ES2248982T3

ES2248982T3 - Combinacion de genes para la regulacion de la induccion de floracion en plantas cultivadas y ornamentales.

Info

Publication number: ES2248982T3
Application number: ES99907223T
Authority: ES
Inventors: Roland Gleissner; Siegbert Melzer; Birgit Kurz; Klaus Apel
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2019-03-19
Also published as: ATE309337T1; AU760494B2; CA2324453A1; EP1071757B1; US20060206965A1; AU2709599A; WO1999047654A3; DE59912771D1; EP1071757A2; WO1999047654A2

Abstract

Secuencia de ADN recombinante que comprende, por lo menos, tres secuencias de ADN, caracterizada porque la primera secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora, que controla la expresión de un fragmento de ADN en un organismo, y porque la segunda y tercera secuencias de ADN comprenden secuencias codificadoras de dos diferentes genes inductores de la floración, seleccionados del grupo compuesto por MADSA, MADSB, FPF1, así como secuencias codificadores de genes homólogos con una identidad de 60 hasta 98%.

Description

Combinación de genes para la regulación de la inducción de la floración en plantas cultivadas y ornamentales.

La presente invención se refiere a la regulación del punto de floración de plantas útiles y decorativas.

Todos los procedimientos conocidos hasta la fecha para la regulación de la formación de florescencias se basan en la sobre-expresión de un único gen. Dado que la inducción de la formación de florescencias, tal como se describe a continuación, está regulada por una red de genes que intervienen en la misma, de los cuales muchos no han sido clonados ni caracterizados todavía, esta vía no resulta óptima para lograr un desarrollo equilibrado de las plantas.

La transición del crecimiento vegetativo a la formación de florescencias es un cambio claramente visible para un nuevo programa de desarrollo de una planta. Muestra una modificación de la función del meristemo apical, que pasa desde la formación de hojas a la formación de florescencias. Esta modificación morfogenética está controlada por factores endógenos, en la cual el programa genético para la formación de florescencias se "inicia" tras un período de tiempo determinado de crecimiento vegetativo, es decir, después de que se haya producido un número determinado de hojas, o, también, por diferentes condiciones del medio ambiente. Las condiciones medioambientales más importantes y más comúnmente investigadas son temperaturas bajas (vernalización), y la duración de la luz diurna (fotoperíodo). En los invernaderos se pueden adaptar estas condiciones medioambientales para garantizar un cultivo óptimo de las plantas o para lograr la mayor eficacia posible de reproducción en la transición del crecimiento vegetativo a la formación de florescencias. Esto exige, sin embargo, un consumo considerable de energías no renovables. En condiciones de campo, estos procedimientos sencillamente son inviables. Por lo tanto, un objetivo del cultivo clásico de plantas es el de seleccionar clases con un punto de floración definido. En el caso de clases de floración precoz, sería posible, entonces, generar importantes plantas de cultivo incluso en regiones en las que, bajo condiciones naturales, no alcanzan la madurez completa. La selección de clases de floración precoz por medio de cultivos clásicos requiere, no obstante, una gran cantidad de tiempo.

Desde que se sabe que los períodos de luz representan un factor importante en la regulación del tiempo de floración, experimentos de injerto y defoliación han proporcionado indicios de que se produce en las hojas de las plantas un estímulo de floración, todavía desconocido, cuando se les expone a una duración crítica del día. Esta señal se transporta desde las hojas, y a través del floema, hasta el meristemo apical. Cuando este estímulo de floración alcanza el meristemo apical, que está preparado para reaccionar frente a esta señal, se inicia la formación de florescencias.

Los mutantes para el tiempo de floración de Arabidopsis thaliana, que florecen antes o después que las correspondientes plantas de tipo salvaje, representan un papel importante en la explicación de los acontecimientos de inducción en las hojas, y de la vía de transmisión de señales desde las hojas hasta el meristemo. En Arabidopsis se han identificado, hasta ahora, con ayuda de los mutantes de floración tardía, 13 genes diferentes que intervienen en la regulación de la formación de florescencias. Estos genes se han podido incluir, mediante investigaciones genéticas, en tres vías paralelas de transducción de señales (Koornneef, M. et al., Mol. Gen. Genet. 229, 57-66, 1991). Los dos genes clonados en primer lugar, que juegan un papel en la determinación del tiempo de floración de Arabidopsis, codifican proteínas reguladoras que se expresan de forma constitutiva. LUMINIDEPENDENS (LD) parece influir sobre la percepción de la luz (Lee et al., Plant Cell 6, 75-83, 1994), y CONSTANS (CO) es necesario para la inducción de la formación de florescencias bajo condiciones de días largos (Putterill et al., Cell 80, 847-857, 1995). Un gen adicional, que regula la transición a la formación de florescencias, es FCA. Este gen se ha clonado y se ha podido demostrar que la proteína codificada posee dos sitios de fijación de ARN y un dominio de interacción con proteína. Se acepta, por consiguiente, que FCA interviene en la regulación de la maduración de trascripción de genes que desempeñan una función en la inducción de la floración (Macknight et al., Cell 89, 737-745, 1997).

En los últimos años, se han realizado avances significativos en lo que respecta a la comprensión de la regulación de la organogénesis de las florescencias. Investigaciones genéticas y moleculares del desarrollo de las florescencias en Antirrhinum majus y Arabidopsis han llevado al aislamiento de los genes de identidad del meristemo de las florescencias y de la organogénesis de las mismas, que controlan la formación de florescencias (Coen, E.S. y Meyerowitz, E.M., Nature 353, 31-37, 1991; Weigel, D. y Meyerowitz, E.M., Science 261, 1723-1726, 1993). Todos, hasta dos de estos genes, codifican productos génicos con un dominio de fijación de ADN amino-terminal, que tienen homologías con los dominios de fijación de ADN de los factores de trascripción MCM1 de las levaduras, y SRF de los mamíferos. Estos dominios se han designado como MADS Box, una abreviatura del nombre de los genes clonados inicialmente (Schwarz-Sommer et al., Science 250, 931-936, 1990). Se ha demostrado que los genes de identidad de los órganos de las florescencias están parcialmente regulados por productos génicos de los genes de identidad del meristemo de las florescencias, tales como FLORICAULA (FLO) en Antirrhinum (Hantke et al., Development 121, 27-35, 1995), y en Arabidopsis a través del homólogo de FLO LEAFY (LFY) y el gen de MADS Box APETALA1 (AP1) (Weigel, D. y Meyerowitz, E.M., Science 261, 1723-1726, 1993). Adicionalmente, se ha podido demostrar que TERMINAL FLOWER1 (TFL1), un gen responsable de la regulación de la formación del meristemo de las florescencias y del mantenimiento del meristemo de las inflorescencias, interactúa con LFY y AP1 (Gustafson-Brown, C. et al., Cell 76, 131-143, 1994; Shannon, S. y Meeks-Wagner, D.R., Plant Cell 5, 639-655, 1993; Weigel, D. et al., Cell 69, 843-859, 1992), y que CO interactúa con LFY (Putterill, J. et al., véase antes).

Igualmente, se ha demostrado que la expresión constitutiva de LFY, AP1 y CO conduce a una formación adelantada de florescencias en Arabidopsis thaliana (Weigel, D. y Nilsson, O., Nature 377, 495-500, 1995; Mandel, M.A. y Yanofsky, M.F., Nature 377, 522-544, 1995; Simon, R. et al., Nature 384, 59-62, 1996). La expresión ectópica de estos genes, bajo control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) conduce, sin embargo, también a efectos pleiotrópicos, que afectan de forma importante a la producción de semillas. De esta forma, los tres genes citados (LFY, AP1 y CO) dan lugar a la generación de florescencias terminales, fusionadas, que suprimen la formación adicional de florescencias en la inflorescencia de Arabidopsis. Por el contrario, en Arabidopsis sólo se produce la formación de una inflorescencia cerrada, con una florescencia terminal precoz, tras mutaciones del gen TERMINAL FLOWER1 (TFL1) que, normalmente, se activa tras la inducción de la formación de florescencias, brevemente bajo el meristemo de la inflorescencia (Bradley et al., Science 275, 80-83, 1997). La expresión ectópica de los genes reguladores, que intervienen en la formación de florescencias, parece ejercer una acción represora sobre TFL1. En el caso de la sobre-expresión de LFY se produce, adicionalmente, la formación de florescencias en los ejes foliculares de plantas transgénicas de Arabidopsis, que desarrollan vainas con una dotación de semillas muy reducida.

Otros genes que influyen sobre el punto de floración son OsMADS1 (Chung, Y.-Y. et al., Plant Molecular Biology 26, 657-665, 1994), cuya expresión constitutiva en plantas transgénicas de tabaco da lugar a enanismo e inflorescencias deformes, así como SPL3 (Cardon, G.H. et al., Plant Journal 12, 367-377, 1997).

Los genes MADSA (Genbank, nº de acceso U25696) y MADSB (Genbank, nº de acceso U25695) (Menzel, S. et al., Plant Journal 9, 399-408, 1996), y FPF1 (EMBL, nº de acceso Y11987 para SaFPF1 y Y11988 para ATFPF1) (Kania, T. et al., Plant Cell 9, 1327-1338, 1997), se aislaron originalmente de la mostaza (Sinapsis alba). Se ha podido demostrar que estos genes son inducidos antes de LFY y AP1 en el meristemo apical, tras la inducción de la formación de florescencias.

MADSA y MADSB se identificaron utilizando la región que codifica MADS Box del gen de identidad de las florescencias AGAMOUS (AG) (Menzel et al., véase antes). Ambos genes se expresan durante la fase de transición del crecimiento vegetativo a la formación de florescencias en los meristemos apicales de Sinapsis alba y Arabidopsis thaliana. Los análisis de transferencia de ARN han confirmado que el número de transcriptazas de los dos genes aumenta drásticamente poco después de la inducción de las florescencias, y que ambos genes se expresan anteriormente como los genes de MADS Box AP1 y AG. Hibridaciones in situ han demostrado que la expresión de los genes se limita al meristemo apical de las plantas inducidas durante las fases precoces del desarrollo reproductivo. La expresión de MADSA se detecta, inicialmente, en el centro del meristemo. En esta región se pueden poner de manifiesto las variaciones más precoces de un meristemo activado por medio de procedimientos fisiológicos clásicos. Por lo tanto, MADSA podría tener una función importante durante la transición del crecimiento vegetativo a la formación de florescencias. Mandel y Yanofsky (Plant Cell 9, 1763-1771, 1995) describen el gen homólogo de MASDB de Arabidopsis como AGL8 (Genbank, nº de acceso U33473), en tanto que se ha aislado de Arabidopsis una secuencia homóloga a MADSA, conocida como EST (del inglés expressed sequence tag, identificador de secuencia expresada) (Newman et al., Plant Physiol. 106, 1241-1255, 1994) (Genbank, nº de acceso H36826).

En una investigación posterior se caracterizó el gen Flowering Promoting Factor1 (FPF1) (Kania et al, véase antes), que se expresa en el meristemo apical inmediatamente después de la inducción fotoperiódica de las florescencias en las plantas de día largo Sinapsis alba y Arabidopsis thaliana. En estadios de transición precoces sólo se detecta una expresión de FPF1 en la zona periférica del meristemo apical. Sin embargo, posteriormente se le puede detectar en el meristemo de las florescencias y en los meristemos axilares, que forman inflorescencias secundarias. El gen FPF1 codifica una proteína de 12,6 kDa de tamaño, que no exhibe ninguna homología con ninguna de las proteínas ya identificadas con una función conocida. Una expresión constitutiva del gen en Arabidopsis, bajo el control del promotor CaMV35S, dio como resultado la característica hereditaria dominante de una formación precoz de florescencias bajo las condiciones de día corto y largo. Los tratamientos con Giberelina (GA) y Paclobutrazol, un inhibidor de la síntesis de GA, han demostrado que FPF1 interviene en una vía de señal dependiente de GA y que modula una respuesta de GA en el meristemo apical durante la transición a florescencia.

Los tres genes ya caracterizados, MADSA, MADSB y FPF1, dan lugar, en una expresión constitutiva, a una formación adelantada de florescencias en Arabidopsis. Plantas transgénicas que sobre-expresan MADSA o FPF1, muestran, en este sentido, un conjunto de florescencias y semillas completamente normal. En líneas 35S::AtMADSB, en las que se expresa fuertemente el transgén, se llega, eventualmente, también a la aparición de florescencias terminales fusionadas.

Misión de la presente invención es regular el punto de floración en plantas útiles y decorativas, teniendo en consideración un desarrollo equilibrado de las plantas.

Esta misión se resuelve, según la invención, por la sobre-expresión de los genes MADSA y FPF1 o MADSB y FPF1 combinados, que se activan a través del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) en la totalidad de la planta, incluido el meristemo apical, e inducen, de esta manera, una formación precoz de florescencias, sin afectar al rendimiento ni al crecimiento de las plantas.

A través de la expresión constitutiva de los tres genes, MADSA, MADSB y FPF1, y sus combinaciones, es posible lograr una regulación de la formación de florescencias, conservando la productividad. La combinación de los genes se puede llevar a cabo mediante vectores que tienen múltiples genes bajo el control de diferentes promotores, o por proteínas de fusión, en las que los dominios activos de las proteínas individuales están bajo el control de un único promotor.

Dado que los tres genes expresados de manera ectópica (MADSA, MADSB y FPF1) conducen a una formación adelantada de florescencias, se investigó, en primer lugar, si los efectos de los tres genes se complementan en plantas que expresan de manera constitutiva dos de los genes. Para las primeras investigaciones, se efectuaron entrecruzamientos entre líneas de plantas que expresan los diversos genes de forma constitutiva. Además de MADSA, MADSB y FPF1, se incorporaron también a las investigaciones los genes de identidad del meristemo de las florescencias LFY y AP1.

Al contrario que las plantas de tipo salvaje, las plantas 35S::LFY transgénicas forman florescencias ya en los ejes de las hojas en roseta. El número de hojas en roseta, por el contrario, no se reduce. La disposición de florescencias en el meristemo apical de Arabidopsis está relacionado, en las plantas de tipo salvaje, con un alargamiento de los internodienos (el llamado "bolting") del eje principal (Hempel y Feldman, Planta 192, 276-286, 1994). En las plantas 35S::LFY los autores encuentran una formación de florescencias sin un estiramiento excesivo del eje principal. Dado que las plantas 35S::LFY muestran, antes de la formación de florescencias, una extensión precoz del eje principal, es evidente que la expresión constitutiva de LFY no da lugar a una activación de FPF1. Tras el entrecruzamiento de plantas 35S::LFY transgénicas con plantas 35S::FPF1 transgénicas, los descendientes, que sobre-expresan de manera constitutiva ambos genes, muestran, una vez más, una floración y fijación coordinadas. El número de hojas en roseta en las plantas 35S::LFY-35S::FPF1 se encuentra, en este caso, claramente reducido tanto en condiciones de día largo como de día corto, con respecto a las plantas 35S::FPF1.

Se ha demostrado que la expresión constitutiva de AP1 da lugar a una floración independiente del fotoperíodo (Mandel y Yanofsky, véase antes). La expresión débil de AP1 conduce, por el contrario, a una reducción de la fase vegetativa bajo condiciones de día largo, pero posee escaso efecto bajo condiciones de día corto, es decir, las plantas florecen en el día corto sólo ligeramente antes que las plantas de tipo salvaje. Si se entrecruza en una línea 35S::AP1 de expresión débil 35S::FPF1, los descendientes, que expresan de manera constitutiva ambos genes, florecen bajo condiciones de día corto con la misma rapidez que bajo condiciones de día largo. Por lo tanto, se anula nuevamente la influencia de los fotoperíodos sobre la formación de florescencias. Las modificaciones observadas del tiempo de floración no son aditivas, sino que se aprecian efectos sinérgicos. Esto se puede explicar por un incremento de la competencia de las plantas 35S::FPF1 transgénicas por la acción del gen de identidad del meristemo de floración AP1.

También se ha demostrado, tras entrecruzamientos de plantas 35S::FPF1 transgénicas con plantas 35S::MADSA y 35S::MADSB, que los descendientes florecen todavía antes cuando se sobre-expresan simultáneamente FPF1 y uno de los restantes genes. Si se sobre-expresan simultáneamente MADSA y MADSB, los descendientes no florecen antes que las correspondientes plantas adultas. Esto indica que estos dos genes son activos en la misma vía de transducción de señales.

Se ha demostrado que las plantas que expresan FPF1 de manera constitutiva son más competentes para la formación de florescencias, es decir, reaccionan de manera más sensible a la expresión adicional de los genes de identidad del meristemo de floración LFY y AP1, así como a la expresión de MADSA y MADSB. Dado que los tres genes, FPF1, MADSA y MADSB, en caso de sobre-expresión con una moderada cantidad de transcrito, no limitan la fertilidad de las plantas ni su vitalidad, y que la influencia observada sobre la formación de florescencias es aditiva, se logran las condiciones para hacer posible la regulación del punto de floración en plantas útiles y decorativas en un grado hasta ahora desconocido. Como ejemplos de estas plantas útiles, cabe citar los géneros Triticum, Oryza, Zea, Hordeum, Sorghum, Avena, Secale, Lolium, Festuca, Lotus, Medicago, Glycine, Brassica, Solanum, Beta, así como plantas productoras de verduras o frutos y árboles angiospermos.

Para la combinación de los genes, existen diversas posibilidades. Los genes se pueden combinar en un vector de transformación y se les puede regular mediante diferentes promotores. El uso de diversos promotores es importante, ya que se ha observado que los genes que son regulados, en plantas transgénicas, por promotores idénticos, pueden entrar en hibernación, en parte por mecanismos que se recopilan bajo el término global de "cosupresión" (Matzke et al., Plant Journal 9, 183-194, 1996). Los genes pueden estar también en forma de proteínas de fusión, bajo el control conjunto de un único promotor. Las diversas posibilidades de combinaciones se representan en los Ejemplos.

Una misión adicional de la presente invención es poner a disposición plantas transgénicas que expresan MADSA y MADSB en orientación antisentido. Se ha demostrado que 35S::ASMADSA y 35S::ASMADSB florecen de forma claramente posterior que las plantas de control correspondientes. Tras un entrecruzamiento de líneas antisentido MADSA y MADSB se ha observado, en plantas que expresan ambas construcciones antisentido, una floración todavía más tardía. El retraso en la formación de florescencias se correlaciona, en este caso, directamente con la potencia de expresión de las construcciones antisentido. Puesto que la sobre-expresión de FPF1 incrementa la competencia de las plantas para la formación de florescencias, por el contrario, la sub-expresión de FPF1 conduce también a una reducción de la competencia para la formación de florescencias. De esta forma, se podrían seleccionar líneas transgénicas que expresen FPF1 en orientación antisentido y, por consiguiente, que florezcan de manera claramente más tardía que las correspondientes plantas d control. Una selección de líneas apropiadas, que expresen diferentes construcciones antisentido, posibilita, por lo tanto, una completa supresión de la formación de florescencias.

En plantas de las que se cosecha, por lo general, sólo la parte vegetal, se pueden utilizar construcciones antisentido para impedir una formación no deseada de florescencias. Esto juega un papel importante en la remolacha, que deposita azúcar en estado vegetativo en el nabo. Al comienzo de la floración, este azúcar se vuelve a movilizar y se utiliza para la construcción de la inflorescencia. Este proceso conlleva considerables pérdidas de cosecha. Dado que para el cultivo de la remolacha se siembran simientes híbridas, se debe garantizar que las plantas adultas sigan floreciendo para producir semillas. En este caso, se ofrece la estrategia mediante la cual las dos partes adultas se transforman con diferentes construcciones que, por sí solas, no provocan una reducción digna de mención de la formación de florescencias. Tan sólo la interacción de ambas construcciones en las plantas híbridas da lugar a una supresión de la formación no deseada de florescencias, que daría lugar a pérdidas de rendimiento. Los promotores inducibles, o promotores que sólo se activan por medio de un activador de una de las plantas adultas, ofrece la posibilidad adicional de permitir la expresión sólo en las plantas híbridas, tal como se describe en Moore, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 376-381, 1998.

La presente invención se ilustra por medio de los Ejemplos siguientes:

Ejemplo I Preparación de líneas transgénicas de Arabidopsis 1.1 Clonación de los genes

La clonación de MADSA y MADSB se llevó a cabo de la forma descrita en Menzel et al., Plant Journal 9, 399-408, 1996. FPF1 se clonó de acuerdo con el procedimiento descrito en Kania et al., Plant Cell 9, 1327-1338.

1.2 Sobre-expresión de los genes FPF1

La sobre-expresión de FPF1 se llevó a efecto según el procedimiento descrito en el documento WO 97/25433.

Construcciones sentido de MADSA y MADSB

Para la sobre-expresión del ADNc de MADSA y MADSB a partir de mostaza y Arabidopsis, se amplificaron las regiones codificadoras del ADNc por el procedimiento de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), según Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates Wiley Interscience, Nueva York (1989). Para la PCR se utilizaron los siguientes cebadores:

MADSA:: SaAEN: 5'-CCGAATTCCATGGTGAGGGGAAAACA-3'

\quad: AtAEN: 5'-CCGAATTCCATGGTGAGGGGAAAACT-3'

\quad: SaAEB: 5'-CCGAATTCGGATCCTCACTTTCTGGAAGAACA-3'

\quad: AtAEB: 5'-CCGAATTCGGATCCTCACTTTCTTGAAGAACA-3'

MADSB:: SaBEN: 5'-CCGAATTCCATGGGAAGGGGTAGGGTT-3'

\quad: AtBEN: 5'-CCGAATTCCATGGGAAGAGGTAGGGTT-3'

\quad: SaBEB: 5'-CCGAATTCGGATCCCTACTCGTTCGAAGTGGT-3'

\quad: AtBEB: 5'-CCGAATTCGGATCCCTACTGTTCGTAGTGGT-3'

Además de la región homóloga, los cebadores AEN y BEN contuvieron, respectivamente, una posición adicional de corte EcoRI y NcoI, y los cebadores AEB y BEB, una posición de corte EcoRI y BamHI. Los productos amplificados se ligaron, tras digestión con EcoRI, en la posición de corte EcoRI del vector pBS SK^{+} (Stratagene). Se secuenciaron las inserciones de clones seleccionados con el fin de excluir posibles errores de la PCR. Las regiones codificadoras se cortaron, seguidamente, con NcoI y BamHI del vector, se purificaron sobre gel de agarosa, y se insertaron en el vector pSH9 (Holtorf et al., Plant Mol. Biol., 29, 637-646, 1995). Este vector contiene el promotor 35S y la señal de poliadenilación del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Este llamado casete de expresión se cortó, a continuación, con HindIII y se ligó en el vector binario BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, 1984). Tras la multiplicación de los plasmidios recombinantes en E. coli, éstos se transformaron en agrobacterias (Höfgen, R. y Willmitzer, L., Nucl. Acids Res. 16, 9877, 1988). Las agrobacterias que contuvieron los plasmidios recombinantes se utilizaron para la transformación de las plantas.

1.3 Transformación de Arabidopsis

La transformación de Arabidopsis, mediante infiltración al vacío, tuvo lugar de manera análoga al procedimiento descrito por Bechthold et al., C.R. Acad. Sci. París, 316, 1194-1199, 1993.

1.4 Evaluación de las líneas transgénicas

A partir de cada construcción de sobre-expresión (sentido) se analizaron, respectivamente, 10 líneas transgénicas. Dado que la longitud de la fase vegetativa de Arabidopsis se correlaciona con el número de hojas en roseta formadas, se evalúa, por lo general, el número de hojas formadas hasta la formación de florescencias como medida del punto de floración.

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Genotipo	Hojas en día corto	Hojas en día largo
Col WT	65,1	16,3
35S::SaMADSA7	36,7	12,3
35S::SaMADSB21	37,4	7,0
35S::AtMADSA1	11,2	7,5
35S::AtMADSB1	10,3	7,2
35S::AtFPF1	43,3	11,4
35S::SaLFY	46,6	14,2
35S::SaAP1	58,4	9,6

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De las 10 líneas transgénicas evaluadas por construcción, se recogieron en la Tabla los valores de la línea que floreció más precozmente. Se registra, en todos los casos, el número total de hojas, incluidas las hojas altas en el eje principal de la inflorescencia.

En la Tabla se observa que las plantas transgénicas producen, en ambos fotoperíodos, un número claramente menor de hojas y, por lo tanto, florecen antes que las plantas de control. Resulta llamativa la floración especialmente precoz de las líneas que sobre-expresan los ADNc de MASDA y MADSB de Arabidopsis. Esto fue consecuencia de un mejor rendimiento de transformación, de manera que, al contrario que en la transformación con los ADNc de SaMADSA y SaMADSB, se pudo seleccionar ya entre los transformantes primarios tras la floración
precoz.

Ejemplo II Entrecruzamiento de líneas que sobre-expresan diversos genes 2.1 Ensayos de entrecruzamiento

Se llevaron a cabo entrecruzamientos de las siguientes líneas:

35S::AtFPF1 x 35S::SaMADSA

35S::AtFPF1 x 35S::SaMADSB

35S::SaMADSA x 35S::SaMADSB

35S::AtFPF1 x 35S::SaAP1

35S::AtFPF1 x 35S::SaLFY

Para los entrecruzamientos, se abrieron con pinzas los brotes de floración, todavía cerrados, de las plantas receptoras y se retiraron los sacos de polen de las florescencias, para evitar la posibilidad de una autopolinización. El polen de la línea mencionada en primer lugar se transfirió respectivamente a las marcas realizadas en los brotes abiertos. Después de 4 semanas, se cosecharon vainas maduras y se sembraron las semillas para las investigaciones
posteriores.

2.2 Evaluación de los entrecruzamientos

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Genotipo	Hojas en día corto	Hojas en día largo
Col WT	65,1	16,3
35S::AtFPF1 x 35S::SaMADSA	16,2	6,3
35S::AtFPF1 x 35S::SaMADSB	11,5	7,8
35S::SaMADSA x 35S::AtMADSB	35,5	10,1
35SFPF1 x 35S::SaAP1	9,8	8,6
35S::AtFPF1 x 35SSaLFY	17,3	11,6

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A partir de los entrecruzamientos de las plantas transgénicas se seleccionaron, en primer lugar, líneas homocigotas dobles. De las líneas seleccionadas, se analizaron y evaluaron, respectivamente, 12 plantas.

En todas las líneas en las que se entrecruzó 35S::AtFPF1, se observó una clara reducción del tiempo de espera hasta la formación de florescencias. Las plantas que sobre-expresaron MADSA y MADSB no exhibieron un acortamiento adicional de la fase vegetativa.

Ejemplo III Preparación de líneas de plantas con dos transgenes 3.1 Preparación de vectores de transformación que contienen dos genes bajo el control de diferentes promotores

Las regiones codificadoras de SaMADSA, SaMADSB y AtFPF1 se ligaron, de la forma descrita en el Ejemplo I, en el vector pSH5, que contiene un promotor de ubiquitina (Holtorf et al., véase antes). Los casetes de expresión clonados se cortaron, entonces, con PstI, se purificaron sobre un gel y se ligaron en el vector pBS SK^{+}. A continuación, a partir del vector pBS SK^{+}, se pudieron cortar los fragmentos con el promotor de ubiquitina, la correspondiente región codificadora y el terminador de CaMV con BamHI y EcoRI, y se utilizaron en los correspondientes vectores pBIN19-MADSA, pBIN19-MADSB y pBIN19-FPF1, en los que las regiones codificadoras de los respectivos genes están controladas por el promotor CaMV. Se obtuvieron los vectores de transformación: pBIN19-MADSA-MADSB, pBIN19-MADSA-FPF1, y pBIN19-MADSB-FPF1. Seguidamente, estos vectores se multiplicaron en E. coli, y se transformaron en agrobacterias. Plantas de Arabidopsis se transformaron de acuerdo con el método de infiltración de Bechthold et al. (véase antes).

3.2 Análisis de las plantas transgénicas

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Genotipo	Hojas en día corto	Hojas en día largo
Col WT	65,1	16,3
35S::AtMADSA-UBI::AtMADSB	38,3	12,1
35S::AtMADSA-UBI::AtFPF1	18,2	8,4
35S::AtMADSB-UBI::AtFPF1	19,6	7,8

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También en este ensayo se ha demostrado que las plantas con dos transgenes florecen de forma claramente más precoz que las plantas de control. Además, fue posible efectuar una selección de los diferentes puntos de floración a partir de una multiplicidad de transformantes independientes.

Ejemplo IV Preparación de vectores de transformación con proteínas de fusión entre FPF1 y MADSA o FPF1 y MADSB 4.1 Preparación de construcciones y transformación de plantas

En los vectores recombinantes pBIN19-MADSA, pBIN19-MADSB y pBIN19-FPF1 se insertaron, en la posición de corte de NcoI, fragmentos de PCR de las regiones codificadoras de MADSA, MADSB y FPF1, que tenían, respectivamente, una posición de corte de NcoI en el codón de inicio y tras los últimos aminoácidos codificados. De esta forma, se generaron vectores recombinantes que contenían dos regiones codificadoras bajo el control del promotor CaMV. Se obtuvieron las cuatro construcciones siguientes: 35S::MADSA::FPF1, 35S::MADSB::FPF1, 35S::FPF1::MADSA, y 35S::FPF1::MADSB. Los vectores recombinantes se multiplicaron en E. coli y se convirtieron en agrobacterias. Arabidopsis se transformó de acuerdo con el método de Bechthold et al. (véase antes).

4.2 Análisis de las plantas transgénicas

Las plantas transgénicas florecieron de manera claramente más precoz que las correspondientes plantas de control y que las plantas que sobre-expresaron un solo gen. Se evaluaron sendos 8 líneas transformadas con, respectivamente, 10 plantas. Los valores de las líneas más precoces aparecen representados en la Tabla.

Genotipo	Hojas en día corto	Hojas en día largo
Col WT	65,1	16,3
35S::AtMADSA::AtFPF1	21,3	11,2
35S::AtMADSB::AtFPF1	18,2	10,8
35S::AtFPF1::AtMADSA	23,8	12,1
35S::AtFPF1::AtMADSB	22,7	12,3

En este ensayo, se ha demostrado que las plantas con dos transgenes, bajo el control de solamente un promotor, también florecen de manera claramente más precoz que las plantas de control. También en este caso fue posible realizar una selección de diferentes puntos de floración a partir de una multiplicidad de transformantes independientes.

Ejemplo V Modificación del punto de floración en variedades de tabaco transgénico con diversas dependencias fotoperiódicas con respecto a la inducción de la floración

Desde el descubrimiento de la inducción fotoperiódica de la formación de florescencias (Garner y Allard, J. Agric. Res. 18, 553-606, 1920), se han llevado innumerables estudios para comprender la influencia de la duración del día sobre la inducción de la floración. La mayor parte de los tipos de plantas utilizadas con estos fines muestra una estricta dependencia de los fotoperíodos, es decir, florecen sólo cuando se baja por debajo de una duración crítica del período de luz (plantas de día corto), o se supera dicha duración crítica (plantas de día largo). A estas plantas pertenecieron también, en particular, los distintos tipos de tabaco, con diversos requerimientos fotoperiódicos para una inducción de la floración. En los Ejemplos descritos en este documento se utilizaron tres tipos diferentes de tabaco: el tabaco de día largo Nicotiana sylvestris (Ns), el tabaco de día neutro Nicotiana tabacum (Nt), y el tabaco de día corto Nicotiana tabacum Maryland Mammoth (Nt-MM). A través del uso de las construcciones génicas descritas en los Ejemplos anteriores, se puede lograr la inducción de la floración de las variedades estrictamente fotoperiódicas también bajo fotoperíodos no inductores.

5.1 Transformación del tabaco

Para la transformación de las diversas variedades de tabaco fotoperiódico se utilizaron las construcciones que se describen en el Ejemplo I. Adicionalmente, se utilizó también el gen FPF1 homólogo de Nicotiana tabacum, que exhibe una identidad de la secuencia de nucleótidos en la región codificadora de 67,7% con el gen FPF1 de la mostaza. Este gen FPF1 del tabaco se dotó, del mismo modo, para una expresión constitutiva, con un promotor CaMV y un terminador, como se ha descrito en el Ejemplo I para los transgenes de mostaza y Arabidopsis. Para esto, se introdujeron, mediante una reacción de PCR con los siguientes cebadores, una posición de corte de restricción NcoI en el codón de inicio, y una posición de corte de restricción BamHI en el codón de detención:

NtFPF-EN: 5'-CAGGAATTCCATGGCTGGAGTTTGGGT-3'

NtFPF-EB: 5'-CAGGAATTCGGATCCTTATCATATGTCTCTAAC-3'

La transformación del tabaco se llevó a cabo con un método estándar (Horsch et al., Science 227, 1229-1234, 1985).

5.2 Expresión constitutiva de FPF1, MADSA o MADSB

Las plantas transgénicas se cultivaron en cámaras climáticas bajo las mismas condiciones de día corto o largo que se emplearon para Arabidopsis.

Para la evaluación del punto de floración, se tuvo en consideración, en el caso del tabaco, la duración del tiempo transcurrido desde la siembra hasta la apertura de la primera florescencia. Se evaluaron de una línea representativa 8 plantas. En la Tabla siguiente se consideran plantas que, respectivamente, sólo sobre-expresan de manera constitutiva un solo gen.

\vskip1.000000\baselineskip

Genotipo	Número de días hasta la	Número de días hasta la
	formación de florescencias	formación de florescencias
	en DC	en DL
Nt	93	76
Nt 35S::SaFPF1	85	68
Nt 35S::SaMADSA	76	55
Nt 35S::SaMADSB	68	54
Nt 35S::NtFPF1	81	64
Nt-MM	106	no florece
Nt-MM 35S::SaFPF1	99	no florece
Nt-MM 35S::SaMADSA	72	124
Nt-MM 35S::SaMADSB	80	no florece
Nr-MM 35S::NtFPF1	97	no florece
Ns	no florece	82
Ns 35S::FPF1	no florece	78
Ns 35S::MADSA	no florece	76
Ns 35S::MADSB	94	70
Ns 35S::NtFPF1	no florece	67

\vskip1.000000\baselineskip

La evaluación de este ensayo demuestra que el tabaco de día neutro Nicotiana tabacum, a través de la sobre-expresión de los diversos transgenes, produce florescencias de manera más rápida tanto bajo condiciones de día corto como de día largo. El número de florescencias y de semillas es comparable, en todos los casos, con los registrados en plantas de tipo salvaje. El tabaco de día corto transgénico Nicotiana tabacum Maryland Mammoth florece, bajo condiciones de día corto inductoras, de manera respectivamente más precoz que las plantas de tipo salvaje bajo las mismas condiciones. Bajo condiciones de día largo no inductoras, el tipo salvaje de tabaco Maryland Mammoth no florece. El tabaco Maryland Mammoth transgénico que sobre-expresa FPF1 o MADSB tampoco florece bajo condiciones de día largo; ahora bien, si sobre-expresa MADSA, también este tabaco florece bajo condiciones no inductoras. Mediante la sobre-expresión de solamente un gen se vence, también en este caso, la limitación fotoperiódica de la inducción a la floración bajo condiciones no inductoras. Las plantas de tipo salvaje de Nicotiana sylvestris no florecen bajo condiciones de día corto, y tampoco la expresión constitutiva de FPF1 o MADSA conduce a la floración bajo condiciones no inductoras. No obstante, la sobre-expresión de MADSB da lugar a la formación de florescencias también en el tabaco de día largo Nicotiana sylvestris bajo condiciones no inductoras de día
corto.

Ejemplo VI 6.1 Expresión combinada de FPF1 con MADSA o MADSB en distintas variedades de tabaco

De manera análoga a las combinaciones de transgenes por entrecruzamiento, descritas en el Ejemplo II, se llevaron a cabo entrecruzamientos también con las diferentes líneas de tabaco fotoperiódicas que sobre-expresan FPF1, MADSA o MADSB. En la Tabla siguiente se representan los puntos de floración de plantas que contienen, respectivamente, dos transgenes.

\vskip1.000000\baselineskip

Genotipo	Número de días hasta la	Número de días hasta la
	formación de florescencias	formación de florescencias
	en DC	en DL
Nt 35S::SaFPF1
X	65	59
Nt 35S::SaMADSA
Nt 35S::FPF1
X	60	50
Nt 35S::SaMADSB
Nt-MM 35S::SaFPF1
X	68	88
Nt-MM 35S::SaMADSA
Nt_MM 35S::SaFPF1
X	76	98
Nt-MM 35S::SaMADSB
Ns 35S::SaFPF1
X	no florece	67
Ns 35S::SaMADSA
Ns 35S::SaFPF1
X	82	62
Ns 35S::SaMADSB

\vskip1.000000\baselineskip

Hasta el entrecruzamiento de Ns-SaFPF1 con Ns-SaMADSA, la expresión combinada conduce, en todos los casos, a un acortamiento adicional de la fase vegetativa. Mientras que las plantas Maryland Mammoth que sobre-expresan MASDB o FPF1 no producen florescencias bajo condiciones de día largo no inductoras, la expresión combinada de estos dos genes, bajo condiciones por lo demás idénticas, si produce formación de florescencias.

Ejemplo VII Modificación del punto de floración en plantas de colza

La colza es una planta de gran importancia en la agricultura, que se cultiva en todos los continentes para la fabricación de aceites comestibles e industriales. En latitudes nórdicas tales como, por ejemplo, Canadá o Escandinavia, en las regiones de cultivo de la colza existe el riesgo de irrupciones precoces del invierno que, a menudo, devalúan la cosecha de colza, puesto que la planta no puede madurar y proporciona aceite de baja calidad. Un adelantamiento del punto de floración y, por lo tanto, una maduración más precoz de las plantas de colza en pocos días podría resolver este problema. Adicionalmente, se podrían cultivar plantas de colza florecientes en regiones más septentrionales y ampliar, de este modo, las superficies de cultivo.

7.1 Preparación de plantas de colza transgénicas

Para una sobre-expresión en las plantas de colza (Brassica napus) se utilizaron los vectores descritos en el Ejemplo I para la expresión de FPF1, MADSA y MADSB. La transformación tuvo lugar según un método estándar (Moloney et al., Plant Cell Reports 8, 238-242, 1989). Se transformaron una línea de colza de invierno (WR) y otra de verano (SR).

7.2 Análisis del punto de floración de las plantas de colza transgénicas

En la Tabla se recogió el número de días en que se adelantó la maduración de la colza con respecto a plantas de control. Se evaluaron, respectivamente, 12 plantas de una línea transgénica representativa. Las plantas se cultivaron en invernadero y, tal como es preciso en la colza de invierno, se aplicaron condiciones de vernalización en distintos tiempos.

Genotipo	Número de días en que se adelantó la maduración
	de la colza transgénica
Bn (WR) 35S::SaFPF1	7
Bn (SR) 35S::SaFPF1	3
Bn (WR) 35S::SaMADSA	7
Bn (SR) 35S::SaMADSA	5
Bn (WR) 35S::SaMADSB	12
Bn (SR) 35S::SaMADSB	6

Las plantas de colza transgénica maduraron de manera significativamente más precoz que las plantas de tipo salvaje bajo condiciones iguales. Se demostró, además, que las plantas de colza de invierno que sobre-expresan el gen MADSB, se deben someter a vernalización durante un período claramente menor para alcanzar la formación de florescencias. En tanto que las plantas de tipo salvaje se deben mantener durante 8 semanas a 4ºC, para las plantas 35S::MADSB sólo se necesitaron 2 semanas de vernalización para una completa competencia para la inducción de la floración. La combinación de 35S::MADSB con 35S::FPF1 condujo, en este sentido, incluso a una supresión total de la necesidad de vernalización para la formación de florescencias. Esto se puede aprovechar para un cultivo más rápido de cereales invernales y plantas de colza de invierno, o para la siembra de las semillas tras el período de invierno.

Ejemplo VIII Preparación de vectores de transformación con construcciones antisentido, para evitar la formación de florescencias 8.1 Preparación de vectores de transformación con construcciones antisentido de FPF1, MADSA y MADSB

Las construcciones antisentido tienen aplicación, por ejemplo, en el cultivo de la remolacha y plantas de lechuga. El procedimiento se lleva a cabo, en este caso, sobre el modelo de Arabidopsis thaliana.

Construcciones antisentido

Mediante la transformación de plantas con construcciones de ADN que hacen posible la trascripción de un ARN antisentido en la planta, se puede suprimir la expresión de un gen, de manera que se pueden excluir las alteraciones fenotípicas, que aparecen eventualmente, de la planta transformada sobre la función de este gen en los procesos metabólicos o de desarrollo. Para la inhibición específica de la expresión de AthMADSA y AthMADSB, sin influir simultáneamente sobre la actividad de otros genes de MADS Box, se utilizaron en la preparación de las construcciones de transformación aquellos segmentos del ADNc de Arabidopsis que no contenían las regiones de MADS Box conservadas. En una primera etapa, se cortó un fragmento de 530 pb del ADNc de AthMADSA, que comprendió XbaI/HindIII, que contuvo una parte de la región codificadora y la región no codificadora 3', prácticamente completa, así como un fragmento de 640 pares de bases (pb) de longitud de BamHI/HindIII del ADNc de AthMADSB, que contuvo igualmente una parte de la región codificadora así como la sección no codificadora 3' completa. Se completaron los extremos sobresalientes de los fragmentos aislados y se ligaron en la posición de corte SmaI del vector pBS SK^{+} (Stratagene).

Para la preparación de la construcción antisentido de FPF1 fue posible cortar la totalidad del ADNc con BamHI y EcoRI en la orientación correcta a partir de un vector pBS SK^{+}.

Tras determinar la orientación apropiada de los ADNc de MADSA y MADSB, se aislaron los tres ADNc con BamHI y EcoRI, ligándolos de manera dirigida en orientación antisentido en el vector pRT 104 (Töpfer et al., Nucl. Acids Res. 15, 5890, 1987). De esta forma, se estableció un casete promotor::antisentido::terminador, compuesto por el promotor CaMV, el correspondiente ADNc (MADSA, MADSB o FPF1), y una señal de poliadenilación de CaMV. Para comprobar la orientación antisentido de los fragmentos de ADNc, las construcciones se secuenciaron.

\newpage

A continuación, las construcciones antisentido se aislaron, por medio de una digestión de HindIII, a partir de un vector pRT104, y se insertaron en la posición de corte de HindIII del vector de transformación de plantas pBIN19 (Bevan, véase antes). Las etapas individuales de la clonación se analizaron por análisis de transferencia de Southern.

Los plasmidios BIN19 recombinantes se clonaron en E. coli y se convirtieron, seguidamente, en agrobacterias. Arabidopsis se transformó de acuerdo con Bechthold et al. (véase antes).

8.2 Análisis de las plantas transgénicas

Genotipo	Hojas en día corto	Hojas en día largo
Col WT	65,1	16,3
35S::ASAtFPF1	79,8	18,2
35S::ASAtMADSA40	73,3	21,0
35S::ASAtMADSB74	76,5	17,9
35S::ASAtMADSA40
X	86,3	25,8
35S::ASAtMADSB74

De esta manera, se pudo demostrar que las líneas transgénicas con construcciones antisentido florecen de forma marcadamente más tardía que las correspondientes plantas de control.

Claims

1. Secuencia de ADN recombinante que comprende, por lo menos, tres secuencias de ADN, caracterizada porque la primera secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora, que controla la expresión de un fragmento de ADN en un organismo, y porque la segunda y tercera secuencias de ADN comprenden secuencias codificadoras de dos diferentes genes inductores de la floración, seleccionados del grupo compuesto por MADSA, MADSB, FPF1, así como secuencias codificadores de genes homólogos con una identidad de 60 hasta 98%.

2. Secuencia de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizada porque las secuencias codificadoras comprenden los genes MADSA y FPF1 o MADSB y FPF1.

3. Secuencia de ADN recombinante según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque determinan el adelantamiento de la inducción a la floración en plantas útiles y decorativas.

4. Procedimiento para adelantar la inducción a la floración en plantas útiles y decorativas, caracterizado porque las regiones codificadoras de dos genes inductores de la floración diferentes, seleccionados del grupo compuesto por MADSA, MADSB y FPF1, se expresan de forma constitutiva, siempre bajo el control de una secuencia reguladora propia, y porque las regiones codificadoras de los citados genes MADSA, MADSB y FPF1 se encuentran bajo el control de un promotor CaMV, o bajo el control de otros promotores con secuencias de expresión de señales, incluidos los promotores bacterianos del gen de nopalin sintetasa (nos), del gen octopin sintetasa (ocs) del plasmidio Ti de Agrobacterium tumefaciens, o de los promotores de ubiquitina, actina, histona y tubulina, o de los promotores inducibles del golpe de calor y del ácido abscisínico (ABA), o de promotores específicos del
meristemo.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque las regiones codificadoras de los genes MADSA, MADSB y FPF1 están incluidas en un vector.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque las regiones codificadoras de los genes MADSA, MADSB y FPF1

a): están ligadas en un promotor de ubiquitina y un vector pSH5 que contiene un terminador CaMV;

b): los casetes de expresión resultantes de a) se ligan en vectores pBIN19-MADSA, pBIN19-MADSB y pBIN19-FPF1 que contienen promotores CaMV;

c): las construcciones 35S::MADSA::UBI::FPF1, 35S::MADSB::UBI::FPF1, 35S::FPF1::UBI::MADSA, y 35S::FPF1::UBI::MADSB, resultantes de b), se multiplican en E. coli; y

d): las construcciones obtenidas de c) se transforman en plantas, preferentemente plantas útiles y decorativas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque las plantas útiles mencionadas en la etapa d) comprenden plantas de los géneros Triticum, Oryza, Zea, Hordeum, Sorghum, Avena, Secale, Lolium, Festuca, Lotus, Medicago, Glycine, Brassica, Solanum, Beta, así como plantas productoras de verduras o frutos, árboles angiospermos y plantas decorativas.

8. Secuencia de ADN recombinante según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque los dominios activos de los genes inductores de la floración se expresan como proteínas de fusión.

9. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque los dominios activos de los genes inductores de la floración se expresan como proteínas de fusión.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque

a): en los vectores recombinantes pBIN19-MADSA, pBIN19-MADSB y pBIN19-FPF1 se introducen fragmentos de las regiones codificadoras de MADSA, MADSB y FPF1;

b): las construcciones 35S::MADSA::FPF1, 35S::MADSB::FPF1, 35S::FPF1::MADSA, y 35S::FPF1:: MADSB, obtenidas de a), se multiplican en E. coli; y

c): las construcciones multiplicadas en b) se transforman en plantas, preferentemente en plantas útiles y decorativas.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque las plantas útiles mencionadas en la etapa c) comprenden plantas de los géneros Triticum, Oryza, Zea, Hordeum, Sorghum, Avena, Secale, Lolium, Festuca, Lotus, Medicago, Glycine, Brassica, Solanum, Beta, así como plantas productoras de verduras o frutos, árboles angiospermos y plantas decorativas.

12. Procedimiento para retrasar la inducción de la floración en plantas útiles y decorativas, caracterizado porque se expresan en una planta las secuencias codificadoras de dos genes inductores de la floración diferentes, en orientación antisentido, en donde las construcciones antisentido se derivan de los genes FPF1, MADSA o MADSB.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque se entrecruzan dos plantas adultas que expresan, respectivamente, una secuencia codificadora de dos genes inductores de la floración diferentes, en orientación antisentido, en donde las construcciones antisentido derivan de los genes FPF1, MADSA o MADSB.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la expresión de las secuencias codificadoras de los dos genes inductores de la floración diferentes, en orientación antisentido, no da lugar en las plantas adultas a ninguna reducción digna de mención de la formación de florescencias.

15. Procedimiento según las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque las dos plantas adultas son remolachas.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque se expresa una secuencia de ADN recombinante, según la reivindicación 1 ó 2, en orientación antisentido.

17. Procedimiento para acortar el tiempo de vernalización de cereales de invierno y colza de invierno, caracterizado porque para la producción de colza de invierno y cereales de invierno transgénicos se utiliza una secuencia de ADN recombinante según una de las reivindicaciones 1 ó 2.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la citada secuencia de ADN recombinante determina una sobre-expresión del gen MADSB.

19. Procedimiento para suprimir el tiempo de vernalización de la colza de invierno y cereales de invierno, caracterizado porque se utiliza una secuencia de ADN recombinante, según la reivindicación 17, para la producción de colza de invierno y cereales de invierno transgénicos, que determina una sobre-expresión combinada de los genes MADSB y FPF1.