ES2307532T3 - Metodos y medios para modificar caracteristicas de la floracion de vegetales. - Google Patents

Abstract

Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos VRN1 que codifica un polipéptido que es capaz de alterar específicamente la respuesta a la vernalización de un vegetal en el que se ha introducido y expresado el ácido nucleico, en el que la secuencia de nucleótidos VRN1: (i) codifica el polipéptido VRN1 de la figura 7, o (ii) codifica una variante del polipéptido que comparte por lo menos un 70% de identidad con el polipéptido que se muestra en la figura 7.

Description

Métodos y medios para modificar características de la floración de vegetales.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a procedimientos y materiales que se utilizan para modificar características de vegetales, en particular la respuesta de vernalización en vegetales.

Técnica anterior

Los vegetales deben integrar una amplia variedad de señales del entorno para maximizar su éxito reproductivo. Parte de esta integración debe implicar la percepción de las estaciones, tanto para asegurar que el vegetal florece durante la estación correcta (a la cual está adaptado) como para sincronizar su floración con otros miembros de su propia especie, para aumentar las posibilidades de fertilización cruzada. Arabidopsis thaliana sirve como vegetal modelo porque muestra respuestas a una amplia variedad de estímulos del entorno que se observan en muchas especies. Entre otros estímulos, la floración de cepas de aparición natural (ecotipos) de Arabidopsis puede favorecerse mediante vernalización, un tratamiento a base de frío de larga duración que emula el frío del invierno.

Muchas especies de vegetales que crecen en climas templados o más fríos requieren forzosamente vernalización para florecer. Dichos vegetales germinan habitualmente en otoño, se mantienen a lo largo del invierno como vegetales vegetativos y florecen con el clima más templado de la primavera. De este modo la vernalización actúa como un estímulo que permite a los vegetales percibir las estaciones y llegado el momento de florecer maximizar sus posibilidades de éxito reproductivo.

Las especies para las cuales florecer es importante para la producción del cultivo son numerosas, fundamentalmente todos los cultivos que proceden de semilla, siendo ejemplos importantes los cereales, el arroz y el maíz, probablemente los agronómicamente más importantes en zonas climáticas más cálidas, y el trigo, la cebada, la avena y el centeno en climas más templados. Productos importantes procedentes de semilla son la colza, la remolacha azucarera, el maíz, el girasol, la soja y el sorgo. Muchos cultivos que se cosechan por sus raíces se cultivan, evidentemente, de forma anual a partir de semillas y la producción de semillas de cualquier tipo depende mucho de la capacidad del vegetal para florecer, ser polinizado y formar semillas. En horticultura, es importante controlar el momento de la floración. Los vegetales de horticultura cuya floración puede controlarse son la lechuga, la endibia y las brasicáceas, entre las cuales la col, el brécol y la coliflor, y los claveles y los geranios.

Dado el gran número de especies cultivares comercialmente importantes que requieren vernalización para florecer, la modificación de este requisito (por ejemplo reduciendo la duración de la vernalización requerida, o cambiando la temperatura óptima, o eliminando el requisito totalmente) sería de interés agronómico.

Chandler y otros (1996) describieron mutantes de Arabidopsis que mostraban una respuesta alterada a la vernalización. La mutagénesis produjo 5 mutaciones independientes (denominadas mutaciones vrn) en 3 locus (denominados VRN1, VRN2 y VRN3). El locus VRN1 se localizó en el cromosoma 3.

Descripción de la invención

Los inventores han utilizado un mutante de Arabidopsis sensible a la vernalización y de floración tardía, el mutante fca, como marco en el cual aislar mutantes que muestran una respuesta reducida a la vernalización y para identificar alelos vrn1 que son responsables de este fenotipo. El gen VRN1 es el primer gen de Arabidopsis relacionado con el momento de floración aislado que es al parecer exclusivo para favorecer la vía de la vernalización. Tal como se comenta con mayor detalle posteriormente, la manipulación del gen puede permitir el control o la modificación de la respuesta a la vernalización de especies cultivares agronómicamente importantes.

Que el VRN1 es necesario para la respuesta normal a la vernalización es algo que queda claro a partir del fenotipo de los mutantes vrn1. Otros experimentos de los inventores indican que hay un aspecto cuantitativo relativo a la actividad VRN1. Esto sugiere que aumentar o disminuir artificialmente la cantidad de VRN1 (por ejemplo, a través de la sobreexpresión o supresión no codificante) puede proporcionar una herramienta para, entre otras cosas, ajustar con precisión la cinética y/o la temperatura óptima de la respuesta a la vernalización; para inmunizar a los vegetales ante el efecto de frío en la respuesta de floración; o para eliminar totalmente la necesidad de un tratamiento con frío. Además de la manipulación cuantitativa, podría conseguirse otro nivel de control dirigiendo una construcción VRN1 codificante o no codificante utilizando promotores que o bien se mantienen siempre (constitutivos); o que son inducibles por la aplicación de una molécula específica; o que dirigen "naturalmente" la expresión sólo durante un tiempo determinado del ciclo vital del vegetal, por ejemplo la maduración de las semillas o la fase vegetativa tardía.

Dichos procedimientos podrían utilizarse para mejorar especies cultivares agronómicamente importantes, por ejemplo tal como sigue:

(a) Extensión de un intervalo geográfico de variedades de élite: Si un cultivar de élite de un cultivo se origina en una área geográfica en la que se ha adaptado a requerir un período determinado de vernalización, y por lo tanto se ve limitado climáticamente en su alcance, entonces ajustar la expresión de VRN1 puede permitir alterar la longitud y la intensidad del tratamiento con frío necesario para conseguir un momento de floración óptimo en nuevas áreas geográficas. A este respecto merece la pena observar dos hechos:

(1)

incluso alteraciones moderadas en la respuesta a la vernalización podrían abrir enormes áreas nuevas de cultivo para variedades de élite en particular (una situación análoga a aquella en la que pequeños cambios en condiciones climáticas pueden alterar la ecología y el carácter de enormes áreas de tierra), y (2) el éxito comercial de genotipos de élite se ve muy dificultado por la dependencia en condiciones climáticas específicas observadas en áreas geográficas limitadas.

(b) Reducción del período de vernalización: si un cultivo de invierno puede sembrarse y dejarse en el suelo durante un período de tiempo más corto del habitual (es decir, un tiempo reducido de vernalización, quizás como resultado de un aumento o falta de expresión de VRN1) esto puede reducir el riesgo asociado con las duras condiciones del invierno, ya que los cultivos se ven expuestos a condiciones invernales durante menos tiempo.

(c) Extensión del crecimiento vegetativo: si el cultivo en cuestión es un cultivo en el cual las partes vegetativas del vegetal son el producto deseado (por ejemplo, vegetales de hoja, remolacha azucarera), entonces evitar que el vegetal florezca en respuesta a la temperatura fría (es decir, haciéndola menos sensible al frío alterando la función VRN1) evitaría la malversación de recursos valiosos del vegetal que van de los tejidos vegetativos a los tejidos reproductivos de desarrollo y por lo tanto aumentaría la producción.

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Otros experimentos indican que especies distintas de Arabidopsis contienen genes parecidos al VRN1. Además, también puede haber homólogos y/o ortólogos y/o parálogos de VRN1 (tales como RTV1) en Arabidopsis y en otras especies. Según la descripción de la presente invención, tales genes pueden aislarse sin que ello represente ninguna dificultad para los expertos en la materia y utilizarse de un modo análogo a los que se describen en la presente invención.

Estos y otros aspectos de la presente invención se comentarán con mayor detalle a continuación.

De este modo según un aspecto de la presente invención se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos VRN1 que codifica un polipéptido que es capaz de alterar específicamente la respuesta a la vernalización de un vegetal en el que se ha introducido y expresado el ácido nucleico, en el que la secuencia de nucleótidos VRN1:

(i) codifica el polipéptido VRN1 de la figura 7, o (ii) codifica un polipéptido distinto que comparte por lo menos un 70%, un 80% o un 90% de identidad con el polipéptido de la figura 7.

La alteración en la respuesta a la vernalización puede evaluarse comparando con un vegetal en el cual no se ha introducido el ácido nucleico.

El fenotipo de respuesta a la vernalización de los vegetales puede analizarse examinando su tiempo de floración en respuesta a las distintas duraciones del tratamiento de vernalización. En los experimentos posteriores esto se evaluó de dos maneras: (1) como el número total de hojas vegetativas producidas antes de la floración (LN), y (2) como el tiempo en días desde el final del tratamiento de vernalización hasta la aparición del primer capullo (FT). No obstante, puede utilizarse cualquier procedimiento apropiado conocido por los expertos en la materia.

Aparte del cambio específico en la respuesta a la vernalización, se prefiere que otras características del vegetal se mantengan fundamentalmente sin modificar por el polipéptido, lo cual significa que el polipéptido actúa específicamente sobre esta respuesta y no más generalmente sobre características del tiempo de floración u otros estímulos, tales como aquellos en los que intervienen otros locus tales como el locus FRI (Clarke y Dean, 1994, Mol. Gen. Genet. 242, 81-89) o el locus VRN2 (Chandler y otros, 1996).

Preferiblemente la molécula de ácido nucleico aislada capaz de alterar específicamente la respuesta a la vernalización de un vegetal puede obtenerse a partir del locus VRN1 de un vegetal, más preferiblemente a partir de A. thaliana.

Según la presente invención el ácido nucleico puede incluir ADNc, ARN, ADN genómico y ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos modificados (por ejemplo, ácido nucleico peptídico). Cuando se especifica una secuencia de ADN, por ejemplo en referencia a una figura, a no ser que el contexto lo requiera de otro modo se incluye el equivalente de ARN, con sustitución de U por T. Las moléculas de ácido nucleico según la presente invención pueden proporcionarse aisladas y/o purificadas de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o libres o sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos de la especie de origen. Cuando se utiliza en la presente invención, el término "aislado" incluye todas estas posibilidades. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser total o parcialmente sintéticas. En particular pueden ser recombinantes dado que las secuencias de ácido nucleico que no se hallan juntas en la naturaleza (no aparecen de manera contigua) han sido ligadas o combinadas de otro modo artificialmente. Alternativamente pueden haberse sintetizado directamente utilizando por ejemplo un sintetizador automatizado.

De este modo en un aspecto de la invención, se ha descrito un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la figura 7. El polipéptido VRN1 tiene una longitud de 341 aminoácidos y consta de por lo menos tres regiones. La región 1 (restos 2-94 de la figura 7) y la región 3 (restos 239-332) pueden alinearse entre sí y están relacionadas con el dominio B3 de unión a ADN hallado originalmente en el factor de transcripción del maíz VIVIPAROUS1 (VP1; McCarty y otros, 1991). La región 2 de VRN1 (restos 95-238), que se sitúa entre los dos dominios B3, no se relaciona claramente con ningún dominio de función conocida ni tiene características evidentes de un dominio de activación o represión de la transcripción. Sin embargo, la región 2 cuenta con varias características y motivos de la secuencia provocadora, incluida una supuesta señal de localización nuclear (NSL), dos supuestas regiones PEST y tres motivos RXXL también asociados a degradación proteínica rápida (Cooper y otros, 1997). Curiosamente, la segunda región PEST de VPRN1 contiene un posible sitio de fosforilación de la proteinquinasa C (PKC) (restos 176-178).

En la figura 7 se muestra un ácido nucleico que codifica este polipéptido desde los nucleótidos 269-1295 inclusive (que incluye el codón de terminación). Entre otros ácidos nucleicos de la invención se incluyen aquellos que son degenerativamente equivalentes a éste.

En el Anexo I se muestra una secuencia genómica que incluye el locus VRN1. En la figura 7 se muestra la supuesta secuencia de ADNc transcrita a partir de esta secuencia genómica. Aunque este marco abierto de lectura (ORF) ha sido designado ORF de la presente invención, los expertos en la materia sabrán apreciar que la discusión de aquí en adelante se aplica igualmente a cualquier otro ORF presente en la secuencia descrita que tenga las propiedades atribuidas a VRN1.

En otro aspecto de la presente invención se describen ácidos nucleicos que son variantes de las secuencias VRN1 comentadas anteriormente.

Una variante de una molécula de ácido nucleico comparte homología con todas o con parte de las secuencias comentadas anteriormente, o es idéntica a las mismas.

Dichas variantes pueden haberse utilizado para alterar las características de vernalización de un vegetal, tal como han sido evaluadas por los procedimientos descritos en la presente invención. Por ejemplo, una variante de ácidos nucleicos puede incluir una secuencia que codifique un polipéptido funcional (que por ejemplo puede ser una variante de un polipéptido VRN1 y el cual puede presentar reactividad cruzada con un anticuerpo creado para dicho polipéptido). Alternativamente pueden incluir una secuencia que interfiere con la expresión o la actividad de dicho polipéptido (por ejemplo supresión codificante o no codificante de una secuencia que codifica VRN1).

Las variantes también pueden utilizarse para aislar o amplificar ácidos nucleicos que tienen estas propiedades (por ejemplo, mediante inclusión de una secuencia que puede hibridarse con una secuencia de VRN1.).

De un modo general las variantes pueden ser:

(i) Ácidos nucleicos nuevos, de aparición natural, que pueden aislarse utilizando las secuencias de la presente invención. Pueden incluir alelos (que incluirán polimorfismos o mutaciones en una o más bases, por ejemplo vrn1 o vnr2 que se muestran en la figura 7) o seudoalelos (que pueden tener lugar en locus estrechamente unidos al gen VRN1). También se incluyen parálogos, isogenes u otros genes homólogos que pertenecen a la misma familia que el gen VRN1. Aunque éstas pueden tener lugar en distintos locus genómicos del gen, es probable que compartan regiones conservadas con éste (por ejemplo, RTV1 en los Ejemplos que aparecen posteriormente). También se incluyen homólogos de VRN1 de otras especies de vegetales.

(ii) Ácidos nucleicos artificiales que puede preparar el experto en la materia a la luz de la presente descripción. Dichos derivados pueden prepararse, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida o aleatoria, o mediante síntesis directa. Preferiblemente, la variante de ácido nucleico se genera directa o indirectamente (por ejemplo, a través de una o más etapas de amplificación o replicación) a partir de un ácido nucleico que tenga toda o parte de la secuencia VRN1 que se muestra en la figura 7.

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Particularmente se incluyen variantes que comprenden sólo una parte o fragmento distintivos (no obstante producidos) que corresponden a una parte de la secuencia proporcionada. Los fragmentos pueden codificar partes funcionales particulares del polipéptido. Alternativamente, los fragmentos pueden ser de utilidad para sondaje, o amplificación, de la secuencia proporcionada o de aquellas muy afines. A continuación se describen con mayor detalle las longitudes adecuadas del fragmento y las condiciones para tales procesos.

También se incluyen ácidos nucleicos que corresponden a los anteriores, pero que han sido ampliados en los extremos 3' o 5'.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "variante" de ácido nucleico incluye todas estas posibilidades. Cuando se utiliza en el contexto de polipéptidos o proteínas indica el producto de expresión codificado de la variante de ácido nucleico.

Algunos de los aspectos de la presente invención que se refieren a variantes se comentarán con mayor detalle a continuación.

La homología (semejanza o identidad) puede evaluarse tal como se establece en el apartado de Materiales y procedimientos en los Ejemplos que aparecen posteriormente.

Puede constatarse homología a nivel de la secuencia de nucleótidos y/o la secuencia de aminoácidos codificados. La secuencia de ácidos nucleicos y/o aminoácidos comparte por lo menos un 70% o un 80% de identidad, más preferiblemente por lo menos un 90%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% de identidad.

Puede haber homología en toda la longitud de la secuencia relevante mostrada en la presente invención, o en parte de la misma, preferiblemente en una secuencia contigua de aproximadamente o más de aproximadamente 20, 25, 30, 33, 40, 50, 67, 133, 167, 200, 233, 267, 300, o más aminoácidos o codones, comparado con la figura 7.

De este modo una variante de polipéptido codificado por un ácido nucleico de la presente invención puede incluir, dentro de la secuencia mostrada en la figura 7, un solo cambio de aminoácido o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 cambios, aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40 o 50 cambios, o más de aproximadamente 50, 60, 70, 80 o 90 cambios.

En otro aspecto de la invención se describe un procedimiento para producir un ácido nucleico derivado que comprende la etapa de modificar cualquiera de las secuencias descritas anteriormente, en particular la secuencia codificante de la figura 7.

Los cambios pueden ser deseables por numerosas razones. Por ejemplo, pueden introducir o eliminar sitios de restricción de la endonucleasa o para alterar el uso de codones.

Alternativamente los cambios en una secuencia pueden producir un derivado mediante una o más adición, inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en el ácido nucleico, causantes de la adición, inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado.

Dichos cambios pueden modificar sitios que son necesarios para la modificación posterior a la traducción tales como sitios de escisión en el polipéptido codificado; motivos en el polipéptido codificado para fosforilación, etc. (por ejemplo, restos 176-178 de la figura 7). Pueden añadirse secuencias líder u otras secuencias de reconocimiento (por ejemplo, secuencias de localización de membrana o de Golgi) a la proteína expresada para determinar su localización tras la expresión si se desea aislarla de un sistema microbiano.

Otras mutaciones deseables pueden ser mutagénesis aleatoria o dirigida para alterar la actividad (por ejemplo, especificidad) o estabilidad del polipéptido codificado. Los cambios pueden ser mediante variación conservadora, es decir sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina. Como muy bien saben los expertos en la materia, alterar la estructura primaria de un polipéptido mediante sustitución conservadora puede no alterar considerablemente la actividad de dicho péptido porque la cadena secundaria del aminoácido que se halla insertada en la secuencia puede ser capaz de formar enlaces y contactos similares a la cadena secundaria del aminoácido que ha sido sustituida. Esto es así incluso cuando la sustitución tiene lugar en una región que es muy importante para determinar la conformación de los péptidos. También se incluyen variantes que tienen sustituciones no conservadoras. Como muy bien saben los expertos en la materia, las sustituciones en regiones de un péptido que no son importantes para determinar su conformación pueden no influir mucho en su actividad porque no alteran mucho la estructura tridimensional del péptido. En regiones que son importantes para determinar la conformación de los péptidos o la actividad, tales cambios pueden conferir propiedades ventajosas al polipéptido. En realidad, cambios como los descritos anteriormente pueden conferir propiedades ligeramente ventajosas al péptido, por ejemplo, estabilidad o especificidad alteradas.

Regiones particulares, o dominios, de VRN1 pueden ser de utilidad en sí mismos. Por ejemplo, los dominios B3 pueden utilizarse para dirigir la expresión génica de un modo preciso, por ejemplo mediante reconocimiento de secuencias de ADN específicas que representan elementos en los promotores de sus genes diana normales. Mediante la creación de proteínas de fusión, que comprendan el dominio (o dominios) de unión a ADN de VRN1, y una activación o represión heteróloga prestada de otra proteína, podría controlarse la expresión de genes diana VRN1. Esto puede llevar a un control preciso de la expresión de aquellos genes que normalmente son dianas de VRN1. Puesto que tales genes, solos o en combinación, controlan en última instancia la transición hasta la floración (habitualmente tras la vernalización), su expresión dirigida en otras condiciones puede proporcionar un medio útil para controlar la floración. Además, el uso de fusiones basadas en los dominios de unión a ADN en experimentos convencionales SELEX o de un híbrido puede utilizarse para descubrir los genes diana o las secuencias de ADN normalmente unidas mediante VRN1. De este modo, los ácidos nucleicos que codifican estos dominios, o las proteínas de fusión que los comprenden, constituyen una realización de este aspecto de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para identificar y/o clonar una variante de ácido nucleico VRN1 de un vegetal cuyo procedimiento utiliza una secuencia descrita anteriormente.

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En una realización, la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente invención puede utilizarse en una búsqueda en una base de datos (por ejemplo, de EST o STS) para hallar secuencias homólogas, tales como las que pueden hallarse disponibles en su debido momento, y productos de expresión de los cuales puede comprobarse la actividad tal como se describe posteriormente.

Por ejemplo, las búsquedas se llevaron a cabo utilizando el programa tBLASTn (versión 2.0 utilizando los parámetros por defecto) disponible en NCBI (sitio Web: www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Se comparó la secuencia proteínica VRN1 deducida de 341 aminoácidos con todas las EST de GenBank (base de datos dbEST). Posteriormente se enumeran las adquisiciones que satisfacían los siguientes criterios:

(1) eran expresadas: todas las secuencias son EST (parcial), es decir, derivadas de ARNm; (2) compartían estructura de dominio VRN1: todas las secuencias comparten homología con VRN1 que se extiende más allá de los dos dominios B3, es decir, no son simplemente secuencias que contienen uno de muchos B3; (3) las secuencias parciales comparten el 50% o más de identidad con VRN1 a nivel del aminoácido codificado. A la luz de la presente invención, puede esperarse que estas secuencias parciales deriven de genes afines a VRN1 hasta ahora no caracterizados.

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1

En otra realización la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente invención puede utilizarse para diseñar sondas y cebadores para el sondaje o amplificación. Un oligonucleótido de uso en el sondaje o PCR puede ser de aproximadamente 30 o menos nucleótidos de longitud (por ejemplo, 18, 21 o 24). Generalmente los cebadores específicos son de más 14 nucleótidos de longitud. Para una especificidad y rentabilidad óptimas, pueden preferirse cebadores de 16-24 nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia son muy versados en el diseño de cebadores que se utilizan en procesos tales como PCR. Si es necesario, el sondaje puede llevarse a cabo con fragmentos de restricción enteros del gen descrito en la presente invención que puede ser de cientos o incluso miles de nucleótidos de longitud. Pueden introducirse pequeñas variaciones en la secuencia para producir cebadores "de consenso" o "redundantes" si es necesario.

Tales sondas y cebadores constituyen un aspecto de la presente invención.

En los sondajes puede utilizarse la técnica estándar de transferencia Southern. Por ejemplo, puede extraerse ADN de las células y digerirse con distintas enzimas de restricción. A continuación pueden separarse los fragmentos de restricción mediante electroforesis sobre gel de agarosa, antes de la desnaturalización, y transferirse a un filtro de nitrocelulosa. La sonda marcada puede hibridarse con fragmentos de ADN de cadena simple sobre el filtro y la unión determinados. El ADN para el sondaje puede prepararse a partir de preparados de ARN de células. El sondaje puede realizarse de manera opcional mediante los así llamados "chips de ácidos nucleicos" (véase Marshall y Hodgson (1988) Nature Biotechnology 16: 27-31, para una revisión).

En una realización, una variante según la presente invención puede obtenerse mediante un procedimiento que incluye:

(a) proporcionar un preparado de ácido nucleico, por ejemplo de células de un vegetal. El ácido nucleico de prueba puede proceder de una célula como ADN genómico, ADNc o ARN, o de una mezcla de cualquiera de estos, preferiblemente como una genoteca en un vector adecuado. Si se utiliza el ADN genómico puede utilizarse la sonda para identificar regiones no transcritas del gen (por ejemplo, promotores, etc.), tales como las descritas de aquí en adelante,

(b) proporcionar una molécula de ácido nucleico que es una sonda o cebador tal como se ha comentado anteriormente,

(c) poner el ácido nucleico de dicha preparación en contacto con dicha molécula de ácido nucleico en condiciones de hibridación de dicha molécula de ácido nucleico con cualquier dicho gen u homólogo en dicha preparación, e,

(d) identificar dicho gen u homólogo si existe mediante hibridación con dicha molécula de ácido nucleico. La unión de una sonda a un ácido nucleico diana (por ejemplo, ADN) puede determinarse utilizando cualquiera de una variedad de técnicas a disposición de los expertos en la materia. Por ejemplo, las sondas puedan estar marcadas radiactivamente, fluorescentemente o enzimáticamente. Otros procedimientos que no utilizan marcado de una sonda son la amplificación utilizando PCR (véase posteriormente), la escisión ARNasa y el sondaje de oligonucleótidos específicos de alelos. La identificación de hibridación satisfactoria se sigue del aislamiento del ácido nucleico que ha hibridado, que puede implicar una o más etapas de PCR o amplificación de un vector en un huésped adecuado.

Pueden realizarse experimentos preliminares mediante hibridación en condiciones poco rigurosas. Para el sondaje, las condiciones preferidas son aquellas que son suficientemente rigurosas para tratarse de un patrón simple con un número reducido de hibridaciones identificadas como positivas que pueden investigarse posteriormente.

Por ejemplo, pueden realizarse hibridaciones, según el procedimiento de Sambrook y otros (posteriormente) utilizando una solución de hibridación que comprende: SSC 5X (en la que "SSC" = cloruro de sodio 0,15 M; citrato de sodio 0,15 M; pH 7), reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5-1,0%, 100 \mug/ml de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, pirofosfato de sodio al 0,05% y formamida hasta el 50%. La hibridación se lleva a cabo a 37-42ºC durante por lo menos seis horas.

Tras la hibridación, se lavan los filtros como sigue: (1) 5 minutos a temperatura ambiente en SSC 2X y SDS al 1%; (2) 15 minutos a temperatura ambiente en SSC 2X y SDS al 0,1%; (3) de 30 minutos a 1 hora a 37ºC en SSC 1X y SDS al 1%; (4) 2 horas a 42-65ºC en SSC 1X y SDS al 1%, cambiando la solución cada 30 minutos.

Una fórmula frecuente para calcular las condiciones de rigurosidad necesarias para conseguir hibridación entre moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia especificada es (Sambrook y otros, 1989):

Tm = 81,5ºC + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (% formamida) - 600/n.º pb en ADN bicatenario

Para ilustrar la fórmula anterior, utilizando [Na+] =[0,368] y formamida al 50%, con contenido de GC del 42% y un tamaño promedio de la sonda de 200 bases, la T_{m} es 57ºC. La T_{m} de un ADN bicatenario disminuye en 1-1,5ºC cada disminución de la homología del 1%. De este modo, se observarían dianas con una identidad de secuencia superior al 75% utilizando una temperatura de hibridación de 42ºC. Una secuencia de este tipo se consideraría sustancialmente homóloga a la secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención.

Es bien conocido en el estado de la técnica el aumento de la rigurosidad de la hibridación de manera gradual hasta que sólo permanezcan unos pocos clones positivos. Entre otras condiciones adecuadas se incluyen, por ejemplo, aquellas para detectar secuencias que son aproximadamente idénticas en un 80-90%, hibridación de toda una noche a 42ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M, pH 7,2, SDS al 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y lavado final a 55ºC en SSC 0,1X, SDS al 0,1%. Para detectar secuencias que son idénticas en más de aproximadamente un 90%, entre las condiciones adecuadas se incluyen la hibridación de toda una noche a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M, pH 7,2, SDS al 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y lavado final a 60ºC en SSC 0,1X, SDS al 0,0%1.

De este modo, este aspecto de la presente invención incluye un ácido nucleico que incluye o consta fundamentalmente de una secuencia de nucleótidos complementaria con una secuencia de nucleótidos hibridable con cualquier secuencia codificante proporcionada en la presente invención. Otra forma de considerar esto sería en el caso de un ácido nucleico según este aspecto que fuera hibridable con una secuencia de nucleótidos complementaria con cualquier secuencia codificante proporcionada en la presente invención.

En otra realización, la hibridación de una molécula de ácido nucleico con una variante puede determinarse o identificarse indirectamente, por ejemplo utilizando una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR requiere el uso de dos cebadores para amplificar específicamente ácido nucleico, de modo que preferiblemente se utilizan dos moléculas de ácido nucleico con secuencias características de VRN1. Utilizando PCR RACE, sólo se requiere un cebador de este tipo (véase "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", eds. Innis y otros, Academic Press, Nueva York, (1990)).

Entre los cebadores preferidos para la amplificación de regiones conservadas de VRN1 para utilizar como sondas para obtener clones genómicos o de ADNc puede incluirse cualquiera de los que se muestran en la tabla 3.

Por ejemplo pueden utilizarse los cebadores S63 y S49 para amplificar una región VRN1 genómica que incluya el promotor y el extremo 3' del gen.

Los cebadores V7 y V2 amplifican el ORF del ADNc de VRN1. Pueden utilizarse los cebadores V6 y V15 para diferenciar VRN1 y RTV1.

De este modo, un procedimiento que implica utilizar PCR para obtener ácido nucleico según la presente invención puede incluir:

(a) proporcionar un preparado de ácido nucleico de vegetales, por ejemplo, de una semilla o de otro tejido u órgano apropiados.

(b) proporcionar una pareja de cebadores de moléculas de ácido nucleico útiles en PCR (es decir, adecuados para PCR), siendo por lo menos uno de dichos cebadores un cebador según la presente invención tal como se ha comentado anteriormente,

(c) poner en contacto el ácido nucleico de dicha preparación con dichos cebadores en condiciones para la realización de la PCR,

(d) realizar la PCR y determinar la presencia o ausencia de un producto PCR amplificado. La presencia de un producto PCR amplificado puede indicar la identificación de una variante.

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En todos los casos anteriores, si es necesario, pueden ampliarse los clones o fragmentos identificados en la búsqueda. Por ejemplo, si se sospecha que son incompletos, puede volver a analizarse la fuente original de ADN (por ejemplo una colección de clones, un preparado de ARNm, etc.) para aislar partes ausentes utilizando por ejemplo sondas o cebadores basados en aquella parte que ya se ha obtenido para identificar clones que contienen secuencia de solapamiento.

Si se identifica una supuesta secuencia homóloga de aparición natural, puede confirmarse su importancia en la vernalización, por ejemplo mediante procedimientos análogos a los utilizados en los Ejemplos posteriores, o generando mutantes del gen (por ejemplo, cribando las genotecas disponibles de mutantes de inserción) y analizándolas según su capacidad para responder a la vernalización, posiblemente en presencia y ausencia de otros alelos tales como vrn1. Alternativamente puede inferirse la importancia localizando mutantes vrn para ver si el homólogo se sitúa en un locus adecuado o cerca del mismo.

En otra realización, pueden utilizarse los anticuerpos creados para un polipéptido o péptido VRN1 para identificar y/o aislar polipéptidos de la variante, y a continuación sus genes codificantes. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar o aislar VRN1 o una variante del mismo, que comprende cribar polipéptidos de elección con un polipéptido que comprende el dominio de un anticuerpo de unión a antígenos (por ejemplo, un anticuerpo entero o un fragmento del mismo) que es capaz de unirse a dicho polipéptido VRN1 o variante del mismo, o que preferiblemente tiene especificidad de unión para dicho polipeptido. Los procedimientos para obtener anticuerpos se describen de aquí en adelante.

Los polipéptidos de elección para cribar pueden ser por ejemplo los productos de una genoteca de expresión creada utilizando ácido nucleico procedente de un vegetal de interés, o pueden ser el producto de un proceso de purificación de una fuente natural. Puede aislarse un polipéptido que se observa que se une al anticuerpo y a continuación puede someterse a secuenciación de aminoácidos. Puede utilizarse cualquier técnica adecuada para secuenciar el polipéptido por completo o parcialmente (por ejemplo, puede secuenciarse un fragmento del polipéptido). La información de la secuencia de aminoácidos puede utilizarse para obtener ácido nucleico que codifica el polipéptido, por ejemplo, diseñando uno o más nucleótidos (por ejemplo una reserva redundante de oligonucleótidos) para utilizarlos como sondas o cebadores en la hibridación de un ácido nucleico de elección.

Este aspecto de la invención incluye además un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que es complementaria a cualquiera de las aisladas u obtenidas como anteriormente. En cada caso el "complemento" es de la misma longitud que la referencia, pero es 100% complementario por lo que cada nucleótido se empareja con su homólogo, es decir, G con C, y A con T o U.

Tal como se utiliza de aquí en adelante, a no ser que el contexto lo exija de otro modo, el término "VRN1" pretende incluir cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención descritos anteriormente, incluidas las variantes funcionales.

En un aspecto de la presente invención, el ácido nucleico VRN1 descrito anteriormente se halla en la forma de un vector recombinante y preferiblemente replicable.

La definición de "vector" incluye, entre otras cosas, cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario de Agrobacterium de forma lineal o circular monocatenario o bicatenario que puede o no ser autotransmisible o movilizable, y que puede transformar un huésped procariota o eucariota bien mediante integración en el genoma celular o existir extracromosómicamente (por ejemplo, plásmido replicante autónomo con un origen de replicación).

En general, los expertos en la materia son capaces de construir vectores y diseñar protocolos para la expresión de un gen recombinante. Pueden elegirse o construirse vectores apropiados, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, que incluyan secuencias del promotor, fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias de potenciadores, genes de marcadores y otras secuencias consideradas adecuadas. Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2.ª edición, Sambrook y otros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press o Current Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel y otros, eds., John Wiley & Sons, 1992.

Se incluyen específicamente los vectores lanzadera mediante los cuales se hace referencia a un vehículo de ADN capaz, de manera natural o por diseño, de replicarse en dos organismos huésped distintos, que pueden seleccionarse a partir de actinomicetos y especies afines, de bacterias y eucariotas (por ejemplo, células de vegetales superiores, de mamíferos, de levaduras o de hongos).

Un vector que incluye ácido nucleico según la presente invención no es necesario que incluya un promotor u otra secuencia reguladora, en particular si el vector va a utilizarse para introducir el ácido nucleico en células para recombinación en el genoma.

En el vector el ácido nucleico se halla preferiblemente bajo el control de un promotor apropiado, o de otros elementos reguladores, y operativamente unido a los mismos, para la transcripción en una célula huésped tal como una célula microbiana, por ejemplo bacteriana, o vegetal. El vector puede ser un vector de expresión bifuncional que actúa en múltiples huéspedes. En el caso del ADN genómico, éste puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y en el caso de ADNc puede hallarse bajo el control de un promotor apropiado o de otros elementos reguladores para la expresión en la célula huésped.

Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos a partir de los cuales puede iniciarse la transcripción de ADN unido operativamente en dirección 3' en la cadena codificante de un ADN bicatenario.

"Unido operativamente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, posicionado y orientado adecuadamente para iniciar la transcripción a partir del promotor. Un ADN unido operativamente a un promotor se halla "bajo regulación del inicio de la transcripción" del promotor.

En una realización preferida, el promotor es un promotor inducible.

El término "inducible" cuando se aplica a un promotor es bien comprendido por los expertos en la materia. Fundamentalmente, la expresión bajo el control de un promotor inducible es "activada" o aumentada en respuesta a la aplicación de un estímulo. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles provocan niveles bajos o indetectables de expresión (o no expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles provocan expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo. Independientemente de que el nivel de expresión sea en ausencia del estímulo, la expresión de cualquier promotor inducible aumenta en presencia del estímulo correcto.

De este modo, este aspecto de la invención proporciona una construcción génica, preferiblemente un vector replicable, que comprende un promotor (opcionalmente inducible) unido operativamente con una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención, tal como el gen VRN1 o una variante del mismo.

De interés particular en el contexto actual son las construcciones de ácido nucleico que actúan como vectores vegetales. Los procedimientos y vectores específicos utilizados anteriormente de manera muy satisfactoria en vegetales se describen en Guerineau y Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, págs. 121-148). Entre los vectores adecuados pueden incluirse vectores vegetales derivados de virus (véase por ejemplo, EP-A-194809).

Entre los promotores adecuados que actúan en vegetales se incluyen el virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV 35S). Otros ejemplos se describen en la pág. 120 de Lindsey & Jones (1989) "Plant Biotechnology in Agriculture" Pub. OU Press, Milton Keynes, Reino Unido. El promotor puede seleccionarse para que incluya uno o más motivos o elementos de secuencia que confieren un control regulador de la expresión específico de los tejidos y/o del desarrollo Entre los promotores vegetales inducibles se incluyen el promotor inducido por etanol de Caddick y otros (1989) Nature Biotechnology 16: 177-180.

Si se desea, pueden incluirse marcadores genéticos seleccionables en la construcción, tales como aquellos que confieren fenotipos seleccionables tales como resistencia a antibióticos o herbicidas (por ejemplo, kanamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfurón, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato).

La presente invención también proporciona procedimientos que comprenden la introducción de dicha construcción en una célula vegetal o una célula microbiana y/o la inducción de expresión de una construcción dentro de un célula vegetal, mediante la aplicación de un estímulo adecuado, por ejemplo un inductor exógeno efectivo.

En otro aspecto de la invención, se describe una célula huésped que contiene una construcción heteróloga según la presente invención, especialmente una célula vegetal o microbiana.

El término "heterólogo" se utiliza ampliamente en este aspecto para indicar que el gen/secuencia de nucleótidos en cuestión (por ejemplo, VRN1 codificante) han sido introducidos en dichas células del vegetal o en un progenitor de las mismas, utilizando ingeniería genética, es decir, por medio de la intervención humana. Un gen heterólogo puede sustituir a un gen endógeno equivalente, es decir, a uno que normalmente realiza la misma función o similar, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endógeno o a otra secuencia. Puede que un ácido nucleico heterólogo respecto de una célula vegetal no sea de aparición natural en células de aquel tipo, variedad o especie. De este modo, el ácido nucleico heterólogo puede comprender una secuencia codificante, o proceder de la misma, de un tipo particular de célula vegetal o especie o variedad de vegetal, situada en el contexto de una célula vegetal de distinto tipo o especie o variedad de vegetal. Otra posibilidad es que una secuencia de ácidos nucleicos se sitúe dentro de una célula en la cual ella o su homóloga sean de aparición natural, pero en la que la secuencia de ácidos nucleicos esté unida y/o sea contigua al ácido nucleico que no es de aparición natural dentro de la célula o células de aquel tipo o especie o variedad de vegetal, tal como unida operativamente a una o más secuencias reguladoras, tales como una secuencia promotora, para el control de la expresión.

La célula huésped (por ejemplo célula vegetal) es preferiblemente transformada por la construcción, lo que significa que la construcción se establece dentro de la célula, alterando una o más de las características de la célula y de ahí el fenotipo, por ejemplo con respecto a la respuesta a la vernalización.

El ácido nucleico puede introducirse en las células vegetales utilizando cualquier tecnología adecuada, tal como un vector plásmido Ti atenuado portado por Agrobacterium que explota la capacidad natural de transferencia del gen (EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12(22)8711-87215 1984), bombardeo de partículas o microproyectiles (patente de EE.UU. US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), microinyección (documentos WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green y otros (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), electroporación (EP 290395, documento WO 8706614 Gelvin Debeyser) otras formas de reabsorción directa de ADN (patente de Alemania DE 4005152, documento WO 9012096, patente de EE.UU. US 4684611), reabsorción de ADN mediada por liposomas (por ejemplo, Freeman y otros, Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), o el procedimiento de agitación en un vórtex (por ejemplo, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d) los procedimientos físicos para la transformación de células vegetales se revisan en Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11.

La transformación de Agrobacterium es muy utilizada por los expertos en la materia para transformar especies dicotiledóneas.

Recientemente, también se ha observado un avance sustancial hacia la producción sistemática de vegetales transgénicos fértiles, estables, en prácticamente todos los vegetales monocotiledóneos económicamente relevantes (véase por ejemplo Hiei y otros (1994) The Plant Journal 6, 271-282)). El bombardeo con microproyectiles, la electroporación y la reabsorción directa de ADN son preferibles cuando Agrobacterium por sí solo es ineficaz o inefectivo. Alternativamente, puede utilizarse una combinación de distintas técnicas para aumentar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo bombardeo de micropartículas recubiertas de Agrobacterium (EP-A-486234) o bombardeo de microproyectiles para inducir la formación de heridas seguida de cocultivo con Agrobacterium
(EP-A-486233).

Los protocolos de transformación preferidos para brasicáceas, trigo, cebada y arroz pueden hallarse en Becker y otros, 1994 y en referencias de la presente invención. No obstante, el experto en la materia sabrá apreciar que la elección particular de una tecnología de transformación vendrá determinada por su eficiencia para transformar determinadas especies de vegetales así como por la experiencia y las preferencias de quien pone en práctica la invención con una metodología de elección particular.

De este modo otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para transformar una célula vegetal que implica introducir una construcción, tal como se describe anteriormente, en una célula vegetal y provocar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma de la célula vegetal para introducir un ácido nucleico según la presente invención en el genoma.

La invención incluye además una célula huésped transformada con ácido nucleico o un vector según la presente invención (por ejemplo que comprende la secuencia VRN1), especialmente una célula vegetal o microbiana. En la célula vegetal transgénica (es decir, transgénica para el ácido nucleico en cuestión) el transgén puede ser un vector genómico extra o incorporado, preferiblemente estable, en el genoma. Puede haber más de una secuencia de nucleótidos heteróloga por genoma haploide.

En general, tras la transformación, un vegetal puede regenerarse, por ejemplo a partir de células únicas, de tejido calloso o de discos foliares, como es habitual en el estado de la técnica. Prácticamente cualquier vegetal puede regenerarse por completo a partir de células, tejidos y órganos del vegetal. Las técnicas disponibles se revisan en Vasil y otros, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.

La generación de vegetales transgénicos fértiles se ha conseguido en los siguientes cereales: arroz, maíz, trigo, avena y cebada (revisado en Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162; Vasil y otros (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain y otros, 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 pág. 702).

También se proporcionan vegetales que incluyen una célula vegetal según la invención. Un vegetal según la presente invención puede ser uno que no reproduce verdaderamente una o más propiedades.

Además del vegetal regenerado, la presente invención abarca todo lo siguiente: un clon de dicho vegetal, semilla, o progenie y descendientes puros o híbridos (por ejemplo, descendientes F1 y F2. La invención también proporciona un propágulo vegetal de tales vegetales que es cualquier parte que pueda utilizarse en la reproducción o propagación, sexual o asexual, incluidos injertos, semilla, etc. También proporciona cualquier parte de estos vegetales, los cuales en todos los casos incluyen la célula vegetal o el ADN del VRN1 heterólogo descrito anteriormente.

De este modo, un ejemplo de la realización anterior sería expresar constitutivamente la proteína VRN1 en un vegetal transgénico, por ejemplo, mediante fusión entre el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y el marco de lectura abierto del ADNc del VRN1. Preferiblemente éste utilizaría el sector binario SLJ1714 (Jones JDG, Shlummokov L, Carland F, English J, Scofield SR, Bishop GJ, Harrison K: Effective vectors for transformation, expression of heterologous genes, and assaying transposon excision in transgenic plants. Transgenic Research 1: 285-297 (1992)) utilizando técnicas moleculares estándar (Sambrook y otros, 1989). En otra realización, la expresión inducible de la proteína VRN1 se consigue utilizando fusiones génicas entre el marco de lectura abierto de VRN1 y el dominio del receptor del receptor glucocorticoide de rata (GR). Un ejemplo del uso de esta estrategia para conseguir función génica inducible puede hallarse en Schena M, Lloyd AM, Davis RW: A steroid-inducible gene expression system for plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A 88 (23): 10.421-10.425 (1991) y Simon R, Igeno MI, Coupland G: Activation of floral meristem identity genes in Arabidopsis. Nature 384 (6604): 59-62 (1996). Las fusiones génicas pueden comprobarse, si se desea, en el alelo mutante vrn1-2 de Arabidopsis mediante transferencia habitual mediada por Agrobacterium (Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoot A: A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T- region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180 (1983)). El requisito de vernalización de los distintos vegetales transgénicos obtenidos se analizará en comparación con vegetales control (no transformados).

Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para evaluar la sensibilidad a la vernalización de un vegetal, el procedimiento comprende la etapa en la que se determina la presencia y/o identidad de un alelo VRN1 a ese respecto que comprende el uso de un ácido nucleico tal como se describe anteriormente. Dicha prueba diagnóstica puede utilizarse con vegetales transgénicos o de tipo salvaje. El uso de pruebas diagnósticas para alelos permite al investigador o productor de vegetales establecer, con plena confianza y de forma independiente de las pruebas bioquímicas que requieren tiempo, si un alelo deseado se halla o no en el vegetal de interés (o en una célula del mismo), si un vegetal es representativo de un conjunto de otros vegetales genéticamente idénticos (por ejemplo, una variedad cultivada o cultivar) o un individuo en una muestra de vegetales afines (por ejemplo, una selección del productor) o no afines.

El procedimiento puede formar parte de un esquema de reproducción vegetal basado en la selección y obtención de individuos puros deseables. La selección fiable de alelos VRN1 apropiados puede hacerse en generaciones tempranas y sobre más material del que de otro modo sería posible. Este aumento en la fiabilidad de la selección más el ahorro de tiempo ya que puede comprobarse el material antes y sin el costoso cribado fenotípico es muy importante en la reproducción de vegetales.

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La determinación basada en ácidos nucleicos de la presencia o ausencia de uno o más alelos deseables puede combinarse con la determinación del genotipo del ADN genómico unido flanqueante y de otros ADN genómicos no unidos utilizando conjuntos establecidos de marcadores tales como RFLP, microsatélites o SSR, AFLP, RAPD etc. Esto permite al investigador o productor de vegetales seleccionar no sólo para la presencia del alelo deseable sino también para cada vegetal o familia de vegetales que tienen las combinaciones más deseables de antecedentes genéticos unidos y no unido. {0Dichas recombinaciones de material deseable pueden tener lugar sólo raramente dentro de una población dada, que se reproduce mediante segregación, o de una progenie dada, que experimenta retrocruzamiento. El análisis directo del locus permitido por la presente invención permite al investigador llevar a cabo un método escalonado para fijar (hacer homocigota) la combinación deseada de marcadores flanqueantes y alelos, identificando en primer lugar los individuos fijados por un marcador flanqueante e identificando después la progenie fijada al otro lado del locus sabiendo en todo momento que el alelo deseable sigue estando presente.

La presente descripción proporciona suficiente información para que un experto en la materia pueda obtener una secuencia de ADN genómico para cualquier alelo nuevo o existente determinados y concibe un análisis diagnóstico basado en ácidos nucleicos y/o polipéptidos adecuados. Al diseñar un análisis de ácidos nucleicos se tiene en cuenta la variación distintiva en la secuencia que caracteriza la variante alélica en particular (véase por ejemplo, figura 7 y las variaciones alélicas descritas al respecto).

La invención proporciona además un procedimiento para influir en la respuesta a la vernalización de un vegetal, el procedimiento incluye provocar o permitir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos VRN1 heteróloga, tal como se ha comentado anteriormente, dentro de las células del vegetal. El procedimiento puede incluir el uso de ácido nucleicos VRN1 junto con otros genes que influyen en la vernalización (por ejemplo, VRN2). Tal como se comenta en los Ejemplos posteriores, VRN1 y VRN2 pueden actuar en vías que favorecen la vernalización distintas y parcialmente redundantes.

La etapa puede ir precedida de una etapa anterior de introducción del ácido nucleico VRN1 en una célula del vegetal o en un progenitor del mismo. Además de utilizar los ácidos nucleicos de la presente invención para producir polipéptidos VRN1 funcionales (estimulando por lo tanto la respuesta a la vernalización), la información descrita en la presente invención también puede utilizarse para reducir la actividad VRN1 en células en las cuales se desea hacerlo (inhibiendo o eliminando por lo tanto la respuesta a la vernalización).

Por ejemplo la disminución de la expresión de un gen diana puede conseguirse utilizando tecnología no codifican-
te.

Al utilizar genes no codificantes o secuencias génicas parciales para disminuir la expresión génica, se coloca una secuencia de nucleótidos bajo el control de un promotor en una "orientación inversa" tal que la transcripción produce ARN que es complementario del ARNm normal transcrito a partir de la cadena "codificante" del gen diana. Véase, por ejemplo, Rothstein y otros, 1987; Smith y otros, (1988) Nature 334, 724-726; Zhang y otros, (1992) The Plant Cell 4, 1.575-1.588, English y otros, (1996) The Plant Cell 8, 179-188. La tecnología no codificante también se revisa en Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, y Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3.490-3.496.

Una alternativa a la no codificante ("anti-sense") es utilizar una copia de todo o parte del gen diana insertado en la cadena codificante ("sense"), es decir, la misma orientación que el gen diana, para conseguir reducción en la expresión del gen diana mediante cosupresión. Véase, por ejemplo, van der Krol y otros (1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoli y otros (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang y otros (1992) The Plant Cell 4, 1.575-1.588, y patente de EE.UU. US-A-5.231.020. Otros ajustes de la tecnología del silenciamiento de genes o cosupresión pueden hallarse en el documento WO95/34668 (Biosource); Angell y Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16,12: 3.675-3.684; y Voinnet y Baulcombe (1997) Nature 389: pág. 553.

Otras opciones para disminuir la expresión génica son el uso de ribozimas, por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo, que pueden catalizar la escisión específica del sitio del ARN, tal como ARNm (véase por ejemplo, Jaeger (1997) "The new world of ribozymes" Curr Opin Struct Biol 7: 324-335, o Gibson y Shillitoe (1997) "Ribozymes: their functions and strategies form their use" Mol Biotechnol 7: 242-251).

No es necesario utilizar la secuencia completa que corresponde a la secuencia codificante (en orientación inversa para no codificante). Por ejemplo, pueden utilizarse fragmentos de suficiente longitud. Es algo rutinario para el experto en la materia cribar fragmentos de varios tamaños y de varias partes de la secuencia codificante para optimizar el nivel de inhibición no codificante. Puede ser ventajoso incluir el codón de inicio ATG y quizás uno o más nucleótidos por encima del codón de inicio. Otra posibilidad es dirigir una secuencia conservada de un gen, por ejemplo una secuencia que es característica de uno o más genes, tal como una secuencia reguladora.

La secuencia utilizada puede ser de aproximadamente 500 nucleótidos o menos, posiblemente de aproximadamente 400 nucleótidos, aproximadamente 300 nucleótidos, aproximadamente 200 nucleótidos, o aproximadamente 100 nucleótidos. Pueden utilizarse oligonucleótidos de longitudes mucho menores, 14-23 nucleótidos, aunque cuando es posible son preferibles fragmentos más largos y generalmente incluso más largos de aproximadamente 500 nucleótidos, tales como más largos de aproximadamente 600 nucleótidos, de aproximadamente 700 nucleótidos, de aproximadamente 800 nucleótidos, de aproximadamente 1.000 nucleótidos o más.

Puede ser preferible que haya identidad de la secuencia completa en la secuencia utilizada para disminuir la expresión de una secuencia diana, y la secuencia diana, a pesar de la total complementariedad o semejanza de la secuencia, no es esencial. Uno o más nucleótidos pueden diferir en la secuencia utilizada a partir del gen diana. De este modo, una secuencia utilizada en la disminución de la expresión génica según la presente invención puede ser una secuencia de tipo salvaje (por ejemplo, un gen) seleccionada a partir de las disponibles, o una variante de dicha secuencia en los términos descritos anteriormente. No es necesario que la secuencia incluya un marco de lectura abierto o que especifique un ARN que sería traducible.

De este modo la presente invención proporciona además el uso de una variante de secuencia de nucleótidos VRN1, o su complemento, para disminuir la expresión génica, en particular la disminución de la expresión del gen VRN1 o de un homólogo del mismo, preferiblemente para inhibir o suprimir la respuesta a la vernalización en un vegetal.

La regulación no codificante o codificante puede regularse utilizando un promotor inducible en una construcción adecuada.

La presente invención también incluye el producto de expresión de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes VRN1 descritas y los procedimientos para realizar el producto de expresión mediante expresión de ácido nucleico codificante en condiciones adecuadas, que pueden hallarse en células huésped estables.

Como se describe en los Ejemplos, varias características de VRN1 indican que es probable que actúe como modulador de la transcripción (por ejemplo, como "coactivador" o "correpresor"), o por lo menos como proteína de unión a ADN. Entre estas características se incluyen la presencia de los dominios B3; la homología de una parte de la región 2 con c-myc, un factor de transcripción; la presencia de un supuesto NLS y la presencia de supuestas señales para la degradación proteínica rápida, que son frecuentes en factores de transcripción y otras proteínas de función reguladora (Chevaillier, 1993; Vierstra, 1996; Barnes y Gomes, 1995; Rechsteiner y Rogers, 1996; Gomes y Barnes, 1997).

La presente invención también asegura la producción y uso de fragmentos de polipéptidos en toda su longitud descritos en la presente invención, especialmente partes activas de los mismos. Una "parte activa" de un polipéptido se refiere a un péptido que es menor que dicho polipéptido en toda su longitud, pero que conserva una actividad biológica fundamental. En particular, la parte activa conserva la capacidad de alterar la respuesta a la vernalización en un vegetal, tal como Arabidopsis thaliana.

Un "fragmento" de un polipéptido se refiere a una extensión de restos de aminoácidos de por lo menos aproximadamente cinco a siete aminoácidos contiguos, a menudo por lo menos aproximadamente siete a nueve aminoácidos contiguos, habitualmente por lo menos aproximadamente nueve a 13 aminoácidos contiguos y, más preferiblemente, por lo menos aproximadamente 20 a 30 o más aminoácidos contiguos.

El uso de proteína VRN1 recombinante, o de un fragmento del mismo (por ejemplo, los dominios comentados anteriormente), como proteína de unión a ADN, o de un modo más específico como modulador de la transcripción, constituye un aspecto de la invención.

Entre los fragmentos de los polipéptidos pueden incluirse uno o más epítopos útiles para crear anticuerpos frente a una parte de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente invención. Los epítopos preferidos son aquellos a los cuales los anticuerpos son capaces de unirse específicamente, que pueden tomarse para unirse a un polipéptido o un fragmento del mismo de la invención con una afinidad que es de por lo menos aproximadamente 1.000 veces la de otros polipéptidos.

La proteína VRN1 purificada de este modo, o un fragmento u otra variante de la misma, por ejemplo producida de manera recombinante mediante expresión de un ácido nucleico codificante, puede utilizarse para crear anticuerpos que utilizan técnicas que son habituales en el estado de la técnica. Pueden utilizarse anticuerpos y otros polipéptidos que comprenden fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos para identificar homólogos de otras especies vegetales tal como se ha comentado anteriormente.

Entre los procedimientos para producir anticuerpos se incluyen inmunizar a un mamífero (por ejemplo un ratón, una rata, un conejo, un caballo, una cabra, una oveja o un mono) con la proteína o con un fragmento de la misma. Pueden obtenerse anticuerpos a partir de animales inmunizados utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en el estado de la técnica, y podrían cribarse, utilizando preferiblemente unión del anticuerpo al antígeno de interés.

Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de inmunotransferencia o de inmunoprecipitación (Armitage y otros, 1992, Nature 357: 80-82). Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.

Los anticuerpos pueden modificarse de modos muy distintos. En realidad el término "anticuerpo" debería establecerse como el que engloba cualquier sustancia de unión específica que tiene un dominio de unión con la especificidad necesaria. De este modo, este término incluye fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, entre los cuales cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión a inmunoglobulina, independientemente de que sea sintético o natural.

Como alternativa o complemento a la inmunización de un mamífero, pueden obtenerse anticuerpos con la especificidad de unión apropiada a partir de una genoteca producida mediante recombinación de dominios variables de inmunoglobulina expresada, utilizando por ejemplo bacteriófago lambda o bacteriófago filamentoso que muestran dominios funcionales de unión a inmunoglobulina en sus superficies; véase por ejemplo el documento WO92/01047.

Los elementos de unión específicos tales como anticuerpos y polipéptidos que comprenden dominios de unión a antígenos que son preferiblemente específicos para un polipéptido VRN1 o una variante del mismo representan otros aspectos de la presente invención, del mismo modo que su uso y los procedimientos que los utilizan.

La descripción anterior se ha relacionado generalmente con las partes codificantes del gen VRN1 y con variantes y productos del mismo. También dentro del alcance de la presente invención destacan partes del gen no transcritas.

De este modo, otro aspecto de la presente invención es una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor del gen VRN1, que se cree que se encuentra en la secuencia que se muestra en el Anexo I (que empieza al final del gen LARS1).

Tal como se describe en los Ejemplos posteriores, se observó que la región promotora del VRN1 y el intrón 1 del VRN1 contenían una variedad de posibles sitios de unión entre los cuales elementos de respuesta a temperaturas bajas; sitios de unión para el gen rd22 de Arabidopsis sensible a la deshidratación y a ABA; un sitio de unión para Myb2 de Arabidopsis, un factor de transcripción implicado en la regulación de genes sensibles al estrés hídrico; sitios de unión a caja H ("H-box") y TCA-1 (que pueden ser inducidos por heridas y estrés abiótico); y cajas ICE ("ICE-boxes") (un elemento promotor de consenso observado en varios genes inducibles por frío).

Estos elementos de control es probable que determinen las condiciones en las cuales se obtiene la expresión del transcrito de VRN1. Por ejemplo, el VRN1 puede ser inducido por tratamiento con frío y/o privación de agua, o simplemente por la aplicación de ABA, y el uso del promotor o de parte del mismo para la inducción o transcripción bajo cualquiera de estas condiciones constituye un aspecto de la presente invención.

El análisis de la región que hay encima pondrá al descubierto regiones de control para la expresión génica entre las cuales regiones de control frecuentes en muchos genes (es decir, cajas TATA y CAAT) y otras regiones de control, habitualmente localizadas a partir de los nucleótidos 1 a 10.000, tal como 1 a 1.000 o 50 a 500 que hay por encima del inicio de la transcripción. Para hallar el mínimo de elementos o motivos responsables de la regulación, pueden utilizarse enzimas de restricción o nucleasas para digerir una molécula de ácido nucleico, o puede utilizarse mutagénesis, seguida de un análisis apropiado (por ejemplo utilizar un gen indicador tal como luciferasa) para determinar la actividad del promotor. La región de control también puede estar mutada para identificar subregiones específicas responsables del control de la transcripción. Esto puede conseguirse mediante numerosas técnicas bien conocidas en el estado de la técnica como tales, entre las cuales análisis de huellas de protección DNasa en los cuales se pone la región de control en contacto con un extracto de una célula, en la cual el gen VRN1 se expresa activamente, y se determinan las regiones de la región de control que se unen a factores en aquel extracto.

El ácido nucleico que comprende estos elementos o motivos forma parte de la presente invención.

La "actividad del promotor" se utiliza para referirse a la capacidad de iniciar la transcripción bajo condiciones apropiadas, por ejemplo opcionalmente en presencia de un inductor. El nivel de actividad del promotor puede cuantificarse por ejemplo mediante evaluación de la cantidad de ARNm producido por la transcripción del promotor o mediante la evaluación de la cantidad de producto proteínico producido por la traducción de ARNm producido por la transcripción del promotor. La cantidad de ARNm específico presente en un sistema de expresión puede determinarse utilizando por ejemplo oligonucleótidos específicos que son capaces de hibridar con los ARNm que están marcados o que pueden utilizarse en una reacción de amplificación específica tal como la reacción en cadena de la polimerasa.

Los expertos en la materia son conscientes de una multitud de posibles genes indicadores y técnicas de análisis que pueden utilizarse para determinar la actividad del promotor. Puede utilizarse cualquier indicador/análisis adecuado y debería tenerse en cuenta que ninguna elección en particular es esencial para la presente invención ni constituye una limitación de la misma. También se proporciona una construcción de ácido nucleico, preferiblemente un vector de expresión, incluido el promotor VRN1 (o un fragmento activo, o una variante del mismo, capaz de favorecer la transcripción) unido operativamente al gen heterólogo, por ejemplo una secuencia codificante, que preferiblemente no es la secuencia codificante a la que el promotor se halla unido operativamente en la naturaleza.

A continuación la invención se describirá además haciendo referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos no excluyentes. Otras realizaciones de la invención se aparecerán a los expertos en la materia a la luz de éstas.

Figuras y anexos de las secuencias

Figura 1: fenotipo de vernalización de mutante vrn1 bajo LD y SD; fenotipo de vernalización del alelo vrn1-1 comparado con alelo vrn1-2.

Figura 2: mapa genético de la posición de VRN1 en el cromosoma III en relación con los marcadores utilizados para el mapeo. Los marcadores (que se muestran a la derecha) fueron puntuados en una población de 194 vegetales F2 procedentes de un cruzamiento entre vrn1-1 fac1 x fca-10. La distancia en cM entre cada marcador se muestra a la izquierda.

Figura 3: mapa físico de la región que contiene VRN1.

Figura 4: complementación del fenotipo mutante vrn1-1 por los cósmidos 8H8 y 10F10. Tras la vernalización los vegetales fca-1 florecen antes y los vegetales vrn1 fca-1 florecen más tarde. Las líneas T2 representativas en las que el cósmido 8H8 o 10F10 se ha transformado en vegetales vrn1-1 fca-1 muestran la proporción esperada (aproximadamente 3: 1) de vegetales de floración temprana a tardía.

Figura 5: región secuenciada y ORF predichos en la cercanía de VRN1. El solapamiento entre cósmidos se determinó inicialmente mediante digestión XbaI + XhoI y transferencia de Southern. La secuenciación del ADN de cósmido confirmó estos resultados y demostró que la región complementaria era de 6.565 pb. Posteriormente se observó que el ORF1 era VRN1.

Figura 6: estructura del gen y el transcrito VRN1, y posiciones de las mutaciones vrn1-1 y vrn1-2.

Figura 7: supuesto transcrito VRN1 y secuencia de aminoácidos deducida.

Figura 8: alineación de VRN1 y RTV1. Anexo I: muestra el cóntigo 29 [1.501-6.500 pb] derivado del ADN genómico VRN1 Ler. El promotor VRN1 se encuentra en la región situada aproximadamente entre los nucleótidos 1 y 1.879.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de mutantes vrn1

La mutación vrn1 se seleccionó a partir de poblaciones mutagenizadas de Arabidopsis thaliana (L.) Vegetales Heynh (ecotipo Landsberg erecta) en base a su alteración de la aceleración de la floración tras seis semanas de tratamiento con frío (vernalización).

Posteriormente se analizó el tiempo de floración de los mutantes en ausencia de vernalización para confirmar que la alteración inducida era específica del proceso de vernalización y no se debía a una mutación general de floración tardía (Chandler y otros, 1996).

Se han identificados dos alelos recesivos de vrn1: (1) vrn1-1 se aisló mediante mutagenización de semillas de fca-1 con EMS, tal como se describe (Chandler y otros, 1996), y (2) vrn1-2 se aisló mediante mutagenización de semillas fca-1 con irradiación gamma. La línea vrn1-1 fca-1 utilizada en la presente invención se sometió dos vecs a retrocruzamiento con fca-1 con anterioridad al mapeo genético. Posteriormente, vrn1 fca-1 volvió a someterse a retocruzamiento con fca-1 (seis veces en total) y vrn-2 fca-1 se sometió a retrocruzamiento dos veces en total.

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Ejemplo 2 Caracterización del fenotipo vrn1

El fenotipo de respuesta-dosis a la vernalización de vegetales mutantes vrn1 se analizó examinando su tiempo de floración en respuesta a las distintas duraciones del tratamiento de vernalización. El tiempo de floración se determinó de dos maneras: (1) como el número total de hojas vegetativas producidas antes de la floración (LN), y (2) como el tiempo en días desde el final del tratamiento de vernalización hasta la aparición del primer capullo (FT). En todos los experimentos estas dos medidas se correlacionaron positivamente, de modo que sólo se proporciona LN para facilitar más fácilmente la comparación entre experimentos.

Se realizaron dos tipos de experimento: (1) un análisis de respuesta a la dosis de vrn1-1 fca-1 y vrn1-2 fca-1 analizaba en condiciones de crecimiento de día largo (LD) (figura 1A), y (2) el efecto de 6 semanas de vernalización sobre vrn1-1 en ausencia de fca-1 analizado en condiciones de crecimiento de día corto (figura 1B). En el experimento LD que se muestra en la figura 1A, sin vernalización (0 semanas), tanto los vegetales mutantes vrn1-1 como vrn1-2 florecieron muy poco antes comparado con los controles parentales fca-1, aunque en otros experimentos los vegetales mutantes vrn1-1 fca-1 y vrn1-2 fca-1 florecieron aproximadamente al mismo tiempo que fca-1 sin vernalización. Al contrario, tras la vernalización, en los vegetales fca-1 se observó una reducción notable del número de hojas (\approx66% tras 6 semanas de vernalización), mientras que en los vegetales mutantes vrn1-1 fca-1 y vrn1-2 fca-1 se observó una respuesta más reducida (\approx14% y \approx27% tras 6 semanas de vernalización, respectivamente). Por lo tanto, ambos alelos de vrn1 se hallan radicalmente alterados en su respuesta a la vernalización, siendo más grave en vrn1-1 que en vrn1-2.

En el experimento SD que se muestra en la figura 1B, en los vegetales Ler de tipo salvaje se observó una reducción de \approx49% en el número de hojas tras un tratamiento de vernalización de seis semanas comparado con vegetales sin vernalización. No obstante, en los vegetales mutantes vrn1-1 sólo se observó una reducción de \approx18% en las mismas condiciones. Además, este experimento muestra que el fenotipo de vrn1-1 no depende de la presencia de la mutación fca-1 o de fotoperíodos de día largo. Vrn1-1 también se combinó con otras mutaciones sensibles a la vernalización de floración tardía (fve-1, ld-3, fwa-1, fe-1, fpa-2 y ft-1) y se observó que también alteraba la respuesta a la vernalización de estos mutantes (Chandler y otros, 1996).

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Ejemplo 3 Mapeo genético de VRN1

El gen VRN1 se localizó inicialmente en la parte superior del brazo del cromosoma III, entre los marcadores RLFP mi207 y mi339, utilizando una población F2 (77 vegetales) relativamente pequeña derivada de un cruce entre vrn1-1 fca-1 y fca-10, tal como se describe (Chandler y otros, 1996). A continuación se utilizó una población más grande (F2 de 494 vegetales) derivada del mismo cruce para localizar con precisión la posición de VRN1 (figura 2). La escasez de marcadores genéticos disponibles en esta región requería el desarrollo de varios marcadores genéticos nuevos que eran polimórficos entre los ecotipos Ler y Ws (tabla 1). Como primera etapa, se utilizaron dos marcadores flanqueantes VRN1, ATHCHIB (SSLP) y g4711 (CAPS) para cribar la población en busca de recombinantes en este intervalo de \approx18 cM. Se identificaron aproximadamente 170 cromosomas recombinantes. A continuación, los marcadores indicados en la figura 2 se utilizaron con estos recombinantes para definir la posición de VRN1 en el intervalo de \approx0,5 cM entre mi339 (2 recombinantes hacia el norte) y pkS1240 (un recombinante hacia el sur). El marcador CAPS agp14, que corresponde a un gen de la dioxigenasa, era genéticamente inseparable de VRN1 (figura 2).

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Ejemplo 4 Localización física de VRN1

El intervalo entre mi339 y pKS1240 se situaba en un espacio entre el cóntigo 3 y el cóntigo 4 de la cubierta CIC YAC del cromosoma III (Camilleri y otros, 1998) por lo que no se disponía de datos de un mapa físico. Inicialmente se intentó llenar el espacio utilizando clones YAC distintos de los derivados de la colección CIC (es decir, yUP, EW y EG), pero esta región genómica no estaba aparentemente representada en ninguna de estas colecciones. Por lo tanto, se construyó un mapa físico del intervalo utilizando clones BAC IGF (Mozo y otros, 1998) y TAMU (dirección del Web: genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/ww/Vol2/choi.html). El marcador mi339 se utilizó para cribar colecciones BAC y para iniciar el desplazamiento hacia pKS1240. Los cóntigos BAC (figura 3) se ensamblaron hibridando los BAC con sondas terminales desarrolladas por iPCR (tabla 2) y utilizando datos de secuencias terminales BAC disponibles públicamente (de TIGR; dirección del Web \underbar{www.tigr.org/tdb/at/atgenome/bac\_end\_search/bac\_end\_search.html}) como base para diseñar cebadores de oligonucleótidos para PCR (tabla 2). El tamaño de cada uno de los clones BAC se determinó mediante electroforesis en gel de campo pulsado hexagonal (Maules, 1997). Por lo tanto se observó que el intervalo =0,5 cM entre mi339 y pKS1240 que contiene el gen VRN1 correspondía a 120 kb de ADN genómico.

Para la preparación de experimentos de complementación de cósmidos, se cribó inicialmente una colección genómica Ler en el vector binario 04541 de cósmidos (Macknight y otros, 1997) utilizando las siguientes sondas: BAC T24F13, mi339, agp14 y pKS1240. Los supuestos clones positivos se verificaron mediante transferencia de Southern y el solapamiento entre cada uno de los cósmidos se determinó mediante hibridación con sondas de ADN o con cebadores PCR diseñados a partir de datos de secuencias terminales BAC y de cósmidos (tabla 2). Los tamaños de los insertos de cada uno de los clones de cósmidos se determinaron mediante digestión con XbaI + XhoI seguida de electroforesis estándar en gel de agarosa utilizando pedazos de ADN lambda con HindIII como estándar. Se generó un cóntigo cósmido completo a lo largo de la región =120 kb (figura 3).

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Ejemplo 5 Complementación de cósmidos del fenotipo vrn1

Ocho cósmidos (39K3, 8H8, 10F10, 42A10, 2P5, 19D3, 27J7, 67N6) centrados alrededor del marcador agp14 se transformaron en vegetales vrn1-1 fca-1 mediante infección de Agrobacterium tumefaciens del tejido radicular (Hooykaas, 1989). Para comprobar si alguno de estos cósmidos rescataba el fenotipo mutante de vrn1-1 fca-1, se sembró semilla T2 (de transformantes T1 resistentes a kanamicina) en el suelo y se sometió a vernalización durante 5 semanas. A continuación se transfirieron las plántulas a condiciones LD y se plantaron en compartimientos individuales de bandejas separadas tras aproximadamente una semana de crecimiento. Se determinó el número total de hojas anterior a la floración y los cósmidos fueron considerados complementarios si la proporción de segregación de los vegetales tempranos frente a tardíos (comparado con los controles fca-1 y vrn1-1 fca-1) era de aproximadamente 3:1 o superior. Se observó que ocho líneas independientes que contenían cósmido 8H8, ocho líneas independientes que contenían cósmido 10F10 y tres líneas independientes que contenían cósmido 30K3 rescataban fenotipo de mutante de vrn1-1 fca-1. Las líneas que contenían los otros cinco cósmidos no eran complementarias del fenotipo vrn1-1 (figura 3). En la figura 4 se muestra el análisis de segregación del tiempo de floración en líneas complementarias 8H8 y 10F10 características. La presencia de cada cósmido en líneas complementarias (vegetales T2) se confirmó mediante un diagnóstico específico de cósmidos.

PCR, que comprende un cebador específico de insertos 8H8DIAG1 (ACCTGCTTCTGCCAACCGCTC) y
10F10DIAG1 (AGTTCGCTCTTGCTGTTTTTTTTCCC) (que corresponde a una parte del ADN genómico Ler) y un cebador BACT 7U (CCTCTTCGCTATTACGCCAG) presente en el vector cósmido (véase "Complementación de cósmidos" posteriormente en "Materiales y procedimientos").

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Ejemplo 6 Análisis de ADN genómico que corresponde a la región complementaria (A) Secuenciación de ADN de cósmido

La región del cromosoma III que corresponde al VRN1 que hay alrededor del cóntigo del cósmido(figura 3) al parecer no había sido secuenciada con anterioridad. Por lo tanto se secuenció el ADN insertado a partir de los cósmidos 8H8, 10FF10 y 30K3 (derivado del ADN genómico Ler) mediante una combinación de estrategias de "primer-walking" y de "shotgun" (tabla 3), que produjeron tres cóntigos de secuencia (figura 5). La cantidad total de secuencia nueva de Arabidopsis obtenida fue de 20.950 pb.

(B) Identificación de los ORF de elección en la secuencia genómica

A medida que se obtenían nuevos datos de la secuencia genómica se analizaron de diversos modos para identificar posibles marcos de lectura abiertos (ORF) y genes. En primer lugar, se realizaron búsquedas de homología utilizando los programas informáticos BLAST y FASTA disponibles en la Base de datos de Arabidopsis thaliana (BDAt; dirección del Web: genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/seqtools.html) y National Center for Biotechnology Information (NCBI; dirección del Web: www.ncbi.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Con estos programas, se comparó la secuencia genómica en la región VRN1 con (1) la base de datos EST de Arabidopsis y (2) la base de datos de todas las secuencias de Genbank no redundantes. En segundo lugar, se realizaron búsquedas utilizando la dirección del Web de NetPlantGene: www.cbs.dtu.dk/NetPlantGene.html), la dirección del Web de BCM Gene Finder: (dot.imgen.bcm.tmc.edu: 9331/gene-finder/gf.html) y programas informáticos de la dirección del Web de GENESCAN: genomic.stanford.edu/GENSCANW.html) que han sido diseñados para identificar características de genes eucariotas, tales como límites intrón-exón, ORF y señales de poliadenilación. Los resultados de estos análisis se resumen en la figura 5 ("ORF predichos"). Se observó que la región secuenciada (cóntigos 29, 2 y 4) contenía \approx8 genes posibles. Tres de estos genes, agp14, LARS1 y ORF1 (identificados más tarde como VRN1) estaban representados por EST en la base de datos EST de Genbank.

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Ejemplo 7 Identificación de mutaciones vrn1-1 y vrn1-2 y determinación de la estructura del gen VRN1 (A) Hallazgo de mutaciones en vegetales mutantes vrn1

Los tres cósmidos que rescataron el fenotipo mutante vrn1-1 fca-1 (8H8, 10F10, 39K3) fueron sometidos a análisis de restricción utilizando XbaI y XhoI (figura 5) y la región de solapamiento observada entre estos tres cósmidos fue de \approx6,5 kb. El análisis ORF indicaba que este intervalo de 6,5 kb contenía el extremo 3' del gen LARS1 (una dioxigenasa estrechamente relacionada con agp14), el extremo 3' de un gen hipotético de función desconocida y la estructura completa de otro gen, "ORF1" (figura 5).

Para determinar si LARS1 o ORF1 correspondían a VRN1, se llevó a cabo una búsqueda de la presencia de mutaciones en estos genes en vegetales mutantes vrn1-1 fca-1 y vrn1-2 fca-1. Los cebadores PCR utilizados inicialmente en la secuenciación de ADN de cósmidos (tabla 3) se utilizaron ahora para amplificar productos de ADN genómico de vrn1-1 fca-1 y vrn1-2 fca-1. Los productos de solapamiento que incluían todo el ORF predicho de LARS1 y ORF1 fueron secuenciados en ambas cadenas y comparados con la secuencia de cósmidos derivados de Ler en busca de la presencia de diferencias que correspondieran a mutaciones. No se observaron mutaciones en el gen LARS1, pero en ORF1 se observó una mutación no codificante de 1 pb en el ADN derivado de vrn1-1 fca-1 y una deleción de 1 pb en el ADN derivado de vrn1-2 fca-1 (figura 6). Cada una de estas supuestas mutaciones fueron confirmadas después mediante secuenciación de otros cuatro productos independientes en ambas cadenas. El efecto de las mutaciones vrn1-1 y vrn1-2 en la proteína VRN1 codificada se describe en el Ejemplo 8.

(B) Determinación de la estructura del gen VRN1

La estructura del gen VRN1 y del supuesto transcrito se determinó mediante una combinación de (1) análisis RT-PCR, (2) análisis 3'-RACE y (3) análisis de clones parciales de ADNc representados en la base de datos EST de Arabidopsis de GenBank (tabla 4). Estas técnicas permitieron descubrir la secuencia del transcrito de VRN1 y comparando esta secuencia con la secuencia genómica VRN1, se determinaron los límites intrón/exón (figura 6, figura 7). Los resultados obtenidos mediantes estas estrategias coincidían siempre, es decir, los límites intrón-exón y el punto de poliadenilación determinados mediante RT-PCR y 3'-RACE eran idénticos a los determinados a través del análisis de clones EST que correspondían a ADNc de VRN1, aunque el inicio de transcripción 5' del gen VRN1 no estaba determinado definitivamente por los experimentos. Dentro del supuesto transcrito VRN1 (figura 7), la secuencia derivada de Ler obtenida mediante RT-PCR y la secuencia derivada de Columbia obtenida mediante la secuenciación de clones EST eran 100% idénticas.

El gen VRN1 consta de 5 exones e incluye \approx3,0 kb del ADN genómico procedente del supuesto inicio de transcripción en el punto de poliadenilación (véase Anexo I). Los intrones 2, 3 y 4 tienen el tamaño característico de un gen de Arabidopsis (\approx100 pb), mientras que el intrón 1 es bastante largo: \approx1,2 kb (figura 6). Las UTR 5' y 3' del transcrito VRN1 también son de algún modo más grandes que la media: \approx270 y \approx200 pb, respectivamente (figuras 6 y 7).

Se analizaron la región del promotor VRN1 (desde el extremo del gen LARS1 hasta el codón de inicio de la traducción de VRN1) y el intrón 1 de VRN1 en busca de sitios de unión de factores de transcripción de vegetales conocidos y elementos del promotor conocidos utilizando el programa Web Signal Scan y la dirección del Web de la base de datos PLACE: (www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/signalscan.html). Se observó que estas regiones de VRN1, las cuales pueden especificar potencialmente la expresión del gen VRN1, contenían los siguientes posibles sitios de unión: (1) dos elementos de respuesta a temperaturas bajas (LTRE; también conocidos como CRT/DRE), observados en varios genes inducidos con frío de Arabidopsis, Brassica napus y cebada y unidos por el factor de transcripción CBF1 (Baker y otros, 1994; Stockinger y otros, 1997; Jiang y otros, 1996; Nordin y otros, 1993), (2) tres sitios de unión para el gen rd22 de Arabidopsis sensible a la deshidratación y ABA (Abe y otros, 1997), (3) un sitio de unión para Myb2 de Arabidopsis, un factor de transcripción que interviene en la regulación de genes sensibles a estrés hídrico (Urao y otros, 1993), (4) una caja H y tres sitios de unión a TCA-1, elementos promotores observados en varios genes del tabaco, la cebada y la judía (P. vulgaris) que son inducidos por heridas y estrés abiótico (Loake y otros, 1992; Mhiri y otros, 1997; Goldsbrough y otros, 1993), y (5) tres cajas ICE, un elemento promotor de consenso observado en varios genes inducibles por frío (G.J. Warren, no publicado). Es interesante que los elementos de control para los genes tanto inducibles con frío como con privación de agua se hallan presentes dentro del promotor VRN1 y el intrón 1, ya que es sabido que estas condiciones inducen a varios genes involucrados en la aclimatación a temperaturas bajo cero (Thomashow, 1994), y también interviene la señalación ABA (Gilmour y Thomashow, 1991). Es probable que estos elementos de control determinen las condiciones en las cuales se obtiene la expresión del transcrito de VRN1. Por ejemplo, es posible que VRN1 sea inducido por tratamiento con frío y/o con privación de agua, o simplemente mediante la aplicación de ABA.

En conjunto, la presencia de mutaciones dentro de ORF1 (el único gen predicho que se hallaba por completo dentro de la región complementaria) en ADN genómico derivado de vegetales mutantes vrn1-1 y vrn1-2 confirmó que ORF1 corresponde al gen VRN1.

Esto puede confirmarse fácilmente mediante la introducción del ORF (en cadena codificante y no codificante) en Arabidopsis (véase Ejemplo 5 anterior). Las construcciones pueden basarse en el vector pGreen0029 que dirige la expresión de los clonados en el gen con un doble promotor y finalizador 35S derivado de CaMV. En el documento WO 99/27120 (Plant Biosciencie Limited) se describe con mayor detalles este vector y cómo obtenerlo.

(1) Construcción genómica codificante: el ORF del VRN1 (genómico) no se conectó en la orientación codificante para producir niveles elevados de producto VRN1 funcional. Esta construcción se introducirá en vegetales vrn1-1 fca-1 y vrn1-2 fca-1.

(2) Construcción de ADNC codificante: el ORF del VRN1 (ADNc) se conectó en la orientación codificante para producir niveles elevados de producto VRN1 funcional. Esta construcción se introducirá en vegetales vrn1-1 fca-1 y vrn1-2 fca-1.

(3) Construcción de ADNc no codificante: el ORF del VRN1 (ADNc) se conectó en la orientación no codificante para reprimir la expresión normal de VRN1 y disminuir la cantidad de producto VRN1 funcional. Esta construcción se introducirá en vegetales fca-1 y Ler.

Como alternativa al promotor constitutivo, puede ser deseable utilizar un promotor inducible, tal como uno que esté controlado por la aplicación de la molécula dexametasona.

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Ejemplo 8 Análisis de la supuesta proteína codificada por el gen VRN1

La secuencia de aminoácidos deducida de VRN1 (figura 7) se comparó con toda la base de datos GenBank (NCBI) utilizando los programas BLASTP y TBLASTN.

(A) VRN1: estructura del dominio, características de la secuencia y semejanza con otras secuencias conocidas e hipotéticas

El gen VRN1 codifica una supuesta proteína de 341 aa (PM calculado =39.278 Da) que es básica (pI =9,1) y consta de por lo menos tres regiones. Región 1 (restos 2-94 de la figura 7) y región 3 (restos 239-332), que son homólogas entre sí y están relacionadas con el dominio B3 de unión a ADN hallado originalmente en el factor de transcripción del maíz VIVIPAROUS1 (VP1; McCarty y otros, 1991). Posteriormente se han observado dominios parecidos al dominio B3 de VP1 en varios factores de transcripción de Arabidopsis o en supuestos factores de transcripción tales como ABI3 (el ortólogo de Arabidopsis del VP1 del maíz) (Giraudat y otros, 1992), en factores de respuesta a auxinas (Ulmasov y otros, 1997), en factores de respuesta a IAA (Kim y otros, 1997; Abel y otros, 1994; Guilfoyle y otros 1998), en FUSCA 3 (Luerssen y otros, 1998) y en RAV (Kagaya y otros, 1999). Se ha observado que varias de estas proteínas se unen a ADN de un modo específico de la secuencia a través de su dominio B3 (por ejemplo, Kagaya y otros, 1999; Suzuki y otros, 1997; Ulmasov y otros, 1997).

El dominio de unión a ADN B3 es al parecer específico de los vegetales (Suzuki y otros, 1997), y el análisis de las secuencias de nucleótidos traducidas (es decir, proteínas hipotéticas) de las bases de datos de GenBank ha puesto al descubierto por lo menos 22 secuencias de Arabidopsis que contienen dominios B3, así como secuencias EST procedentes de otras varias especies de vegetales tales como Brassica oleracea, el álamo híbrido (Populus tremula x P. tremuloides) y el tomate. Aunque VRN1 contiene dos dominios B3, se observó que las secuencias de aminoácidos principalmente caracterizadas e hipotéticas sólo contenían un dominio B3, y en algunas se vio que contenían más de dos. El dominio B3 se halla al parecer "definido" por un número de posiciones conservadas (los resultados no se muestran) más que por una identidad de secuencia a lo largo de todo el dominio. Por lo tanto, las puntuaciones BLAST entre las secuencias mostradas comprobadas son sólo ligeramente significativas (del orden de 10^{-6} a 10^{-1}). La parte terminal C del dominio B3 es más conservada que la parte terminal N.

El análisis filogenético de los dominios B3 (los resultados no se muestran) que utiliza el procedimiento Clustal indica que las proteínas de Arabidopsis que contienen B3 se clasifican en diversos grupos: (1) B3 de tipo ABI3 y FUSCA3, (2) B3 de tipo proteínico inducibles por factores de respuesta a auxina (ARFs) y por IAA, (3) B3 de tipo RAV1 y (4) por lo menos cuatro grupos no caracterizados, entre los cuales B3 de tipo VRN1. Es probable que a lo largo de la evolución el dominio B3 se haya visto implicado de distintas maneras por proteínas involucradas en distintos procesos vegetales.

La región 2 de VRN1 (restos 95-238), que se sitúa entre los dos dominios B3 (figura 7), no se halla claramante relacionada con ningún dominio de función conocida, ni tiene características evidentes de una activación de la transcripción o dominio de represión. Sin embargo, la región 2 cuenta con varias características y motivos de interés, entre los cuales una supuesta señal de localización nuclear (NSL), dos supuestas regiones PEST (identificadas utilizando la Utilidad de la secuencia PEST (dirección del Web: www.lif.icnet.uk/LRITu/projects/pest/) basada en Rechsteiner y Rogers, 1996; Rogers y otros, 1986), y tres motivos RXXL también asociados con degradación proteínica rápida (Cooper y otros, 1997) (figura 7). Curiosamente, la segunda región PEST de VRN1 contiene un posible sitio de fosforilación de la proteinquinasa C (PKC) (restos 176-178 en la figura 7). Hay varios ejemplos en la bibliografía sobre la regulación del "período de vida" celular de proteínas mediante fosforilación de regiones PEST (por ejemplo, McKinsey y otros, 1997; Koepp y otros, 1999; Yaglom y otros, 1996; Marchal y otros, 1998; Liu y otros, 1997). Por ejemplo, en el caso de estimulación IkB, de receptores celulares de superficie por citoquinas se inicia una señal de cascada de transducción que fosforila IkB en dos restos serina específicos en la región PEST, desencadenando la poliubiquitinación de los restos cercanos de lisina y en última instancia la proteólisis (McKinsey y otros, 1997; Laney y Hochstrasser, 1999).

El análisis de las características fisioquímicas de VRN1 indica que los dos dominios B3 son básicos (pI medio \approx9,5) y de carácter ligeramente hidrófobos, mientras que la región 2 es ligeramente ácida (pI \approx6,3) y en cierto modo hidrofílica y por lo tanto es probable que esté en la superficie de la molécula y expuesta al entorno acuoso. Curiosamente, a diferencia de los dominios B3 que al parecer son específicos de los vegetales, la búsquedas BLAST frente a Genbank (NCBI) con región 2 de VRN1 no consiguieron un éxito considerable de vegetales (excepto por RTV1, véase posteriormente) pero sí permitieron descubrir poca homología entre la parte terminal N de la región 2 (restos 109-167) y una región del factor de transcripción c-MYC de protooncogenes en vertebrados (Schmidt, 1999).

Además, esta región de c-myc se sitúa en el enlazador entre el dominio de unión a ADN y el dominio de activación de la transcripción (Kerkhoff y Bister, 1991; Classon y otros, 1993) y no es necesaria para la actividad de transformación oncogénica de la proteína (Stone y otros, 1987). Por analogía, esta parte de la región 2 de VRN1 puede actuar de un modo similar como una región del enlazador de no gran importancia para la función VRN1. Alternativamente, la región 2 puede actuar como un nuevo tipo de activación de la transcripción o dominio de represión, o en alguna otra función desconocida de VRN1. La tabla 4 proporciona información sobre las secuencias que se utilizaron en comparaciones con VRN1. Posteriormente se habla del gen RTV1.

(B) Efecto de las mutaciones alélicas sobre VRN1

Las mutaciones observadas en los dos alelos mutantes de vrn1 (figura 6) y el efecto de estas mutaciones en la proteína codificada resultante pueden correlacionarse con la gravedad fenotípica, es decir, efecto sobre la respuesta de vernalización (figura 1A), de los dos alelos. Tal como se muestra en la figura 7, el alelo vrn1-1 codifica un polipéptido de sólo 47 aa y el alelo vrn1-2 codifica un polipéptido de 194 aa (del cual los últimos seis son incorrectos debido a una mutación del marco de lectura) comparado con 341 aa de la proteína de tipo salvaje. El hecho de que el polipéptido codificado por vrn1-2 contenga el primer dominio B3, así como las supuestas regiones PEST y NLS, pero sea sólo ligeramente menos grave en su efecto sobre la vernalización que el alelo vrn1-1 (figura 1A), indica que puede requerirse (pero no ser necesariamente suficiente) el segundo dominio B3 de unión a ADN para que VRN1 actúe en las condiciones utilizadas.

(C) El gen RTV1, próximo a VRN1

A pesar de la presencia de muchas proteínas vegetales que contienen el dominio B3, sólo se ha observado una posible secuencia proteínica con una estructura de dominio idéntica a VRN1, es decir, que contenga regiones 1-3 en la misma configuración y sin dominios adicionales. El gen que codifica esta proteína, que está representado en la base de datos EST de Arabidopsis (tabla 4), se ha denominado RTV1 (relacionado con VRN1). RTV1, que se sitúa en el clon BAC IGF F13F21 en el cromosoma 1, codifica una proteína de 301 aa que es muy parecida a VRN1 (tabla 5). Mientras que la semejanza global entre RTV1 y VRN1 es de un 74% (dentro de la región codificante), la semejanza es mayor en el extremo terminal C, con una semejanza del 99% en la región 3 de RTV1 y VRN1 (tabla 5). Fuera de la región codificante (es decir, en las UTR, la región promotora y los intrones), los genes VRN1 y RTV1 no están al parecer relacionados. No obstante, la organización intrón/exón del gen RTV1 es parecida a VRN1 y por lo tanto es probable que los dos genes sean el resultado de un fenómeno de duplicación. La diferencia más notable entre VRN1 y RTV1 es la deleción de 33 aminoácidos en el primer dominio B3 de RTV1. Merece la pena observar que esta deleción no afecta a la parte del extremo terminal C, más conservada, del dominio B3.

La observación de un gen que se halla estrechamente relacionado con VRN1 indica que RTV1 puede actuar de algún modo en la respuesta a la vernalización o en otro aspecto del control del tiempo de floración. Puesto que el alelo vrn1-1 codifica un polipéptido corto de sólo 47 aminoácidos, sin supuesto dominio de unión a ADN completo (figura 7) es probable que codifique un polipéptido no funcional. El hecho de que los vegetales mutantes vrn1-1 sigan conservando una ligera respuesta a la vernalización (figura 1) sugiere la presencia de otros factores de Arabidopsis que pueden sustituir parcialmente la función VRN1. Puesto que RTV1 es un parálogo de VRN1 estrechamente relacionado en Arabidopsis puede ser tal factor.

Otro factor que posiblemente puede ser responsable de esta redundancia funcional es VRN2 (Chandler y otros, 1996). Como los mutantes vrn1-1 fca-1, los mutantes vrn2-1 fca-1 también conservan una respuesta parcial a la vernalización, pero los mutantes triples vrn1-1 vrn2-1 fca-1 no (no se muestran los datos). Si se supone que vrn1-1 es una mutación "nula", entonces este resultado indica que VRN1 y VRN2 actúan en vías separadas y parcialmente redundantes que favorecen la vernalización.

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Ejemplo 9 Detección y aislamiento de genes afines a VRN1 procedentes de otras especies vegetales

Cuando se hibridó con una sonda correspondiente al transcrito VRN1, una transferencia de Southern muy rigurosa de ADN genómico procedente de varios cereales detectó específicamente genes afines a VRN1 en el mijo (FINGER, FOXTAIL 863B- PEARL, 841B- PEARL), el sorgo (P20, P10), la cebada (BETZER, TRIUMPH, IGRI), el arroz (63-83, IR20), el trigo (SYNTHETIC, SQ1, CHINESE SPRING) y el maíz (P9, P10, C0, C8, C2, C9, DPT A, DTP79, B73, M017, B84, 12B84, L175, L25, DTP A, DW) (no se muestran los resultados).

Para preparar la transferencia, se digirieron aproximadamente 10 \mug de ADN genómico de cada una de estas variedades con Eco RI (37ºC, toda la noche). Las muetras de ADN se separaron mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8% que corrió a 50 V durante 16 horas. A continuación se procesó el gel para someterlo a transferencia de Southern mediante procedimientos estándar (véase Maniatis, supra) y se transfirió el ADN sobre una membrana de nailon (Hybond-N, Amersham) durante toda la noche. Tras la transferencia, se entrecruzó el ADN con el filtro mediante exposición a luz UV según las recomendaciones del fabricante y se horneó a 80ºC durante 2 horas.

La sonda de ADNc de VRN1 V2V6 se preparó amplificando un alícuota de la síntesis de ADNc de la primera cadena a partir de todo el ARN de las plántulas de Arabidopsis con los cebadores de oligonucleótidos V2 y V6. El producto PCR resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se marcó con ^{32}P-dCTP mediante el procedimiento de cebado con hexámeros aleatorios (véase Maniatis, supra).

La hibridación del filtro con la sonda radiomarcada, y los posteriores lavados, se realizaron bajo condiciones estándar muy rigurosas utilizando un tampón que comprende SSC 5x, solución de Denhart 5X y SDS al 0,5% a 65ºC durante 16 horas. A continuación se lavó el filtro secuencialmente en (1) SSC 2X, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 10 minutos; (2) SSC 1X, SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos; y (3) SSC 1X, SDS al 0,1% a 65ºC durante 10 minutos.

El filtro lavado se expuso a una placa de PhosphorImager (Molecular Dynamics) durante 3 días antes de la visualización.

A la luz de los resultados anteriores, además de en monocotiledónias, es muy probable que se observe que existen genes afines a VRN1 en especies dicotiledóneas agronómicamente importantes (por ejemplo, brasicáceas, remolacha azucarera, guisantes y apio, etc.).

De este modo, la provisión de información de la secuencia para el gen VRN1 de Arabidopsis thaliana permite la obtención de secuencias homólogas de genotecas de ADNc o genómicas de otras especies vegetales, tales como las que puede preparar u obtener cualquier experto en la materia. Los clones positivos pueden analizarse posteriormente mediante digestión de endonucleasas de restricción y técnicas de transferencia de Southern tal como se ha descrito anteriormente. Son particularmente preferidos los homólogos de especies comercialmente importantes que tienen un requisito de vernalización o que muestran alguna respuesta a la vernalización.

Materiales y procedimientos utilizados en los ejemplos Crecimiento vegetal

Para los tratamientos de vernalización, se sembraron semillas en arenilla fina (M3 de Levington) en recipientes individuales y se dejaron germinar durante distintos períodos de tiempo cada vez mayores a 4ºC, con 8 horas de luz: 16 horas de oscuridad, intensidad de luz 5 mmol m^{-2} s^{-1}. Para los experimentos de respuesta a la dosis se escalonó la siembra de semillas y se eliminaron las condiciones de vernalización en todos los vegetales al mismo tiempo. Tras la vernalización, se colocaron las plántulas en un entorno controlado (Gallenkamp) a 20ºC, con 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad, intensidad de luz 90 mmol m^{-2} s^{-1}. Las plántulas que no recibieron tratamiento de vernalización se dispusieron en estratos durante 2 días bajo condiciones de vernalización y se dejaron crecer durante dos días antes de transferirlas al lugar de crecimiento. Se dejo que los vegetales crecieran durante 10 días y a continuación se plantaron en compartimientos individuales de bandejas P40. Se determinó el tiempo de floración contando el número total de hojas (es
decir, hojas en roseta y caulinares) mediante el marcado permanente de las hojas con tinta negra a medida que salían.

Mapeo genético

El VRN1 se situó inicialmente en el cromosoma 3 a través de la unión a los marcadores RFLP mi339 y mi207 (Liu y otros, 1996), en la progenie F2 (154 cromosomas) de un cruce entre vrn1-1 fca-1 (origen Ler) y fca-10 (origen Ws), tal como se ha descrito (Chandler y otros, 1996). Como primera etapa en el ajuste de esta posición en el mapa, se evaluaron dos marcadores RLFP existentes en la región (g4711 y m560B2; Chang y otros, 1988) y dos marcadores SSLP existentes en la región (ATHCHIB y ngal62; Bell y Ecker, 1994), en una población F2 más grande (988 cromosomas) del mismo cruce anterior. Para ajustar mejor la posición en el mapa del VRN1, se crearon nuevos marcadores genéticos que eran polimórficos entre Ler y Ws (tabla 1). De principio a fin se utilizaron técnicas estándar (por ejemplo, digestión de restricción, marcado de sondas con ^{32}P, electroforesis en gel de agarosa, transferencia de Southern y detección en PhosphorImager).

Mapeo físico

Se manejaron, analizaron e hibridaron los clones YAC, BAC y de cósmidos y las colecciones según procedimientos estándar (Schmidt y Dean, 1995; Bent y otros, 1998; Macknight y otros, 1997). Igual que con el mapeo genético de VRN1, algunas sondas y marcadores PCR ya existían y se hallaban disponibles, y algunos se crearon para establecer o ajustar el solapamiento entre clones. Las siguientes sondas y marcadores PCR ya existían y se hallaban disponibles: mi289, GBGe303, MSH2, ve039, mi339, agp14, MAP2K, sAT2105b y m506B2. Las sondas y marcadores PCR nuevos para identificar el gen VRN1 se enumeran en la tabla 2. Las sondas y marcadores PCR nuevos se crearon mediante tres procedimientos: (1) iPCR de extremos BAC, (2) diseño de cebadores PCR basados en datos de secuencia de extremos BAC (de TIGR; dirección del Web: www.tigr.org/tdb/at/atgenome/bac_end_search/bac_end_search.html), y (3) secuenciación de extremos cósmidos y diseño de cebadores PCR basados en los datos obtenidos.

(A) iPCR de extremos pBelo-BAC

El siguiente procedimiento es una modificación de un protocolo recibido de T. Altmann (MPI, Golm, Alemania). Se digerió ADN de 1/10 de un cultivo de toda la noche de 25 ml de BAC con (1) HhaI o EcoRI o HincIII o RsaI para el extremo T7, o (2) HhaI o HaeII o EcoRV para el extremo Sp6 y fenol cloroformo extractado y precipitado de etanol. El material digerido se unió en una reacción estándar de 100 \mul con ligasa de ADN T4, se inactivó con calor y se precipito con etanol. Los productos de la unión se digirieron con PvuI para el extremo T7 y con BsrBI para el extremo Sp6 en un volumen de reacción de 15 \mul. Para la PCR, se amplificó 1 \mul de reacción de digestión en una reacción estándar utilizando (1) cebadores BACT7U y BACT7L para el extremo T7, o (2) cebadores Sp6A para el extremo Sp6.

BACT7U

5'-CCTCTTCGCTATTACGCCAG-3'

BACT7L

5'-GCCCTTCCCAACAGTTCG-3'

Sp6A

5'-CACACAGGAAACAGCTAT-3'

Sp6B

5'-ACACAACATACGAGCCGGAA-3'

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(B) Secuenciación de ADN de cósmidos y productos PCR

La secuencia genómica se obtuvo a partir de los extremos de ADN de cósmido insertado utilizando el kit de secuenciación de ciclos BIGDYE (Perkin Elmer Applied Biosystems) y cebadores T3 y T7, cuyas secuencias flanquean el sitio del inserto de ADN genómico. Para secuenciar otras regiones en el ADN de cósmido insertado, y para secuenciar productos PCR amplificados fuera del ADN genómico procedente de los alelos vrn1-1 y vrn1-2, se utilizaron los oligonucleótidos que se muestran en la tabla 3. Las reacciones se llevaron a cabo en una máquina ABI377 y se compilaron utilizando el programa SeqMan (DNAStar, Lasergene).

Complementación de cósmidos

Los cósmidos en el vector binario 04541 se movilizaron en Agrobacterium tumefaciens (cepa C58Cl RifR) mediante emparejamiento triparental (Hoekema y otros, 1983). Los vegetales vrn1-1 fca-1 se transformaron con estas cepas de Agrobacterium mediante infección radicular (Hooykaas, 1989). Se seleccionaron vegetales transgénicos en GM con kanamicina (50 mg/ml) y se transfirieron al suelo cuando alcanzaron la etapa de 3-4 hojas. La presencia de cada cósmido en las líneas transgénicas se confirmó utilizando una reacción PCR diagnóstica específica, utilizando un cebador presente en la secuencia de cósmidos insertados y un cebador presente en el cósmido que flanquea el sitio de inserción. Se recogieron semillas T2 y se analizaron para la segregación de resistencia o sensibilidad a kanamicina en placas GM que contenían kanamicina (como anteriormente), se evaluaron a los 14-20 días después de la germinación. En el caso de las líneas que segregaron a una proporción 3:1 de vegetales resistentes o sensibles se comprobó su capacidad para complementar el fenotipo mutante vrn1-1, mediante vernalización de 5 semanas y registrando el número total de hojas.

RT-PCR y 3'-RACE

Para determinar la estructura intrón-exón del gen VRN1, se realizaron reacciones RT-PCR utilizando todo el ARN preparado a partir de plántulas fca-1 y vrn1-1 fca-1 cultivadas en el suelo según procedimientos estándar (Frohman y otros, 1988). Los productos PCR se secuenciaron utilizando ambos cebadores utilizados para la PCR, y se seleccionaron cebadores internos, utilizando el kit BIGDYE (PE Applied Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo en una máquina ABI377 y se compilaron utilizando el programa SeqMan (DNAStar, Lasergene).

Comparaciones de las secuencias

La comparación de secuencias de ácidos nucleicos de la tabla 5 se llevó a cabo utilizando el procedimiento Jotun Hein (tabla de restos pesados) de MegAlign (DNAstar). Las secuencias genómicas y de ADNc se alinearon utilizando el programa BLAST 2 SEQUENCES (dirección del Web: www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html) de NCBI.

Los parámetros se establecen preferiblemente por defecto, tal como sigue:

Penalización espacial ("gap penalty"): 11

Penalización longitud espacial ("gap length penalty"): 3

Longitud palabras KTUP ("KTUP word length"): 6

Las secuencias de aminoácidos se alinearon inicialmente utilizando el procedimiento Clustal, utilizando la tabla de pesos de los restos PAM 250 y ajustando además manualmente. Para comparar la semejanza entre aminoácidos, se agruparon los aminoácidos en cinco clases en base a las propiedades fisioquímicas, tal como sigue: (1) hidrófobos - G, A, V, P, M, I, L; (2) polares - S, T, N, Q, C; (3) de anillo voluminoso - Y, F, W, H; (4) cargados positivamente - K, R; (5) cargados negativamente - D, E

TABLA 1 Marcadores genéticos creados para identificar el gen VRN1

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TABLA 2 Marcadores de localización física creados para identificar el gen VRN1

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TABLA 3 Oligonucleótidos creados para identificar el gen VRN1. La cadena positiva (+) oligos corresponde a la cadena de ADN adelantada, o ARNm, y la cadena negativa (-) oligos corresponde a la cadena de ADN inversa, o codificante. La posición indicada en la tabla se refiere a la posición del nucleótido en la secuencia genómica VRN1 (Anexo I) del extremo 5' de la oligos

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TABLA 4 Secuencias que corresponden a EST para VRN1 y RTV1, y otras secuencias utilizadas para comparar con VRN1

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TABLA 5 Comparación de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de RTV1 y VRN1

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Bibliografía

Abe, H., Yamaguchi-Shinozaki, K., Urao, T., Iwasaki, T., Hosokawa, D. y Shinozaki, K. (1997). Role of arabidopsis MYC and MYB homologs in drought- and abscisic acid-regulated gene expression. Plant Cell 9, 1.859-68.

Abel, S., Oeller, P. W. y Theologis, A. (1994). Early auxin-induced genes encode short-lived nuclear proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 326-30.

Baker, S. S., Wilhelm, K. S. y Thomashow, M. F. (1994). The 5'-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cisacting elements that confer cold-, drought- and ABA- regulated gene expression. Plant Mol Biol 24, 701-13.

Barnes, J. A., and Gomes, A. V. (1995). PEST sequences in calmodulin-binding proteins. Mol Cell Biochem 149-150, 17-27.

Becker, D., Brettschneider, R. y Lorz, H. (1994). Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. Plant J 5, 299-307.

Bell, C. J., y Ecker, J. R. (1994). Assignment of 30 Microsatellite Loci to the Linkage Map of Arabidopsis. Genomics 19, 137-144.

Bent, E., Johnson, S. y Bancroft, I. (1998). BAC representation of two low-copy regions of the genome of Arabidopsis thaliana. Plant J 13, 849-55.

Camilleri, C., Lafleuriel, J., Macadre, C., Varoquaux, F., Parmentier, Y., Picard, G., Caboche, M. y Bouchez, D. (1998). A YAC contig map of Arabidopsis thaliana chromosome 3. Plant J 14, 633-42.

Chandler, J., Wilson, A. y Dean, C. (1996). Arabidopsis mutants showing an altered response to vernalization. Plant Journal 10, 637-644.

Chang, C., Bowman, J. L., DeJohn, A. W., Lander, E. S. y Meyerowitz, E. M. (1988). Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 6.856-60.

Chevaillier, P. (1993). Pest sequences in nuclear proteins. Int J Biochem 25, 479-82.

Classon, M., Wennborg, A., Henriksson, M. y Klein, G. (1993). Analysis of c-Myc domains involved in stimulating SV40 replication. Gene 133, 153-61.

Cooper, K. F., Mallory, M. J., Smith, J. B. y Strich, R. (1997). Stress and developmental regulation of the yeast C-type cyclin Ume3p (Srb11p/Ssn8p). Embo J 16, 4.665-75.

Frohman, M. A., Dush, M. K. y Martin, G. R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 8.998-9.002.

Gilmour, S. J. y Thomashow, M. F. (1991). Cold-acclimation and cold-regulated gene-expression in ABA mutants of Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology 17, 1.233-1.240.

Giraudat, J., Hauge, B. M., Valon, C., Smalle, J., Parcy, F. y Goodman, H. M. (1992). Isolation of the Arabidopsis thaliana ABI3 (Abscisic acid- insensitive) gene by positional cloning. The Plant Cell 4, 1.251-1.261.

Goldsbrough, A. P., Albrecht, H. y Stratford, R. (1993). Salicylic acid-inducible binding of a tobacco nuclear protein to a 10 bp sequence which is highly conserved amongst stress-inducible genes. Plant J 3, 563-71.

Gomes, A. V. y Barnes, J. A. (1997). Protein phosphatases are pest containing proteins. Biochem Mol Biol Int 41, 65-73.

Guilfoyle, T. J., Ulmasov, T. y Hagen, G. (1998). The ARF family of transcription factors and their role in plant hormone-responsive transcription. Cell Mol Life Sci 54, 619-27.

Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J. y Schilperoort, R. A. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303, 179-180.

Hooykaas, P. J. (1989). Transformation of plant cells via Agrobacterium. Plant Mol Biol 13, 327-36.

Jiang, C., Iu, B. y Singh, J. (1996). Requirement of a CCGAC cis-acting element for cold induction of the BN115 gene from winter Brassica napus. Plant Mol Biol 30, 679-84.

Kagaya, Y., Ohmiya, K. y Hattori, T. (1999). RAV1, a novel DNA-binding protein, binds to bipartite recognition sequence through two distinct DNA-binding domains uniquely found in higher plants. Nucleic Acids Res 27, 470-8.

Kerkhoff, E. y Bister, K. (1991). Myc protein structure: localization of DNA-binding and protein dimerization domains. Oncogene 6, 93-102.

Kim, J., Harter, K. y Theologis, A. (1997). Protein-protein interactions among the Aux/IAA proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 11.786-91.

Koepp, D. M., Harper, J. W. y Elledge, S. J. (1999). How the cyclin became a cyclin: regulated proteolysis in the cell cycle. Cell 97, 431-4.

Laney, J. D. y Hochstrasser, M. (1999). Substrate targeting in the ubiquitin system. Cell 97, 427-30.

Liu, Y. G., Mitsukawa, N., Lister, C., Dean, C. y Whittier, R. F. (1996). Isolation and mapping of a new set of 129 RFLP markers in Arabidopsis thaliana using recombinant inbred lines. Plant J 10, 733-6.

Liu, Z. P., Galindo, R. L. y Wasserman, S. A. (1997). A role for CKII phosphorylation of the cactus PEST domain in dorsoventral patterning of the Drosophila embryo. Genes Dev 11, 3.413-22.

Loake, G. J., Faktor, O., Lamb, C. J. y Dixon, R. A. (1992). Combination of H- box[CCTACC (N) 7CT] and G- box (CACGTG) cis elements is necessary for feed- forward stimulation of a chalcone synthase promoter by the phenylpropanoid-pathway intermediate p-coumaric acid. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 9.230-4.

Luerssen, H., Kirik, V., Herrmann, P. y Misera, S. (1998). FUSCA3 encodes a protein with a conserved VP1/
AB13-like B3 domain which is of functional importance for the regulation of seed maturation in Arabidopsis thaliana. Plant J 15, 755-64.

Macknight, R., Bancroft, I., Page, T., Lister, C., Schmidt, R., Love, K., Westphal, L., Murphy, G., Sherson, S., Cobbett, C. y Dean, C. (1997). FCA, a gene controlling flowering time in Arabidopsis, encodes a protein containing RNA binding domains. Cell 89, 737-745.

Mannervik, M., Nibu, Y., Zhang, H. y Levine, M. (1999). Transcriptional coregulators in development. Science 284, 606-9.

Marchal, C., Haguenauer-Tsapis, R. y Urban-Grimal, D. (1998). A PEST-like sequence mediates phosphorylation and efficient ubiquitination of yeast uracil permease. Mol Cell Biol 18, 314-21.

Maule, J. (1997). Physical mapping by pulsed-field gel electrophoresis. Methods Mol Biol 68, 93-121.

McCarty, D. R., Hattori, T., Carson, C. B., Vasil, V., Lazar, M. y Vasil, I. K. (1991). The Viviparous-1 developmental gene of maize encodes a novel transcriptional activator. Cell 66, 895-905.

McKinsey, T. A., Chu, Z. L. y Ballard, D. W. (1997). Phosphorylation of the PEST domain of IkappaBbeta regulates the function of NF-kappaB/IkappaBbeta complexes. J Biol Chem 272, 22.377-80.

Mhiri, C., Morel, J. B., Vernhettes, S., Casacuberta, J. M., Lucas, H. y Grandbastien, M. A. (1997). The promoter of the tobacco Tnt1 retrotransposon is induced by wounding and by abiotic stress. Plant Mol Biol 33, 257-66.

Mozo, T., Fischer, S., Shizuya, H. y Altmann, T. (1998). Construction and characterization of the IGF Arabidopsis BAC library. Mol Gen Genet 258, 562-70.

Nordin, K., Vahala, T. y Palva, E. T. (1993). Differential expression of two related, low-temperature- induced genes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Mol Biol 21, 641-53.

Rechsteiner, M. y Rogers, S. W. (1996). PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 21, 267-71.

Rogers, S., Wells, R. y Rechsteiner, M. (1986). Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234, 364-8.

Schmidt, E. V. (1999). The role of c-myc in cellular growth control. Oncogene 18, 2.988-96.

Schmidt, R. y Dean, C. (1995). Hybridization analysis of YAC clones. Methods in Mol. & Cell. Biol. 5, 309-318.

Steger, D. J., Utley, R. T., Grant, P. A., John, S., Eberharter, A., Cote, J., Owen-Hughes, T., Ikeda, K. y Workman, J. L. (1998). Regulation of transcription by multisubunit complexes that alter nucleosome structure. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 483-91.

Stockinger, E. J., Gilmour, S. J. y Thomashow, M. F. (1997). Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 1.035-40.

Stone, J., de Lange, T., Ramsay, G., Jakobovits, E., Bishop, J. M., Varmus, H. y Lee, W. (1987). Definition of regions in human c-myc that are involved in transformation and nuclear localization. Mol Cell Biol 7, 1.697-709.

Suzuki, M., Kao, C. Y. y McCarty, D. R. (1997). The conserved B3 domain of VIVIPAROUS1 has a cooperative DNA binding activity. Plant Cell 9, 799-807.

Thomashow, M. F. (1994). Arabidopsis thaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance. In Arabidopsis (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), págs. 807-834.

Torchia, J., Glass, C. y Rosenfeld, M. G. (1998). Co-activators and co-repressors in the integration of transcriptional responses. Curr Opin Cell Biol 10, 373-83.

Ulmasov, T., Hagen, G. y Guilfoyle, T. J. (1997). ARF1, a transcription factor that binds to auxin response elements. Science 276, 1.865-8.

Urao, T., Yamaguchi-Shinozaki, K., Urao, S. y Shinozaki, K. (1993). An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence. Plant Cell 5, 1.529-39.

Vierstra, R. D. (1996). Proteolysis in plants: mechanisms and functions. Plant Mol Biol 32, 275-302.

Yaglom, J. A., Goldberg, A. L., Finley, D. y Sherman, M. Y. (1996). The molecular chaperone Ydj1 is required for the p34CDC28-dependent phosphorylation of the cyclin Cln3 that signals its degradation. Mol Cell Biol 16, 3.679-84.

Anexo I (cóntigo 29 [1501-6500]) genómico de VRN1 Ler

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias bibliográficas mencionada por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido una gran precaución al recopilar las referencias bibliográficas, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet EP 194809 A [0076]

\bullet EP 270355 A [0083]

\bullet EP 0116718 A [0083]

\bullet US 5100792 A [0083]

\bullet EP 444882 A [0083]

\bullet EP 434616 A [0083]

\bullet WO 9209696 A [0083]

\bullet WO 9400583 A [0083]

\bullet EP 331083 A [0083]

\bullet EP 175966 A [0083]

\bullet EP 290395 A [0083]

\bullet WO 8706614 A [0083]

\bullet DE 4005152 [0083]

\bullet WO 9012096 A [0083]

\bullet US 4684611 A [0083]

\bullet EP 486234 A [0085]

\bullet EP 486233 A [0085]

\bullet US 5231020 A [0102]

\bullet WO 9534668 A [0102]

\bullet WO 9201047 A [0119]

\bullet WO 9927120 A [0150]

Bibliografía que no constituye una patente citada en la descripción

\bulletCLARKE; DEAN. Mol. Gen. Genet., 1994, vol. 242, 81-89 [0015]

\bulletMARSHALL; HODGSON. Nature Biotechnology, 1998, vol. 16, 27-31 [0045]

\bullet PCR protocols; A Guide to Methods and Applications. Academic Press, 1990 [0054]

\bulletSAMBROOK y otros. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0067]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1992 [0067]

\bullet Plant transformation and expression vectors. GUERINEAU; MULLINEAUX. Plant Molecular Biology Labfax. BIOS Scientific Publishers, 1993, 121-148 [0076]

\bulletCADDICK y otros. Nature Biotechnology, 1998, vol. 16, 177-180 [0077]

\bullet NAR, 1984, vol. 12 (22), 8.711-87.215 [0083]

\bulletGREEN y otros. Plant Tissue and Cell Culture. Academic Press, 1987 [0083]

\bulletFREEMAN y otros. Plant Cell Physiol., 1984, vol. 29, 1.353 [0083]

\bulletKINDLE. PNAS U.S.A., 1990, vol. 87, 1.228 [0083]

\bulletOARD. Biotech. Adv., 1991, vol. 9, 1-11 [0083]

\bulletHiei y otros. The Plant Journal, 1994, vol. 6, 271-282 [0085]

\bullet Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. VASIL y otros. Laboratory Procedures and Their Applications. Academic Press, 1989, vol. I, II, I [0089]

\bulletWEISSBACH; WEISSBACH. Methods for Plant Molecular Biology. Academic Press, 1989 [0089]

\bulletSHIMAMOTO, K. Current Opinion in Biotechnology. 1994, vol. 5, 158-162 [0090]

\bulletVASIL y otros. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 667-674 [0090]

\bulletVAIN y otros. Biotechnology Advances, 1995, vol. 13 (4), 653-671 [0090]

\bulletVASIL. Nature Biotechnology, vol. 14, 702 [0090]

\bulletJONES JDG; SHLUMMOKOV L; CARLAND F; ENGLISH J; SCOFIELD SR; BISHOP GJ; HARRISON K. Effective vectors for transformation, expressionof heterologous genes, and assaying transposon excision in transgenic plants. Transgenic Research, 1992, vol. 1, 285-297 [0093]

\bulletSCHENA M; LLOYD AM; DAVIS RW. A steroid-inducible gene expression system for plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991, vol. 88 (23), 10.421-10.425 [0093]

\bulletSIMON R; IGENO MI; COUPLAND G. Activation of floral meristem identity genes in Arabidopsis. Nature, 1996, vol. 384 (6604), 59-62 [0093]

\bulletHOEKEMA A; HIRSCH PR; HOOYKAAS PJJ; SCHILPEROOT A. A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature, 1993, vol. 303, 179-180 [0093]

\bulletSMITH y otros. Nature, 1988, vol. 334, 724-726 [0101]

\bulletZHANG y otros. The Plant Cell, 1992, vol. 4, 1.575-1.588 [0101] [0102]

\bulletENGLISH y otros. The Plant Cell, 1996, vol. 8, 179-188 [0101]

\bulletBOURQUE. Plant Science, 1995, vol. 105, 125-149 [0101]

\bulletFLAVELL. PNAS USA, 1994, vol. 91, 3.490-3.496 [0101]

\bullet VAN DER KROL y otros. The Plant Cell, 1990, vol. 2, 291-299 [0102]

\bulletNAPOLI y otros. The Plant Cell, 1990, vol. 2, 279-289 [0102]

\bulletANGELL; BAULCOMBE. The EMBO Journal, 1997, vol. 16 (12), 3.675-3.684 [0102]

\bulletVOINNET; BAULCOMBE. Nature, 1997, vol. 389, 553 [0102]

\bulletJAEGER. The new world of ribozymes. Curr Opin Struct Biol, 1997, vol. 7, 324-335 [0103]

\bulletGIBSON; SHILLITOE. Ribozymes: their functions and strategies form their use. Mol Biotechnol, 1997, vol. 7, 242-251 [0103]

\bulletARMITAGE y otros. Nature, 1992, vol. 357, 80-82 [0117]

\bulletABE, H.; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K.; URAO, T.; IWASAKI, T.; HOSOKAWA, D.; SHINOZAKI, K. Role of arabidopsis MYC and MYB homologs in drought- and abscisic acid-regulated gene expression. Plant Cell, 1997, vol. 9, 1.859-68 [0180]

\newpage

\bulletABEL, S.; OELLER, P. W.; THEOLOGIS, A. Early auxin-induced genes encode short-lived nuclear proteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, vol. 91, 326-30 [0180]

\bulletBAKER, S. S.; WILHELM, K. S; THOMASHOW, M. F. The 5'-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-, droughtand ABA-regulated gene expression. Plant Mol Biol, 1994, vol. 24, 701-13 [0180]

\bulletBARNES, J. A.; GOMES, A. V. PEST sequences in calmodulin-binding proteins. Mol Cell Biochem, 1995, 149-15017-27 [0180]

\bulletBECKER, D.; BRETTSCHNEIDER, R.; LORZ, H. Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. Plant J, 1994, vol. 5, 299-307 [0180]

\bulletBELL, C. J.; ECKER, J. R. Assignment of 30 Microsatellite Loci to the Linkage Map of Arabidopsis. Genomics, 1994, vol. 19, 137-144 [0180]

\bulletBENT, E.; JOHNSON, S.; BANCROFT, I. BAC representation of two low-copy regions of the genome of Arabidopsis thaliana. Plant J, 1998, vol. 13, 849-55 [0180]

\bulletCAMILLERI, C.; LAFLEURIEL, J.; MACADRE, C.; VAROQUAUX, F.; PARMENTIER, Y.; PICARD, G.; CABOCHE, M.; BOUCHEZ, D. A YAC contig map of Arabidopsis thaliana chromosome 3. Plant J, 1998, vol. 14, 633-42 [0180]

\bulletCHANDLER, J.; WILSON, A.; DEAN, C. Arabidopsis mutants showing an altered response to vernalization. Plant Journal, 1996, vol. 10, 637-644 [0180]

\bulletCHANG, C.; BOWMAN, J. L.; DEJOHN, A. W.; LANDER, E. S.; MEYEROWITZ, E. M. Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A, 1988, vol. 85, 6856-60 [0180]

\bulletCHEVAILLIER, P. Pest sequences in nuclear proteins. Int J Biochem, 1993, vol. 25, 479-82 [0180]

\bulletCLASSON, M.; WENNBORG, A.; HENRIKSSON, M.; KLEIN, G. Analysis of c-Myc domains involved in stimulating SV40 replication. Gene, 1993, vol. 133, 153-61 [0180]

\bulletCOOPER, K. F.; MALLORY, M. J.; SMITH, J. B.; STRICH, R. Stress and developmental regulation of the yeast C-type cyclin Ume3p (Srb11p/Ssn8p. Embo J, 1997, vol. 16, 4.665-75 [0180]

\bulletFROHMAN, M. A.; DUSH, M. K.; MARTIN, G. R. Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc Natl Acad Sci U S A, 1988, vol. 85, 8.998-9.002 [0180]

\bulletGILMOUR, S. J.; THOMASHOW, M. F. Cold-acclimation and cold-regulated gene-expression in ABA mutants of Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, 1991, vol. 17, 1.233-1.240 [0180]

\bulletGIRAUDAT, J.; HAUGE, B. M.; VALON, C.; SMALLE, J.; PARCY, F.; GOODMAN, H. M. Isolation of the Arabidopsis thaliana ABI3 (Abscisic acid-insensitive) gene by positional cloning. The Plant Cell, 1992, vol. 4, 1.251-1.261 [0180]

\bulletGOLDSBROUGH, A. P.; ALBRECHT, H.; STRATFORD, R. Salicylic acid-inducible binding of a tobacco nuclear protein to a 10 bp sequence which is highly conserved amongst stress-inducible genes. Plant J, 1993, vol. 3, 563-71 [0180]

\bulletGOMES, A. V.; BARNES, J. A. Protein phosphatases are pest containing proteins. Biochem Mol Biol Int, 1997, vol. 41, 65-73 [0180]

\bulletGUILFOYLE, T. J.; ULMASOV, T.; HAGEN, G. The ARF family of transcription factors and their role in plant hormone-responsive transcription. Cell Mol Life Sci, 1998, vol. 54, 619-27 [0180]

\bulletHOEKEMA, A.; HIRSCH, P. R.; HOOYKAAS, P. J. J.; SCHILPEROORT, R. A. A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature, 1983, vol. 303, 179-180 [0180]

\bulletHOOYKAAS, P. J. Transformation of plant cells via Agrobacterium. Plant Mol Biol, 1989, vol. 13, 327-36 [0180]

\bulletJIANG, C.; IU, B.; SINGH, J. Requirement of a CCGAC cis-acting element for cold induction of the BN115 gene from winter Brassica napus. Plant Mol Biol, 1996, vol. 30, 679-84 [0180]

\bulletKAGAYA, Y.; OHMIYA, K.; HATTORI, T. RAV1, a novel DNA-binding protein, binds to bipartite recognition sequence through two distinct DNA-binding domains uniquely found in higher plants. Nucleic Acids Res, 1999, vol. 27, 470-8 [0180]

\bulletKERKHOFF, E.; BISTER, K. Myc protein structure: localization of DNA-binding and protein dimerization domains. Oncogene, 1991, vol. 6, 93-102 [0180]

\bulletKIM, J.; HARTER, K.; THEOLOGIS, A. Protein-protein interactions among the Aux/IAA proteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, vol. 94, 11.786-91 [0180]

\bulletKOEPP, D. M.; HARPER, J. W.; ELLEDGE, S. J. How the cyclin became a cyclin: regulated proteolysis in the cell cycle. Cell, 1999, vol. 97, 431-4 [0180]

\bulletLANEY, J. D.; HOCHSTRASSER, M. Substrate targeting in the ubiquitin system. Cell, 1999, vol. 97, 427-30 [0180]

\bulletLIU, Y. G.; MITSUKAWA, N.; LISTER, C.; DEAN, C.; WHITTIER, R. F. Isolation and mapping of a new set of 129 RFLP markers in Arabidopsis thaliana using recombinant inbred lines. Plant J, 1996, vol. 10, 733-6 [0180]

\bulletLIU, Z. P.; GALINDO, R. L.; WASSERMAN, S. A. A role for CKII phosphorylation of the cactus PEST domain in dorsoventral patterning of the Drosophila embryo. Genes Dev, 1997, vol. 11, 3.413-22 [0180]

\bulletLOAKE, G. J.; FAKTOR, O.; LAMB, C. J.; DIXON, R. A. Combination of H-box [CCTACC(N)7CT] and G-box (CACGTG) cis elements is necessary for feed-forward stimulation of a chalcone synthase promoter by the phenylpropanoid-pathway intermediate p-coumaric acid. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, vol. 89, 9230-4 [0180]

\bulletLUERSSEN, H.; KIRIK, V.; HERRMANN, P.; MISERA, S. FUSCA3 encodes a protein with a conserved VP1/AB13-like B3 domain which is of functional importance for the regulation of seed maturation in Arabidopsis thaliana. Plant J, 1998, vol. 15, 755-64 [0180]

\bulletMACKNIGHT, R.; BANCROFT, I.; PAGE, T.; LISTER, C.; SCHMIDT, R.; LOVE, K.; WESTPHAL, L.; MURPHY, G.; SHERSON, S.; COBBETT, C. FCA, a gene controlling flowering time in Arabidopsis, encodes a protein containing RNA-binding domains. Cell, 1997, vol. 89, 737-745 [0180]

\bulletMANNERVIK, M.; NIBU, Y.; ZHANG, H.; LEVINE, M. Transcriptional coregulators in development. Science, 1999, vol. 284, 606-9 [0180]

\bulletMARCHAL, C.; HAGUENAUER-TSAPIS, R.; URBAN-GRIMAL, D. A PEST-like sequence mediates phos-
phorylation and efficient ubiquitination of yeast uracil permease. Mol Cell Biol, 1998, vol. 18, 314-21 [0180]

\bulletMAULE, J. Physical mapping by pulsed-field gel electrophoresis. Methods Mol Biol, 1997, vol. 68, 93-121 [0180]

\bulletMCCARTY, D. R.; HATTORI, T.; CARSON, C. B.; VASIL, V.; LAZAR, M.; VASIL, I. K. The Viviparous-1 developmental gene of maize encodes a novel transcriptional activator. Cell, 1991, vol. 66, 895-905 [0180]

\bulletMCKINSEY, T. A.; CHU, Z. L.; BALLARD, D. W. Phosphorylation of the PEST domain of IkappaBbeta regulates the function of NF-kappaB/IkappaBbeta complexes. J Biol Chem, 1997, vol. 272, 22.377-80 [0180]

\bulletMHIRI, C.; MOREL, J. B.; VERNHETTES, S.; CASACUBERTA, J. M.; LUCAS, H.; GRANDBASTIEN, M. A. The promoter of the tobacco Tnt1 retrotransposon is induced by wounding and by abiotic stress. Plant Mol Biol, 1997, vol. 33, 257-66 [0180]

\bulletMOZO, T.; FISCHER, S.; SHIZUYA, H.; ALTMANN, T. Construction and characterization of the IGF Arabidopsis BAC library. Mol Gen Genet, 1998, vol. 258, 562-70 [0180]

\bulletNORDIN, K.; VAHALA, T.; PALVA, E. T. Differential expression of two related, low-temperature-induced genes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Mol Biol, 1993, vol. 21, 641-53 [0180]

\bulletRECHSTEINER, M.; ROGERS, S. W. PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci, 1996, vol. 21, 267-71 [0180]

\bulletROGERS, S.; WELLS, R.; RECHSTEINER, M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science, 1986, vol. 234, 364-8 [0180]

\bulletSCHMIDT, E. V. The role of c-myc in cellular growth control. Oncogene, 1999, vol. 18, 2988-96 [0180]

\newpage

\bulletSCHMIDT, R.; DEAN, C. Hybridization analysis of YAC clones. Methods. Mol. & Cell. Biol., 1995, vol. 5, 309-318 [0180]

\bulletSTEGER, D. J.; UTLEY, R. T.; GRANT, P. A.; JOHN, S.; EBERHARTER, A.; COTE, J.; OWEN-HU- GHES, T.; IKEDA, K.; WORKMAN, J. L. Regulation of transcription by multisubunit complexes that alter nucleosome structure. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1998, vol. 63, 483-91 [0180]

\bulletSTOCKINGER, E. J.; GILMOUR, S. J.; THOMASHOW, M. F. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, vol. 94, 1.035-40 [0180]

\bulletSTONE, J.; DE LANGE, T.; RAMSAY, G.; JAKOBOVITS, E.; BISHOP, J. M.; VARMUS, H.; LEE, W. Definition of regions in human c-myc that are involved in transformation and nuclear localization. Mol Cell Biol, 1987, vol. 7, 1.697-709 [0180]

\bulletSUZUKI, M.; KAO, C. Y.; MCCARTY, D. R. The conserved B3 domain of VIVIPAROUS1 has a cooperative DNA binding activity. Plant Cell, 1997, vol. 9, 799-807 [0180]

\bulletArabidopsis thaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance. THOMASHOW, M. F. In Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, 807-834 [0180]

\bulletTORCHIA, J.; GLASS, C.; ROSENFELD, M. G. Co-activators and co-repressors in the integration of transcriptional responses. Curr Opin Cell Biol, 1998, vol. 10, 373-83 [0180]

\bulletULMASOV, T.; HAGEN, G.; GUILFOYLE, T. J. ARF1, a transcription factor that binds to auxin response elements. Science, 1997, vol. 276, 1.865-8 [0180]

\bulletURAO, T.; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K.; URAO, S.; SHINOZAKI, K. An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence. Plant Cell, 1993, vol. 5, 1.529-39 [0180]

\bulletVIERSTRA, R. D. Proteolysis in plants: mechanisms and functions. Plant Mol Biol, 1996, vol. 32, 275-302 [0180]

\bulletYAGLOM, J. A.; GOLDBERG, A. L.; FINLEY, D.; SHERMAN, M. Y. The molecular chaperone Ydj1 is required for the p34CDC28-dependent phosphorylation of the cyclin Cln3 that signals its degradation. Mol Cell Biol, 1996, vol. 16, 3679-84 [0180]

Claims (32)

1. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos VRN1 que codifica un polipéptido que es capaz de alterar específicamente la respuesta a la vernalización de un vegetal en el que se ha introducido y expresado el ácido nucleico,

en el que la secuencia de nucleótidos VRN1:

(i) codifica el polipéptido VRN1 de la figura 7, o

(ii) codifica una variante del polipéptido que comparte por lo menos un 70% de identidad con el polipéptido que se muestra en la figura 7.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos codifica una variante del polipéptido que comparte por lo menos un 80% de identidad con el polipéptido que se muestra en la figura 7.

3. Ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 2 ,en el que la secuencia de nucleótidos VRN1 codifica una variante del polipéptido que comparte por lo menos un 90% de identidad con el polipéptido que se muestra en la figura 7.

4. Ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos VRN1 es la que se muestra en la figura 7 de nucleótidos 269-1.295 inclusive, o una secuencia que es degenerativamente equivalente a la misma.

5. Ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos VRN1 se muestra en el Anexo I.

6. Ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos VRN1 es la secuencia RTV1 que se muestra en la figura 8.

7. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la secuencia de nucleótidos VRN1 de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

8. Ácido nucleico que se utiliza como sonda o cebador, siendo dicho ácido nucleico una secuencia distintiva de por lo menos aproximadamente 16-24 nucleótidos de longitud, cuya secuencia se halla en el Anexo I, o una secuencia que es degenerativamente equivalente a la misma, o el complemento de cualquiera, cuyo ácido nucleico se selecciona de los oligonucleótidos (que se muestran posteriormente en la orientación 5' a 3'):

15

150

9. Proceso para producir un ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 5, que comprende la etapa de modificar un ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 3 o en la reivindicación 4.

10. Procedimiento para identificar o clonar un ácido nucleico que codifica una variante del polipéptido que comparte por lo menos un 70% de identidad con el polipéptido que se muestra en la figura 7, cuyo procedimiento utiliza un ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 8.

11. Procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 10, el cual comprende las siguientes etapas:

\vskip1.000000\baselineskip

(a) proporcionar un preparado de ácido nucleico a partir de una célula vegetal;

(b) proporcionar una molécula de ácido nucleico que es un ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 8,

(c) poner en contacto el ácido nucleico de dicho preparado con dicha molécula de ácido nucleico en condiciones para la hibridación, y,

(d) identificar el ácido nucleico en dicho preparo que se hibrida con dicha molécula de ácido nucleico.

\vskip1.000000\baselineskip

12. Procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 10, el cual comprende las siguientes etapas:

\vskip1.000000\baselineskip

(a) proporcionar un preparado de ácido nucleico a partir de una célula vegetal;

(b) proporcionar una pareja de cebadores de molécula de ácido nucleico apropiados para PCR, siendo por lo menos uno de dichos cebadores un ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 8.

(c) poner en contacto el ácido nucleico de dicho preparado con dichos cebadores en condiciones para la realización de la PCR,

(d) realizar la PCR y determinar la presencia o ausencia de un producto PCR amplificado.

\vskip1.000000\baselineskip

13. Procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 12, en el que el preparado de ácido nucleico se obtiene de una brasicácea.

14. Vector recombinante que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

15. Vector tal como se reivindica en la reivindicación 14, en el que el ácido nucleico se halla unido operativamente a un promotor para la transcripción en una célula huésped, en el que el promotor es optativamente un promotor inducible.

16. Vector tal como se reivindica en la reivindicación 14 o la reivindicación 15 que es un vector vegetal.

17. Procedimiento para transformar una célula huésped, que comprende la etapa de introducir el vector de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en una célula huésped, y que optativamente causa o permite la recombinación entre el vector y el genoma de la célula huésped de manera que transforma la célula huésped.

18. Célula huésped que contiene un vector heterólogo, o que ha sido transformada por éste, de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

19. Procedimiento para producir un vegetal transgénico, el cual comprende las siguientes etapas:

(a) realizar un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 17 en el que la célula huésped es una célula vegetal,

(b) regenerar un vegetal a partir de una célula vegetal transformada.

\vskip1.000000\baselineskip

20. Vegetal transgénico que puede obtenerse mediante el procedimiento de la reivindicación 19, o el cual es un clon, o progenie pura o híbrida u otro descendiente de dicho vegetal transgénico, que en cada caso incluye un ácido nucleico heterólogo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

21. Vegetal tal como se reivindica en la reivindicación 20, que se selecciona de la lista que consiste en: arroz; maíz; trigo; cebada; avena; centeno; colza; remolacha azucarera; maíz; girasol; soja; sorgo; lechuga; endibia; col; brécol; coliflor; claveles; geranios.

22. Parte o propágulo de un vegetal tal como se reivindica en la reivindicación 20 o en la reivindicación 21, la cual en cada caso incluye un ácido nucleico heterólogo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

23. Polipéptido aislado que es codificado por la secuencia de nucleótidos VRN1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

24. Polipéptido tal como se reivindica en la reivindicación 23 que es el polipéptido de resistencia VRN1 que se muestra en la figura 4.

25. Procedimiento para producir el polipéptido de la reivindicación 23 o la reivindicación 24, el cual comprende la etapa de provocar o permitir la expresión de un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en una célula huésped adecuada.

26. Polipéptido que comprende el sitio de unión a antígenos de un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica para el polipéptido de la reivindicación 24.

27. Procedimiento para evaluar el fenotipo de vernalización de un vegetal, el procedimiento que comprende la etapa de determinar la presencia y/o identidad de un alelo de VRN1 en el mismo que comprende el uso de un ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 8.

28. Procedimiento para influir o afectar en el fenotipo de vernalización de un vegetal, el cual comprende la etapa de provocar o permitir la expresión de un ácido nucleico heterólogo tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en las células del vegetal, tras una etapa anterior de introducir el ácido nucleico en una célula del vegetal o en un progenitor de la misma.

29. Procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 28 para modificar la cinética y/o la temperatura óptima de la respuesta a la vernalización, de manera que se altera el fenotipo del vegetal con respecto a cualquiera o más de uno de los siguientes parámetros: intervalo geográfico; longitud del período de vernalización; longitud de la fase de crecimiento vegetativo.

30. Procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 28 o en la reivindicación 29, para reducir el requisito de vernalización de un vegetal, en el que el ácido nucleico heterólogo es el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

31. Procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 28 o en la reivindicación 29, para aumentar el requisito de vernalización de un vegetal, el cual comprende cualquiera de las siguientes etapas:

(i) provocar o permitir la transcripción de un ácido nucleico tal como se reivindica en la reivindicación 7 en el vegetal de manera que se reduce la expresión de VRN1 mediante un mecanismo no codificante;

(ii) provocar o permitir la transcripción de un ácido nucleico tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de una parte del mismo de manera que se reduce la expresión de VRN1 mediante cosupresión;

(iii) uso de un ácido nucleico que codifica una ribozima específica de un ácido nucleico tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

\vskip1.000000\baselineskip

32. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende el promotor del gen VRN1, en el que la secuencia del promotor es tal como se muestra en el Anexo I dentro de la región de nucleótidos 1 a 1.879.