ES2260770T3 - Control genetico de la floracion. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN GENES FCA DE ARABIDOPSIS THALIANA Y BRASSICA NAPUS QUE PERMITEN VARIAR LAS CARACTERISTICAS DE LA FLORACION, EN PARTICULAR EL MOMENTO DE LA FLORACION, DE PLANTAS TRANSGENICAS. EL MOMENTO DE LA FLORACION SE PUEDE RETRASAR O ADELANTAR UTILIZANDO FORMAS DE EXPRESION DE SENTIDO Y ANTISENTIDO, ASI COMO VARIOS MUTANTES Y ALELOS, INCLUIDAS LAS FORMAS UNIDAS ALTERNATIVAMENTE.

Description

Control genético de la floración.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al control genético de la floración en plantas y a la clonación y expresión de genes implicados en la misma. Más particularmente, la invención se refiere a la clonación y a la expresión del gen FCA de Arabidopsis thaliana, y a homólogos de otras especies, y a la manipulación y utilización de estos genes en plantas.

La floración eficiente en las plantas es importante, particularmente cuando el producto deseado es la flor o la semilla producida a partir de la misma. Un aspecto de esto es el tiempo de la floración, avanzar o retrasar el inicio de la floración puede resultar útil para granjeros y productores de semillas. Una comprensión de los mecanismos genéticos que influyen sobre la floración proporciona un medio para alterar las características de floración de la planta objetivo. Las especies para las que la floración resulta importante para la producción del cultivo son numerosas, esencialmente todos los cultivos que se desarrollan a partir de semilla, siendo ejemplos importantes los cereales, el arroz y el maíz, probablemente los más importantes agronómicamente en las zonas climáticas más cálidas, y el trigo, la cebada, la avena y el centeno en climas más templados. Son productos importantes de semilla el aceite de colza, el azúcar de remolacha, el maíz, el girasol, la soja y el sorgo. Muchos cultivos que se cosechan por sus raíces evidentemente se desarrollan anualmente a partir de semillas y la producción de semillas de cualquier tipo depende mucho de la capacidad de la planta para florecer, de resultar polinizada y de producir semillas. En horticultura, el control del tiempo de la floración resulta importante. Entre las plantas de horticultura cuya floración puede controlarse se incluyen la lechuga, la endibia y las brásicas vegetales, incluyendo la col, el brócoli y la coliflor, y los claveles y los geranios.

Arabidopsis thaliana es una planta facultativa de días largos, que florece pronto bajo días largos y tarde bajo días cortos. Debido a que presenta un genoma pequeño y bien caracterizado, resulta relativamente fácil de transformar y de regenerar, y presenta un ciclo de crecimiento rápido, Arabidopsis es una planta modelo ideal en la que estudiar la floración y su control.

Uno de los genes requeridos para la rápida inducción floral es el gen FCA (Koornneef et al. 1991). Las plantas que portan mutaciones de este gen florecen mucho más tarde que las de tipo salvaje bajo fotoperiodos largos y bajo fotoperiodos cortos. Existe un rango considerable de tiempos de floración en los diferentes alelos mutantes de fca. El más extremo (fca-1) florece bajo fotoperiodos largos con un máximo de 40 hojas, mientras que fca-3, fca-4 florecen con 20 hojas en la roseta, en comparación con las 9 del tipo salvaje de Landsberg erecta. La floración tardía de todos los mutantes de fca puede superarse y dar lugar a floración temprana tanto bajo fotoperiodos largos como cortos si las semillas embebidas, o las plantas de diferentes edades de desarrollo, se someten a un periodo de entre 3 y 8 semanas a 4ºC, un tratamiento de vernalización (Chandler y Dean 1994).

Los presentes inventores clonaron y secuenciaron el gen FCA de Arabidopsis thaliana, un homólogo de Brassica y secuencias mutantes.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con función FCA. Los expertos en la materia entenderán que la "función FCA" se refiere a la capacidad de influir sobre el tiempo de floración fenotípicamente de la misma manera que el gen FCA de Arabidopsis thaliana, especialmente la capacidad de complementar una mutación fca en Arabidopsis thaliana.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden codificar un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 2, o un alelo, variante, derivado o mutante del mismo que presenta por lo menos aproximadamente el 75% de identidad global de secuencia con la secuencia de la Figura 2. Entre las variantes particulares se incluyen aquéllas en las que no se incluyen los residuos aminoácidos corriente arriba de la tercera metionina y/o los residuos corriente arriba de la segunda metionina en la secuencia de aminoácidos de la Figura 2.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden presentar la secuencia de un gen FCA de Arabidopsis thaliana, o ser un mutante, variante (o derivado) o alelo de la secuencia proporcionada, de acuerdo con las presentes reivindicaciones. Entre los mutantes, variantes y alelos preferentes se encuentran aquéllos que codifican una proteína que conserva una característica funcional de la proteína codificada por el gen de tipo salvaje, especialmente la capacidad de estimular la floración, tal y como se describe en la presente memoria. La estimulación de la floración puede avanzar, apresurar o acelerar la floración. Otros mutantes, variantes y alelos preferentes codifican una proteína que retrasa la floración en comparación con el tipo salvaje o un gen con la secuencia proporcionada. Los cambios de una secuencia para producir un mutante o una variante pueden realizarse mediante uno o más de entre inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en el ácido nucleico, que conducen a la inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos. Evidentemente se incluyen los cambios de ácidos nucleicos que no varían la secuencia de aminoácidos codificada. Las variantes, mutantes, alelos y variantes particulares se describen adicionalmente a continuación.

En la Figura 1, se muestra una secuencia preferente de ácidos nucleicos que abarca la región que codifica el gen FCA, y en la Figura 2 se muestra la secuencia de aminoácidos predicha que codifica el ORP de FCA. Los ácidos nucleicos pueden alterarse por medio de la sustitución de nucleótidos y/o de una combinación de adición, inserción y/o sustitución de uno o más nucleótidos con o sin alterar la secuencia codificada de aminoácidos (en virtud de la degeneración del código genético).

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender un intrón, tal como un intrón mostrado en la Figura 1, por ejemplo el intrón 3 (tal y como en diversas realizaciones, por ejemplo, tal y como se ilustra en la presente memoria), se altere o no la secuencia de aminoácidos codificada. Por ejemplo, la variante \alpha_{B} de FCA, cuya secuencia de ácidos nucleicos se muestra en la Figura 3, comprende el intrón 3 de la secuencia de la Figura 1, de manera que la traducción de la secuencia da lugar a una secuencia de aminoácidos diferente de la de la Figura 2 (el intrón 3 de la Figura 1 contiene un codón de parada en la posición 3026-3028 que potencialmente se utiliza en transcritos).

La presente invención también proporciona un vector que comprende ácidos nucleicos con cualquiera de las secuencias proporcionadas, preferentemente un vector a partir del cual puede expresarse el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos. El vector preferentemente resulta adecuado para la transformación en una célula vegetal. La invención abarca además una célula huésped transformada con dicho vector, especialmente una célula vegetal. De esta manera, se proporciona una célula huésped, tal como una célula vegetal, que comprende ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Dentro de la célula, los ácidos nucleicos pueden incorporarse dentro del cromosoma. Puede existir más de una secuencia de nucleótidos heteróloga por genoma haploide. Esto, por ejemplo, permite un incremento de la expresión del producto génico en comparación con los niveles endógenos, tal y como se describe posteriormente.

Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no necesita incluir un promotor, particularmente si el vector se utiliza para introducir el ácido nucleico en células para la recombinación en el genoma.

Las moléculas y vectores de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden proporcionarse aisladas y/o purificadas a partir de su ambiente natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o libres o sustancialmente libres de ácidos nucleicos o genes de las especies de interés o de origen diferente del de la secuencia que codifica un polipéptido capaz de influir sobre la floración, por ejemplo, en ácidos nucleicos de Arabidopsis thaliana, un ácido nucleico diferente de la secuencia FCA. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender ADNc, ARN, ADN genómico y pueden ser total o parcialmente sintético. El término "aislado" puede abarcar todas estas posibilidades.

La presente invención también abarca el producto de expresión de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas y los procedimientos de preparación del producto de expresión mediante la expresión a partir de ácidos nucleicos codificantes, por lo tanto bajo condiciones adecuadas en células huésped adecuadas, por ejemplo E. coli (ver el Ejemplo 7). Los expertos en la materia son perfectamente capaces de construir vectores y de diseñar protocolos para la expresión y recuperación de productos de expresión génica recombinante. Pueden seleccionarse o construirse vectores adecuados, que contienen una o más secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según resulte apropiado. Para más detalles ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a Edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los procedimientos de transformación dependen del huésped utilizado, pero son bien conocidos. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo para la preparación de constructos de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y el análisis de proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, 2a edición, Ausubel et al., editores, John Wiley e Hijos, 1992.

La proteína PCA purificada, o un fragmento, mutante o variante de la misma, por ejemplo producida recombinantemente mediante la expresión a partir del ácido nucleico codificante del mismo, puede utilizarse para cultivar anticuerpos utilizando técnicas que son estándar en la técnica, tal y como se ejemplifica en el Ejemplo 7. Los anticuerpos y polipéptidos que comprenden fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno pueden utilizarse para identificar homólogos de otras especies, tal y como se describe adicionalmente a continuación.

La presente invención abarca además una planta que comprende una célula vegetal que comprende ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, como resultado de la introducción del ácido nucleico en la célula o en un ancestro del mismo, y progenie autofecundada o híbrida y cualquier descendiente de dicha planta, también cualquier parte o propágulo de la progenie o descendientes de dicha planta, incluyendo las semillas.

El gen FCA codifica una proteína de grandes dimensiones (796 aminoácidos mostrados en la figura 2) con homología con una clase de proteínas identificada como proteínas de unión a ARN (Burd y Dreyfuss 1994). Estas proteínas contienen 80 aminoácidos, motivos de reconocimiento del ARN (RRMs) y presentan una estructura modular, pueden contener varios dominios de unión a ADN y dominios auxiliares ricos en aminoácidos, tales como glicina, glutamina y prolina. Las proteínas RRM pueden dividirse en subfamilias basándose en la homología dentro y alrededor de los dominios RRM. La proteína FCA presenta mayor homología con una subfamilia de proteínas de unión a ARN (clúster 1028.16, identificado utilizando una búsqueda en la base de datos BEAUTY, Worley et al. 1995) ejemplificada por el gen elav de Drosophila (Robinow et al. 1988). Entre otros miembros de esta familia se incluyen la proteína sex-lethal de Drosophila; las proteínas del sistema nervioso humano HuD, HuC, Rel-N1 y Hel-M2; y las proteínas de Xenopus elrA, elrB, elrC, elrD y etr-1. FCA presenta dos dominios de unión a ARN, mientras que la mayoría de los miembros de la familia del gen elav presentan tres dominios de unión a ARN. Los dos primeros dominios de unión a ARN de la familia elav (y el espaciado entre los dominios) es similar a los dominios de unión a ARN en la proteína FCA. Al igual que la proteína FCA, elav presenta una región con elevado contenido de glutamina. También existe una región de 20 aminoácidos cerca del extremo C-terminal de la proteína FCA que muestra una fuerte homología a los ORFs de los dos genes de función desconocida de la levadura y de C. elegans.

El transcrito de FCA se ha sometido alternativamente a corte y empalme. Se generan cinco formas del transcrito en las células. Una, denominada en la presente memoria transcrito \beta de FCA presenta 2 kb y representa la terminación prematura y la poliadenilación dentro del intrón 3. En FCA \alpha_{A} y \alpha_{B} se han extraído 19 de los 20 intrones mediante corte y empalme, pero se conserva el intrón 3 (2 kb). FCA \alpha_{A} es igual a \alpha_{B} excepto en el intrón 13, en el que se utilizan diferentes uniones exón/intrón 5' y 3'. FCA \alpha_{A} utiliza la unión exón/intrón 5' en la posición 7.055 pb (secuencia genómica en la figura 1) y la unión exón/intrón 3' en la posición 7.377 pb. FCA \alpha_{B} utiliza la unión exón/intrón 5' en la posición 7.130 pb (secuencia genómica en la figura 1) y la unión exón/intrón 3' en la posición 7.295 pb. En ambos transcritos de FCA, \gamma_{A} y \gamma_{B}, se ha extraído el intrón 3, y \gamma_{B} utiliza las mismas uniones alrededor del intrón 13 que \alpha_{A} y \alpha_{B}, respectivamente. Únicamente \gamma_{B} codifica ambos dominios de unión a ARN y el dominio C-terminal conservado (Figura 10).

Se ha observado que las proteínas de unión a ARN se encuentran implicadas en varias facetas de la regulación postranscripcional. El motivo RNP forma una superficie de unión a ARN en forma de lámina \beta que atrapa al ARN como una plataforma abierta para la interacción con otras moléculas de ARN o con otras proteínas. Uno de los genes mejor caracterizados que codifican una proteína que contiene motivo RNP es el gen SEX-LETHAL de Drosophila (Bell et al. 1988). La proteína SEX-LETHAL está implicada en la alteración del corte y empalme de sus propios y otros transcritos dentro del mecanismo que determina el sexo en Drosophila. Únicamente el producto de corte y empalme alternativo proporciona una proteína activa. De esta manera, este producto génico es responsable de la determinación y mantenimiento del estado hembra. Se ha demostrado que otras proteínas de unión a ARN funcionan mediante la localización de transcritos específicos en el núcleo o previniendo la traducción de transcritos específicos. Se han descrito seis mutantes fca aislados de manera independiente, y los presentes inventores han identificado los cambios de secuencia que causan una reducción en la actividad de FCA en tres casos. La mutación fca-1 convierte un nucleótido C en la posición 6.861 (Figura 1) en una T. De esta manera, se cambia un codón de glutamina (CAA) por un codón de parada (TAA). La mutación fca-3 convierte un nucleótido G en la posición 5.271 en una A. El efecto de esta mutación es la alteración de la unión de corte y empalme 3' del intrón 7 de manera que se utiliza una nueva unión de corte y empalme 3' situada 28 nucleótidos dentro del exón 8. La mutación fca-4 es el resultado de una reorganización (una inversión que aleja 250 kb el extremo 3' del gen) con el punto de corte en la posición 4.570 (dentro del intrón 4).

La disposición de información de secuencia para el gen FCA de Arabidopsis thaliana permite la obtención de secuencias homólogas de Arabidopsis y de otras especies vegetales. En experimentos de hibridación Southern, una sonda que contiene el gen FCA de Arabidopsis thaliana se hibrida con el ADN extraído de Brassica rapa, de Brassica napus y de Brassica oleraceae. En contraste con la mayoría de los genes de Arabidopeis, que normalmente se encuentran presentes en el genoma de B. napus en 6 copias, el gen FCA se encuentra presente dos veces en únicamente un par de cromosomas. Se ha aislado y secuenciado un homólogo de FCA de Brassica napus y muestra una homología de secuencia media de los nucleótidos del 86,1% dentro de los exones, del 65,8% dentro de los intrones, y una identidad del 78% a nivel aminoácido (similitud del 87%). Este gen de Brassica complementa totalmente una mutación en el gen FCA de Arabidopsis y de esta manera puede considerarse un homólogo totalmente funcional. También se han detectado homólogos mediante análisis de transferencia Southern de Antirrhinum, tabaco, remolacha de azúcar, tomate, guisante, trigo, maíz, arroz, centeno, Lolium y avena.

El homólogo FCA de Brassica cuya secuencia de nucleótidos se proporciona en la Figura 8a, que incluye la secuencia codificante y cuya secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de la Figura 8a se muestra en la Figura 8b, representa y proporciona aspectos adicionales de la presente invención de acuerdo con los dados a conocer para el gen FCA de Arabidopsis. Por ejemplo, se incluyen los mutantes, alelos y variantes, por ejemplo los que presentan por lo menos el 80% de identidad con la secuencia de la Figura 8b, aunque los niveles elevados de identidad de los aminoácidos podrían encontrarse limitados a los dominios o regiones funcionalmente significativos, tal y como se ha descrito anteriormente.

La presente invención también abarca a los ácidos nucleicos que codifican un homólogo de FCA obtenido utilizando una secuencia de nucleótidos derivada de la mostrada en la Figura 1, o la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2. La secuencia de nucleótidos y/o la secuencia de aminoácidos comparten homología con la secuencia codificada por la secuencia de nucleótidos de la Figura 1, por lo menos aproximadamente el 75%, o por lo menos aproximadamente el 78%, o por lo menos aproximadamente el 80% de homología, más preferentemente por lo menos aproximadamente el 90% de homología, con especies diferentes de Arabidopsis thaliana, y el polipéptido codificado comparte un fenotipo con el gen FCA de Arabidopsis thaliana, preferentemente la capacidad de influir sobre el tiempo de la floración. Éstos pueden estimular o retrasar la floración en comparación con FCA de Arabidopsis thaliana, y los mutantes, variantes o alelos pueden estimular o retrasar la floración en comparación con el tipo salvaje. El término "homología" puede utilizarse para referirse a identidad.

La comparación de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos FCA de los genes de Arabidopsis thaliana y de Brassica napus, tal como en la Figura 9, revela dominios y regiones de significado funcional, es decir, con una influencia sobre una característica de floración de una planta, tal como el tiempo de la floración. La mutagénesis por deleción, por ejemplo, puede utilizarse para someter a ensayo la función de una región del polipéptido y su papel o necesidad en la influencia sobre el tiempo de la floración.

La información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente memoria, o cualquier parte de la misma, puede utilizarse en una búsqueda de base de datos para encontrar secuencias homólogas, los productos de expresión de las cuales pueden someterse a ensayo para su capacidad de influir sobre una característica de la floración. Éstas pueden presentar función de FCA o la capacidad de complementar un fenotipo mutante, que es el retraso de la floración, donde puede revertirse el retraso mediante un tratamiento de vernalización.

La vernalización es bien conocida de la técnica y las condiciones apropiadas se encuentran a disposición de los expertos en la materia. Las plantas pueden vernalizarse en el estadio de semilla, inmediatamente después de la siembra. Puede llevarse a cabo durante 8 semanas, en un fotoperiodo de 8 horas (por ejemplo con luz fluorescente, PAR: 9,5 mmoles m^{-2}s^{-1}, proporción R/FR de 3,9) a una temperatura de 5ºC \pm 1ºC.

En las bases de datos públicas de secuencias los presentes inventores recientemente identificaron varias secuencias de clones de ADNc de Arabidopsis obtenidas en programas de secuenciación aleatoria y que compartían homología con FCA tanto dentro de los dominios RRM como en las regiones C-terminales. Las búsquedas BLAST y FASTA de bases de datos identificaron en Arabidopsis 23 etiquetas de secuencia expresadas (ESTs). Estos clones se han obtenido y utilizado en experimentos de hibridación de baja astringencia con diferentes regiones del gen FCA (central y 3'). Ocho clones muestran una buena homología con la parte 3' del gen FCA, dos clones muestran una buena homología con la parte central y un clon muestra una buena homología con ambas (42 A 4, otra proteína de unión a ARN). De manera similar, entre los ADNc de arroz secuenciados aleatoriamente, los presentes inventores identificaron 10 ESTs. Estos se hibridaban con clones genómicos de FCA y clones de ADNc bajo condiciones de baja astringencia. Cinco clones mostraban una buena hibridación con FCA, particularmente C1480.

Mediante la secuenciación de homólogos, el estudio de sus patrones de expresión y el examen del efecto de alteración de su expresión, resulta posible obtener genes que llevan a cabo una función similar a FCA en la regulación del momento de floración.

El nivel elevado de homología entre los genes FCA de Arabidopsis thaliana y de Brassica napus, tal como se da a conocer en la presente memoria, también podría explotarse para identificar homólogos adicionales, por ejemplo utilizando oligonucleótidos (por ejemplo un grupo degenerado) diseñado sobre la base de la conservación de secuencias.

En general, el ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido capaz de complementar un fenotipo mutante que es el retraso de la floración, de manera que el retraso pueda corregirse mediante un tratamiento de vernalización. Además, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que es un mutante o variante de un gen de tipo salvaje que codifica un polipéptido con capacidad para influir sobre el tiempo de la floración, siendo el fenotipo mutante o variante el retraso de la floración, corrigiéndose el tiempo de floración mediante vernalización. Estos se distinguen del gen CO informado por Putterill et al. 1995, Putterill et al. 1993, y del gen LD informado por Lee et al. 1994. El gen LD muestra características similares al gen FCA en el aspecto de que una mutación en el gen proporciona floración tardía que se corrige con un tratamiento de vernalización, pero LD requiere un segundo producto génico para influir sobre el momento de floración en el ecotipo Landsberg erecta de Arabidopsis thaliana (Lee et al. 1994, Koornneef et al. 1994). De esta manera, en muchas especies de plantas, la manipulación del gen LD por sí solo puede no influir sobre el momento de la floración. La acción de FCA es opuesta a la del fitocromo B, en el aspecto de que las mutaciones en PHYB (hy3) proporcionan una floración temprana y la introducción de un gen PHYB intacto en mutantes hy3 restaura el tiempo de floración normal (Wester et al. 1994). LD y CO quedan excluidos del alcance de la presente invención. El gen FCA y los mutantes, variantes y alelos del mismo pueden no complementar una mutación LD. El gen LD y los mutantes, variantes y alelos del mismo pueden no complementar una mutación en FCA.

La secuencia de aminoácidos de FCA es totalmente diferente de aquéllas de CO y de LD.

La acción de FCA también puede distinguirse de la expresión ectópica de identidad de meristemo o de los genes de la caja MADS que alteran el momento de la floración (Weigel y Nilsson 1995, Chung et al. 1994, Mandel y Yanofsky 1995, Mizukama y Ma 1992). Aparte de un fenotipo de floración temprana, la expresión ectópica o la sobreexpresión de la identidad de meristemo o de los genes de la caja MADS produce muchas perturbaciones adicionales en el fenotipo tanto vegetativo como floral de la planta (por ejemplo estatura corta, dominancia apical reducida, flores estériles).

Asimismo, de acuerdo con la invención se proporciona una célula vegetal en la que se ha incorporado en su genoma una secuencia de nucleótidos de la que se han eliminado diferentes intrones. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de dicha célula vegetal que implica la introducción de un vector que comprende la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal y provocar o permitir que se produzca recombinación entre el vector y el genoma de la célula vegetal con el fin de introducir la secuencia de nucleótidos en el genoma.

También se proporcionan las plantas que comprenden una célula vegetal de acuerdo con la invención, junto con cualquier parte o propágulo de la misma, progenie autofecundada o híbrida, y descendientes y cualquier parte o propágulo de los mismos.

La invención proporciona además un procedimiento para influir sobre las características de floración de una planta, que comprende la expresión de una secuencia heteróloga de un gen FCA (o mutante, alelo, variante u homólogo de la misma, tal como se ha comentado anteriormente) dentro de células de la planta. El término "heterólogo" indica que el gen/secuencia de nucleótidos en cuestión se ha introducido en dichas células de la planta o de un ancestro de la misma utilizando ingeniería genética, es decir, mediante intervención humana. El gen puede encontrarse en un vector extragenómico o incorporarse, preferentemente de manera estable, en el genoma. El gen heterólogo puede sustituir un gen equivalente endógeno, es decir, uno que normalmente lleva a cabo la misma función o una función similar en el control de la floración, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endógeno. Una ventaja de la introducción de un gen heterólogo es la capacidad de situar la expresión del gen bajo el control de un promotor seleccionado, con el fin de poder influir sobre la expresión génica, y por lo tanto la floración, según se prefiera. Además, pueden utilizarse mutantes y variantes del gen de tipo salvaje, por ejemplo con actividad superior o inferior a la del tipo salvaje, en lugar del gen endógeno.

La característica de floración principal que puede alterarse utilizando la presente invención es el tiempo de la floración. La infraexpresión del producto génico del gen FCA conduce a un retraso de la floración (tal como indica el fenotipo fca mutante y el Ejemplo 3, experimentos antisentido) que puede superarse para producir floración temprana con un tratamiento de vernalización; la sobreexpresión puede conducir a una floración más temprana (Ejemplos 2, 4 y 5). Este grado de control resulta útil para garantizar la floración síncrona de las líneas parentales macho y hembra en la producción de híbridos, por ejemplo. Otra utilización es avanzar o retrasar la floración de acuerdo con los dictados del clima, de manera que se extienda o se reduzca la estación de crecimiento. Ello puede implicar la utilización de regulación antisentido o de regulación sentido.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, tales como un gen FCA u homólogo, pueden situarse bajo el control de un promotor génico externamente inducible, situando de esta manera el tiempo de la floración bajo el control del usuario. Ello resulta ventajoso en el aspecto de que la producción de flores, y los sucesos posteriores, tales como la producción de semillas, pueden temporizarse para cumplir con las demandas del mercado, por ejemplo, de flores cortadas o de plantas de maceta decorativas con flor. La floración retrasada en plantas de maceta resulta ventajosa para alargar el periodo disponible para el transporte del producto desde el productor hasta el punto de venta, y el alargamiento del periodo de floración resulta una ventaja evidente para el comprador.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un constructo génico que comprende un promotor inducible ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención, tal como el gen FCA o Arabidopsis thaliana, un homólogo de otra especie vegetal, por ejemplo una Brassica, tal como Brassica napus, o cualquier mutante, variante, o alelos de los mismos. Tal como se ha comentado anteriormente, ello permite el control de la expresión del gen. La invención también proporciona plantas transformadas con dicho constructo génico y procedimientos que comprenden la introducción de dicho constructo en una célula vegetal y/o la inducción de la expresión de un constructo dentro de una célula vegetal, mediante la aplicación de un estímulo adecuado, un inductor exógeno efectivo.

El término "inducible" aplicado a un promotor es bien conocido por los expertos en la materia. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible se "activa" o se incrementa en respuesta a la aplicación de un estímulo. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles provocan niveles escasos o indetectables de expresión (o la falta de expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles provocan la expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo. Sea cual sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, se incrementa el nivel de expresión desde cualquier promotor inducible en presencia del estímulo correcto. La situación preferible se produce cuando el nivel de expresión se incrementa al aplicar el estímulo relevante en una cantidad efectiva para alterar una característica fenotípica. De esta manera, puede utilizarse un promotor inducible (o "activable") que provoque un nivel básico de expresión en ausencia del estímulo, nivel que resulta excesivamente bajo para producir un fenotipo deseado (y de hecho puede ser cero). Al aplicar el estímulo, se incrementa la expresión (o se activa) hasta un nivel que resulta en el fenotipo deseado.

Entre los promotores adecuados se incluyen el promotor génico del virus 35S del mosaico de la coliflor (CaMV 35S), que se expresa a nivel elevado en prácticamente todos los tejidos vegetales (Benfey et al. 1990a y 1990b), el promotor meri 5 de la coliflor, que se expresa en el meristemo apical vegetal, así como varias posiciones bien localizadas en el cuerpo de la planta, por ejemplo en el floema interno, los primordios florales, los puntos de ramificación de las raíces y de los brotes (Medford 1992; Medford et al. 1991) y el promotor LEAFY de Arabidopsis thaliana, que se expresa muy pronto en el desarrollo de la flor (Weigel et al. 1992).

Al introducir un constructo génico seleccionado en una célula, deben tenerse en cuenta determinadas consideraciones, bien conocidas por los expertos en la materia. El ácido nucleico a insertar debe ensamblarse dentro de un constructo que contenga elementos reguladores efectivos que controlen la transcripción. Debe disponerse de un procedimiento para transportar el constructo hasta el interior de la célula. Una vez el constructo se encuentra dentro de la membrana celular, puede producirse o no la integración en el material cromosómico endógeno. Finalmente, respecto a las plantas, el tipo celular objetivo debe permitir que las células puedan regenerarse para formar plantas completas.

Las plantas transformadas con el segmento de ADN que contiene la secuencia pueden producirse mediante técnicas estándar que ya son conocidas para la manipulación genéticas de plantas. Puede transformarse ADN en las células vegetales utilizando cualquier tecnología adecuada, tal como un vector plásmido Ti desarmado transportado por Agrobacterium que explote su capacidad natural de transferencia génica (patentes EP A-270355 y EP A-0116718; NAR 12(22):8711-8715, 1984), bombardeo con partículas o microproyectiles (patente US 5.100.792, patentes EP A-444882 y EP A-434616), microinyección (patentes WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966), electroporación (patentes EP 290395 y WO 8706614) u otras formas de incorporación directa del ADN (patentes DE 4.005.152, WO 9.012.096, US 4.684.611). Los expertos en la materia utilizan ampliamente la transformación de Agrobacterium para transformar las especies dicotiledóneas. Aunque se ha informado de que Agrobacterium es capaz de transformar ADN foráneo en algunas especies monocotiledóneas (patente WO 92/14828), resultan preferentes el bombardeo con micropoyectiles, la electroporación y la incorporación directa del ADN cuando Agrobacterium resulta ineficiente o inefectivo. Alternativamente, puede utilizarse una combinación de diferentes técnicas con el fin de incrementar la eficiencia del procedimiento de transformación, por ejemplo el bombardeo con micropartículas recubiertas con Agrobacterium (patente EP A-486234) o el bombardeo con microproyectiles con el fin de inducir lesiones, seguido del cocultivo con Agrobacterium (patente EP A-486233).

La selección particular de una tecnología de transformación quedará determinada por su eficiencia para transformar determinadas especies vegetales, así como por la experiencia y preferencia de la persona que pone en práctica la invención con una metodología particular seleccionada. Resultará evidente al experto en la materia que la selección particular de un sistema de transformación para introducir ácidos nucleicos en células vegetales no resulta esencial ni limitativo de la invención.

En la presente invención, la sobreexpresión puede conseguirse mediante la introducción de la secuencia de nucleótidos en una orientación sentido. De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento para influir sobre una característica de floración de una planta, comprendiendo el procedimiento provocar o permitir la expresión del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención a partir de los ácidos nucleicos que se encuentran dentro de las células de la planta.

La infraexpresión del polipéptido producto génico puede conseguirse utilizando tecnología antisentido o "regulación de sentido".

La utilización de genes antisentido o de secuencias génicas parciales para regular negativamente la expresión génica se encuentra bien establecida en la actualidad. Se sitúa ADN de doble cadena bajo el control de un promotor en una "orientación inversa", de manera que la transcripción de la cadena "antisentido" del ADN proporciona ARN que es complementario al ARNm normal transcrito a partir de la cadena "sentido" del gen objetivo. La secuencia de ARN antisentido complementaria se piensa que seguidamente se une al ARNm para formar un dúplex, inhibiendo la traducción del ARNm endógeno desde el gen objetivo en proteína. Se desconoce todavía si éste es el modo de acción real. Sin embargo, se ha establecido que la técnica funciona. Ver, por ejemplo, Rothstein et al. 1987; Smith et al. 1988; Zhang et al. 1992, English et al. 1996. No resulta necesario utilizar la secuencia completa que corresponde a la secuencia codificante en orientación inversa. Por ejemplo, pueden utilizarse fragmentos de longitud suficiente. Es una cuestión rutinaria para el experto en la materia cribar fragmentos de diversos tamaños y de diversas partes de la secuencia codificante con el fin de optimizar el nivel de inhibición antisentido. Puede resultar ventajoso incluir el codón ATG de metionina de iniciación, y quizás uno o más nucleótidos corriente arriba del codón de iniciación. Un fragmento adecuado puede presentar aproximadamente 14 a 23 nucleótidos, por ejemplo aproximadamente 15, 16 ó 17.

La regulación antisentido misma puede regularse mediante la utilización de un promotor inducible en un constructo apropiado.

De esta manera, la presente invención también proporciona un procedimiento para influir sobre una característica de floración de una planta, comprendiendo el procedimiento provocar o permitir la transcripción antisentido a partir de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención dentro de las células de la planta.

Cuando se insertan en orientación sentido copias adicionales del gen objetivo, es decir, la misma orientación que la del gen objetivo, se produce un abanico de fenotipos, incluyendo individuos en los que se produce sobreexpresión y algunos en los que se produce la infraexpresión de proteína desde el gen objetivo. Cuando el gen insertado únicamente es una parte del gen endógeno, se incrementa el número de individuos infraexpresantes en la población transgénica. El mecanismo por el que se produce la regulación, particularmente la regulación negativa, no se comprende por completo. Sin embargo, también se cita mucho esta técnica en la literatura científica y de patentes, y se utiliza rutinariamente para el control génico. Ver, por ejemplo, van der Krol 1990; Napoli et al. 1990, Zhang et al. 1992.

De esta manera, la presente invención también proporciona un procedimiento para influir sobre una característica de floración de una planta, comprendiendo el procedimiento, provocar o permitir la expresión a partir de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención dentro de células de la planta con el fin de suprimir la actividad de un polipéptido con capacidad para influir sobre una característica de floración. En la presente invención, la actividad del polipéptido preferentemente se suprime como resultado de la infraexpresión dentro de las células vegetales.

Puede utilizarse una versión modificada de FCA para influir sobre una característica de floración de una planta. Por ejemplo, puede utilizarse un mutante identificado en la presente memoria como fca-1, fca-3 o fca-4. Los cambios de secuencia resultantes en estos mutantes y los fenotipos resultantes han sido comentados anteriormente.

Estimulación de la actividad de FCA con el fin de provocar la floración temprana

Las mutaciones que reducen la actividad de FCA provocan la floración tardía tanto bajo condiciones de día largo como de día corto, indicando que FCA se encuentra implicado en la estimulación de la floración de manera constitutiva. Los experimentos con dobles mutantes también indican que puede resultar necesaria la función de FCA tanto corriente arriba como corriente abajo de los productos génicos implicados en la provisión de identidad de meristemo floral-inflorescencia, por ejemplo LEAFY, APETALAI y TERMINAL FLOWER. De esta manera, la función de FCA podría encontrarse implicada en la capacidad del meristemo de responder a los productos génicos de LEAFY, APETALAI y TERMINAL FLOWER.

El transcrito de FCA completamente procesado por corte y empalme se encuentra presente a muy baja abundancia en todas las condiciones analizadas hasta el momento. Aunque la mutación fca es recesiva, las plantas fca transgénicas homocigóticas para un gen FCA de tipo salvaje introducido florecieron ligeramente antes que las plantas que portaban una copia (Ejemplo 2), sugiriendo que bajo algunas condiciones, el nivel del transcrito de FCA resulta limitante para el momento de floración. Ello indica que la floración podría manipularse mediante la utilización de promotores foráneos con el fin de alterar la expresión del gen. Además, la mayoría del transcrito se encuentra presente en una forma que no puede producir proteína activa. De esta manera, el corte y empalme alternativo podría ser un mecanismo específico de control para mantener niveles relativamente bajos de la proteína FCA. La alteración de este patrón de corte y empalme, por ejemplo mediante la introducción de un gen FCA que carece de intrones en plantas, podría proporcionar niveles mucho más elevados de la proteína FCA que, a su vez, proporcionarían la floración acelera-
da.

Inducción de floración temprana bajo condiciones no inductivas o bajo condiciones inductivas

Las plantas Arabidopsis de tipo salvaje florecen extremadamente rápido bajo condiciones inductivas y el gen FCA se expresa previamente a la floración, aunque a nivel reducido. El nivel de producto de FCA puede incrementarse mediante la introducción de una fusión de promotor, por ejemplo CaMV35S o meri 5. Además, la introducción de un gen FCA que carezca de intrones podría incrementar el nivel de proteína FCA y provocar la floración temprana bajo todas las condiciones.

Inhibición de la actividad de FCA con el fin de provocar la floración tardía

Las mutaciones fca provocan la floración tardía en Arabidopsis. Pueden utilizarse enfoques transgénicos para reducir la actividad de FCA y de esta manera retrasar o prevenir la floración en un abanico de especies vegetales. Puede utilizarse una diversidad de estrategias. Por lo tanto, puede superarse esta floración tardía, si se desea, proporcionando a semillas o plantas embebidas de diferentes edades, un tratamiento de vernalización.

Expresión de ARNs sentido o antisentido

En varios casos, se ha reducido la actividad de genes vegetales endógenos mediante la expresión de ARNs antisentido homólogos procedentes de un transgén, tal como se ha comentado anteriormente. De manera similar, la expresión de transcritos sentido procedentes de un transgén podría reducir la actividad de la copia endógena correspondiente del gen, tal como se ha comentado anteriormente. La expresión de un transcrito antisentido a partir del gen FCA se ha demostrado que reduce la actividad del gen endógeno y provoca la floración tardía (Ejemplo 3).

Expresión de versiones modificadas de la proteína FCA

Las proteínas de unión a ARN presentan una estructura modular en la que las secuencias aminoácidas requeridas para la unión a diferentes moléculas de ARN son dominios separados de la proteína (Burd y Dreyfuss 1994). Ello permite la construcción de proteínas de fusión truncadas que muestran únicamente una de las funciones de la proteína de unión a ARN. En el caso de FCA, la modificación del gen in vitro y la expresión de versiones modificadas de la proteína podría conducir a la inhibición dominante de la proteína endógena intacta y de esta manera retrasar la floración. Ello puede conseguirse de diversas maneras, entre ellas las siguientes:

Expresión de una proteína FCA truncada

Algunas proteínas motivo multi-RNP puede unirse a diferentes secuencias de ARN de manera simultánea. Por ejemplo, U1 A se une al ARN nuclear pequeño U1 mediante su primer dominio de unión a ARN y a las secuencias pre-ARNm mediante su segundo dominio, controlando de esta manera el corte y empalme (Burd y Dreyfuss 1994). La expresión de una proteína FCA que presenta únicamente uno de estos motivos RNP puede bloquear dominantemente la acción de FCA, mediante la prevención de la unión de la proteína FCA de tamaño completo. Además, la expresión de una proteína FCA mutante, que no codifica las secuencias C-terminales, podría prevenir la alineación correcta de la unión de la molécula de ARN y por lo tanto nuevamente bloquear la unión del FCA de tipo salvaje.

A continuación, se ilustran aspectos y realizaciones de la presente invención, a título de ejemplo, haciendo referencia a las figuras adjuntas.

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En las Figuras:

La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una realización de la invención, obteniéndose la secuencia de la región genómica que codifica FCA de Arabidopsis thaliana. Los intrones se muestran en minúsculas, los exones en mayúsculas. Características: 1000 (1.118)-inicio de transcripción; \square (1.531-1.534, 1.568-70, 1.601-1.603) -
inicio putativo de traducción ATG; _{\ulcorner}\beta(2.753) - sitio Poli A del transcrito \beta; 1001 (7.056-7.377) - corte y empalme alternativo alrededor del intrón 13; _(8.771-73) - parada de traducción TAA; _{\ulcorner} (9.256) - sitio Poli A. El codón de parada de traducción adicional en la posición 3.026-3.028 dentro del intrón 3.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos predicha derivada de la secuencia de nucleótidos que codifica el ORF de FCA.

La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos del gen FCA \alpha_{A}, incluyendo las secuencias flanqueantes 5' y 3'. La secuencia dentro del ORF es la de uno de los transcritos abundantes, es decir, se han extraído 19 intrones por corte y empalme pero se conserva el intrón 3. Se señala la posición de terminación de los otros transcritos abundantes. Se proporcionan las secuencias de cebador en la Tabla 2. Sitios de restricción SalI -352; HindIII -776; XbaI -1.557; HindIIi -3125; BgIII -3177; ClaI -3.293; BamHI -3.549; HindIII -4.728; SpeI -S003. Otros elementos importantes: cola de poliA -1.293 añadida tras el nucleótido A en el clon de ADNc 77B o en el transcrito de FCA; sitio de corte y empalme 5' del intrón 3 -897; sitio de corte y empalme del intrón 3 -2.973.

La figura 4 compara los motivos RRM de FCA con aquellos de los genes SEX-LETHAL y TRA-2 de Drosophila. También se muestran los aminoácidos C-terminales con homología con las proteínas de levadura y de C. elegans.

La figura 5 muestra el análisis de recombinación para posicionar el gen FCA.

La figura 6 muestra el análisis de complementariedad para localizar el gen FCA.

La figura 7 muestra la complejidad y posición del gen FCA en los cósmidos complementarios.

La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos del homólogo de FCA de Brassica napus y el polipéptido codificado: Figura 8a - secuencia de nucleótidos de FCA de Brassica, incluyendo la secuencia codificante; Figura 8b - secuencia de aminoácidos del polipéptido codificada por la secuencia codificante de la Figura 8a.

La figura 9 muestra una alineación de las secuencias aminoácidas de FCA de Arabidopsis y de Brassica. La línea superior es Arabidopsis; la línea inferior es Brassica.

La figura 10 muestra los diferentes transcritos producidos a partir del marco de lectura abierto del gen FCA; *región conservada en C. elegans y ESTs de levadura; R1, R2: dominios 1 y 2 de unión a ARN.

Ejemplo 1 Clonación y análisis del gen FCA Identificación de una región genómica de 300 kb que incluye el gen FCA de Arabidopsis thaliana

La mutación fca se ha mapado respecto a marcadores visibles en 29 cM en el cromosoma 4. Con el fin de mapar el locus respecto a los marcadores moleculares como punto de partida para la clonación mediante paseo cromosómico, se analizó el patrón de segregación de los marcadores RFLP localizados en la mitad superior del cromosoma 4 en 171 individuos de floración tardía (clase homocigosis recesiva) de la F2 de una cruce entre el mutante de floración tardía fca-1 (en un fondo de Landsberg erecta) y el ecotipo polimórfico Columbia de floración temprana. Este análisis localizó el locus FCA en un intervalo de 5,2 cM entre los marcadores m326 y m226.

Estos marcadores seguidamente se utilizaron como los puntos de partida para el paseo cromosómico. Los clones YAC que contenían estos marcadores RFLP se identificaron mediante experimentos de hibridación de colonias. En los experimentos iniciales, las bibliotecas YAC utilizadas eran las bibliotecas EG, EW y ABI, pero al hacerse disponible una nueva (yUP, mayo de 1992), ésta se incorporó al análisis. Se confirmaron los clones YAC de hibridación positiva mediante análisis de transferencia southern. Se estimaron sus dimensiones mediante PFGE y análisis de transferencia southern y después se generaron sondas de los extremos utilizando PCR inversa o "rescate de extremo izquierdo" para la utilización en experimentos de paseo cromosómico. En la mayoría de casos, cada etapa del paseo se cubrió con dos clones YAC independientes con el fin de evitar falsos ligamientos generados por los clones YAC quiméricos. Estos clones constituían una fracción significativa de las bibliotecas EG, EW y yUP y complicaron la construcción del contig de YAC. El resultado de la generación y análisis de 65 sondas terminales fue un contig de YAC que cubría el intervalo m326-m226 que incluía los 57 clones de YAC.

Se determinaron los polimorfismos entre Landsberg erecta y Columbia para la sonda del extremo izquierdo de EG9D2, para la sonda del extremo derecho del clon YAC yUP13C7, para la sonda del extremo derecho del clon YAC yUP3F7 y para la sonda del extremo derecho del clon YAC EW20B3. El análisis del patrón de segregación de estos marcadores en progenie de recombinantes agrupada con puntos de entrecruzamiento localizados en el intervalo m326-m226 definió la región con el gen FCA como localizada entre los polimorfismos identificados con yUP3F7RE y m226. Este intervalo cubría los dos clones YAC solapantes EW20B3 y ABI10C10.

Con el fin de definir adicionalmente la posición del gen FCA, resultaron necesarias más sondas localizadas dentro de los dos clones YAC solapantes. Ello se consiguió mediante la utilización de sondas de extremos procedentes de los clones YAC ABI3C4, ABI6C3, un fragmento aleatorio Sau3A procedente del clon YAC EW20B3 (W5) y dos cósmidos cAtA2 y g19247. Los mapas de restricción para SmaI, Mlul y PacI se construyeron y se utilizaron para localizar las sondas dentro de los clones YAC.

Se generaron recombinantes adicionales, en los que el punto de entrecruzamiento se localizada cerca del locus de FCA, mediante la selección de plantas individuales que eran resistentes a la arabinosa y presentaban una floración temprana/intermedia de la generación F2 de un cruce entre fca (en Landsberg erecta) y aral (en Columbia). Se comprobó la progenie de estos con el fin de confirmar que eran homocigóticos para el alelo de resistencia a la arabinosa y heterocigóticos para la mutación fca. Tres de estos individuos (A2/7, A1/8 y A4/7) se analizaron con los marcadores RFLP denominados 3F7RE, W5, cAtA2, 19247, 3C4LE, 6C3LE y 226. Ello definió el extremo norte de la región genómica en la que se localizaba el gen FCA como dentro de los cósmidos cAtA2 y 19247. Esta información se resume en la Fig. 5.

Análisis de complementariedad para definir el gen FCA

Los dos clones YAC denominados EW20B3 y ABI10C10 se purificaron en gel y se hibridaron con filtros que portaban clones del cósmido 25500 que contenía 15 a 20 kb de ADN genómico de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta. Esta biblioteca de cósmidos se construyó en un nuevo vector (04541) mediante clonación de un fragmento BgIII de 1,6 kb procedente de pHC79 que portaba el fragmento lambda cos en el vector pSLJ1711. El vehículo cósmido altamente estable de clonación portaba secuencias límite de Agrobacterium para la transferencia de ADN en los cromosomas vegetales, un marcador seleccionable vegetal 35S-NPTII, secuencias lacz-laci para la selección de la inserción blue/white en E. coli y un polilínker con 7 sitios de clonación.

Se analizaron las colonias de hibridación positiva mediante la hibridación de cada clon con membranas southern que portaban todos los clones de cósmido digeridos con HindIII, EcoRI y BamHI. Ello generó un mapa de restricción para la inserción de cada cósmido e indicó qué clones portaban las inserciones solapantes. Los cósmidos también se corrieron al lado de ADN vegetal y se hibridaron con el cósmido con el fin de confirmar que la inserción de cósmido era colineal con el ADN vegetal. Los dos clones de cósmido, cAtA2 y cAtB1, localizados en este intervalo, se aislaron a partir de una biblioteca de cósmidos diferente (Olszewski y Ausubel 1988). El resultado de este análisis fue un contig de cósmido que cubría el intervalo de 300 kb en el que se había definido el locus de FCA.

Se encontraban disponibles seis alelos mutantes fca, dos de los cuales se habían generado mediante radiación FN y uno mediante irradiación de rayos X. Las mutaciones inducidas por irradiación frecuentemente se asocian a reorganizaciones o deleciones genómicas. Para comprobar si ello podía refinar adicionalmente la localización del gen FCA, en los seis alelos se examinó la región genómica cubierta por los clones YAC denominados EW20B3 y ABI10C10. Los dos clones YAC se hibridaron a membranas southern-PFGE con ADN procedente de diferentes alelos digeridos con SmaI y con Mlul. Se descubrió que un fragmento MlUl de \sim50 kb era de tamaño ligeramente menor en el alelo fca-4. El análisis adicional mediante hibridación de los clones de cósmido correspondientes a la región que mostraba la diferencia, indicó que parte de la alteración se había producido en un fragmento BamHI de 1,9 kb que portaba los cósmidos cAtA2 y 19247. Ello permitió concentrar los esfuerzos de los presentes inventores en los primeros experimentos de complementariedad con clones de cósmido en el extremo norte del contig.

Se introdujeron once clones de cósmido mostrados en la Fig. 6, partiendo de aquellos en el extremo izquierdo, en el mutante fca-1 de Arabidopsis utilizando el procedimiento de transformación de explantes de raíces (Valvekens et al. 1988). Se recolectaron semillas de individuos autofertilizados resistentes a la canamicina y se analizaron con respecto a su segregación en canamicina y al momento de floración. En la Figura 6 se muestra el número de transformantes que mostraba complementariedad con floración temprana para cada cósmido. Los cuatro cósmidos que resultaron en com-
plementariedad se localizaban en el extremo de la región genómica, donde se localizaba la inversión en el alelo fca-4.

Identificación del gen FCA

Se obtuvo la secuencia genómica completa del alelo Columbia correspondiente a la región genómica dentro de los clones de cósmido complementarios mediante los esfuerzos de la iniciativa de secuenciación de Arabidopsis del departamento de los presentes inventores (G. Murphy, com. pers.). La mayor parte de la región genómica contenida en los cósmidos complementarios se encuentra en los tres fragmentos de restricción BamHI, de 4, 1,9 y 2 kb. Se aislaron estos fragmentos y se hibridaron separadamente o agrupados con 1 x 10^{6} clones fágicos de la biblioteca de ADNc de PRL-2. Esta biblioteca se había preparado a partir de muestras agrupadas de ARN y fue puesta a disposición de los presentes inventores por Tom Newman (Michigan). Se aislaron y se caracterizaron cuatro clones que hibridaban con el fragmento BamHI de 2 kb, y tres clones que hibridaban con los fragmentos de 4 kb y de 1,9 kb. Identificaron dos clones de ADNc con tamaños de inserción de \sim1700 pb y 1350 pb. El análisis de los tamaños de los transcritos que hibridaban con estos dos clones de ADNc demostró que uno (en fca-4) presentaba un tamaño reducido en comparación con los otros alelos y el tipo salvaje, y por lo tanto este clon de ADNc se asignó al gen FCA. El otro clon no mostró ninguna diferencia y se denominó 77B.

El tamaño de transcrito del gen FCA putativo era de >3 kb, indicando que el clon de ADNc no era de longitud completa. El clon de ADNc se secuenció y se encontró que codificaba una inserción de 1.811 pb. Los cebadores se diseñaron a partir de la secuencia genómica (cebador BamX marcado en la Figura 3) y el extremo 5' de la secuencia de ADNc (marcado lanRT1 y lanRT2 en la Figura 3). Se construyó la primera cadena de ADNc utilizando el cebador lanRT2 para cebar el ARN aislado de las plántulas de tipo salvaje (estadio de dos hojas). Se utilizó con los cebadores BamX y lanRT2 para amplificar por PCR un fragmento detectado como una banda pálida en un gel teñido con bromuro de etidio. El producto de PCR se diluyó 1/300 y se amplificó nuevamente utilizando los cebadores BamX y lanRT1. Los extremos del producto de esta reacción se completaron con ADN polimerasa de T4 y se clonaron en el sitio EcoRV del vector de clonación general Bluescript KSII (Stratagene). El producto se secuenció y se encontró que era colineal con la secuencia genómica y extendía la secuencia del clon de ADNc en 735 pb.

La secuencia se comparó con todas las secuencias disponibles utilizando BlastX, BlastN y TBlastN. En la búsqueda de TBlastN se detectaron homologías significativas con una clase de proteínas anteriormente definida como proteínas de unión a ARN. El rasgo característico de estas proteínas es la presencia de uno o más motivos RRM constituidos por aminoácidos conservados que abarcan una región de 80 aminoácidos (mostrada en la Fig. 4). La localización de los submotivos RNP2 y RNP1 y de los aminoácidos conservados individuales se mantiene en todo momento dentro del motivo RRM completo. La traducción de la secuencia del clon de ADNc de FCA extendido en los experimentos de PCR-RT mostró la presencia de múltiples codones de parada traduccional en la región 5' de la secuencia. El primer residuo metionina corriente abajo del último codón de parada traduccional y en el mismo marco de lectura que el resto de la proteína FCA estaba localizado en el medio del motivo RRM, dividiendo RNP2 y RNP1. La fuerte homología del motivo RRM con otras proteínas de unión a ARN sugería que este residuo MET no era el inicio de la proteína FCA. Además, los transcritos de un gran número de proteínas de unión a ARN se someten a corte y empalme alternativo, rindiendo productos activos e inactivos. Seguidamente, se regula el corte y empalme, con frecuencia de manera autorregulada, con el fin de controlar la producción de la proteína activa. Estos hechos sugieren que el transcrito de FCA generado en los experimentos de PCR-RT contenía un intrón situado inmediatamente corriente arriba del motivo RRM.

Con el fin someter a ensayo dicha hipótesis, se diseñaron varios cebadores a partir de la secuencia genómica para la utilización en experimentos adicionales de PCR-RT. Se preparó una primera cadena de ADNc a partir de ARN aislado de plántulas (estadio de 4 hojas), se cebó con hexámeros aleatorios (Boehringer). Los cebadores situados dentro de la secuencia 5' respecto al ADNc de FCA hasta el extremo 3' del ADNc 77B (el otro clon de ADNc que hibridaba con los clones de cósmido complementarios), junto con lanRT1 proporcionaron productos de amplificación del tamaño esperado a partir de la secuencia genómica, pero no proporcionaron productos más pequeños, como resultaría previsible de un transcrito en el que se había extraído un intrón intermedio. A continuación, se utilizó un cebador situado dentro del clon de ADNc 77B indicado como ADNcII-BamHI (en la Fig. 3), conjuntamente con el cebador lanRT1; no resultaba visible ninguna banda en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio tras 30 ciclos de amplificación. Seguidamente, se diluyó 1/300 la reacción de PCR y se amplificó nuevamente utilizando los cebadores ADNcII-1 y RevEx4 (mostrados en la Figura 3). El producto de PCR se digirió con los enzimas de restricción SalI y BgIII y se clonó en el plásmido BluescriptKSII digerido con SalI y BamHI. El análisis de secuencia del producto de 760 pb y la comparación con la secuencia genómica reveló que se había extraído un intrón de 2 kb uniéndose el ORF situado en el ADNc 77B con el ORF que portaba el motivo RRM en el gen FCA. Este corte y empalme reveló la presencia de un segundo motivo RRM intacto interrumpido por el intrón 3.

La comparación directa de la secuencia FCA con la de LUMINIDEPENDENS y CO, los otros genes de tiempo de floración clonados de Arabidopsis (Lee et al. 1994, Putterill et al. 1995) no detectaron ninguna homología significativa.

Mutaciones en los alelos mutantes fca

Se preparó ADNc a partir de ARN aislado de los alelos mutantes. Éste se amplificó utilizando ADNcII-BamHI y ADNc-3'a: BamX y lanRTI; fca5'-1 y fca3'-a (posiciones indicadas en la Fig. 3). Los fragmentos de PCR resultantes se clonaron y se secuenciaron, comparándolos con la secuencia del transcrito Landsberg erecta de tipo salvaje. La mutación fca-1 convirtió un nucleótido C en la posición 6861 en una T. De esta manera, se cambió un codón de glutamina (CAA) por un codón de parada (TAA). La mutación fca-3 convirtió un nucleótido G en la posición 5.271 en una A. El efecto de esta mutación fue alterar la unión de corte y empalme 3' del intrón 7 de manera que se usase una nueva unión de corte y empalme 3' a 28 nucleótidos dentro del exón 8. La mutación fca-4 es el resultado de una reorganización con el punto de corte en la posición 4.570 (dentro del intrón 4).

Ejemplo 2 Aislamiento y análisis de secuencia del homólogo de Brassica napus

Se obtuvo una biblioteca genómica de Brassica napus construida a partir de ADN parcialmente digerido con Sau3A clonado en el vector lambda DASH^{R}II/BamHI (Strategene). La biblioteca se sometió a cribado utilizando el clon de ADNc de FCA de 1.811 pb. Se aisló un clon que portaba una inserción de 12 kb que se hibridaba con el clon de ADNc de FCA y con el clon de ADNc 77B. El clon lambda se digirió con SalI, liberando la inserción de Brassica de 12 kb de longitud completa, y ésta se clonó en Bluescript KSII. Se subclonaron en BluescriptKSII y se secuenciaron los fragmentos de restricción de este clon (una combinación de EcoRI, SacI y BamHI).

También se subclonó el fragmento de Brassica de 12 kb en el sitio de restricción de XhoI del vector binario pSLJ1714 de Agrobacterium (Jones et al. 1992) para la transformación en el mutante fca. Al introducirlo en la mutación fca-4, utilizando la transformación de explantes de raíces, la progenie del transformante segregó plantas de floración temprana. Éstas florecieron con una media de 8,3 hojas en comparación con el Landsberg erecta de tipo salvaje cultivado al lado, con 9,1 hojas, y fca-4, con 24,1 hojas. De esta manera, el gen FCA de Brassica complementa por completo la mutación fca-4.

Expresión de ARNm de FCA

Se aisló ARNm poliA de un abanico de etapas del desarrollo: 2 hojas, 4 hojas, 6 hojas y 10 hojas, raíces e inflorescencias, se fraccionó en transferencias northern y se hibridó con el clon de ADNc de FCA de 1.811 pb. El transcrito FCA \gamma combinado se encontraba presente en aproximadamente la misma cantidad en todos los tejidos examinados excepto en las inflorescencias, en las que la expresión era ligeramente inferior. Se detectó el transcrito \beta prematuramente poliadenilado utilizando el clon de ADNc 77B como sonda. El transcrito \beta era 20 veces más abundante que \gamma_{A+B}. Los transcritos \alpha_{A+B} que contenían el intrón 3 no se detectaron en una transferencia northern y sólo pudieron encontrarse utilizando PCR-RT.

La expresión de FCA también se ha analizado utilizando ensayos de protección frente a ARNasa. Mediante la utilización de una sonda (entre 725 pb y 1.047 pb del constructo \gamma_{B}), se detectaron los transcritos \gamma_{A+B} a niveles similares en un abanico de etapas del desarrollo en fotoperiodos tanto de día largo como de día corto, y a niveles más bajos en rosetas e inflorescencias de las plantas maduras. El transcrito \beta se encontraba a nivel más elevado en estos tejidos, en consistencia con el análisis de transferencia northern.

Procedimientos para los ejemplos 1 y 2 Condiciones de cultivo y medición del tiempo de floración

Se midió el tiempo de floración bajo condiciones definidas mediante el cultivo de plantas en cuartos de ambiente controlado Sanyo Gallenkamp a 20ºC. Los días cortos comprendían un fotoperíodo de 10 horas iluminadas con lámparas de haluro metálico de tipo power star de 400 vatios suplementadas con lámparas de haluro de tungsteno de 100 vatios. Ello proporcionaba un nivel de radiación fotosintéticamente activa (PAR) de 113,7 \mumoles de fotones m^{-2}s^{-1} y una proporción de luz roja:rojo lejano de 2,41. Se utilizó un cuarto y lámparas similares para el día largo. El fotoperiodo era de 10 horas bajo las mismas condiciones utilizadas para los días cortos y prolongado durante 8 horas adicionales utilizando únicamente las lámparas de haluro de tungsteno. En este cuarto la combinación de lámparas utilizada para el periodo de 10 horas proporcionó un PAR de 92,9 \mumoles de fotones m^{-2}s^{-1} y una proporción de rojo:rojo lejano de 1,49. La extensión de 8 horas produjo un PAR de 14,27 \mumoles m^{-2}s^{-1} y una proporción de rojo:rojo lejano de 0,66.

Se midieron los tiempos de floración de grandes poblaciones de plantas tanto bajo condiciones de invernadero como bajo condiciones en cámara de crecimiento. El tiempo de floración se midió mediante el recuento del número de hojas, excluyendo los cotiledones, en la roseta y en la inflorescencia. Se muestran los números de hojas con los errores estándar correspondientes al límite de confianza del 95%. También se registró el número de días desde la siembra hasta la aparición del capullo de flor, aunque no se muestra. La estrecha correlación entre el número de hojas y el tiempo de floración se ha demostrado anteriormente para Landsberg erecta y para los alelos fca (Koorneef et al., 1991).

Marcadores cósmidos y RFLP

Se obtuvo ADN de clones lambda m210, m326, m580 y m226 de Elliot Meyerowitz (Caltech, Pasadena). Se utilizó el ADN total como sonda marcada radioactivamente para filtros de colonias de biblioteca de YAC y membranas de transferencia de ADN genómico vegetal. Los cósmidos g10086, g4546, g4108, g19247 se obtuvieron de Brian Hauge y Howard Goodman (MGH, Boston), se cultivaron en presencia de 30 mg/l de canamicina y se almacenaron en glicerol a -70ºC. Se utilizó ADN total de cósmido como sonda marcada radioactivamente para filtros de colonias de biblioteca de YAC y membranas de transferencia de ADN genómico vegetal. Se obtuvieron los clones de cósmido cAtA2 y cATB1 de Chris Cobbett (Universidad de Melbourne) y se cultivaron en presencia de 10 mg/l de tetraciclina. Elliot Meyerowitz (Caltech, Pasadena) proporcionó cósmido pCITd23, se cultivó en presencia de 100 \mug/ml de espectromicina/espectinomicina y se almacenó en glicerol a -70ºC. Las secuencias del vector pCIT30 comparten homología con los vectores derivados de pYAC4 y, por lo tanto, se hibridaron los filtros de colonias de biblioteca de YAC con inserciones de ADN extraídas del cósmido. Se utilizó el ADN total de pCITd23 como sonda marcada radioactivamente para sondear las membranas de transferencia de ADN genómico vegetal.

Bibliotecas de YAC

Se obtuvieron las bibliotecas de EG y de ABI de Chris Somerville (Michigan State University). La biblioteca EW se obtuvo de Jeff Dangl (Max Delbruck Laboratory, Cologne) y la biblioteca de yUP, de Joe Ecker (University of Pennsylvania). Las copias maestras de las bibliotecas se almacenaron a -70ºC (tal como describen Schmidt et al., Aust. J. Plant Physiol. 19:341-351, 1992). Los cultivos de trabajo se mantuvieron en ágar Kiwibrew selectivo a 4ºC. Kiwibrew es un medio mínimo completo selectivo menos uracilo y que contiene 11% de ácidos Casamino. Se sembraron en placa nuevamente cultivos de trabajo de las bibliotecas utilizando un replicador de 96 agujas cada 3 meses.

Filtros de colonias de levaduras

Se produjeron y se procesaron (tal como describen Coulson et al., Nature 335:184-186, 1988) filtros Hybond-N (Amersham) (8 cm x 11 cm) que contenían series de ADN de colonias de levaduras procedentes de 8-24 placas de biblioteca y se modificaron (tal como describen Schimdt y Dean, Genome Analysis, vol. 4:71-98, 1992). La hibridación y las condiciones de lavado fueron según las instrucciones del fabricante. Se preparó ADN marcado radioactivamente de sonda mediante marcaje de hexámeros aleatorios.

Preparación de cromosomas de levadura y fraccionamiento mediante electroforesis de gel con campo pulsado (PFGE)

Se inocularon cinco mililitros de Kiwibrew con una sola colonia de levadura y se cultivaron a 30ºC durante 24 horas. Se generaron esferoplastos de levadura mediante incubación con 2,5 mg/ml de Novozym (Novo Biolabs) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió sorbitol 1 M para completar el volumen final de esferoplastos a 50 \mul. Se añadieron a los esferoplastos ochenta microlitros de agarosa LMP fundida (agarosa InCert al 1%, FMC) en sorbitol 1 M, la mezcla se mezcló con vórtex brevemente y se pipeteó en moldes de bloques. Los pellets se introdujeron en tubos Eppendorf de 1,5 ml y después se incubaron en 1 ml de 1 mg/ml de proteinasa K (Boehringer Mannheim) en EDTA 100 mM, pH 8, sarkosyl al 1% durante 4 horas a 50ºC. Se renovó la solución y los bloques se incubaron durante la noche. Los bloques se lavaron tres veces durante 30 minutos cada uno con TE y dos veces durante 30 minutos con 0,5 x TVBE. Se llevó a cabo PFGE utilizando el sistema Pulsaphor (LKB). Se cargó un tercio de un bloque en un gel de agarosa al 1% y se sometió a electroforesis en 0,5 x TBE a 170 V, tiempo de pulso: 20 s, durante 36 horas a 4ºC. Los marcadores de ADN eran concatámeros de ADN de lambda preparado tal como describen Bancroft y Wolk, Nucleic A. Res. 16:74OS-7416, 1988. El ADN se visualizó mediante tinción con etidio de
bromo.

ADN genómico de levadura para la digestión con enzimas de restricción y reacción en cadena de la polimerasa inversa (IPCR)

Se preparó ADN genómico de levadura esencialmente tal como describen Heard et al. (1989), excepto en que se prepararon esferoplastos de levadura tal como se ha indicado anteriormente. Finalmente, se extrajo el ADN dos veces con fenol/cloroformo, una vez con cloroformo y se precipitó con etanol. El rendimiento de un cultivo de 5 ml fue de aproximadamente 10 \mug de ADN.

Aislamiento de sondas de YAC de extremo izquierdo mediante rescate de plásmido

El rescate de plásmido de los fragmentos de YAC de extremo izquierdo de los YAC denominados EG, ABI y EW se llevó a cabo tal como describen Schmidt et al. (1992). Se utilizó IPCR para generar fragmentos de extremo izquierdo y derecho utilizando el protocolo y los cebadores indicados en Schmidt et al. (1992).

Transferencia de geles y condiciones de hibridación

La transferencia de gel a Hybond-N, la hibridación y las condiciones de lavado fueron según instrucciones del fabricante, excepto en que el ADN se fijó a los filtros mediante tratamiento UV Stratalinker y/o se hornearon a 80ºC durante 2 horas. El ADN marcado radioactivamente se preparó mediante marcaje de hexámeros aleatorios.

Análisis de RFLP

Se prepararon dos a tres microgramos de ADN genómico vegetal a partir de plantas parentales utilizadas en los cruces y se sometieron a corte y empalme en un volumen de 300 \mul. El ADN digerido se precipitó con etanol y se separó en geles de agarosa al 0,7% y se transfirió a filtros Hybond-N. La sonda de ADN de cósmido, lambda o de extremo de YAC se hibridó con los filtros con el fin de identificar los RFLPs.

Extracciones de ARN

Se extrajo el ARN utilizando un procedimiento descrito por Dean et al. (1986). Se extrajo el ARN poliA utilizando el sistema de aislamiento de ARNm denominado poliAtract® (Promega).

Extracciones de ADN

El ADN de Arabidopsis se extrajo mediante el procedimiento de extracción CTAB descrito por Dean et al. (1992).

Aislamiento de ADNc mediante PCR-RT

Se aisló ARN total a partir de plántulas completas en el estado de 2-3 hojas, que crecían sometidas a días largos en el invernadero. Para la síntesis de la primera cadena del ADNc, se calentaron 10 \mug de ARN en un volumen de 10 \mul a 65ºC durante 3 minutos, y después se enfriaron rápidamente en hielo. Se prepararon 10 \mul de mezcla de reacción que contenía 1 \mul de ARNsin, 1 \mul de cebador adaptador dT17 estándar (1 \mug/\mul; Frohman et al. 1988), 4 \mul de tampón 5X de transcriptasa inversa (TrisHCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl_{2} 15 mM), 2 \mul de DTT (100 mM), 1 \mul de dNTP (20 mM), 1 \mul de transcriptasa inversa (200 unidades, M-MLV Gibco). A continuación, esta mezcla de reacción se añadió al ARN, generando un volumen final de 20 \mul. La mezcla se incubó a 42ºC durante 2 horas y después se diluyó a 200 \mul con agua.

Se añadieron 10 \mul de la reacción diluida de síntesis de primera cadena a 90 \mul de mezcla PCR que contenía 4 \mul de dNTP 2,5 mM, 10 \mul de tampón PCR x10 (Boehringer más Mg), 1 \mul de una solución 100 ng/\mul de cada uno de los cebadores, 73,7 \mul de agua y 0,3 \mul de 5 unidades/\mul de polimerasa Taq (Boehringer o Cetus Amplitaq). La reacción se llevó a cabo a 94ºC durante 1 minuto, 34 ciclos de 1 minuto a 55ºC, 72ºC durante 2 minutos y finalmente a 72ºC durante 10 minutos.

Secuenciación de ADN

Se utilizó el procedimiento Sanger para secuenciar fragmentos de interés insertados en un vector plásmido Bluescript. Se llevaron a cabo reacciones utilizando un kit Sequenase (United States Biochemical Corporation).

Cribado de la biblioteca de cósmidos Landsberg erecta y la biblioteca de ADNc PRL-2

Se cribaron 26.000 clones organizados ordenadamente en placas de microtitulación mediante la colocación de "offsets" (capas de plantas) de las 16 placas de microtitulación sobre placas LB-tet (10 \mug/ml) y después transfiriendo las colonias a filtros Hybond-N. Se cribaron 1 x 10^{6} placas de la biblioteca CD4-71-PRL2 (suministrada por el Arabidopsis Biological Resource Center de la Ohio State University) sembrando 20 placas de 50.000 placas y después transfiriendo las placas a filtros Hybond-N.

Transformación de Arabidopsis

Los cósmidos que contenían ADN situado cerca de FCA se movilizaron en Agrobacterium tumefaciens CS8C1, y el ADN-T se introdujo en plantas de Arabidopsis tal como describen Valvekens et al., 1988. Las raíces de las plantas cultivadas in vitro se aislaron y se cultivaron en medio inductor de callos (Valvekens et al. 1988) durante 2 días. A continuación, se cortaron las raíces en segmentos cortos y se cocultivaron con Agrobacterium tumefaciens que portaba el plásmido de interés. Los explantes de raíces se secaron sobre filtro de transferencia y se colocaron sobre medio inductor de callos durante 2 a 3 días. Se eliminaron por lavado los Agrobacterium, las raíces se secaron y se colocaron sobre medio inductor de brotes (Valvekens et al. 1988) que contenía vancomicina para eliminar los Agrobacterium, y canamicina para seleccionar para las células vegetales transformadas. Tras aproximadamente 6 semanas, los callos verdes en las raíces empezaron a producir brotes. Estos se extrajeron y se colocaron en placas Petri o potes magenta que contenían medio de germinación (Valvekens et al. 1988). Estas plantas produjeron semillas en los potes magenta. A continuación, éstas se sembraron en medio de germinación que contenía canamicina con el fin de identificar las plántulas transformadas que contenían el transgén (Valvekens et al. 1988).

Ejemplo 3 Plantas homocigóticas para la inserción de ADN-T que portan FCA florecen antes que los heterocigóticas

Se autofecundaron de cada uno de los cuatro clones de cósmido dos transformantes que complementaban el fenotipo mutante fca y se recogieron semillas de individuos de floración tardía y temprana y se sembraron en placas en medio con canamicina. Toda la progenie de floración tardía era sensible a la canamicina, mientras que la progenie de los individuos de floración temprana eran homocigóticos o heterocigóticos para la resistencia a la canamicina. Ello demuestra que el marcador de la canamicina en el ADN-T que incluye la región que contiene el gen FCA se co-segregó por completo con el fenotipo de floración temprana. De esta manera, la complementación con la floración temprana se debe a secuencias dentro del cósmido insertado. Se registró el LD para los individuos de floración temprana homocigóticos o heterocigóticos para la inserción de ADN-T.

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TABLA 1

cósmido	K/K	K/-
CL58I16	10,3 (9)	13 (4)
	9,7 (4)	10,4 (10)
CL44B23	9,5 (2)	11,8 (6)
	12 (2)	11,1 (6)
cAtA1	14,2 (5)	15 (3)
	9,6 (3)	10,8 (5)
cAtA2	9,1 (7)	9,3 (3)
	12,5 (3)	14,4 (7)

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El análisis del tiempo de floración (medido por el LD total) en transformantes que mostraban complementación del fenotipo mutante fca. Para cada cósmido, se analizaron dos transformantes independientes. Se contó el número de hojas en individuos F2 (el número de las cuales se muestra entre paréntesis) que seguidamente se autofecundaron y la progenie se sembró en medio que contenía canamicina con el fin de establecer si la planta era homocigótica (K/K) o heterocigótica (K/-) para la inserción de ADN-T.

Los resultados, mostrados en la Tabla 1 anteriormente, indican que los homocigotos florecieron significativamente antes que los heterocigotos en la totalidad de los 8 transformantes analizados. De esta manera, el incremento de la dosis de gen FCA y por lo tanto con toda probabilidad la cantidad de producto génico, provoca la floración temprana.

Ejemplo 4 Experimentos antisentido

Se subclonó en los sitios de restricción BamHI/HindIII de pBluescriptKSII un fragmento de restricción BamHI de 1.184 pb (pb3547, Fig. 3)/HindIII (pb4731, Fig. 3) procedente del clon de ADNc FCA. La inserción se liberó con los enzimas BamHI y XhoI y se subclonó en el vector binario pSLJ6562 de Agrobacterium (J. Jones, Sainsbury Laboratory). El plásmido resultante contenía el promotor CaMV 35S que transcribe el fragmento de ADNc FCA, produciendo ARN antisentido, que termina con secuencias 3' del gen de la nopalina sintasa. Este plásmido también porta secuencias LB y RB de Agrobacterium para la introducción en células vegetales, y una fusión nos5'-kan-ocs3' para permitir la selección con canamicina de los transformantes. El constructo se introdujo en Arabidopsis thaliana ecotipo Landsberg erecta utilizando el procedimiento de transformación de explantes de raíces de Valvekens et al. (1988).

Se recogieron las semillas autofecundadas procedentes de cinco transformantes, se sembraron en medio que contenía canamicina y se trasplantaron en el suelo 10 individuos resistentes a la canamicina. Tres de los transformantes segregaron una sola inserción de ADN-T, los otros presentaban dos o más. Se midió el tiempo de floración, registrado como número de hojas en la roseta. La progenie de cuatro de los cinco transformantes presentaba floración tardía, produciendo 12 hojas de roseta, en comparación con las 4 del quinto transformante cultivado en paralelo, bajo estas condiciones particulares, las plantas Landsberg erecta no transformadas y las plantas fca-1 florecieron con 4 y 11 hojas de roseta, respectivamente. De esta manera, el constructo antisentido (como locus único) reprodujo con efectividad el fenotipo de floración tardía de la mutación fca-1.

Ejemplo 5 Construcción de fusiones de promotor del marco de lectura abierto de FCA

Se clonó en un sitio XhoI del vector binario pSLJ6562 de Agrobacterium (indicado anteriormente) un fragmento genómico SalI-XhoI que portaba el gen FCA completo más 64 pb corriente arriba del inicio putativo de traducción y 500 pb corriente abajo del sitio de poliadenilación. Ello resultó en un vector que portaba una fusión nos-kan para la selección de transformantes y una fusión en la que el promotor 35S regulaba la región genómica FCA (21 exones, 20 intrones). Se prepararon los transformantes con este constructo.

Este constructo, al introducirlo en las plantas fca-4, corrigió el fenotipo de floración tardía, provocando que las plantas floreciesen con 6,4 hojas bajo un fotoperiodo de día largo. El resultado fue similar en Landsberg erecta de tipo salvaje, cultivada en paralelo, que floreció con 6,2 hojas.

Ejemplo 6 Construcción de un gen FCA que carece de intrones - transcritos \gamma_{A} y \gamma_{B}

Se creó el constructo \gamma_{A} clonando juntos siete fragmentos:

i.

un fragmento EcoRI (un sitio presente a la unión de la inserción en el sitio de clonación múltiple del vector)-SalI procedente del cósmido CL43B23. Este fragmento contiene el promotor 5' y la región no traducida de FCA y la región 5' del ORF.

ii.

un fragmento de restricción SalI-HindIII de 425 pb del clon 77B de ADNc.

iii.

la región del transcrito sometido a corte y empalme que abarca el sitio de corte y empalme 5' del intrón 3 se generó utilizando PCR-RT con los cebadores ADNcII-BamHI y ranRT1. El producto se amplificó nuevamente utilizando ADNcII-1 y RevEx4, se digirió con SalI y con BgIII y se clonó en pBluescriptKSII digerido con SalI y con BamHI. A continuación, se utilizó un fragmento HindIII de 270 pb de este plásmido en la reconstrucción del transcrito maduro.

iv.

se amplificó una región del transcrito sometido a corte y empalme utilizando PCR-RT y los cebadores BamX y lanRT1. Dicha región se digirió con HindIII y con BgIII y el fragmento 52 pb se utilizó en la reconstrucción del transcrito maduro.

v.

se amplificó una región del transcrito sometido a corte y empalme utilizando PCR-RT y los cebadores BamX y Rev404 (se indica la posición en la Fig. 3).

vi.

se extrajo un fragmento ClaI-SpeI del clon de ADNc de FCA (el clon de 1.811 pb aislado de la biblioteca de PRL-2).

vii.

se aisló del clon genómico FCA un fragmento SpeI-XhoI con los últimos 140 pb de la región 3' no traducida más 500 pb de la secuencia 3' genómica.

Los siete fragmentos utilizados para construir el gen FCA sin los intrones se construyeron en dos partes, la región 5' y después la región 3', que seguidamente se combinaron.

A.

Región 5'. El fragmento iv se clonó en pBluescriptKSII como inserción HindIII/ClaI. A continuación, se clonó el fragmento ii en lo anterior como fragmento EcoRI/HindIII (procediendo el sitio EcoRI del sitio de clonación múltiple en el vector de clonación de ADNc). Seguidamente se clonó el fragmento iii en el sitio HindIII entre los fragmentos ii y iv, determinando la orientación correcta con un sitio RsaI situado asimétricamente. A continuación, se clonó el fragmento i en los sitios EcoRI/SalI.

B.

Región 3'. El fragmento vii se clonó en los sitios SpeI/XhoI presentes en el fragmento vi (procediendo el sitio XhoI del sitio de clonación múltiple en el vector). A continuación, se clonó el fragmento v en el sitio BamHI, determinando la orientación correcta con un sitio ClaI situado asimétricamente.

A continuación, se clonó la región 3' que contenía los fragmentos v, vi y vii, como fragmento ClaI/XhoI en el plásmido que contenía los fragmentos 5'.

Se generó el constructo \gamma_{B} mediante la sustitución del fragmento EcoNI (1.503 pb a 2.521 pb de transcrito sometido a corte y empalme) con un fragmento EcoNI procedente de un clon derivado mediante PCR-RT del ARN Ler que contenía la forma alternativa de corte y empalme que codificaba la proteína de longitud completa.

Se liberaron los constructos resultantes del vector utilizando EcoRI y XhoI y se clonaron en los sitios EcoRI/XhoI del vector binario pSLJ1714 de Agrobacterium (Jones et al. 1992). De esta manera se generaron los transformantes que portaban este constructo.

La introducción del constructo \gamma_{A} en Landsberg erecta causó que floreciese con 5,6 hojas bajo un fotoperiodo de día largo. Ello es ligeramente antes que el Landsberg erecta de tipo salvaje cultivada en paralelo, que floreció con 6,2 hojas. Cuando se cultivó bajo un fotoperiodo de día corto, 1/4 de la progenie del transformantes floreció temprano (con una media de 8,7 hojas). Ello es significativamente más temprano que el Landsberg erecta de tipo salvaje, que floreció con 23,5 hojas bajo estas condiciones.

Ejemplo 7 Expresión en E. coli

Se digirió el constructo \gamma_{S}, descrito en el Ejemplo 6, con Sal1 y KpnI y se clonó en los sitios XhoI-KpnI del vector de expresión pRSETC de E. coli (Invitrogen Corp.). El vector resultante presentaba el ADNc de FCA clonado en el mismo marco de lectura con un dominio de unión de polihistidina-metal, que permite que la proteína recombinante se purifique separándola de las proteínas nativas de E. coli utilizando una resina de afinidad por metales (ProBond TM Ni^{2+}, Invitrogen Corp.). La proteína FCA no se unía bien a las columnas de afinidad y por lo tanto se separó de las proteínas de E. coli cortando el gel de SDS-poliacrilamida. La proteína se extrajo de la sección de gel y se utilizó para la inyección en conejos. Se administró una inyección de refuerzo y después se extrajeron dos muestras de sangre. Los anticuerpos producidos detectan la proteína FCA en transferencia de puntos sobre membrana de nilón a una dilución de 1/10.000.

Ejemplo 8 Cebadores diseñados para amplificar genes que contienen dominios RRM de homología elevada con FCA

Basándose en la homología entre etr-1, un EST derivado de un ARNm de cerebro humano (dbest H1995); la proteína sexlethal de Drosophila; las proteínas del sistema nervioso humano HuD, HuC, Hel-N1 y Hel-N2, y las proteínas de Xenopus elrA, elrB, elrC, elrD, se diseñó un juego de cebadores degenerados para PCR que contenían dos regiones de homología muy elevada.

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Ejemplo 9 Construcción de derivados de FCA para producir mutaciones negativas dominantes y con el fin de analizar el patrón de expresión y de corte y empalme del gen FCA

Se construyó un constructo que expresaba el segundo marco de lectura abierto del transcrito \alpha_{B} bajo el control del promotor FCA, mediante la deleción del primer marco de lectura abierto (entre 450 pb y 1.206 pb). Ello se llevó a cabo utilizando oligomutagénesis para introducir un sitio SphI en las dos posiciones, digiriendo y religando el vector.

Con el fin de examinar la expresión de FCA, se prepararon constructos de fusión de promotor de FCA-GUS. Se construyeron fusiones de promotor de FCA + exones 1-4 de FCA con el gen de la \beta-glucuronidasa (GUS) con el fin de realizar el seguimiento del corte y empalme en el intrón 3. Se preparó la totalidad del ADNc (\gamma_{B}) de FCA sometido a corte y empalme fusionado con GUS en el mismo marco de lectura en el extremo C-terminal, con el fin de realizar el seguimiento de la localización de la proteína FCA dentro de la célula.

Ejemplo 10 Identificación de los homólogos de FCA dentro del genoma de Arabidopsis

Se cribó una biblioteca de cósmido de Landsberg erecta equivalente a cuatro genomas bajo condiciones de baja astringencia (40ºC durante la noche, SDS al 1%, 5 x SSC, leche en polvo al 0,5%) con el clon genómico completo de FCA. Los filtros se lavaron 2 x 20 minutos a 45ºC en 2 x SSC, SDS al 0,5%. Tras la exposición, se lavaron nuevamente 2 x 20 minutos, 50ºC en 2 x SSC, SDS al 0,5%. Se seleccionaron 61 clones de cósmido, más dos cósmidos de control negativo. Cinco de estos cósmidos eran clones de FCA adicionales, dejando 56 homólogos putativos de FCA. Se prepararon minipreparaciones a partir de 10 ml o/n de cósmidos, se digirieron con EcoRI, se corrieron en geles al 0,8% con controles positivos y negativos en cada gel y se realizaron transferencias southern. Las membranas se hibridaron separadamente con ADNc 77B y FCA (originalmente denominado 61A) (Fig. 7) utilizando las condiciones indicadas anteriormente y después se lavaron a 45ºC únicamente.

De los homólogos putativos:

(a) 2 cósmidos hibridaron únicamente con 77B,

(b) 11 cósmidos hibridaron únicamente con 61A,

(c) 31 cósmidos hibridaron con ambos ADNc,

(d) 13 cósmidos resultaron difíciles de asignar o no mostraron niveles significativos de hibridación.

(a) 2 cósmidos aparentemente no se encontraban relacionados,

(b) 49 C 22 y 67 I 3 comparten fragmentos EcoRI comunes,

(c) 39 G 10, 46 H 15, 56 F 2 y 59 A 8 comparten fragmentos EcoRI comunes,

-

39 G 10 y 56 F 2 comparten un fragmento adicional

-

4 H 4 y 45 K 24 comparten dos fragmentos,

-

por lo menos nueve otros pares de cósmidos podrían presentar por lo menos un fragmento EcoRI en común.

TABLA 2

Cebadores	Secuencia	inicio (pb) Figura 3
ADNcII-BamHI	5' CAGGATCCTTCATCATCTTCGATACTCG 3'	25
ADNcII-1	5' GTCCCTCAGATTCACGCTTC 3'	228
ADNcII-3'a	5' CACTTTTCAAACACATC 3'	1.167
ADNcII-3'b	5' GTTCTCTGTACATTAACTC 3'	1.213
BamX	5' ATTGAGATTCTTACATACTG 3'	2.568
RevEx1A	5' TAAGACATGTCTGACAG 3'	2.838

TABLA 2 (continuación)

Cebadores	Secuencia	inicio (pb) Figura 3
RevEx1B	5' GTGATCTGATTGTGCAG 3'	3.030
RevEx4	5' TAGACATCTTCCACATG 3'	3.145
IanRT1	5' CAATGGCTGATTGCAACCTCTC	3.320
IanRT2	5' TCTTTGGCTCAGCAAACCG 3'	3.348
Rev404	5' CAATGTGGCAGAAGATG 3'	3.673
fca-3'a	5' AGGCCATTGTTTGGCAGCTC	4.941
fca-3'b	5' CCCAGCTAAGTTACTACTAG 3'	5.003

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Claims (41)

1. Aislado de ácidos nucleicos, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2.

2. Ácidos nucleicos según la reivindicación 1, en los que la secuencia codificante comprende una secuencia mostrada como un exón en la Figura 1.

3. Ácidos nucleicos según la reivindicación 2, en los que la secuencia codificante comprende las secuencias mostradas como exones en la Figura 1.

4. Ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprenden un intrón.

5. Ácidos nucleicos según la reivindicación 4, que comprenden un intrón tal y como se muestra en la Figura 1.

6. Ácidos nucleicos según la reivindicación 5, en los que dicho intrón es el intrón 3 de la Figura 1.

7. Aislado de ácidos nucleicos, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante, alelo o variante de la secuencia de aminoácidos PCA de la especie Arabidopsis thaliana mostrada en la Figura 2, mediante la inserción, deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos, o un homólogo de otra especie, cuyo mutante, alelo, variante u homólogo presenta una identidad global de secuencia de por lo menos el 75% con la secuencia de la Figura 2, y en el que la producción mediante expresión a partir de dichos ácidos nucleicos del polipéptido codificado en una planta transgénica influye sobre una característica de floración de dicha planta.

8. Ácidos nucleicos según la reivindicación 7, en los que dicha característica de floración es el tiempo de la floración.

9. Ácidos nucleicos según la reivindicación 8, en los que dicho mutante, alelo o variante presenta la capacidad de avanzar la floración en una planta.

10. Ácidos nucleicos según la reivindicación 8, en los que dicho mutante, alelo o variante presenta la capacidad de retrasar la floración en una planta.

11. Ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprenden un intrón.

12. Ácidos nucleicos según la reivindicación 11, que comprenden un intrón tal y como se muestra en la Figura 1.

13. Ácidos nucleicos según la reivindicación 12, en los que dicho intrón es el intrón 3 de la Figura 1.

14. Ácidos nucleicos según la reivindicación 13, que comprenden la secuencia de nucleótidos de FCA \alpha_{B}, es decir, la de la Figura 3.

15. Ácidos nucleicos según la reivindicación 7 que presentan la secuencia de nucleótidos de FCA \alpha_{A}, es decir, el intrón 3 de la Figura 1, y la totalidad de los exones de la Figura 1 excepto los nucleótidos de exón que se indican en la Figura 1 que se encuentran dentro de los sitios de corte y empalme alternativo de intrón alrededor del intrón 13.

16. Ácidos nucleicos según la reivindicación 7, que presentan la secuencia de nucleótidos de FCA \gamma_{A}, es decir, la totalidad de los exones de la Figura 1 excepto los nucleótidos de exón que se indican en la Figura 1 que se encuentran dentro de sitios de corte y empalme alternativos de intrón alrededor del intrón 13.

17. Ácidos nucleicos según la reivindicación 7, que presentan la secuencia de nucleótidos de FCA \gamma_{B}, es decir, la totalidad de los exones de la Figura 1 excepto los nucleótidos de exón que se indican en la Figura 1 que se encuentran dentro de sitios de corte y empalme alternativos de intrón alrededor del intrón 13.

18. Ácidos nucleicos según la reivindicación 17, en los que dicha especie diferente de Arabidopsis thaliana es una Brassica.

19. Ácidos nucleicos según la reivindicación 18, en los que dicho homólogo comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 8b.

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20. Ácidos nucleicos según la reivindicación 19, que comprende la secuencia codificante mostrada en la Figura 8a.

21. Ácidos nucleicos según la reivindicación 19, en los que la secuencia codificante es un mutante, alelo o variante de la secuencia codificante de la Figura 8a.

22. Aislado de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mutante, alelo o variante de la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico según la reivindicación 19, mediante la inserción, deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos, cuyo mutante, alelo o variante presenta por lo menos el 80% de identidad de aminoácidos con la secuencia de la Figura 8b y la capacidad de influir sobre una característica de floración de una planta.

23. Ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que comprenden además una secuencia reguladora para la expresión de dicho polipéptido.

24. Ácidos nucleicos según la reivindicación 23, que comprenden un promotor inducible.

25. Utilización de un aislado de ácidos nucleicos, que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia codificante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, o un fragmento de dicha secuencia codificante para influir sobre una característica de floración de una planta.

26. Utilización según la reivindicación 25, en la que el aislado de ácidos nucleicos comprende un promotor inducible.

27. Aislado de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con una secuencia codificante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o un fragmento de dicha secuencia codificante, en el que dichos ácidos nucleicos son ADN y dicha secuencia de nucleótidos se encuentra bajo control de una secuencia reguladora para la transcripción antisentido.

28. Ácidos nucleicos según la reivindicación 27, que comprenden un promotor inducible.

29. Vector de ácidos nucleicos adecuado para la transformación de una célula vegetal y que comprende ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, y 28.

30. Célula huésped que contiene ácidos nucleicos heterólogos según la reivindicación 29.

31. Célula huésped según la reivindicación 30, que es bacteriana.

32. Célula huésped según la reivindicación 30, que es una célula vegetal.

33. Célula vegetal según la reivindicación 32, que presenta dichos ácidos nucleicos heterólogos dentro de su genoma.

34. Célula vegetal según la reivindicación 33, que presenta más de una de dichas secuencias de nucleótidos por genoma haploide.

35. Planta que comprende una célula vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35.

36. Progenie autofecundada o híbrida, o un descendiente de una planta según la reivindicación 34, o cualquier parte o propágulo de dicha planta, progenie o descendiente, tal como semillas, que comprende una célula vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35.

37. Procedimiento para influir sobre una característica de floración de una planta, comprendiendo el procedimiento causar o permitir la expresión del polipéptido codificado por los ácidos nucleicos heterólogos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, dentro de células de la planta.

38. Procedimiento para influir sobre una característica de floración de una planta, comprendiendo el procedimiento causar o permitir la transcripción a partir de ácidos nucleicos heterólogos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 dentro de células de la planta.

39. Procedimiento para influir sobre una característica de floración de una planta, comprendiendo el procedimiento causar o permitir la transcripción antisentido a partir de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 28 dentro de células de la planta.

40. Utilización de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 en la producción de una planta transgénica.

41. Utilización de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 28 en la producción de una planta transgénica.