JPH11506001A; US6140085A; JP3898223B2; EP0832234A2; EP0832234B1; PT832234E; AU5906096A

Description

Diese Erfindung betrifft die genetische Steuerung der Blüte von Pflanzen und das Klonieren und Exprimieren von darin involvierten Genen. Insbesondere betrifft die Erfindung das Klonieren und Exprimieren des FCA-Gens von Arabidopsis thaliana und Homologen aus anderen Spezies sowie die Manipulation und Verwendung dieser Gene in Pflanzen.
Eine effiziente Blütezeit bei Pflanzen ist wichtig, insbesondere, wenn das beabsichtigte Produkt die Blüte oder der daraus gebildete Samen ist. Ein Aspekt hiervon ist der Eintritt der Blüte: ein Verfrühen oder Verzögern des Eintritts der Blüte kann für Landwirte und Samenproduzenten nützlich sein. Das Wissen um die genetischen Mechanismen, die die Blüte beeinflussen, liefert ein Mittel zur Veränderung der Blüteneigenschaften der Targetpflanze. Spezies, für die die Blüte für den Fruchtertrag wichtig ist, sind zahlreich, insbesondere alle Früchte, die aus Samen wachsen, wofür wichtige Beispiele Getreidesorten, Reis und Mais, die für wärmere Klimazonen wahrscheinlich die agronomisch wichtigsten Sorten sind, und Weizen, Gerste, Hafersorten und Roggen in gemäßigteren Zonen sind. Wichtige Samenprodukte sind Ölsamenraps, Zuckerrübe, Mais, Sonnenblume, Sojabohne und Sorghum. Zahlreiche Feldfrüchte, die für ihre Wurzeln geerntet werden, werden natürlich jährlich aus Samen gezüchtet, und die Produktion von Samen jeglicher Art ist sehr stark von der Fähigkeit der Pflanze abhängig, zu blühen, bestäubt zu werden und Samen zu bilden. Im Bereich des Gartenbaus ist eine Steuerung des Eintritts der Blüte wichtig. Gartenbaupflanzen, deren Blüte gesteuert werden kann, umfassen (Kopf)Salat, Endivie und Gemüsekohl, einschließlich Kohl, Brokkoli und Karfiol (Blumenkohl), sowie Nelken und Geranien.
Arabidopsis thaliana ist eine fakultative Langtagspflanze, die an langen Tagen früh blüht und an kurzen Tagen später blüht. Da sie ein kleines, gut charakterisiertes Genom aufweist, relativ leicht transformiert und regeneriert werden kann und einen raschen Wachstumszyklus hat, ist Arabidopsis eine ideale Modellpflanze, an der die Blüte und ihre Steuerung untersucht werden kann.
Eines der Gene, die für rasche Blühinduktion erforderlich sind, ist das FCA-Gen (Koornneef et al. (1991)). Pflanzen, die Mutationen dieses Gens in sich tragen, blühen viel später als Wildtyppflanzen unter langen Photoperioden und kurzen Photoperioden. Es gibt einen beträchtlichen Bereich bezüglich der Blütezeit innerhalb verschiedener mutierter fca-Allele. Das extremste (fca-1) blüht unter langen Photoperioden mit bis zu 40 Blättern, während fca-3, fca-4 mit ~20 Rosettenblättern im Vergleich zu 9 im Fall von Wildtyp-Landsberg-erecta blühen. Die späte Blüte aller fca-Mutanten kann zu früher Blüte, sowohl in langen als auch in kurzen Photoperioden, gebracht werden, wenn imbibierte Samen, oder Pflanzen mit unterschiedlichen Reifealtern, 3-8 Wochen lang bei 4 °C einer Vernalisationsbehandlung unterzogen werden (Chandler & Dean (1994)).
Die Erfinder klonierten und sequenzierten das FCA-Gen von Arabidopsis thaliana, ein Homolog von Brassica und mutierte Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid mit FCA-Funktion kodiert. Fachleuten wird bekannt sein, dass sich "FCA-Funktion" auf die Fähigkeit bezieht, den Eintritt der Blüte phänotypisch wie das FCA-Gen von Arabidopsis thaliana zu beeinflussen, insbesondere auf die Fähigkeit, eine fca-Mutation in Arabidopsis thaliana zu komplementieren.
Nucleinsäure gemäß der Erfindung kann für ein Polypeptid kodieren, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, oder für ein Allel, eine Variante, ein Derivat oder eine Mutante davon, das bzw. die zumindest etwa 75 % Gesamtsequenzidentität mit der Sequenz aus 2 aufweist. Besondere Varianten umfassen jene, in denen die Aminosäurereste stromauf des dritten Methionins und/oder stromauf des zweiten Methionins in der Aminosäuresequenz aus 2 nicht umfasst sind.
Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Sequenz eines FCA-Gens von Arabidopsis thaliana aufweisen, oder aber eine Mutante, Variante (oder ein Derivat) oder ein Allel der gemäß den vorliegenden Ansprüchen bereitgestellten Sequenz sein. Bevorzugte Mutanten, Varianten und Allele sind jene, die für ein Protein kodie ren, das eine funktionelle Eigenschaft des Proteins beibehält, für das das Wildtyp-Gen kodiert, insbesondere die Fähigkeit, die Blüte, wie hierin erläutert, zu fördern. Ein Fördern der Blüte kann die Blütezeit früher stattfinden lassen, sie vorantreiben oder sie beschleunigen. Andere bevorzugte Mutanten, Varianten oder Allele kodieren für ein Protein, das die Blüte im Vergleich zum Wildtyp oder zu einem Gen mit der bereitgestellten Sequenz verzögert. Veränderungen an einer Sequenz, um eine Mutante oder Variante zu bilden, können durch eine oder mehrere aus Insertion, Deletion oder Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden in der Nucleinsäure gebildet werden, was zur Insertion, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren führt. Natürlich sind Veränderungen an der Nucleinsäure, die keinen Unterschied zur kodierten Aminosäuresequenz ergeben, ebenfalls eingebunden. Besondere Varianten, Mutanten, Allele und Varianten werden nachstehend erläutert.
Eine bevorzugte Nucleinsäuresequenz, die die für das FCA-Gen kodierende Region abdeckt, ist in 1 gezeigt, und die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die für FCA-ORF kodiert, ist in 2 gezeigt. Nucleinsäure kann Veränderungen mittels Substitution von Nucleotiden und/oder einer Kombination von Addition, Insertion und/oder Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden mit oder ohne Veränderung der kodierten Aminosäuresequenz (aufgrund der Degeneration des genetischen Codes) unterzogen werden.
Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Intron wie beispielsweise ein Intron, wie es in 1 gezeigt ist, beispielsweise Intron 3 (wie in verschiedenen Ausführungsform, z.B. wie hierin veranschaulicht), umfassen, unabhängig davon, ob die kodierte Aminosäuresequenz verändert ist oder nicht. Die Variante FCA α_B beispielsweise, deren Nucleinsäuresequenz in 3 gezeigt ist, umfasst Intron 3 der Sequenz aus 1, sodass Translation der Sequenz in einer sich von der Sequenz aus 2 unterscheidenden Aminosäuresequenz resultiert (Intron 3 aus 1 enthält ein Stoppcodon an 3026-3028, das potenziell in Transkripten verwendet wird).
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, der Nucleinsäure mit jeder beliebigen der bereitgestellten Sequenzen umfasst, vorzugsweise einen Vektor, aus dem Polypeptid, für das die Nucleinsäuresequenz kodiert, exprimiert werden kann. Der Vektor ist vorzugsweise zur Transformation in eine Pflanzenzelle geeignet. Die Erfindung umfasst weiters eine Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert wird, insbesondere eine Pflanzenzelle. Somit wird eine Wirtszelle, wie eine Pflanzenzelle, die Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, bereitgestellt. Innerhalb der Zelle kann die Nucleinsäure in das Chromosom eingebunden werden. Es kann mehr als eine heterologe Nucleotidsequenz pro haploidem Genom geben. Dies ermöglicht beispielsweise erhöhte Expression des Genprodukts im Vergleich zu endogenen Konzentrationen, wie nachstehend noch erläutert wird.
Ein Vektor, der Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, muss keinen Promotor umfassen, insbesondere, wenn der Vektor verwendet wird, um die Nucleinsäure in Zellen für Rekombination in das Genom einzuführen.
Nucleinsäuremoleküle und Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung können isoliert und/oder gereinigt von ihrer natürlichen Umgebung bereitgestellt werden, in im Wesentlichen reiner oder homogener Form oder frei oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure oder Genen der Spezies von Interesse oder von einem anderen Ursprung als die Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, die Blüte zu beeinflussen, z.B. in der Arabidopsis-thaliana-Nucleinsäure eine andere als die FCA-Sequenz. Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann cDNA, RNA, genomische DNA umfassen und kann vollständig oder teilweise synthetisch sein. Die Bezeichnung "Isolat" kann alle diese Möglichkeiten umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch das Expressionsprodukt von jeder der offenbarten Nucleinsäuresequenzen und Verfahren zur Herstellung des Expressionsprodukts durch Expression aus der dafür kodierenden Nucleinsäure unter geeigneten Bedingungen in geeigneten Wirtszellen, z.B. E. coli (siehe Beispiel 7). Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden in der Lage sein, Vektoren zu konstruieren und Arbeitsvorschriften zur Expression und Gewinnung von Produktion rekombinanter Genexpression zu entwerten. Geeignete Vektoren können ausgewählt oder konstruiert werden und enthalten eine oder mehrere geeignete Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminationsfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene und andere Sequenzen je nach Bedarf. Weitere Details hierzu sind beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), zu finden. Transformationsverfahren hängen vom verwendeten Wirt ab, sind jedoch durchwegs bekannt. Zahlreiche bekannte Verfahren und Arbeitsvorschriften zur Manipulation von Nucleinsäure wie beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführen von DNA in Zellen und Genexpression sowie Analyse von Proteinen werden im Detail in Short Protocols in Molecular Biology, 2. Auflage, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1992), beschrieben.
Gereinigtes FCA-Protein oder ein Fragment, eine Mutante oder Variante davon, z.B. rekombinant durch Expression aus dafür kodierender Nucleinsäure gebildet, kann verwendet werden, um Antikörper unter Verwendung von Verfahren zu züchten, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, wie in Beispiel 7 dargestellt wird. Antikörper und Polypeptide, die Antigen-Bindungsfragmente von Antikörpern umfassen, können zur Identifikation von Homologen aus anderen Spezies, wie nachstehend noch näher erläutert wird, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiters eine Pflanze, die eine Pflanzenzelle umfasst, die Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, z.B. als ein Resultat des Einführens der Nucleinsäure in die Zelle oder in einen Vorläufer davon, umfasst, und geselbstete oder hybride Nachkommenschaft und jeglichen Abkömmling von solch einer Pflanze, auch jede(n) beliebige(n) Teil oder Propagationseinheit solch einer Pflanze, Nachkommenschaft oder Abkömmling, einschließlich Samen.
Das FCA-Gen kodiert für ein großes Protein (796 Aminosäuren, wie in 2 gezeigt) mit Homologie zu einer Klasse von Proteinen, die als RNA-Bindungsproteine bezeichnet werden (Burd & Dreyfuss (1994)). Diese Proteine enthalten 80 Aminosäuren, RNA-Erkennungsmotive (RRMs) und weisen eine modulare Struktur auf – sie können mehrere RNA-Bindungsdomänen und -Hilfsdomänen enthalten, die reich an Aminosäuren wie Glycin, Glutamin und Prolin sind. Die RRM-Proteine können basierend auf Homologie innerhalb und rund um die RRM-Domänen in Subfamilien unterteilt werden. Das FCA-Protein ist am stärksten zu einer Subfamilie von RNA-Bindungsproteinen homolog (Cluster 1028.16; identifiziert unter Verwendung von BEAUTY-Datenbanksuche, Worley et al. (1995)), wie durch das Drosophila-elav-Gen beispielhaft dargestellt werden kann (Robinow et al. (1988)). Andere Elemente dieser Familie umfassen das Drosophila-Protein Sexlethal; die menschlichen Proteine des Nervensystems HuD, HuC, HeI-N1 und HeI-N2; und die Xenopus-Proteine elrA, elrB, elrC, elrD und etr-1. FCA weist zwei RNA-Bindungsdomänen auf, während die meisten der Elemente der elav-Gen-Familie drei RNA-Bindungsdomänen aufweisen. Die ersten zwei RNA-Bindungsdomänen aus der elav-Familie (und die Abstände zwischen den Domänen) sind den RNA-Bindungsdomänen im FCA-Protein ähnlich. Wie das FCA-Protein weist das elav eine Region mit hohem Glutamingehalt auf. Auch gibt es eine 20-Aminosäuren-Region in der Nähe des C-Terminus des FCA-Proteins, die starke Homologie zu ORFs aus zwei Genen mit unbekannter Funktion aus Hefe und C. elegans zeigt.
Das FCA-Transkript ist alternativ gespleißt. Fünf Formen des Transkripts werden in Zellen gebildet. Eine, die hierin als FCA-Transkript-β bezeichnet wird, ist etwa 2 kb lang und weist frühreife Termination und Polyadenylierung innerhalb von Intron 3 auf. FCA α_A und α_B weisen 19 von 20 Intronen ausgespleißt auf, Intron 3 (2 kb) jedoch bleibt. FCA α_A ist dasselbe wie α_B, außer an Intron 13, wo verschiedene 5'- und 3'-Exon/Intron-Verbindungen verwendet werden. FCA α_A verwendet die 5'-Exon/Intron-Verbindung bei 7055 bp (genomische Sequenz, 1) und die 3'-Exon/Intron-Verbindung bei 7377 bp. FCA α_B verwendet die 5'-Exon/Intron-Verbindung bei 7130 bp (genomische Sequenz, 1) und die 3'-Exon/Intron-Verbindung bei 7295 bp. FCA-Transkripte γ_A und γ_B haben beide Intron 3 entfernt, und γ_A und γ_B verwenden dieselben Verbindungen rund um Intron 13 wie α_A bzw. α_B. Nur γ_B kodiert sowohl für RNA-Bindungsdomänen als auch für die konservierte C-terminale Domäne (10).
Für RNA-Bindungsproteine wurde gezeigt, dass sie in mehrere Aspekten von posttranskriptionaler Regulation eingebunden sind. Das RNP-Motiv bildet eine β-Faltblatt-RNA-Bindungsoberfläche, die die RNA als eine offene Plattform zur Wechselwirkung entweder mit anderen RNA-Molekülen oder mit anderen Proteinen einbindet. Eines der am besten charakterisierten Gene, das für ein das RNP-Motiv enthaltendes Protein kodiert, ist das Drosophila-Sex-Lethal-Gen (Bell et al. (1988)). Das Sex-Lethal-Protein ist in die Veränderung der Spleißung seiner eigenen und anderer Transkripte innerhalb des Stoffwechselweges eingebunden, der das Geschlecht in Drosophila bestimmt. Nur das alternativ gespleißte Produkt ergibt ein aktives Protein. Somit ist dieses Genprodukt für die Bestimmung und Aufrechterhaltung des weiblichen Geschlechts verantwortlich. Für andere RNA-Bindungsproteine wurde gezeigt, dass sie durch Lokalisierung spezifischer Transkripte im Nucleus oder Prävention von Translation von spezifischen Transkripten funktionieren. Sechs unabhängig voneinander isolierte fca-Mutanten wurden bereits beschrieben, und die Erfinder identifizierten die Sequenzänderungen, die eine Reduktion der FCA-Aktivität in drei Fällen verursachen. Die fca-1-Mutation setzte ein C-Nucleotid an Position 6861 (1) zu einem T um. Dadurch wird ein Glutamincodon (CAA) zu einem Stoppcodon (TAA) verändert. Die fca-3-Mutation setzte ein G-Nucleotid an Position 5271 zu einem A um. Die Wirkung dieser Mutation ist, die 3'-Spleißverbindung von Intron 7 so zu verändern, dass eine neue 3'-Spleißverbindung 28 Nucleotide in Exon 8 hinein verwendet wird. Die fca-4-Mutation ist das Resultat einer Neuanordnung (einer Inversion, die das 3'-Ende des Gens 250 kb weit wegnimmt) mit der Bruchstelle an Position 4570 (innerhalb von Intron 4).
Die Bereitstellung von Sequenzinformation für das FCA-Gen von Arabidopsis thaliana ermöglicht das Gewinnen von homologen Sequenzen aus Arabidopsis und anderen Pflanzenspezies. In Southern-Hybridisierungsversuchen hybridisiert eine Sonde, die das FCA-Gen von Arabidopsis thaliana enthält, an DNA, die aus Brassica rapa, Brassica napus und Brassica oleraceae extrahiert wird. Im Gegensatz zu den meisten Arabidopsis-Genen, die normalerweise am B.-napus-Genom in 6 Kopien vorhanden sind, ist das FCA-Gen an nur einem Chromosomenpaar zweimal vorhanden. Ein FCA-Homolog aus Brassica napus wurde isoliert und sequenziert und zeigt 86,1 % mittlere Nucleotidsequenzhomologie innerhalb der Exone, 65,8 % innerhalb der Introne und 78 % Identität auf Aminosäureebene auf (87 % Ähnlichkeit). Dieses Brassica-Gen komplementiert eine Mutation im Arabidopsis-FCA-Gen vollständig und kann daher als ein vollständig funktionelles Homolog betrachtet werden. Homologe wurden auch durch Southern-Blot-Analyse aus Löwenmaul, Tabak, Zuckerrübe, Tomate, Linse, Weizen, Mais, Reis, Roggen, Lolium und Hafersorten nachgewiesen.
Das Brassica-FCA-Homolog, dessen Nucleotidsequenz, einschließlich der Kodiersequenz, in 8a angegeben ist und dessen Aminosäuresequenz, für die die Sequenz aus 8a kodiert, in 8b gezeigt ist, stellt weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung gemäß jenen, die für das Arabidopsis-FCA-Gen offenbart sind, dar und stellt diese auch bereit. Mutanten, Allele und Varianten beispielsweise sind eingebunden, z.B. jene, die zumindest 80 % Identität mit der Sequenz aus 8b aufweisen, wenn auch hohe Niveaus von Aminosäureidentität auf funktionell signifikante Domänen oder Regionen, wie erläutert, eingeschränkt sein können.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleinsäure, die für ein FCA-Homolog kodiert, das unter Verwendung einer Nucleotidsequenz gewonnen wird, die von jener aus 1 abstammt, oder die Aminosäuresequenz aus 2. Die Nucleotidsequenz und/oder Aminosäuresequenz weisen Homologie zur Sequenz auf, für die die Nucleotidsequenz aus 1 kodiert, zumindest etwa 75 %, oder zumindest etwa 78 %, oder zumindest etwa 80 %, Homologie, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % Homologie, wobei diese Sequenz aus Spezies stammt, die nicht Arabidopsis thaliana sind, und das kodierte Polypeptid weist einen selben Phänotyp wie das Arabidopsisthaliana-FCA-Gen auf, vorzugsweise die Fähigkeit, den Eintritt der Blüte zu beeinflussen. Dies kann die Blüte im Vergleich zu Arabidopsis-thaliana-FCA fördern oder verzögern, und Mutanten, Varianten oder Allele können die Blüte im Vergleich zu Wildtyp fördern oder verzögern. "Homologie" kann verwendet werden, um auf Identität Bezug zu nehmen.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der FCA-Polypeptide der Arabidopsisthaliana- und Brassica-napus-Gene, wie in 9 gezeigt, zeigt Domänen und Regi onen mit funktioneller Bedeutung auf, d.h. solche, die bei der Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze, wie z.B. des Eintritts der Blüte, eine Rolle spielen. Deletionsmutagenese beispielsweise kann verwendet werden, um die Funktion einer Region des Polypeptids und seine Rolle bei der oder seine Notwendigkeit für die Beeinflussung des Blüteneintritts zu testen.
Die hierin bereitgestellte Nucleotidsequenzinformation, oder jeder beliebige Teil davon, kann in einer Datenbanksuche verwendet werden, um homologe Sequenzen zu suchen, von denen Expressionsprodukte auf ihre Fähigkeit getestet werden können, eine Blüteneigenschaft zu beeinflussen. Diese können FCA-Funktion oder die Fähigkeit haben, einen mutierten Phänotyp zu komplementieren, wobei der Phänotyp verzögerte Blütezeit ist, worin die Verzögerung durch eine Vernalisationsbehandlung umgekehrt werden kann.
Vernalisation ist auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt, und geeignete Bedingungen stehen Fachleuten zur Verfügung. Pflanzen können, sofort nach der Aussaat, in der Samenphase vernalisiert werden. Dies kann 8 Wochen lang in einer achtstündigen Photoperiode (z.B. fluoreszierendes Licht, PAR 9,5 mmol m^–2s^–1, R/FR-Verhältnis 3,9) bei einer Temperatur von 5 °C +/– 1 °C durchgeführt werden.
In öffentlichen Sequenzdatenbanken identifizierten die Erfinder erst jüngst mehrere Arabidopsis-cDNA-Klonsequenzen, die in Zufalls-Sequenzierungsprogrammen gewonnen wurden und Homologie zu FCA sowohl innerhalb der RRM-Domänen als auch der C-terminalen Regionen aufweisen. BLAST- und FASTA-Suchen von Datenbanken identifizierten 23 exprimierte Arabidopsis-Sequenzmarkierungen (ESTs). Diese Klone wurden erhalten und in wenig stringenten Hybridisierungsversuchen mit verschiedenen Regionen des FCA-Gens (zentral und 3') verwendet. Acht Klone zeigen gute Homologie zum 3'-Teil des FCA-Gens, zwei Klone zeigen gute Homologie zum zentralen Teil, und ein Klon zeigt gute Homologie zu beiden (42 A 4 – ein anderes RNA-Bindungsprotein). In ähnlicher Weise identifizierten die Erfinder unter zufällig sequenzierten Reis-cDNAs 10 Reis-ESTs. Diese hybridisieren an genomische FCA- und cDNA-Klone unter wenig stringenten Bedingungen. Fünf Klone zeigen gute Hybridisierung an FCA, insbesondere C1480.
Durch Sequenzieren von Homologen, Untersuchen ihrer Expressionsmuster und Überprüfen der Wirkung einer Veränderung ihrer Expression sind Gene, die eine ähnliche Funktion wie FCA bei der Regulierung der Blütezeit ausüben, erhältlich.
Das hohe Niveau an Homologie zwischen den FCA-Genen von Arabidopsis thaliana und Brassica napus, wie hierin offenbart, kann auch für die Identifikation von weiteren Homologen, beispielsweise unter Verwendung von Oligonucleotiden (z.B. einem degenerierten Pool), die auf Grundlage von Sequenzkonservierung entworfen werden, genutzt werden.
Im Allgemeinen kann eine Nucleinsäure gemäß der Erfindung eine Nucleotidsequenz umfassen, die für ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, einen mutierten Phänotyp zu komplementieren, der eine verzögerte Blüte aufweist, worin die Verzögerung durch eine Vernalisationsbehandlung korrigiert werden kann. Auch stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die eine Mutante oder Variante eines Wildtypgens ist, die für ein Polypeptid kodiert, mit der Fähigkeit bereit, den Eintritt der Blüte zu beeinflussen, wobei der mutierte oder variierte Phänotyp eine verzögerte Blüte aufweist, wobei dieser Eintritt der Blüte durch Vernalisation korrigiert wird. Diese werden vom CO-Gen, über das Putterill et al. (1995), Putterill et al. (1993), berichteten, und vom LD-Gen, über das Lee et al. (1994) berichteten, unterschieden. LD zeigt darin ähnliche Eigenschaften wie das FCA-Gen, dass eine Mutation im Gen zu später Blüte führt, was durch eine Vernalisationsbehandlung korrigiert wird, doch LD erfordert ein zweites Genprodukt, um die Blütezeit im Arabidopsis-thaliana-Landsberg-erecta-Ökotyp zu beeinflussen (Lee et al. (1994), Koornneef et al. (1994)). Somit kann in zahlreichen Pflanzenspezies eine Manipulation des LD-Gens alleine die Blütezeit nicht beeinflussen. Die Wirkung von FCA ist der Wirkung von Phytochrom B darin entgegengesetzt, dass Mutationen in PHYB (hy3) zu früher Blüte führen und die Einführung eines intakten PHYB-Gens in hy3-Mutanten normale Blütezeit wiederherstellt (Wester et al. (1994)). LD und CO werden aus dem Umfang der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen. FCA und Mutanten, Varianten und Allele davon können eine LD-Mutation nicht komplementieren. LD und Mutanten, Varianten und Allele davon können eine FCA-Mutation nicht komplementieren.
Die FCA-Aminosäuresequenz unterscheidet sich von jenen von CO und LD grundsätzlich.
Die Wirkung von FCA kann auch von ektopischer Expression von Meristemidentität oder MADS-Box-Genen unterschieden werden, die die Blütezeit verändern (Weigel & Nilsson (1995), Chung et al. (1994), Mandel & Yanofsky (1995), Mizukama & Ma (1992)). Neben einem frühen Blütephänotyp führt ektopische oder Überexpression von Meristemidentität oder MADS-Box-Genen zu zahlreichen zusätzlichen Störungen sowohl des vegetativen als auch des floralen Phänotyps der Pflanze (z.B. Kurzwüchsigkeit, herabgesetzte Apikaldominanz, sterile Blumen).
Ebenfalls gemäß der Erfindung wird eine Pflanzenzelle bereitgestellt, die in ihrem Genom eine Nucleotidsequenz inkorporiert hat, in der verschiedene Intronen entfernt wurden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung solch einer Pflanzenzelle bereit, das das Einführen eines Vektors, der die Nucleotidsequenz umfasst, in eine Pflanzenzelle und das Verursachen oder Ermöglichen von Rekombination zwischen dem Vektor und dem Pflanzenzellengenom, um die Nucleotidsequenz in das Genom einzuführen, umfasst.
Pflanzen, die eine Pflanzenzelle gemäß der Erfindung umfassen, zusammen mit jedem beliebigen Teil oder jeder beliebigen Propagationseinheit davon, Samen, geselbsteter oder hybrider Nachkommenschaft und Abkömmlingen und jeglichem Teil oder jeglicher Propagationseinheit davon, werden auch bereitgestellt.
Die Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Beeinflussung der Blüteneigenschaften einer Pflanze, umfassend die Expression einer heterologen FCA-Gen-Sequenz (oder einer Mutante, eines Allels, einer Variante oder eines Homologs davon, wie erläutert) innerhalb von Zellen der Pflanze, bereit. Die Bezeichnung "heterolog" gibt an, dass das betreffende Gen/die betreffende Sequenz von Nucleotiden in die genannten Zellen der Pflanze oder eines Vorgängers davon unter Verwendung von Gentechnik, d.h. durch menschliches Zutun, eingeführt wurde. Das Gen kann an einem extragenomischen Vektor vorhanden sein oder, vorzugsweise stabil, in das Genom inkorporiert sein. Das heterologe Gen kann ein endogenes äquivalentes Gen ersetzen, d.h. eines, das normalerweise dieselbe oder eine ähnliche Funktion bei der Steuerung der Blüte ausübt, oder die insertierte Sequenz kann zum endogenen Gen zusätzlich vorhanden sein. Ein Vorteil des Einführens eines heterologen Gens ist die Fähigkeit, Expression des Gens der Steuerung eines eigens ausgewählten Promotors zu unterstellen, um in der Lage zu sein, Genexpression und somit die Blütezeit je nach Bedarf zu beeinflussen. Weiters können Mutanten und Varianten des Wildtypgens, z.B. mit höherer oder niedrigerer Aktivität als Wildtyp, anstelle des endogenen Gens verwenden werden.
Die grundlegende Blüteneigenschaft, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung verändert werden kann, ist der Eintritt der Blüte. Unterexpression des Genprodukts des FCA-Gens führt zu verzögerter Blüte (wie durch den fca-mutierten Phänotyp und Beispiel 3, Antisense-Versuche, angegeben wird), die durch eine Vernalisationsbehandlung auch zu früher Blüte umgekehrt werden kann; Überexpression kann zu früher Blüte (Beispiele 2, 4 und 5) führen. Dieses Ausmaß an Steuerung ist nützlich, um gleichzeitige Blüte von männlichen und weiblichen Elternlinien beispielsweise in einer Hybridproduktion sicherzustellen. Eine andere Verwendung ist die Beschleunigung oder Verzögerung der Blüte gemäß den Vorgaben des Klimas, um die Vegetationsperiode zu verlängern oder zu verkürzen. Dies kann die Verwendung von Antisense- oder Sense-Regulierung einbinden.
Die Nucleinsäure gemäß der Erfindung, wie z.B. ein FCA-Gen oder -Homolog, kann der Steuerung eines extern induzierbaren Genpromotors unterstellt werden, wodurch der Eintritt der Blüte durch den Benutzer gesteuert werden kann. Dies ist von Vorteil, da Blütenbildung und darauf folgende Ereignisse wie das Ansetzen von Samen zeitlich so festgelegt werden können, dass sie der Nachfrage am Markt entsprechen, beispielsweise im Fall von Schnittblumen oder dekorativen blühenden Topfpflanzen.
Ein Verzögern der Blüte bei Topfpflanzen hat den Vorteil, dass die für den Transport des Produkts vom Produzenten zur Verkaufsstelle verfügbare Zeit verlängert werden kann, und eine Verlängerung der Blütezeit ist ein offensichtlicher Vorteil für den Käufer.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Genkonstrukt bereit, das einen induzierbaren Promotor umfasst, der operativ an eine Nucleotidsequenz gebunden ist, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, wie z.B. das FCA-Gen oder Arabidopsis thaliana, ein Homolog aus einer anderen Pflanzenspezies, z.B. einer Brassica wie Brassica napus, oder jegliche Mutante, Variante oder jegliches Allel davon. Wie hierin erläutert ermöglicht dies die Steuerung von Expression des Gens. Die Erfindung stellt auch Pflanzen bereit, die mit dem Genkonstrukt transformiert sind, sowie Verfahren, die das Einführen eines solchen Konstrukts in eine Pflanzenzelle und/oder die Induktion von Expression eines Konstrukts innerhalb einer Pflanzenzelle durch Anwendung eines geeigneten Stimulus, eines wirksamen exogenen Induktors, umfassen.
Die Bezeichnung "induzierbar", wie sie für einen Promotor verwendet wird, ist Fachleuten durchwegs bekannt. Im Wesentlichen wird Expression unter der Steuerung eines induzierbaren Promotors "angeschaltet" oder in Reaktion auf einen angewandten Stimulus gesteigert. Die Art des Stimulus variiert zwischen Promotoren. Einige induzierbare Promotoren führen in Abwesenheit des geeigneten Stimulus zu niedrigen oder nicht nachweisbaren Expressionsniveaus (oder zu keiner Expression). Andere induzierbare Promotoren verursachen nachweisbare konstitutive Expression in Abwesenheit des Stimulus. Auf welchem Niveau sich Expression auch in Abwesenheit des Stimulus befindet, Expression aus jeglichem induzierbaren Promotor wird in Gegenwart des korrekten Stimulus gesteigert. Die bevorzugte Situation ist, wenn das Expressionsniveau bei Anwendung des relevanten Stimulus um ein Ausmaß ansteigt, das wirksam ist, um eine phänotypische Eigenschaft zu verändern. Somit kann ein induzierbarer (oder "schaltbarer") Promotor verwendet werden, der in Abwesenheit des Stimulus ein Grund-Expressionsniveau verursacht, worin dieses Niveau zu gering ist, um einen erwünschten Phänotyp hervorzurufen (und tatsächlich null sein kann). Bei Anwendung des Stimulus wird Expression gesteigert (oder angeschaltet), und dies auf ein Niveau, das den erwünschten Phänotyp entstehen lässt.
Geeignete Promotoren umfassen den Blumenkohlmosaikvirus-35S- (CaMV-35S-) Genpromotor, der auf einem hohen Niveau in praktisch allen Pflanzengeweben exprimiert wird (Benfey et al., 1990a und 1990b); den Blumenkohl-meri-5-Promotor, der im vegetativen Apikalmeristem sowie in mehreren gut lokalisierten Abschnitten in Pflanzenkörpern, z.B. im inneren Phloem, in der Blütenanlage, in Verzweigungspunkten in Wurzeln und Sprossen, exprimiert wird (Medford (1992), Medford et al. (1991)), und den Arabidopsis-thaliana-LEAFY-Promotor, der sehr früh in der Blütenentwicklung exprimiert wird (Weigel et al. (1992)).
Wird ein ausgewähltes Genkonstrukt in eine Zelle eingeführt, so müssen bestimmte Überlegungen in Betracht gezogen werden, die Fachleuten durchwegs bekannt sind. Die zu insertierende Nucleinsäure sollte innerhalb eines Konstrukts assembliert werden, das wirksame Regulationselemente enthält, die Transkription steuern. Es muss ein Verfahren zum Transport des Konstrukts in die Zelle verfügbar sein. Befindet sich das Konstrukt innerhalb der Zellmembran, so tritt Integration in das endogene chromosomale Material entweder ein oder nicht. Schließlich muss, soweit Pflanzen betroffen sind, der Target-Zelltyp so beschaffen sein, dass Zellen zu ganzen Pflanzen neu entwickelt werden können.
Pflanzen, die mit dem DNA-Segment transformiert sind, das die Sequenz enthält, können mittels Standardverfahren hergestellt werden, die bereits für die genetische Manipulation von Pflanzen bekannt sind. DNA kann unter Verwendung jeglicher geeigneten Technik in Pflanzenzellen transformiert werden, wie beispielsweise unter Verwendung von einem desaktivierten Ti-Plasmidvektor, der von Agrobacterium getragen wird, unter Ausnutzung seiner natürlichen Gentransferfähigkeit, (EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12(22), 8711-87215 (1984)), Partikel- oder Mikroprojektilbeschuss ( US 5100792 , EP-A-444882, EP-A-434616), Mikroinjektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083 , EP 175966 ), Elektroporation ( EP 290395 , WO 8706614) oder anderen Formen von direkter DNA-Aufnahme ( DE 4005152 , WO 9012096, US 4684611 ). Agrobacterium-Transformation wird von Fachleuten umfassend verwendet, um zweikeimblättrige Spezies zu transformieren. Auch wenn von Agrobacterium berichtet wurde, dass es in der Lage ist, fremde DNA in gewisse einkeimblättrige Spezies zu transformieren (WO 92/14828), werden Mikroprojektilbeschuss, Elektroporation und direkte DNA-Aufnahme bevorzugt, wenn Agrobacterium ineffizient oder unwirksam ist.
Alternativ dazu kann eine Kombination verschiedener Verfahren verwendet werden, um die Effizienz des Transformationsprozesses zu erhöhen, z.B. Beschuss mit mit Agrobacterium beschichteten Mikropartikeln (EP-A-486234) oder Mikroprojektilbeschuss zur Herbeiführung von Wunden, gefolgt von Co-Kultivierung mit Agrobacterium (EP-A-486233).
Die bestimmte Auswahl eines Transformationsverfahrens wird durch seine Effizienz bei der Transformation bestimmter Pflanzenspezies sowie durch die Erfahrung und Präferenz der die Erfindung durchführenden Person bezüglich eines bestimmten ausgewählten Verfahrens festgelegt. Fachleuten wird verständlich sein, dass die bestimmte Auswahl eines Transformationssystems zur Einführung von Nucleinsäure in Pflanzenzellen für die Erfindung nicht wesentlich ist und auch keine Einschränkung dieser darstellt.
In der vorliegenden Erfindung kann Überexpression durch Einführen der Nucleotidsequenz in einer Sense-Ausrichtung erreicht werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze bereit, worin das Verfahren das Verursachen oder Ermöglichen der Expression des Polypeptids, für das die Nucleotidsequenz der Nucleinsäure gemäß der Erfindung kodiert, aus dieser Nucleinsäure innerhalb von Zellen in der Pflanze umfasst.
Unterexpression des Genproduktpolypeptids kann unter Verwendung von Antisense-Technologie oder "Sense-Regulierung" erreicht werden.
Die Verwendung von Antisense-Genen oder partiellen Gensequenzen zur Herabregulierung von Genexpression ist mittlerweile ein Routineverfahren. Doppelsträngige DNA wird der Steuerung eines Promotors in einer "reversen Ausrichtung" unterstellt, sodass Transkription des "Antisense"-Strangs der DNA RNA ergibt, die zu normaler mRNA komplementär ist, die aus dem "Sense"-Strang des Targetgens transkribiert ist. Von der komplementären Antisense-RNA-Sequenz wird angenommen, dass sie sich dann mit mRNA bindet, um einen Duplex zu bilden und dadurch Translation der endogenen mRNA aus dem Targetgen in ein Protein zu inhibieren. Ob dies der tatsächliche Wirkungsmodus ist, ist noch ungeklärt. Es ist jedoch anerkannt, dass das Verfahren funktioniert. Siehe beispielsweise Rothstein et al. (1987); Smith et al. (1988); Zhang et al. (1992), English et al. (1996). Die vollständige Sequenz, die der Kodiersequenz in umgekehrter Ausrichtung entspricht, muss nicht verwendet werden. Fragmente von ausreichender Länge können beispielsweise verwendet werden. Für Fachleute ist es ein Routineverfahren, Fragmente verschiedener Größen und aus verschiedenen Teilen der Kodiersequenz zu screenen, um den Grad von Antisense-Inhibierung zu optimieren. Es kann von Vorteil sein, das Initiations-Methionin-ATG-Codon und eventuell ein oder mehrere Nucleotide stromauf des Initiationscodons einzubinden. Ein geeignetes Fragment kann etwa 14-23, z.B. etwa 15, 16 oder 17, Nucleotide aufweisen.
Antisense-Regulation kann selbst durch Einsatz eines induzierbaren Promotors in einem geeigneten Konstrukt reguliert werden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze bereit, worin das Verfahren das Verursachen oder Ermöglichen von Antisense-Transkription aus Nucleinsäuren gemäß der Erfindung innerhalb von Zellen der Pflanze umfasst.
Werden zusätzliche Kopien des Targetgens in Sense-, d.h. derselben, Ausrichtung wie das Targetgen insertiert, so wird eine Reihe von Phänotypen gebildet, die einzelne Phänotypen umfasst, in denen Überexpression auftritt, und andere, in denen Unterexpression von Protein aus dem Targetgen auftritt. Ist das insertierte Gen nur ein Teil des endogenen Gens, so steigt die Anzahl von unterexprimierenden Einheiten in der transgenen Population. Der Mechanismus, durch den Sense-Regulierung, insbesondere Herabregulation, auftritt, ist nicht umfassend bekannt. Dieses Verfahren ist jedoch in der wissenschaftlichen und der Patentliteratur ausführlich beschrieben und wird routinemäßig zur Gensteuerung verwendet. Siehe beispielsweise van der Krol (1990); Napoli et al. (1990); Zhang et al. (1992)).
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze bereit, worin das Verfahren die Verursachung oder Ermöglichung von Expression aus Nucleinsäure gemäß der Erfindung innerhalb von Zellen der Pflanze umfasst, um Aktivität eines Polypeptids mit der Fähigkeit, eine Blüteneigenschaft zu beeinflussen, zu unterdrücken. Hierbei wird die Aktivität des Polypeptids vorzugsweise als ein Resultat von Unterexpression innerhalb der Pflanzenzellen unterdrückt.
Eine modifizierte Version von FCA kann zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze verwendet werden. Beispielsweise kann eine Mutante, die hierin als fca-1, fca-3 oder fca-4 identifiziert wurde, verwendet werden. Die Sequenzänderungen, die zu diesen Mutanten führen, und die resultierenden Phänotypen werden nachstehend erläutert.
Förderung von FCA-Aktivität, um frühe Blüte zu verursachen
Mutationen, die FCA-Aktivität reduzieren, verursachen späte Blüte sowohl unter Langtag- als auch Kurztagbedingungen, was folglich auf FCA-Einbindung in die Unterstützung der Blüte schließen lässt. Versuche mit Doppelmutanten wiesen auch darauf hin, dass FCA-Funktion sowohl stromauf als auch stromab der Genprodukte, die in das Verleihen von Blütenstands-/floraler Meristemidentität eingebunden sind, z.B. LEAFY, APETALA1 und TERMINAL FLOWER, erforderlich sein kann. Somit kann FCA-Funktion in die Fähigkeit von Meristemen eingebunden sein, auf LEAFY-, APETALA1- und TERMINAL-FLOWER-Genprodukte zu reagieren.
Das vollständig gespleißte FCA-Transkript ist bei sehr geringer Häufigkeit unter allen bisher analysierten Bedingungen vorhanden. Wenn die fca-Mutation auch rezessiv ist, blühten transgene fca-Pflanzen, die für ein eingeführtes Wildtyp-FCA-Gen homozygot sind, geringfügig früher als Pflanzen, die eine Kopie tragen (Beispiel 2), was darauf schließen lässt, dass unter manchen Bedingungen die Menge des FCA-Transkripts die Blütezeit limitiert. Dies weist darauf hin, dass die Blüte unter Verwendung fremder Promotoren manipuliert werden kann, um die Expression des Gens zu verändern. Darüber hinaus ist der Hauptteil des Transkripts in einer Form vorhanden, die kein aktives Protein bilden kann. Somit kann alternatives Spleißen ein spezifischer Steuerungsmechanismus sein, um relativ geringe Konzentrationen des FCA-Proteins aufrechtzuerhalten. Eine Veränderung dieses Spleißmusters, beispielsweise durch Einführen eines FCA-Gens, dem Intronen fehlen, in Pflanzen, kann sehr viel höhere Konzentrationen des FCA-Proteins ergeben, die wiederum eine beschleunigte Blüte ergeben würden.
Verursachen von früher Blüte unter nicht-induktiven oder induktiven Bedingungen
Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen blühen unter induktiven Bedingungen äußerst rasch, und das FCA-Gen wird vor der Blüte exprimiert, wenn auch nur in geringer Konzentration. Die Konzentration des FCA-Produkts kann durch Einführen von Promotor-, z.B. CaMV35S- oder meri-5-, Fusionen gesteigert werden. Weiters kann das Einführen eines FCA-Gens, dem Intronen fehlen, die Konzentration von FCA-Protein erhöhen und frühe Blüte unter allen möglichen Bedingungen verursachen.
Inhibierung von FCA-Aktivität, um späte Blüte zu verursachen
fca-Mutationen verursachen späte Blüte von Arabidopsis. Transgene Ansätze können verwendet werden, um FCA-Aktivität zu reduzieren und dadurch die Blüte in einer Reihe von Pflanzenspezies zu verzögern oder zu unterbinden. Zahlreiche verschiedene Vorgehensweisen können verwendet werden. Dieser späten Blüte kann, sofern erwünscht, anschließend dadurch entgegengewirkt werden, dass die imbibier ten Samen oder Pflanzen unterschiedlichen Alters einer Vernalisationsbehandlung unterzogen werden.
Expression von Sense- oder Antisense-RNAs
In mehreren Fällen wurde die Aktivität von endogenen Pflanzengenen durch die Expression von homologer Antisense-RNA aus einem Transgen, wie zuvor erläutert, reduziert. In ähnlicher Weise kann die Expression von Sense-Transkripten aus einem Transgen die Aktivität der entsprechenden endogenen Kopie des Gens, wie zuvor erläutert, reduzieren, Expression eines Antisense-Transkripts aus dem FCA-Gen erwies sich als wirksam zur Reduktion der Aktivität des endogenen Gens und zum Hervorrufen der späten Blüte (Beispiel 3).
Expression von modifizierten Versionen des FCA-Proteins
RNA-Bindungsproteine weisen eine modulare Struktur auf, in der Aminosäuresequenzen, die für die Bindung verschiedener RNA-Moleküle erforderlich sind, getrennte Domänen des Proteins darstellen (Burd & Dreyfuss (1994)). Dies ermöglicht die Konstruktion von trunkierten oder Fusionsproteinen, die nur eine der Funktionen des RNA-Bindungsproteins aufweisen. Im Fall von FCA kann Modifikation des Gens in vitro und Expression von modifizierten Versionen des Proteins zu dominanter Inhibierung des endogenen, intakten Proteins und dadurch zu verzögerter Blüte führen. Dies kann auf verschiedene Weisen erfolgen und die folgenden Arten umfassen:
Expression eines trunkierten FCA-Proteins.
Manche Multi-RNP-Motiv-Proteine können verschiedene RNA-Sequenzen gleichzeitig binden. U1 A beispielsweise bindet sich an die kleine U1-Kern-RNA über seine erste RNA-Bindungsdomäne und an pre-mRNA-Sequenzen über seine zweite, wodurch Spleißung kontrolliert wird (Burd & Dreyfuss (1994)). Expression eines FCA-Proteins mit nur einem dieser RNP-Motive kann FCA-Wirkung in dominanter Weise durch Prävention von Bindung des FCA-Proteins voller Größe blockieren. Auch die Expression eines mutierten FCA-Proteins, das nicht für die C-terminalen Sequenzen kodiert, kann den korrekten Abgleich der Bindung des RNA-Moleküls unterbinden und somit wiederum Wildtyp-FCA-Bindung blockieren.
Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun in Form von Beispielen unter Verweis auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht.
Die Zeichnungen:
1 zeigt eine Nucleotidsequenz gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, die die Sequenz der genomischen, für FCA kodierenden Region ist, erhalten aus Arabidopsis thaliana. Intronen sind in Kleinbuchstaben dargestellt, Exone in Großbuchstaben. Eigenschaften:
(1118) – Transkriptionsstart; ☐ (1532-1534, 1568-1570, 1601-1603) – mutmaßlicher Translationsstart ATG;
(2753) – Poly-A-Stelle von β-Transkript; ⫗ (7056-7377) – alternative Spleißung rund um Intron 13; _—(8771-8773) – Translationsstopp TAA;
(9256) – Poly-A-Stelle. Zusätzliches Translationsstoppcodon bei 3026-3028 innerhalb von Intron 3.
2 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz, abgeleitet von der Nucleotidsequenz, die für den FCA-ORF kodiert.
3 zeigt die Nucleotidsequenz des FCA-α_B-Gens einschließlich 5'- und 3'-Flankierungssequenzen. Die Sequenz innerhalb des ORF ist jene eines der reichlich vorhandenen Transkripte, d.h. 19 Intronen wurden ausgespleißt, wobei jedoch Intron 3 bleibt. Die Terminationsposition des anderen reichlich vorhandenen Transkripts ist angegeben. Primersequenzen sind in Tabelle 2 angegeben. Restriktionsstellen: SalI - 352; HindIII - 776; XbaI - 1157; HindIII - 3125; BglII - 3177; ClaI - 3293; BamHI - 3549; HindIII - 4728; SpeI - 5003. Andere wichtige Orientierungspunkte: 1293 - Poly-A-Ende, hinzugefügt nach diesem Nucleotid in cDNA-Klon 77B oder FCA-Transkript α; 897 - 5'-Spleißstelle von Intron 3; 2973 - 3'-Spleißstelle von Intron 3.
4 vergleicht die FCA-RRM-Motive mit jenen aus den Drosophila-Sex-Lethal- und -TRA-2-Genen. Auch gezeigt sind die C-terminalen Aminosäuren mit Homologie zu Hefe- und C.-elegans-Proteinen.
5 zeigt die Rekombinationsanalyse, um das FCA-Gen zu positionieren.
6 zeigt die Komplementationsanalyse, um das FCA-Gen zu lokalisieren.
7 zeigt die Komplexität und Position des FCA-Gens an den komplementierenden Cosmiden.
8 zeigt die Nucleotidsequenz des Brassica-napus-FCA-Homologs und kodierten Polypeptids:
8a – Brassica-FCA-Nucleotidsequenz einschließlich Kodiersequenz;
8b – Polypeptid-Aminosäuresequenz, für die Kodiersequenz aus 8a kodiert.
9 zeigt einen Abgleich der Arabidopsis- und Brassica-FCA-Aminosäuresequenzen. Die obere Zeile stellt Arabidopsis dar; die untere Zeile steht für Brassica.
10 zeigt die verschiedenen, aus dem FCA-Gen produzierten Transkripte. _—offener Leseraster; * konservierte Region in C.-elegans- und Hefe-ESTs; R1, R2 RNA-Bindungsdomänen 1 und 2.
BEISPIEL 1 – KLONIEREN UND ANALYSE DES FCA-GENS
Idenfifikation einer genomischen 300-kb-Region, die das FCA-Gen von Arabidopsis thaliana in sich trägt.
Die fca-Mutation wurde in Bezug auf sichtbare Marker zu 29 cM an Chromosom 4 kartiert. Um den Locus in Bezug auf molekulare Marker als einen Startpunkt zum Klonieren durch Chromosomen-Walking zu kartieren, wurde das Segregationsmuster der Kartierung von RFLP-Markern zur oberen Hälfte von Chromosom 4 in 171 spätblühenden Pflanzen (der homozygoten rezessiven Klasse) aus dem F2 einer Kreu zung zwischen der spätblühenden Mutante fca-1 (in einem Landsberg-erecta-Hintergrund) und dem polymorphen, frühblühenden Ökotyp Columbia analysiert. Diese Analyse positionierte den FCA-Locus in einem 5,2-cM-Intervall zwischen den Markern m326 und m226.
Diese Marker wurden anschließend als die Ausgangspunkte für den Chromosomen-Walk verwendet. YAC-Klone, die diese RFLP-Marker enthielten, wurden durch Koloniehybridisierungsversuche identifiziert. In den anfänglichen Versuchen waren die verwendeten YAC-Bibliotheken EG-, EW- und ABI-Bibliotheken, als jedoch andere verfügbar wurden (yUP – Mai 1992), wurden sie in die Analyse eingebunden. Positiv hybridisierende YAC-Klone wurden unter Verwendung von Southern-Blot-Analyse bestätigt. Sie wurden unter Verwendung von PFGE und Southern-Blot-Analyse klassiert, und dann wurden End-Sonden unter Verwendung von entweder inverser PCR oder von Erhalt des linken Endes zur Verwendung in Chromosomen-Walking-Versuchen gebildet. Im Großteil der Fälle wurde jeder Schritt im Walk mit zwei unabhängigen YAC-Klonen abgedeckt, um falsche Bindungen, die durch chimäre YAC-Klone gebildet werden, zu vermeiden. Diese stellten einen signifikanten Teil der EG-, EW- und yUP-Bibliotheken dar und verkomplizierten die Anordnung des YAC-Contigs. Das Resultat der Bildung und Analyse von 65 End-Sonden war ein YAC-Contig, das das m326-m226-Intervall abdeckte, das 57 YAC-Klone umfasste.
Polymorphismen zwischen Landsberg erecta und Columbia wurden für die Sonde des linken Endes von EG9D2, Sonde des rechten Endes von YAC-Klon yUP13C7, Sonde des rechten Endes von YAC-Klon yUP3F7 und Sonde des rechten Endes von YAC-Klon EW20B3 bestimmt. Eine Analyse des Segregationsmusters dieser Marker an gepoolter Nachkommenschaft von Rekombinanten mit Überkreuzungsstellen, die im m326-m226-Intervall kartierten, definierte die Region, die das FCA-Gen zwischen den durch yUP3F7RE und m226 identifizierten Polymorphismen trug. Dieses Intervall wurde durch zwei überlappende YAC-Klone EW20B3 und ABI10C10 abgedeckt.
Um die Position des FCA-Gens näher zu definieren, waren mehrere Sonden erforderlich, die innerhalb der zwei überlappenden YAC-Klone kartiert wurden. Dies wurde unter Verwendung von End-Sonden aus den YAC-Klonen ABI3C4, ABI6C3, de unter Verwendung von End-Sonden aus den YAC-Klonen ABI3C4, ABI6C3, einem zufälligen Sau3A-Fragment aus YAC-Klon EW20B3 (W5) und zwei Cosmiden cAtA2 und g19247 erreicht. Restriktionskarten für SmaI, MluI und PacI wurden konstruiert und verwendet, um die Sonden innerhalb der YAC-Klone zu positionieren.
Zusätzliche Rekombinanten, in denen die Überkreuzungsstelle in der Nähe des FCA-Locus kartiert wurde, wurden durch Auswählen einzelner Pflanzen, die Arabinoseresistent waren und eine frühe/zwischenzeitliche Blüte aufwiesen, aus der F2-Generation einer Kreuzung zwischen fca (in Landsberg erecta) und ara1 (in Columbia) gebildet. Die Nachkommenschaft aus diesen wurde überprüft, um zu bestätigen, dass sie für das Arabinose-Resistenzallel homozygot und für die fca-Mutation heterozygot waren. Drei dieser einzelnen Pflanzen (A2/7, A1/8 und A4/7) wurden mit den RFLP-Markern 3F7RE, W5, cAtA2, 19247, 3C4LE, 6C3LE und 226 analysiert. Dies definierte die Nord-Enden der genomischen Region, die das FCA-Gen wie innerhalb der Cosmide cAtA2 und 19247 trugen. Diese Informationen sind in 5 zusammengefasst.
Komplementationsanalyse zur Definition des FCA-Gens.
Die zwei YAC-Klone EW20B3 und ABI10C10 wurden gelgereinigt und an Filter, die 25.500 Cosmidklone trugen, die 15-20 kb von genomischer Arabidopsis-thaliana-Landsberg-erecta-DNA enthielten, hybridisiert. Diese Cosmidbibliothek wurde in einem neuen Vektor (04541) durch Klonieren eines 1,6-kb-BglII-Fragments aus pHC79, das das lambda-cos-Fragment trug, in den Vektor pSLJ1711 konstruiert. Das resultierende hochstabile Cosmid-Klonierungsvehikel trägt Agrobacterium-Grenzsequenzen für den Transfer von DNA in Pflanzenchromosomen, einen selektierbaren 35S-NPTII-Pflanzenmarker, lacz-laci-Sequenzen für die Blau/Weiß-Insertselektion in E. coli und einen Polylinker mit 7 Klonierungsstellen.
Positiv hybridisierende Kolonien wurden durch Hybridisieren jedes Klons an Southern-Blots, die alle die mit einem HindIII, EcoRI und BamHI verdauten Cosmidklone trugen, analysiert. Dies ergab eine Restriktionskarte für das Insert von jedem Cosmid und gab an, welche Klone überlappende Inserts aufwiesen. Die Cosmide wurden auch entlang von Pflanzen-DNA laufen gelassen und mit dem Cosmid hybridisiert, um zu bestätigen, dass das Cosmid-Insert mit der Pflanzen-DNA kolinear war. Die zwei Cosmid-Klone cAtA2 und cAtB1, die bei diesem Intervall kartiert wurden, wurden aus einer anderen Cosmid-Bibliothek isoliert (Olszewski & Ausubel (1988)). Das Resultat dieser Analyse war ein Cosmid-Contig, das das 300-kb-Intervall abdeckte, in dem der FCA-Locus definiert wurde.
Sechs mutierte fca-Allele waren erhältlich, von denen zwei durch FN-Bestrahlung und eines durch Röntgenbestrahlung gebildet worden waren. Strahlungs-induzierte Mutationen werden häufig mit genomischen Neuanordnungen oder Deletionen assoziiert. Für den Fall, dass dies die Anordnung des FCA-Gens weiter verfeinern würde, wurde die genomische Region, die durch die YAC-Klone EW20B3 und ABI10C10 abgedeckt wurde, in allen sechs Allelen untersucht. Die zwei YAC-Klone wurden an PFGE-Southern-Blots hybridisiert, die DNA aus den verschiedenen Allelen, verdaut mit SmaI und MluI, aufwiesen. Für ein MluI-Fragment mit ~50 kb wurde erkannt, dass es im fca-4-Allel geringfügig kleiner war. Eine weitere Analyse durch Hybridisierung von Cosmid-Klonen, die der Region entsprechen, die den Unterschied aufzeigte, wies darauf hin, dass ein Teil der Veränderung in einem 1,9-kb-BamHI-Fragment auftrat, das in den Cosmiden cAtA2 und 19247 getragen wurde. Daher richteten die Erfinder in den ersten Komplementationsversuchen das Hauptaugenmerk auf Cosmid-Klone am Nord-Ende des Contigs.
Elf Cosmid-Klone, die in 6 gezeigt sind, ausgehend von jenen am linken Ende, wurden in die Arabidopsis-fca-1-Mutante unter Verwendung des Wurzelexplantat-Transformationsverfahrens (Valvekens et al. (1988)) eingeführt. Samen wurden aus einzelnen selbstbefruchteten, Kanamycin-resistenten Pflanzen abgenommen und hinsichtlich ihrer Kanamycin-Segregation und Blütezeit analysiert. Die Anzahl an Transformanten, die Komplementation zu früher Blüte für jedes Cosmid zeigten, ist in 6 gezeigt. Die vier Cosmide, die zu Komplementation führten, wurden am Ende der genomischen Region kartiert, wo die Inversion im fca-4-Allel kartiert wurde.
Identifikation des FCA-Gens.
Durch die Bemühungen, Arabidopsis zu sequenzieren, wurde am Institut der Erfinder die vollständige genomische Sequenz von Columbia-Allel, die der genomischen Region innerhalb der komplementierenden Cosmid-Klone entspricht, gewonnen (G. Murphy, pers. Mitteilung). Der Großteil der genomischen Region, der in den komplementierenden Cosmiden enthalten ist, wird an drei BamHI-Restriktionsfragmenten, 4, 1,9 und 2 kb, getragen. Dies wurden isoliert und entweder getrennt hybridisiert oder zu 1 × 10⁶ Phagenklonen der PRL-2-cDNA-Bibliothek gepoolt. Diese Bibliothek wurde aus gepoolten RNA-Proben erstellt und wurde von Tom Newman (Michigan) zur Verfügung gestellt. Vier Klone, die an das 2-kb-BamHI-Fragment hybridisieren, und 3, die an die 4- und 1,9-kb-Fragmente hybridisieren, wurden isoliert und charakterisiert. Sie identifizierten zwei cDNA-Klone mit Insertgrößen von ~1.700 bp und 1.350 bp. Eine Analyse der Größen der Transkripte, die an diese zwei cDNA-Klone hybridisieren, zeigte, dass eines (in fac-4) in seiner Größe in Bezug auf die anderen Allele und den Wildtyp reduziert war, und so wurde dieser cDNA-Klon dem FCA-Gen zugeordnet. Der andere Klon zeigte keine Unterschiede und wurde als 77B bezeichnet.
Die Transkriptgröße des vermutlichen FCA-Gens betrug > 3 kb, was darauf hinwies, dass der cDNA-Klon nicht seine volle Länge aufwies. Der cDNA-Klon wurde sequenziert und dafür erkannt, dass er für ein Insert mit 1.811 bp kodierte. Primer wurden aus der genomischen Sequenz (gekennzeichnet als BamX-Primer in 3) und dem 5'-Ende der cDNA-Sequenz (gekennzeichnet als IanRT1 und IanRT2 in 3) entworfen. Erststrang-cDNA unter Verwendung des IanRT2-Primers gebildet, um RNA, die aus Wildtyp-Sämlingen isoliert wurde (Zweiblattstadium), zu primen. Dies wurde mit den Primern BamX und IanRT2 verwendet, um ein Fragment, das als eine schwache Bande an einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel detektiert wurde, mittels PCR zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde 1/300 verdünnt und unter Verwendung der Primer BamX und IanRT1 neu amplifiziert. Das Produkt aus dieser Reaktion wurde unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und in die EcoRV-Stelle des allgemeinen Klonierungsvektors Bluescript KSII (Stratagene) kloniert. Das Produkt wurde sequenziert, und es wurde erkannt, dass es kolinear mit der genomischen Sequenz war und die Sequenz des cDNA-Klons um 735 bp verlängerte.
Die Sequenz wurde mit allen verfügbaren Sequenzen unter Verwendung von BlastX, BlastN und TBlastN verglichen. Signifikante Homologien wurden in der TBlastN-Suche zu einer Klasse von Proteinen erkannt, die davor als RNA-Bindungsproteine definiert wurden. Die Eigenschaft dieser Proteine ist die Gegenwart von einem oder mehreren RRM-Motiven, die sich aus konservierten Aminosäuren zusammensetzen, die eine 80-Aminosäure-Region abdecken (gezeigt in 4). Die Positionierung von untergeordneten Motiven RNP2 und RNP1 und einzelnen konservierten Aminosäuren wird stets innerhalb des gesamten RRM-Motivs aufrechtgehalten. Translation der Sequenz des FCA-cDNA-Klons, der in den RT-PCR-Versuchen verlängert wurde, zeigte die Gegenwart von mehreren Translationsstoppcodons in der 5'-Region der Sequenz auf. Der erste Methioninrest stromab des letzten Translationsstoppcodons und in Raster mit dem Rest des FCA-Proteins wurde in der Mitte des RRM-Motivs gefunden, wo er RNP2 und RNP1 voneinander trennt. Die starke Homologie des RRM-Motivs zu anderen RNA-Bindungsproteinen ließ darauf schließen, dass dieser MET-Rest nicht der Beginn des FCA-Proteins war. Weiters werden die Transkripte zahlreicher RNA-Bindungsproteine alternativ gespleißt, um aktive und inaktive Produkte zu ergeben. Das Spleißen wird dann, häufig auf eine autoregulative Weise, reguliert, um die Produktion des aktiven Proteins zu steuern. Diese Tatsachen ließen darauf schließen, dass das in den RT-PCR-Versuchen gebildete FCA-Transkript ein Intron genau stromauf des RRM-Motivs enthielt.
Um diese Hypothese zu testen, wurden mehrere Primer aus der genomischen Sequenz zur Verwendung in weiteren RT-PCR-Versuchen entworfen. Erststrang-cDNA wurde aus aus Sämlingen (Vierblattstadium)isolierter RNA gebildet, geprimt mit randomisierten Hexameren (Boehringer). Primer, die innerhalb der Sequenz 5' zur FCA-cDNA bis zum 3'-Ende der 77B-cDNA lagen (wobei der andere cDNA-Klon an die komplementierenden Cosmid-Klone hybridisierte), ergaben zusammen mit IanRT1 Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe aus der genomischen Sequenz, ergaben jedoch keine kleineren Produkte, wie von einem Transkript erwartet werden wür de, in dem ein dazwischenliegendes Intron ausgespleißt wurde. Ein Primer, der innerhalb des 77B-cDNA-Klons liegt, der als cDNAII-BamHI gekennzeichnet ist (in 3), wurde dann in Verbindung mit dem IanRT1-primer verwendet. Nach 30 Amplifikationszyklen war keine Bande an einem Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel sichtbar. Die PCR-Reaktion wurde dann 1/300 verdünnt und unter Verwendung der Primer cDNAII-1 und RevEx4 neuerlich amplifiziert (siehe 3). Das PCR-Produkt wurde mit SalI- und BglII-Restriktionsenzymen verdaut und in SalI- und BamHI-verdautes BluescriptKSII-Plasmid kloniert. Sequenzanalyse des 760-bp-Produkts und ein Vergleich mit der genomischen Sequenz zeigten, dass ein 2-kb-Intron ausgespleißt worden war, um den ORF innerhalb der 77B-cDNA an jenen, der das RRM-Motiv im FCA-Gen trug, zu binden. Dieses Spleißen zeigte die Gegenwart eines zweiten intakten RRM-Motivs auf, das durch Intron 3 unterbrochen war.
Direkter Vergleich der FCA-Sequenz mit jener von LUMINIDEPENDENS und CO, den aus Arabidopsis klonierten anderen Blütezeitgenen (Lee et al. (1994), Putterill et al. (1995)), konnte keine signifikante Homologie aufzeigen.
Mutationen in den mutierten fca-Allelen.
cDNA wurde aus RNA, die aus den mutierten Allelen isoliert worden war, hergestellt. Dies wurde unter Verwendung von cDNAII-BamHI und cDNA-3'a amplifiziert: BamX und IanRT1; fca5'-1 und fca3'-a (Positionen, wie sie in 3 angegeben sind). Die resultierenden PCR-Fragmente wurden kloniert und sequenziert und mit der Sequenz des Wildtyp-Landsberg-erecta-Transkripts verglichen. Die fca-1-Mutation setzte ein C-Nucleotid an Position 6861 zu einem T um. Somit wird ein Glutamincodon (CAA) zu einem Stoppcodon verändert (TAA). Die fca-3-Mutation setzte ein G-Nucleotid an Position 5271 zu einem A um. Die Wirkung dieser Mutation ist, die 3'-Spleißverbindung von Intron 7 so zu verändern, dass eine neue 3'-Spleißverbindung 28 Nucleotide in Exon 8 hinein verwendet wird. Die fca-4-Mutation ist das Resultat einer Neuanordnung mit der Bruchstelle an Position 4570 (innerhalb von Intron 4).
BEISPIEL 2 – ISOLIERUNG UND SEQUENZANALYSE DES BRASSICA-NAPUS-HOMOLOGS.
Eine genomische Brassica-napus-Bibliothek, die aus teilweise Sau3A-verdauter DNA, kloniert in lambda-DASH^RII/BamHI-Vektor (Stratagene), konstruiert wurde, wurde erhalten. Die Bibliothek wurde unter Verwendung des 1811-bp-FCA-cDNA-Klons gescreent. Ein Klon, der ein 12-kb-Insert aufwies, wurde isoliert und hybridisierte an den FCA-cDNA-Klon und den 77B-cDNA-Klon. Der lambda-Klon wurde mit SalI verdaut, der das 12-kb-Brassica-Insert voller Länge freisetzte, und dies wurde in Bluescript KSII kloniert. Restriktionsfragmente von diesem Klon (eine Kombination von EcoRI, SacI und BamHI) wurden in BluescriptKSII subkloniert und sequenziert.
Das 12-kb-Brassica-Fragment wurde auch in die XhoI-Restriktionsstelle des Agrobacterium-Shuttle-Vektors pSLJ1714 (Jones et al. (1992)) zur Transformation in die fca-Mutante subkloniert. Wenn sie in die fca-4-Mutation unter Verwendung von Wurzelexplantat-Transformation eingeführt wurde, spaltete die Nachkommenschaft der Transformante frühblühende Pflanzen ab. Diese blühten mit einem Mittelwert von 8,3 Blättern im Vergleich zu Wildtyp-Landsberg-erecta, die parallel mit 9,1 Blättern gezüchtet wurde, und fca-4, die 24,1 Blätter aufwies. Somit komplementiert das Brassica-FCA-Gen die fca-4-Mutation vollständig.
Expression von FCA-mRNA
PolyA-mRNA wurde aus einer Reihe von Entwicklungsstadien isoliert: 2 Blätter, 4 Blätter, 6 Blätter und 10 Blätter, Wurzeln und Blüten, an Northern-Blots fraktioniert und mit dem 1811-bp-FCA-cDNA-Klon hybridisiert. Das kombinierte FCA-Transkript γ war in etwa derselben Menge in allen untersuchten Geweben vorhanden, unter Ausnahme der Blüten, in denen die Expression geringfügig schwächer war. Das vorzeitig polyadenylierte Transkript β wurde unter Verwendung von 77B-cDNA-Klon als Sonde nachgewiesen. Das β-Transkript war ~20fach häufiger vorhanden als γ_A+B. Die Transkripte α_A+B, die Intron 3 enthielten, wurden an einem Northern-Blot nicht nachgewiesen und konnten nur unter Verwendung von RT-PCR gefunden werden.
FCA-Expression wurde auch unter Verwendung von RNase-Schutztests analysiert. Unter Verwendung einer Sonde (725 bp bis 1.047 bp aus γ_B-Konstrukt) wurden die γ_A+B-Transkripte in ähnlichen Konzentrationen in einer Reihe von Entwicklungsstadien sowohl in Lang- als auch in Kurztagsphotoperioden nachgewiesen und in geringeren Konzentrationen in Rosetten und Blüten reifer Pflanzen. Das β-Transkript war in diesen Geweben in einer höheren Konzentration vorhanden, was mit der Northern-Blot-Analyse übereinstimmt.
VERFAHREN FÜR DIE BEISPIELE 1 UND 2
Wachstumsbedingungen und Messungen von Blütezeit
Blütezeit wurde unter definierten Bedingungen durch Züchten der Pflanzen in "Sanyo Gallenkamp Controlled Environment"-Räumen bei 20 °C gemessen. Kurze Tage umfassten eine Photoperiode von 10 h Beleuchtung mit 400-Watt-Powerstar-Halogen-Metalldampflampen, ergänzt mit 100-Watt-Wolfram-Halogenlampen. Dies lieferte ein Niveau von photosynthetisch aktiver Strahlung (PAR) von 113,7 μmol Photonen m^–2s^–1 und ein Rot : Dunkelrot-Lichtverhältnis von 2,41. Eine ähnliche Kammer und Lampen wurden für den langen Tag verwendet. Die Photoperiode betrug 10 h unter denselben Bedingungen, die für die kurzen Tage verwendet wurden, und wurde um weitere 8 h verlängert, wenn nur die Wolfram-Halogenlampe verwendet wurde. In dieser Kammer lieferte die Kombination von Lampen, die 10 h verwendet wurden, eine PAR von 92,9 μmol Photonen m^–2s^–1 und ein Rot : Dunkelrot-Verhältnis von 1,49. Die 8-stündige Verlängerung führte zu einer PAR von 14,27 μmol m^–2s^–1 und einem Rot: Dunkelrot-Verhältnis von 0,66.
Die Blütezeiten von großen Populationen von Pflanzen wurden sowohl unter Gewächshaus- als auch Kammerbedingungen gemessen. Die Blütezeit wurde durch Zählen der Anzahl der Blätter, ohne die Keimblätter, in der Rosette und an der Blüte gemessen. Die Blattzahlen sind mit dem Standardfehler bei 95 % Vertrauensbereich gezeigt. Die Anzahl der Tage vom Säen weg bis zum Auftreten von Blütenknospen wurde auch aufgezeichnet, ist jedoch nicht dargestellt. Die enge Korrelation zwischen der Blattanzahl und der Blütezeit wurde davor bereits für Landsberg-erecta- und fca-Allele gezeigt (Koorneef et al. (1991)).
Cosmid- und RFLP-Marker.
DNA von lambda-Klonen m210, m326, m580 und m226 wurde von Elliot Meyerowitz (Caltech, Pasadena) erhalten. Gesamt-DNA wurde als radioaktiv markierte Sonde zu YAC-Bibliothekskoloniefiltern und genomischen Pflanzen-DNA-Blots verwendet. Die Cosmide g10086, g4546, g4108 und g19247 wurden von Brian Hauge und Howard Goodman (MGH, Boston) erhalten, in der Gegenwart von 30 mg/l Kanamycin kultiviert und als Glycerin-Stammlösungen bei –70 °C gelagert. Gesamt-Cosmid-DNA wurde als radioaktiv markierte Sonde zu YAC-Bibliothekskoloniefiltern und genomischen Pflanzen-DNA-Blots verwendet. Cosmid-Klone cAtA2 und cATB1 wurden von Chris Cobbett (University of Melbourne) erhalten und in der Gegenwart von 10 mg/l Tetracyclin kultiviert. Cosmid pCITd23 wurde von Elliot Meyerowitz (Caltech, Pasadena) bereitgestellt und in der Gegenwart von 100 μg/ml Streptomycin/Spectinomycin kultiviert und als Glycerin-Stammlösung bei –70 °C gelagert. pCIT30-Vektorsequenzen weisen Homologie zu aus pYAC4 stammenden Vektoren auf, und daher wurden YAC-Bibliothekskoloniefilter mit Insert-DNA, die aus dem Cosmid extrahiert wurde, hybridisiert. Gesamt-DNA von pCITd23 wurde als radioaktiv markierte Sonde zu genomischen Pflanzen-DNA-Blots verwendet.
YAC-Bibliotheken.
Die EG- und ABI-Bibliotheken wurden von Chris Somerville (Michigan State University) erhalten. Die EW-Bibliothek wurde von Jeff Dangl (Max-Delbrück-Zentrum, Köln) erhalten, und die yUP-Bibliothek von Joe Ecker (University of Pennsylvania). Originalkopien der Bibliotheken wurden bei –70 °C (wie von Schmidt et al., Aust. J. Plant Physiol. 19, 341-351 (1992), beschrieben)) gelagert. Die Arbeitsmaterialien wurden auf selektivem Kiwibrew-Agar bei 4 °C gehalten. Kiwibrew ist ein selektives, komplettes minimales Medium ohne Uracil und enthält 11 % Casaminosäuren. Arbeitsmaterialien der Bibliotheken wurden unter Verwendung eines 96-Stift-Replikators alle drei Monate erneut ausplattiert.
Hefekolonie-Filter.
Hybond-N-Filter (Amersham) (8 cm × 11 cm), die Anordnungen von Hefekolonie-DNA aus 8-24 Bibliotheksplatten enthielten, wurden (wie von Coulson et al., Nature 335, 184-186 (1988), beschrieben) hergestellt und verarbeitet und (wie von Schmidt & Dean, Genome Analysis, Bd. 4, 71-98 (1992), beschrieben) modifiziert. Hybridisierungs- und Waschbedingungen entsprachen den Anweisungen des Herstellers. Radioaktiv markierte Sonden-DNA wurde durch Markierung mittels randomisierter Hexamere hergestellt.
Hefechromosom-Herstellung und -Fraktionierung durch Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE).
5 ml Kiwibrew wurden mit einer einzelnen Hefekolonie inokuliert und bei 30 °C 24 h lang kultiviert. Hefe-Sphäroplasten wurden durch Inkubation mit 2,5 mg/ml Novozym (Novo Biolabs) 1 h lang bei Raumtemperatur gebildet. Anschließend wurde 1 M Sorbit zugesetzt, um das Gesamtvolumen von Sphäroplasten auf 50 μl zu erhöhen. 80 μl geschmolzene LMP-Agarose (1 % InCert-Agarose, FMC) in 1 M Sorbit wurde zu den Sphäroplasten zugesetzt, das Gemisch wurde kurz verwirbelt und in Stopfenformen pipettiert. Die Stopfen wurden in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben und anschließend in 1 ml von 1 mg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) in 100 mM EDTA, pH 8,1 % Sarkosyl 4 h lang bei 50 °C inkubiert. Die Lösung wurde ersetzt, und die Stopfen wurden über Nacht inkubiert. Die Stopfen wurden dreimal 30 min lang jeweils mit TE und zweimal 30 min lang mit 0,5 × TVBE gewaschen. PFGE wurde unter Verwendung des Pulsaphor-Systems (LKB) durchgeführt. Ein Drittel eines Stopfens wurde auf ein 1 %iges Agarosegel geladen und in 0,5 × TBE bei 170 V, 20 s Pulsdauer, 36 h lang bei 4 °C Elektrophorese unterzogen. DNA-Marker waren Concate mere von lambda-DNA, die wie von Bancroft & Wolk, Nucleic A Res. 16, 7405-7418 (1988), beschrieben hergestellt worden waren. DNA wurde durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Genomische Hefe-DNA für Restriktionsenzymverdau und inverse Polymerasekettenreaktion (IPCR).
Genomische Hefe-DNA wurde im Wesentlichen wie von Heard et al. (1989) beschrieben hergestellt, außer dass Hefe-Sphäroplasten wie zuvor beschrieben hergestellt wurden. Schließlich wurde die DNA zweimal mit Phenol/Chloroform, einmal mit Chloroform extrahiert und Ethanol-gefällt. Die Ausbeute aus einer 5-ml-Kultur betrug etwa 10 μg DNA.
Isolierung von YAC-Sonden des linken Endes durch Plasmiderhalt.
Plasmiderhalt von YAC-Fragmenten des linken Endes aus EG-, ABI- und EW-YACs erfolgte wie von Schmidt et al. (1992) beschrieben. IPCR wurde verwendet, um Fragmente des linken und des rechten Endes unter Verwendung der Arbeitsvorschrift und der Primer, die in Schmidt et al. (1992) beschrieben werden, zu bilden.
Gel-Blotting- und Hybridisierungsbedingungen.
Bedingungen für Gentransfer zu Hybond-N, Hybridisierungs- und Waschbedingungen entsprachen den Anweisungen des Herstellers, mit der Ausnahme, dass DNA an die Filter durch UV-Stratalinker-Behandlung fixiert wurde und/oder bei 80 °C 2 h lang gebacken wurde. Radioaktiv markierte DNA wurde durch Markierung mit randomisierten Hexameren hergestellt.
RFLP-Analyse.
Zwei bis drei μg von genomischer Pflanzen-DNA wurden aus dem parentalen Pflanzen, die in den Kreuzungen verwendet wurden, hergestellt und in einem 300-μl-Volumina gespalten. Die verdaute DNA wurde Ethanol-gefällt und auf 0,7 %igen Agarosegelen getrennt und auf Hybond-N-Filter geblottet. Radioaktiv markiertes Cosmid, lambda- oder YAC-Endsonden-DNA wurde auf die Filter hybridisiert, um RFLPs zu identifizieren.
RNA-Extrakfionen
RNA wurde unter Verwendung eines Verfahrens, das von Dean et al. (985) beschrieben wurde, extrahiert. polyA-RNA wurde unter Verwendung des polyAtract^R-mRNA-Isolierungssystems (Promega) isoliert.
DNA-Extraktionen
Arabidopsis-DNA wurde durch ein CTAB-Extraktionsverfahren, das von Dean et al. (1992) beschrieben wurde, durchgeführt.
Isolierung von cDNA durch RT-PCR
Gesamt-RNA wurde aus ganzen Sämlingen im 2-3-Blattstadium, die unter Langtagsbedingungen im Gewächshaus gezüchtet wurden, isoliert. Zur Erststrang-cDNA-Synthese wurden 10 μg RNA in einem Volumen von 10 μl 3 min lang auf 65 °C erhitzt und anschließend rasch auf Eis gekühlt. 10 μl Reaktionsgemisch wurden hergestellt, das 1 μl RNAsin, 1 μl Standard-dT17-Adapterprimer (1 μg/μl; Frohman et al. (1988)), 4 μl von 5 × reversem Transkriptasepuffer (250 mM TrisHCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂), 2 μl DTT (100 mM), 1 μl dNTP (20 mM) und 1 μl reverse Transkriptase (200 Einheiten, M-MLV Gibco) enthielt. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann zur RNA zugesetzt, woraus ein Endvolumen von 20 μl resultierte. Das Ge misch wurde bei 42 °C 2 h lang inkubiert und anschließend mit Wasser auf 200 μl verdünnt.
10 μl der verdünnten Erststrang-Synthesereaktion wurden zu 90 μl PCR-Gemisch, das 4 μl 2,5 mM dNTP, 10 μl 10 × PCR-Puffer (Boehringer plus Mg), 1 μl einer 100-ng/μl-Lösung von jedem der Primer, 73,7 μl Wasser und 0,3 μl von 5 Einheiten/μl Taq-Polymerase (Boehringer oder Cetus Amplitaq) enthielt, zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 94 °C 1 min lang, 34 Zyklen bei 55 °C 1 min lang, bei 72 °C 2 min lang, und dann schließlich bei 72 °C 10 min lang durchgeführt.
DNA-Sequenzieren
Das Sanger-Verfahren wurde verwendet, um Fragmente von Interesse zu sequenzieren, die in einen Bluescript-Plasmidvektor insertiert waren. Reaktionen wurden unter Verwendung eines Sequenase-Sets (United States Biochemical Corporation) durchgeführt.
Screenen der Landsberg-erecta-Cosmidbibliothek und der PRL-2-cDNA-Bibliothek.
26.000 Klone, die regelmäßig in Mikrotiterplatten angeordnet waren, wurden durch Transferieren von Ablegern in Rasteranordnung von 16 Mikrotiterplatten auf LB-tet-Platten (10 μg/ml) und anschließendes Platzieren von Kolonie-Lifts auf Hybond-N-Filter gescreent. 1 × 106 Plaques der CD4-71-PRL2-Bibliothek (bereitgestellt vom Arabidopsis Biological Resource Center der Ohio State University) wurden durch Ausplattieren von 20 Platten mit 50.000 Plaques und anschließendes Platzieren von Plaques-Lifts auf Hybond-N-Filter gescreent.
Transformation von Arabidopsis
Die DNA enthaltenden Cosmide aus der Nähe von FCA wurden in Agrobacterium tumefaciens C58C1 mobilisiert, und die T-DNA wurde wie von Valvekens et al. (1988) beschrieben in Arabidopsis-Pflanzen eingeführt. Wurzeln von in vitro gezüchteten Pflanzen wurden isoliert und in Kallus-induzierendem Medium zwei Tage lang gezüchtet (Valvekens et al (1998)). Die Wurzeln wurden dann in kurze Segmente geschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens, das das Plasmid von Interesse trug, gemeinsam kultiviert. Die Wurzelexplantate wurden auf Blotting-Papier getrocknet und 2-3 Tage lang auf kallusinduzierendes Medium platziert. Das Agrobacterium wurde abgewaschen, die Wurzeln wurden getrocknet und auf sprossinduzierendes Medium (Valvekens et al. (1988)), das Vancomycin, um das Agrobacterium abzutöten, und Kanamycin, um auf transformierte Pflanzenzellen zu selektieren, enthielt, gegeben. Nach etwa 6 Wochen begannen die grünen Kalli an den Wurzeln, Sprosse zu bilden. Diese wurden entfernt und in Petrischalen oder Magentatöpfe gegeben, die Keimmedium enthielten (Valvekens et al. (1988)). Diese Pflanzen produzieren in den Magentatöpfen Samen. Diese werden dann in Keimmedium ausgesät, das Kanamycin enthält, um transformierte Sämlinge, die das Transgen enthalten, zu identifizieren (Valvekens et al. (1988)).
BEISPIEL 3 – PFLANZEN, DIE FÜR DIE T-DNA-INSERTION HOMOZYGOT SIND UND FCA-BLÜTE FRÜHER ALS HETEROZYGOTEN TRAGEN.
Zwei Transformanten von jedem der vier Cosmid-Klone, die den mutierten fca-Phänotyp komplementierten, wurden geselbstet, und Samen von einzelnen spät- und frühblühenden Pflanzen wurden gesammelt und auf Kanamycin-hältigem Medium ausplattiert. Die gesamte spätblühende Nachkommenschaft war auf Kanamycin empfindlich, während die Nachkommenschaft der frühblühenden Pflanzen bezüglich Kanamycinresistenz entweder homozygot oder heterozygot war. Dies zeigt, dass sich der Kanamycin-Marker an der T-DNA, der die das FCA-Gen enthaltende Region trägt, gemeinsam mit dem frühblühenden Phänotyp vollständig abspaltete. Somit war die Komplementation zu früher Blüte auf Sequenzen innerhalb des Inserts des Cosmids zurückzuführen. LN wurde für die frühblühenden Pflanzen gezählt, die bezüglich des T-DNA-Inserts entweder homozygot oder heterozygot waren.
TABELLE 1
Analyse der Blütezeit (gemessen durch Gesamt-LN) in Transformanten, die Komplementation des mutierten fca-Phänotyps zeigt. Für jedes Cosmid wurden zwei unabhängige Transformanten analysiert. Die Blattzahl wurde an F2-Pflanzen gezählt (deren Zahl in Klammern angegeben ist), die dann geselbstet wurden und deren Nachkommenschaft auf Kanamycin-hältiges Medium ausgesät wurde, um festzustellen, ob die Pflanze für das T-DNA-Insert homozygot (K/K) oder heterozygot (K/-) war.
Die Resultate, die in Tabelle 1, oben, dargestellt sind, zeigen, dass die Homozygoten in allen 8 analysierten Transformanten signifikant früher als die Heterozygoten blühten. Somit verursacht ein Erhöhen der FCA-Gendosierung und folglich sehr wahrscheinlich der Menge des Genprodukts eine früher auftretende Blüte.
BEISPIEL 4 – ANTISENSEVERSUCHE.
Ein 1184-bp-BamHI- (bp 3547, 3)/HindIII- (bp 4731, 3) Restriktionsfragment aus dem FCA-cDNA-Klon wurde in die BamHI/HindIII-Restriktionsstellen von pBluescriptKSII subkloniert. Das Insert wurde mit den Enzymen BamHI und XhoI freigesetzt und in einen Agrobacterium-Shuttle-Vektor pSLJ6562 (J. Jones, Sainsbury Laboratory) subkloniert. Das resultierende Plasmid enthält den CaMV-35S-Promotor, der das FCA-cDNA-Fragment transkribiert, um Antisense-RNA zu bilden, deren Abschluss 3'-Sequenzen aus dem Nopalin-Synthasegen bilden. Dieses Plasmid trägt auch LB- und RB-Agrobacterium-Sequenzen für die Zufuhr in Pflanzenzellen und eine nos5'-kan-ocs3'-Fusion, um Kanamycin-Selektion für Transformanten zu ermöglichen. Das Konstrukt wurde in Arabidopsis-thaliana-Ökotyp Landsberg erecta unter Verwendung des Wurzelexplantat-Transformationsverfahrens von Valvekens et al. (1988) eingeführt.
Geselbstete Samen aus fünf Transformanten wurden gesammelt, auf Kanamycinhältigem Medium ausgesät, und 10 Kanamycin-resistente Pflanzen wurden in Erde transplantiert. Drei der Transformanten sonderten eine einzelne T-DNA-Insertion ab, die anderen zwei oder mehr. Die Blütezeit, getestet als Rosettenblattanzahl, wurde gemessen. Die Nachkommenschaft aus vier von fünf Transformanten war spätblühend und brachte 12 Rosettenblätter im Vergleich zu 4 im Fall der fünften Transformante hervor. Nebeneinander unter diesen besonderen Bedingungen gezüchtet, blühten transformierte Landsberg-erecta- und fca-1-Pflanzen mit ~4 bzw. 11 Rosettenblättern. Somit reproduzierte das Antisense-Konstrukt (als ein einzelner Locus) den spätblühenden Phänotyp der fca-1-Mutation wirksam.
BEISPIEL 5 – KONSTRUKTION VON PROMOTORFUSIONEN DES OFFENEN FCA-LESERASTERS
Ein genomisches SalI-XhoI-Fragment, das das gesamte FCA-Genom plus 64 bp stromauf des vermutlichen Translationsstarts und 500 bp stromab der Polyadenylierungsstelle trug, wurde in die XhoI-Stelle des Agrobacterium-Shuttle-Vektors pSLJ 6562 (zuvor beschrieben) kloniert. Dies führte zu einem Vektor, der eine nos-kan-Fusion zur Transformantenselektion trug, und zu einer Fusion, wo der 35S-Promotor die genomische FCA-Region steuert (21 Exone, 20 Introne). Transformanten wurden unter Verwendung dieses Konstrukts gebildet.
Dieses Konstrukt korrigierte, wenn es in fca-4-Pflanzen eingeführt wurde, den spätblühenden Phänotyp, indem es die Pflanzen dazu brachte, mit 6,4 Blättern unter ei ner Langtagsphotoperiode zu blühen. Dies war mit Wildtyp-Landsberg-erecta vergleichbar, die mit 6,2 Blättern blühte, wenn sie parallel dazu gezüchtet wurde.
BEISPIEL 6 – KONSTRUKTION EINES FCA-GENS, DEM INTRONE FEHLEN – TRANSKRIPTE γ_A UND γ_B.
Das γ_A-Konstrukt wurde durch Zusammenklonieren von sieben Fragmenten geschaffen:

i. ein EcoRI- (eine Stelle, die an der Insertverbindung in der Mehrfach-Klonierungsstelle des Vektors vorhanden ist) SalI-Fragment aus dem Cosmid CL43B23. Dieses Fragment enthält den 5'-Promotor und eine untranslatierte Region von FCA und die 5'-Region des ORF.
ii. ein SalI-HindIII-Restriktionsfragment mit 425 bp aus cDNA-Klon 77B.
iii. die Region des gespleißten Transkripts, das die 5'-Spleißstelle von Intron 3 abdeckte, wurde unter Verwendung von RT-PCR mit den Primern cDNAII-BamHI und IanRT1 gebildet. Das Produkt wurde unter Verwendung von cDNAII-1 und RevEx4 neuerlich amplifiziert, mit SalI und BglII verdaut und in pBluescriptKSII, mit SalI und BamHI verdaut, kloniert. Ein 270-bp-HindIII-Fragment aus diesem Plasmid wurde dann in der Rekonstruktion des vollständig gespleißten Transkripts verwendet.
iv. eine Region des gespleißten Transkripts wurde unter Verwendung von RT-PCR und den Primern BamX und IanRT1 amplifiziert. Dies wurde mit HindIII und BglII verdaut, und das 52-bp-Fragment wurde zur Rekonstruktion des vollständig gespleißten Transkripts verwendet.
v. eine Region des gespleißten Transkripts wurde unter Verwendung von RT-PCR und den Primern BamX und Rev404 (Position in 3 angegeben) amplifiziert. Ein 256-bp-ClaI-BamHI-Fragment wurde freigesetzt und zur Verwendung zur Rekonstruktion des vollständig gespleißten Transkripts gelgereinigt.
vi. ein ClaI-SpeI-Fragment wurde aus dem FCA-cDNA-Klon (dem 1811-bp-Klon, isoliert aus der PRL-2-Bibliothek) ausgeschnitten.
vii. ein SpeI-XhoI-Fragment, das die letzten ~140 bp von 3'-untranslatierter Region plus ~500 bp von genomischer 3'-Sequenz in sich trug, wurde aus dem genomischen FCA-Klon isoliert.

Die sieben Fragmente, die verwendet wurden, um das FCA-Gen ohne Introne zu konstruieren, wurden in zwei Teilen, 5'-Region und dann 3'-Region, angeordnet, die anschließend kombiniert wurden.

A. 5'-Region. Fragment iv wurde in pBluescriptKSII als ein HindIII/ClaI-Insert kloniert. Fragment ii wurde anschließend in dieses als ein EcoRI/HindIII-Fragment kloniert (wobei die EcoRI-Stelle aus der Mehrfach-Klonierstelle im cDNA-Kloniervektor stammt). Fragment iii wurde dann in die HindIII-Stelle zwischen den Fragmenten ii und iv kloniert, wobei die korrekte Ausrichtung unter Verwendung einer asymmetrisch positionierten RsaI-Stelle bestimmt wurde. Fragment i wurde dann in die Eco-RI/SalI-Stellen kloniert.
B. 3'-Region. Fragment vii wurde in die SpeI/XhoI-Stellen kloniert, die in Fragment vi vorhanden waren (wobei die XhoI-Stelle aus der Mehrfach-Klonierstelle im Vektor stammt). Fragment v wurde dann in die BamHI-Stelle kloniert, wobei die korrekte Ausrichtung unter Verwendung einer asymmetrisch positionierten ClaI-Stelle bestimmt wurde.

Die 3'-Region, die die Fragmente v, vi und vii enthielt, wurde dann in das Plasmid kloniert, das die 5'-Fragmente als ein ClaI/XhoI-Fragment enthielt.
Das γ_B-Konstrukt wurde durch Ersetzen des EcoNI-Fragments (1503 bp bis 2521 bp von gespleißtem Transkript) durch ein EcoNI-Fragment aus einem Klon, der aus RT-PCR von Ler-RNA abstammte und die alternativ gespleißte Form, die für das Protein voller Länge kodierte, enthielt, gebildet.
Die resultierenden Konstrukte wurden aus dem Vektor unter Verwendung von EcoRI und XhoI freigesetzt und in die EcoRI/XhoI-Stellen des Agrobacterium-Shuttle-Vektors pSLJ1714 (Jones et al. (1992)) kloniert. Transformanten, die dieses Konstrukt in sich trugen, wurden gebildet.
Konstrukt γ_A verursachte, wenn es in Landsberg erecta eingeführt wurde, eine Blüte mit 5,6 Blättern unter einer Langtagsphotoperiode. Dies fand geringfügig früher als bei der Wildtyp-Landsberg-erecta statt, die mit 6,2 Blättern blühte, wenn sie gleichzeitig gezüchtet wurde. Wurden sie bei Kurztagsphotoperiode gezüchtet, so blühte 1/4 der Nachkommenschaft der Transformante früh (mit einem Mittelwert von 8,7 Blättern). Dies war signifikant früher als die Wildtypform von Landsberg erecta, die unter diesen Bedingungen mit 23,5 Blättern blüht.
BEISPIEL 7 – EXPRESSION IN E. COLI.
Das γ_B-Konstrukt, das in Beispiel 6 beschrieben wurde, wurde mit SalI und KpnI verdaut und in die XhoI-KpnI-Stellen des E.-coli-Expressionsvektors pRSETC (Invitrogen Corp.) kloniert. Der resultierende Vektor wies die FCA-cDNA in Raster kloniert mit einer Polyhistidin-Metallbindungsdomäne auf, die es dem rekombinanten Protein ermöglicht, von nativen E.-coli-Proteinen unter Verwendung eines Metallaffinitätsharzes (ProBond^TM Ni²⁺, Invitrogen Corp.) weggereinigt zu werden. Das FCA-Protein band sich nicht gut an die Affinitätssäulen und wurde so von den E.-coli-Proteinen durch Ausschneiden aus einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Protein wurde aus dem Gelschnitt extrahiert und verwendet, um Kaninchen injiziert zu werden. Eine Booster-Spritze wurde verabreicht, und dann wurde zweimal Blut abgenommen. Die produzierten Antikörper detektieren das auf Nylon-Membran geblottete FCA-Protein bei einer Verdünnung von > 1/10.000.
BEISPIEL 8 – PRIMER, DIE ENTWORFEN WERDEN, UM PRM-DOMÄNEN MIT HOHER HOMOLOGIE ZU FCA ENTHALTENDE GENE ZU AMPLIFIZIEREN.
Basierend auf der Homologie zwischen etr-1, einem aus einer menschlichen Gehirn-mRNA (dbest H1995) abstammenden EST; dem Drosophila-Sex-Lethal-Protein; den menschlichen Nervensystemproteinen HuD, HuC, HeI-N1 und HeI-N2; und den Xenopus-Proteinen elrA, elrB, elrC, elrD wurde eine Reihe von degenerierten PCR-Primern entworfen, die zwei Regionen mit sehr hoher Homologie enthielten.
BEISPIEL 9 – KONSTRUKTION VON FCA-DERIVATEN ZUR BILDUNG VON DOMINANTEN NEGATIVEN MUTATIONEN UND ZUR ANALYSE DER EXPRESSION UND SPLEISSMUSTER DES FCA-GENS.
Ein Konstrukt, das den zweiten offenen Leseraster von Transkript α_B unter der Steuerung des FCA-Promotors exprimiert, wurde durch Deletieren des ersten offenen Leserasters (von 450 bp bis 1.206 bp) konstruiert. Dies erfolgte unter Verwendung von Oligo-Mutagenese, um eine SphI-Stelle an den zwei Positionen einzuführen, von Verdau und neuerlicher Ligation des Vektors.
Um FCA-Expression zu untersuchen, wurden FCA-Promotor-GUS-Fusionskonstrukte gebildet. FCA-Promotor + Exone 1–4 von FCA, fusioniert an das β-Glucuronidase(GUS-) Gen, wurden konstruiert, um die Spleißung innerhalb von Intron 3 zu über wachen. Die gesamte FCA-gespleißte cDNA (γ_B), mit GUS im Raster am C-Terminus fusioniert, wurde gebildet, um FCA-Proteinanordnung innerhalb der Zelle zu überwachen.
BEISPIEL 10 – IDENTIFIKATION VON FCA-HOMOLOGEN INNERHALB DES ARABIDOPSIS-GENOMS
Eine vier Genomen entsprechende Landsberg-erecta-Cosmidbibliothek wurde unter Verwendung von niedrig stringenten Bedingungen (40 °C über Nacht, 1 % SDS, 5 × SSC, 0,5 % Milchpulver) mit dem vollständigen genomischen FCA-Klon gescreent. Die Filter wurden 2 × 20 min bei 45 °C in 2 × SSC, 0,5 % SDS gewaschen. Nach Aussetzung wurden sie anschließend neuerlich 2 × 20 min bei 50 °C in 2 × SSC, 0,5 % SDS gewaschen. 61 Cosmid-Klone wurden ausgewählt, plus zwei negative Kontroll-Cosmide. Fünf davon waren zusätzliche FCA-Klone, wodurch 56 vermutliche FCA-Homologe übrig bleiben. Mini-Präparationen wurden aus 10 ml Übernacht-Kulturen von Cosmiden hergestellt, mit EcoRI verdaut, auf 0,8-%-Gelen mit positiven und negativen Kontrollen an jedem Gel laufen gelassen und Southern-geblottet. Die Blots wurden getrennt an 77B- und FCA-DNA (ursprünglich als 61A bezeichnet) ( 7) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Bedingungen hybridisiert und anschließend nur bei 45 °C gewaschen.
Von den vermutlichen Homologen:

(a) – hybridisierten 2 Cosmide nur an 77B,
(b) – hybridisierten 11 Cosmide nur an 61A,
(c) – hybridisierten 31 Cosmide an beide cDNAs,
(d) – war es für 13 Cosmide schwierig, Resultate zu verzeichnen, oder sie

(a) – 2 Cosmide scheinen nicht verwandt zu sein,
(b) – 49 C 22 und 67 I 3 weisen gemeinsame EcoRI-Fragmente auf, – 18 G 16 und 7 L 2 weisen gemeinsame EcoRI-Fragmente auf,
(c) – 39 G 10, 46 H 15, 56 F 2 und 59 A 8 weisen gemeinsame EcoRI-Fragmente auf, – 39 G 10 und 56 F 2 weisen beide ein zusätzliches Fragment auf, – 4 H 4 und 45 K 24 weisen zwei gemeinsame Fragmente auf, – zumindest neun andere Cosmidpaare können zumindest ein EcoRI-Fragment gemeinsam haben.

Tabelle 2
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Claims

Nucleinsäureisolat, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Kodiersequenz eine in 1 als ein Exon gezeigte Sequenz umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin die Kodiersequenz die in 1 als Exone gezeigten Sequenzen umfasst.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ein Intron umfassend.
Nucleinsäure nach Anspruch 4, umfassend ein wie in 1 gezeigtes Intron.
Nucleinsäure nach Anspruch 5, worin das Intron Intron 3 aus 1 ist.
Nucleinsäureisolat, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenzmutante, ein Allel oder eine Variante der FCA-Aminosäuresequenz der Spezies Arabidopsis thaliana, gezeigt in 2, gebildet durch Insertion, Deletion, Addition oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, oder ein Homolog einer anderen Spezies umfasst, wobei die Mutante, das Allel, die Variante oder das Homolog zumindest 75 % Gesamtsequenzidentität mit der in 2 gezeigten Sequenz aufweist und worin Herstellung durch Expression aus der Nucleinsäure des kodierten Polypeptids in einer transgenen Pflanze eine Blüteneigenschaft dieser Pflanze beeinflusst.
Nucleinsäure nach Anspruch 7, worin die Blüteneigenschaft der Zeitpunkt der Blüte ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 8, worin die Mutante, das Allel oder die Variante die Fähigkeit besitzt, die Blüte der Pflanze früher stattfinden zu lassen.
Nucleinsäure nach Anspruch 8, worin die Mutante, das Allel oder die Variante die Fähigkeit besitzt, die Blüte der Pflanze zu verzögern.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 7 bis 10, ein Intron umfassend.
Nucleinsäure nach Anspruch 11, umfassend ein wie in 1 gezeigtes Intron.
Nucleinsäure nach Anspruch 12, worin das Intron Intron 3 aus 1 ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 13, umfassend die Nucleotidsequenz von FCA α_B, d.h. jene aus 3.
Nucleinsäure nach Anspruch 7, die die Nucleotidsequenz von FCA α_A, d.h. Intron 3 aus 1 und alle Exone aus 1 unter Ausnahme jener Exonnucleotide, die in 1 als innerhalb der alternativen Intron-Spleißstellen rund um Intron 13 liegend definiert sind, aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 7, die die Nucleotidsequenz von FCA γ_A, d.h. alle Exone aus 1 unter Ausnahme jener Exonnucleotide, die in 1 als innerhalb der alternativen Intron-Spleißstellen rund um Intron 13 liegend definiert sind, aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 7, die die Nucleotidsequenz von FCA γ_B, d.h. alle Exone aus 1 einschließlich der Exonnucleotide, die in 1 als innerhalb der alternativen Intron-Spleißstellen rund um Intron 13 liegend definiert sind, aufweist.
Nucleinsäure nach Anspruch 17, worin die Spezies, die nicht Arabidopsis thaliana ist, eine Brassica ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 18, worin das Homolog die in 8b gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 19, umfassend die in 8a gezeigte Kodiersequenz.
Nucleinsäure nach Anspruch 19, worin die Kodiersequenz eine Mutante, ein Allel oder eine Variante der Kodiersequenz von 8a ist.
Nucleinsäureisolat, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenzmutante, ein Allel oder eine Variante der durch die Nucleinsäure nach Anspruch 19 kodierten Aminosäuresequenz umfasst, gebildet durch Insertion, Deletion, Addition oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, worin die Mutante, das Allel oder die Variante zumindest 80 % Aminosäureidentität mit der Sequenz aus 8b aufweist und die Fähigkeit besitzt, eine Blüteneigenschaft einer Pflanze zu beeinflussen.
Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 22, weiters umfassend eine Regulationssequenz zur Expression des Polypeptids.
Nucleinsäure nach Anspruch 23, umfassend einen induzierbaren Promotor.
Verwendung eines Nucleinsäureisolats, das eine Nucleotidsequenz, die komplementär zur Kodiersequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 22 ist, oder ein Fragment dieser Kodiersequenz zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze umfasst.
Verwendung nach Anspruch 25, worin das Nucleinsäureisolat einen induzierbaren Promotor umfasst.
Nucleinsäureisolat, umfassend eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu einer Kodiersequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 22 ist, oder ein Fragment dieser Kodiersequenz, worin die Nucleinsäure DNA ist und die Nucleotidsequenz unter der Steuerung einer Regulationssequenz für Antisense-Transkription steht.
Nucleinsäure nach Anspruch 27, umfassend einen induzierbaren Promotor.
Nucleinsäurevektor, der zur Transformation einer Pflanzenzelle geeignet ist und Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 24 und 28 umfasst.
Wirtszelle, die heterologe Nucleinsäure nach Anspruch 29 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 30, die bakteriell ist.
Wirtszelle nach Anspruch 30, die eine Pflanzenzelle ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 32, die die heterologe Nucleinsäure innerhalb ihres Genoms aufweist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 33, die mehr als eine dieser Nucleotidsequenz pro haploidem Genom aufweist.
Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 32 bis 34.
Geselbstete oder hybride Nachkommenschaft oder ein Abkömmling einer Pflanze nach Anspruch 34 oder jeder) beliebige Teil oder Propagationseinheit einer solchen Pflanze, Nachkommenschaft oder eines solchen Abkömmlings, wie z.B. Samen, umfassend eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 33 bis 35.
Verfahren zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze, umfassend das Verursachen oder Zulassen von Expression des durch heterologe Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 24 kodierten Polypeptids innerhalb von Zellen der Pflanze.
Verfahren zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze, umfassend das Verursachen oder Zulassen von Transkription aus heterologer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 24 innerhalb von Zellen der Pflanze.
Verfahren zur Beeinflussung einer Blüteneigenschaft einer Pflanze, umfassend das Verursachen oder Zulassen von Antisense-Transkription aus Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 24 bis 28 innerhalb von Zellen der Pflanze.
Verwendung von Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Herstellung einer transgenen Pflanze.
Verwendung von Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 27 bis 28 zur Herstellung einer transgenen Pflanze.