ES2255158T3 - Proceso para modificacion de la floracion de las plantas. - Google Patents
Proceso para modificacion de la floracion de las plantas.Info
- Publication number
- ES2255158T3 ES2255158T3 ES98919436T ES98919436T ES2255158T3 ES 2255158 T3 ES2255158 T3 ES 2255158T3 ES 98919436 T ES98919436 T ES 98919436T ES 98919436 T ES98919436 T ES 98919436T ES 2255158 T3 ES2255158 T3 ES 2255158T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ath1
- plants
- flowering
- plant
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 title description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 title description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 101150111419 ATH1 gene Proteins 0.000 claims description 125
- 101100433747 Arabidopsis thaliana ABCA2 gene Proteins 0.000 claims description 112
- 101100288148 Arabidopsis thaliana KNAT5 gene Proteins 0.000 claims description 112
- 101100135611 Arabidopsis thaliana PAP12 gene Proteins 0.000 claims description 112
- 101150002428 Atoh1 gene Proteins 0.000 claims description 112
- 101100057132 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) ATC1 gene Proteins 0.000 claims description 112
- 102100029373 Transcription factor ATOH1 Human genes 0.000 claims description 112
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 21
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 16
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 7
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 51
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 4
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 136
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 26
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 22
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 13
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 13
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 8
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 8
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 4
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 4
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 3
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 108090000051 Plastocyanin Proteins 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 229920002160 Celluloid Polymers 0.000 description 2
- 240000006740 Cichorium endivia Species 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 235000003733 chicria Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700002450 Arabidopsis KNAT5 Proteins 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021538 Chard Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 241000208150 Geraniaceae Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000679 Phytochrome Proteins 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H azane oxygen(2-) ruthenium(3+) ruthenium(4+) hexachloride Chemical compound N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.N.[O--].[O--].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Ru+3].[Ru+3].[Ru+4] GOOXRYWLNNXLFL-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 238000005213 imbibition Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021232 nutrient availability Nutrition 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000005082 stem growth Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008511 vegetative development Effects 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8297—Gibberellins; GA3
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Se presenta una construcción génica vegetal que comprende una secuencia de ADN completa o parcial que codifica un producto génico de la ATHi (secuencia homeótica del Rabidopsis thaliana) bajo el control de un promotor funcional en las plantas. El promotor es preferiblemente heterólogo. Las células vegetales se transforman con la construcción génica vegetal y las plantas que contienen las células tienen propiedades de floración modificadas. Además se describe un procedimiento para modificar el proceso de floración en las plantas transformando las plantas con una construcción de acuerdo con la invención.
Description
Proceso para modificación de la floración de las
plantas.
La presente invención se refiere a la floración
de las plantas.
Las plantas difieren de los animales. El cuerpo
adulto de la planta se forma post-embrionariamente
por la actividad continua de los meristemos apicales del brote y de
la raíz. El meristemo apical del brote se establece durante la
embriogénesis de la planta y, junto con los cotiledones, el
hipocótilo, la raíz del embrión y el meristemo de la raíz constituye
el plan básico del cuerpo.
El meristemo apical del brote se inicia como una
agrupación de aproximadamente un centenar de células y es la fuente
de la porción aérea de la planta. Durante la fase vegetativa del
desarrollo de la planta, este meristemo da lugar a (una roseta de)
hojas, el tallo, y los meristemos axilares fijos. Esto va seguido
por la formación de inflorescencias secundarias, hojas caulíferas y
determinados meristemos florales después de la inducción floral. La
floración implica interacciones complejas de productos génicos que
regulan un cambio en la identidad de los meristemos del brote. Los
factores que determinan los niveles de expresión de estos genes son
estímulos de genotipo y ambientales, tales como fotoperiodo,
temperatura y calidad de luz. El modo en que la transición se ve
afectada por estos estímulos es todavía desconocido en gran
parte.
Uno de los sucesos más importantes en el ciclo
vital de la planta es la decisión parra entrar en la fase
reproductora. Una extensa gama de señales ambientales y endógenas
controla esta transición de la fase vegetativa a la fase
reproductora. Señales importantes son la duración del día, la
temperatura (vernalización), la disponibilidad de nutrientes y
agua, y varias fitohormonas, especialmente la gibberelina (GA).
Estas señales inducen un cambio en la identidad de los meristemos
apicales vegetativos, denominado la transición floral, y esta
transición establece el meristemo de la inflorescencia. En tanto que
el producto del meristemo apical vegetativo son primordios de
hojas, el meristemo de la inflorescencia produce primordios que se
diferencian en inflorescencias secundarias durante el desarrollo
generativo temprano y en flores más avanzada esta etapa. En la
investigación de la reproducción vegetal, el control de este proceso
es una meta sumamente importante para una diversidad de cosechas.
Esto es especialmente cierto para las plantas de roseta tales como
la lechuga, la espinaca y la remolacha azucarera, que exhiben un
alargamiento rápido del tallo (espigado) subsiguiente a la
transición floral, y esto hace la cosecha inutilizable.
La transición desde el crecimiento vegetativo al
reproductor, es un suceso crítico del desarrollo, y dado que la
misma es el primer paso de la reproducción sexual, presenta una gran
importancia en agricultura, horticultura, y reproducción vegetal.
Los agricultores pueden desear adelantar o retardar el tiempo de
floración, o impedirlo por completo: por ejemplo para prevenir el
"espigado" v.g. en las lechugas o la remolacha azucarera. Una
comprensión mejor de la biología molecular de la floración de las
plantas permitirá que la misma sea controlada o pueda modificarse de
diversas maneras, aportando beneficios prácticos importantes a la
agricultura.
En la publicación PCT WO 96/14414, se describe el
uso del gen Constans (CO) para modificar los mecanismos de
floración en las plantas.
La presente invención propone un camino para
modificación de la transición de una planta desde el crecimiento
vegetativo al reproductor, proporcionando plantas transformadas en
las cuales la transición se retarda, o se adelanta, por expresión de
transgénes específicos que influyen en este proceso. Tales genes
pueden expresarse constitutivamente, o expresarse únicamente en
respuesta a un estímulo externo, por ejemplo ambiental o
químico.
ATH1 es un gen de caja homeótica de
Arabidopsis thaliana. El mismo ha sido descrito por
Quaedvlieg et al., en Plant Cell 7, 117-129,
1995 (incorporado en esta memoria por referencia): su secuencia de
DNA se da en la Figura 1 de dicho documento. El mismo se aisló de
una colección de factores de transcripción inducidos por la luz. Se
expresa en plantas de semillero jóvenes y flores. Los niveles de
mRNA de ATH1 en plantas de semillero etioladas son fuertemente
dependientes de la luz (fitocromo) y son también
foto-adaptativos.
Los autores de la presente invención han
establecido ahora que el producto proteínico de ATH1 está
involucrado en el cambio del desarrollo desde el crecimiento
vegetativo al generativo. Como resultado de los estudios de
ATH1::GUS y estudios iniciales de 35S::ATH1 los autores han llegado
a la deducción de que ATH1 tiene una función en la transición del
meristemo apical vegetativo a un meristemo de inflorescencia.
Específicamente, ATH1 actúa como una
anti-gibberelina, por represión de la síntesis de GA
o posiblemente del camino de respuesta a GA: el Ejemplo 6 ilustra
esto.
Los estudios de los autores de la invención sobre
constructos ATH1::GUS han revelado que en las plantas de semillero
jóvenes, cultivadas en presencia de luz, ATH1 se expresa en las tres
capas del meristemo apical del brote y los primordios foliares. En
las hojas jóvenes, todavía en desarrollo, ATH1 se expresa en tejido
vascular. Esta expresión desaparece en las hojas desarrolladas. Es
notable que la expresión del meristemo de ATH1 se restringe a la
fase vegetativa del desarrollo. Tan pronto como Arabidopsis
inicia la floración (transición vegetativa a reproductora) y el
meristemo apical del brote se ha convertido en un meristemo de
inflorescencia, la expresión de ATH1 en el meristemo se ve regulada
en sentido decreciente. Durante la fase de inflorescencia, ATH1 se
expresa a un nivel bajo en el tejido vascular en desarrollo del
tallo. Posteriormente, a lo largo del desarrollo de la planta,
cuando aparecen las flores, ATH1 se expresa en partes diferentes de
la flor joven (receptáculo, sépalos y tejido vascular de los
estambres). La hipótesis de los autores de la invención en el
sentido de que ATH1 está involucrado en el control de la transición
de fase desde el crecimiento vegetativo al reproductor se ve
confirmada por los fenotipos del tiempo de floración de
sobreexpresadores de sentido y antisentido de ATH1. Las plantas que
sobreexpresan ectópicamente ATH1 antisentido exhiben un fenotipo de
floración temprana; inversamente, la mayoría de las plantas que son
portadoras de un constructo de sobreexpresión de ATH1 de sentido son
de floración tardía. Una pequeña proporción de las plantas que
llevan el constructo de sobreexpresión son, debido a la reducción de
ATH1 por co-supresión, de floración temprana, al
igual que los sobreexpresores de ATH1 antisentido, y el fenotipo de
estas plantas se asemeja al del mutante terminal de la flor (Shannon
y Meeks-Wagner, 1991) y los fenotipos de
sobreexpresores LEAFY(Weigel y Nilsson, 1995), APETALA
1(Mandel y Yanofsky, 1995) y CONSTANS (Putteril et
al., 1995). Basándose en estos resultados, combinados con los
datos de ATH1::GUS, los autores de la invención deducen que ATH1
está involucrado en el control de la transición de fase desde el
crecimiento vegetativo al reproductoro en Arabidopsis
thaliana, y es probablemente un gen del tiempo de floración.
En consecuencia, esta transición puede promoverse
por inhibición del gen ATH1: o retardarse o prevenirse por promoción
de dicha expresión.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona un proceso para modificar la floración en las plantas
que comprende transformar las plantas con un constructo que
comprende una secuencia de DNA completa o parcial que codifica un
producto del gen ATH1 bajo el control de un promotor funcional en
las plantas. El promotor es preferiblemente heterólogo. Se describen
células vegetales transformadas con un constructo de gen vegetal de
este tipo, y plantas que comprenden tales células que tienen
propiedades de floración modificadas.
El uso de secuencias génicas para inhibir o
promover la expresión génica está perfectamente comprendido. Una
secuencia génica completa, bajo el control de un promotor que opera
eficazmente en la planta, sobreexpresará generalmente el producto
génico, conduciendo a una amplificación del efecto de la proteína
así producida. A veces el producto del gen se reduce: este fenómeno
se denomina "co-supresión". La reducción del
producto génico se obtiene también generalmente utilizando una
mutación negativa dominante, o por inversión de la orientación de la
secuencia génica con respecto al promotor de tal modo que la misma
produce RNA mensajero "antisentido".
Un constructo de DNA para uso en la invención
puede ser un constructo "antisentido" que genera RNA
"antisentido" o un constructo de "sentido" (que codifica
al menos parte de la proteína funcional) que genera RNA "de
sentido". El "RNA antisentido" es una secuencia de RNA que
es complementaria a una secuencia de bases en el mRNA
correspondiente: complementaria en el sentido de que cada base (o
la mayoría de las bases) en la secuencia antisentido (leída en el
sentido de 3' a 5') es capaz de aparearse con la base
correspondiente (G con C, A con U) en la secuencia de mRNA leída en
el sentido de 5' a 3'. Dicho RNA antisentido puede producirse en la
célula por transformación con un constructo de DNA apropiado
ordenado para generar un transcrito con al menos parte de su
secuencia complementaria a al menos parte de la cadena codificante
del gen relevante (o de una secuencia de DNA que exhibe una
homología sustancial con la misma). El "RNA de sentido" es una
secuencia de RNA que es sustancialmente homóloga a al menos parte de
la secuencia de mRNA correspondiente. Dicho RNA de sentido puede
producirse en la célula por transformación con un constructo de DNA
apropiado ordenado en la orientación normal de tal modo que genera
un transcrito con una secuencia idéntica a al menos parte de la
cadena codificante del gen relevante (o de una secuencia de DNA que
exhibe homología sustancial con ella). Constructos de sentido
adecuados pueden utilizarse para inhibir la expresión génica (tal
como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO
91/08299) o un constructo de sentido que codifica y expresa la
proteína funcional puede transformarse en la planta para
sobreexpresar la proteína.
Los constructos de DNA para uso en la invención
pueden comprender una secuencia de bases de al menos 10 bases
(preferiblemente al menos 35 bases) de longitud para transcripción
en RNA. No existe ningún límite superior teórico para la secuencia
de bases -la misma puede ser tan larga como el mRNA relevante
producido por la célula- pero por conveniencia se encontrará
generalmente adecuado utilizar secuencias entre 100 y 1000 bases de
longitud. La preparación de tales constructos se describe con mayor
detalle más adelante.
Como fuente de la secuencia de bases del DNA para
transcripción, puede utilizarse un cDNA o DNA genómico adecuado o un
polinucleótido sintético. El aislamiento de secuencias adecuadas de
ATH1 de Arabidopsis se describe en Quaedvlieg et al.,
anteriormente: pueden utilizarse métodos similares para aislar
secuencias de ATH1 de otras plantas. Estas pueden tener grados de
homología mayores o menores con las secuencias de ATH1 de
Arabidopsis. De este modo pueden obtenerse secuencias
codificantes del total, o sustancialmente el total de la proteína.
Longitudes adecuadas de estas secuencias de DNA pueden cortarse para
uso por medio de enzimas de restricción. Cuando se utiliza DNA
genómico como la fuente de una secuencia de bases parcial para
transcripción, es posible utilizar regiones de intrón o exón o una
combinación de ambas.
Para obtener constructos adecuados para
modificación de la expresión de ATH1 en células vegetales, puede
utilizarse la secuencia de cDNA que se encuentra en el cDNA de la
proteína o la secuencia del gen que se encuentra en el cromosoma de
la planta. Pueden producirse constructos de DNA recombinante
utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, la secuencia de DNA para
transcripción puede obtenerse por tratamiento de un vector que
contiene dicha secuencia con enzimas de restricción que cortan el
segmento apropiado.
La secuencia de DNA para transcripción puede
generarse también por reasociación y ligación de oligonucleótidos
sintéticos o por utilización de oligonucleótidos sintéticos en una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para dar sitios de
restricción adecuados en cada extremo. La secuencia de DNA se clona
luego a un vector que contiene secuencias promotoras aguas arriba y
secuencias de terminador aguas abajo. Si se requiere DNA
antisentido, la clonación se lleva a cabo de tal manera que la
secuencia de DNA cortada se invierte con respecto a su orientación
en la cadena de la que se cortó.
En un constructo que expresa RNA antisentido, la
cadena que era anteriormente la cadena molde se convierte en la
cadena codificante, y viceversa. El constructo codificará por tanto
RNA en una secuencia de bases que es complementaria a parte o la
totalidad de la secuencia del mRNA de la proteína. Así, las dos
cadenas de RNA son complementarias no sólo en su secuencia de bases,
sino también en sus orientaciones (5' a 3').
En un constructo que expresa RNA de sentido, las
cadenas molde y codificante retienen las asignaciones y
orientaciones del gen original de la planta. Los constructos que
expresan RNA de sentido codifican RNA con una secuencia de bases que
es homóloga a parte o la totalidad de la secuencia del mRNA. En los
constructos que expresan la proteína funcional, la totalidad de la
región codificante del gen está enlazada a secuencias de control de
la transcripción capaces de expresión en plantas.
Por ejemplo, pueden producirse constructos para
uso en la presente invención como sigue. Un vector adecuado que
contiene la secuencia de bases deseada para transcripción (tal como
el clon de cDNA de pATH1) se trata con enzimas de restricción para
cortar la secuencia. La cadena de DNA así obtenida se clona (si se
desea, en orientación inversa) a una segundo vector que contiene la
secuencia promotora deseada y la secuencia terminadora deseada.
Promotores adecuados incluyen el promotor del virus 35S del mosaico
de la coliflor y la secuencia promotora del en de la
poligalacturonasa del tomate (Bird et al., 1988, Plant
Molecular Biology, 21: 652-662) u otros promotores
de plantas regulados por el desarrollo. Secuencias terminadoras
adecuadas incluyen la del gen de la
nopalina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens
(el extremo nos 3').
En un constructo de DNA para uso en la invención,
la región de iniciación de la transcripción puede derivarse de
cualquier promotor operativo en las plantas. La región de iniciación
de la transcripción puede posicionarse para transcripción de una
secuencia de DNA que codifica RNA que es complementario a una
carrera sustancial de bases en un mRNA que codifica la proteína de
ATH1 (que convierte el constructo de DNA en un constructo
anti-sentido total o parcial).
La región de iniciación de la transcripción (o
promotora) operativa en plantas puede ser un promotor constitutivo
(tal como el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S) o un
promotor inducible o regulado por el desarrollo, como requieran las
circunstancias. Por ejemplo, puede ser deseable modificar la
actividad proteínica en ciertas etapas del desarrollo de la planta.
El uso de un promotor constitutivo tenderá a afectar los niveles de
proteínas y las funciones en todas las partes de la planta, mientras
que el uso de un promotor específico de tejido permite un control
más selectivo de la expresión génica y funciones afectadas. Así, el
RNA antisentido o de sentido se produce únicamente en el órgano en
el que se requiere su acción.
Los constructos de DNA pueden insertarse en
plantas para regular la expresión del gen ATH1 que da como resultado
la modificación de las características de la planta (en particular
la floración). Dependiendo de la naturaleza del constructo, la
producción del producto del ten ATH1 puede incrementarse, o
reducirse, sea en todo momento o en etapas particulares en la vida
de la planta. Generalmente, como sería de esperar, la producción de
la proteína es incrementada únicamente por constructos que expresan
RNA homólogo a los mRNAs sustancialmente completos de las proteínas
endógenas. Los constructos de sentido de longitud total pueden
inhibir también la expresión de la proteína. Los constructos que
contienen una secuencia incompleta de DNA más corta que la
correspondiente al gen completo inhiben por lo general la expresión
del gen y la producción de las proteínas, tanto si están ordenados
para expresar RNA de sentido como si lo están para expresar RNA
antisentido.
Un constructo de DNA se transforma en una célula
vegetal diana. La célula vegetal diana puede ser parte de una planta
entera o puede ser una célula aislada o parte de un tejido que puede
regenerarse en una planta entera. La célula de la planta diana puede
seleccionarse de cualquier especie de planta monocotiledónea o
dicotiledónea. Las plantas pueden derivarse de la célula vegetal
transformada por regeneración de transformantes y por producción de
generaciones sucesivas de la progenie de los transformantes.
Tales constructos pueden utilizarse para
transformar cualquier planta utilizando cualquier técnica de
transformación adecuada para producir plantas por el proceso de
acuerdo con la invención. Tanto células de plantas monocotiledóneas
como de plantas dicotiledóneas pueden transformarse de diversas
maneras conocidas en la técnica. En muchos casos, tales células
vegetales (particularmente cuando las mismas son células de plantas
dicotiledóneas) pueden cultivarse para regenerar plantas enteras que
subsiguientemente se reproducen para dar generaciones sucesivas de
plantas modificadas genéticamente. Puede utilizarse cualquier método
adecuado de transformación de plantas. Por ejemplo, las plantas
dicotiledóneas tales como el tomate y el melón pueden ser
transformadas por la tecnología del plásmido Ti de
Agrobacterium, tal como ha sido descrita por Bevan (1984,
Nucleic Acid Research, 12: 8711-8721) o Fillatti
et al. (Biotechnology, julio de 1987, 5:
726-730). Tales plantas transformadas pueden
reproducirse sexualmente, o por cultivo de células o tejidos. Las
plantas monocotiledóneas pueden transformarse por el uso del cañón
de genes. Otros métodos para transformación de plantas incluyen
microinyección y electroporación.
Ejemplos de plantas modificadas genéticamente
producidas por el proceso de la presente invención incluyen
cereales, por ejemplo arroz y maíz, trigo, cebada, avena y centeno.
Otros productos de semillas importantes son colza oleaginosa
(canola), remolacha azucarera, girasol, soja y sorgo. La mayoría de
las cosechas se cultivan anualmente a partir de semillas y la
producción de semillas de cualquier clase depende de la aptitud de
la planta para florecer, ser polinizada y producir semillas. En
horticultura, el control de la regulación de la floración es
importante. Plantas hortícolas cuya floración puede controlarse
incluyen lechuga, endibia y hortalizas crucíferas con inclusión del
repollo, el brécol y la coliflor, así como clavellinas y
geranios.
Las características principales de tales plantas
modificadas son floración temprana o retardada. Los genotipos en los
cuales la producción de la proteína de ATH1 se ve inhibida son por
lo general de floración temprana: los genotipos en los cuales
aquélla está estimulada florecen más tarde. Otros efectos sobre el
fenotipo de planta pueden observarse también, v.g. forma dominante
enana, por ejemplo en el tabaco.
El control del tiempo de la floración puede ser
útil por varias razones. Por ejemplo, la floración puede controlarse
para proporcionar flores o frutos en el tiempo más apropiado para la
comercialización. En la producción de híbridos, la floración de los
progenitores masculino y femenino puede coordinarse. Es muy
conveniente hacer esto por el uso de promotores de genes inducibles,
que responden a estímulos externos, por ejemplo la aplicación de
productos químicos. Un ejemplo de un promotor de este tipo es el
promotor del gen de la isoforma II de la
glutatión-S-tranferasa del maíz,
activado por aplicación de un agente fitoprotector de herbicidas
conocido (documento WO 93/01294 para ICI).
El control del espigado puede ser económicamente
importante en varias especies de cosechas. Por ejemplo, en la
remolacha azucarera, la producción de variedades que tengan una
tendencia reducida al espigado después del tratamiento en frío
podría ser de gran utilidad. Las fábricas de procesamiento podrían
prolongar sus actividades durante un periodo de tiempo más largo,
con ahorros importantes en gastos generales. Las variedades
resistentes al espigado podrían sembrarse al comienzo de la estación
(febrero) o incluso el año anterior en otoño (con tal que las
heladas invernales no constituyeran un problema). Adicionalmente,
las variedades en las cuales se aumenta el espigado pueden
reproducirse más rápidamente: los cruzamientos pueden realizarse
anualmente en lugar de bianualmente como en la actualidad.
El girasol de floración temprana podría tener un
área geográfica extendida. Podría cultivarse más al norte (al norte
de París), y posiblemente en regiones más secas, v.g. en partes de
España, evitando los periodos de sequía al final del verano.
En las hortalizas, el espigado puede controlarse,
por ejemplo en la lechuga y la endibia. Esto podría permitir el
crecimiento de la cosecha más fácilmente durante el verano. Las
variedades actuales tienden a espigarse con bastante rapidez en
condiciones de verano. En las hierbas, el espigado reducido (o nulo)
es beneficioso para los tipos forrajeros (calidad de alimento
mejorada) y los tipos estéticos (céspedes de mejor calidad).
Será ventajoso ocasionalmente regular la
expresión de los transgénes para detenerla cuando se inicia la
floración, o suprimir genes existentes naturalmente hasta que se
inicia la floración. Esto puede hacerse utilizando el promotor de
ATH1 para controlar la expresión de un transgén, o la transcripción
de DNA homólogo a un gen natural. De acuerdo con ello, constructos
de DNA alternativos comprenden el promotor de ATH1 unido a DNA
heterólogo a fin de causar la transcripción del mismo en células
vegetales: y células vegetales transformadas con tales constructos
de DNA.
El ATH1 se expresa en el meristemo vegetativo
apical, y la regulación decreciente de esta expresión coincide con
la transición floral. La expresión constitutiva forzada de ATH1 da
como resultado una represión espectacular de la transición floral
tanto en Arabidopsis como en el tabaco: así, en el caso de
Arabidopsis se pospone el espigado. Inversamente, la
represión de ATH1 da como resultado un fenotipo de floración
temprana. Los resultados obtenidos por los autores de la invención
sugieren que ATH1 ejerce su función por modulación de la biosíntesis
de o la sensibilidad a GA. Es de esperar que el gen ATH1 sea la base
de un sistema particularmente útil de control del espigado.
La transición floral ha sido particularmente bien
investigada en Arabidopsis thaliana. Esta especie se ha
convertido en el sistema modelo para estudiar la transición floral:
al nivel genético por el aislamiento de mutantes del tiempo de
floración; y al nivel molecular por clonación de genes cuyos
productos participan en el control de la transición floral.
Arabidopsis es una planta típica de roseta en la cual las
hojas vegetativas están estrechamente separadas debido a un
alargamiento reducido de los entrenudos. Durante la transición
floral, los entrenudos recién formados se alargan rápidamente
("espigado"). En la mayoría de los ecotipos de
Arabidopsis la longitud diurna es de la mayor importancia en
la determinación de la transición floral. Arabidopsis es una
planta facultativa de días largos (LD), lo que significa que la
transición floral es acelerada por los días largos (ciclo de 16
horas de luz/8 horas de oscuridad), pero no existe requerimiento
obligado alguno para ello. En condiciones de día largo (LD), la
transición floral se inicia rápidamente y se forman únicamente unas
cuantas hojas de roseta (\sim7 hojas, 16-20 días
para el ecotipo Col-0). Cuando se cultiva durante
días cortos (SD), v.g. 8 horas de luz/16 horas de oscuridad), la
transición floral requiere mucho más tiempo (\sim60 días) y se
forma un roseta sumamente hojoso que puede tener más de \sim30
hojas de roseta (ecotipo Col-0).
La invención se describirá ulteriormente con
referencia a los ejemplos y experimentos siguientes, que ilustran
ciertos aspectos de la presente invención: y con respecto a los
dibujos, en los cuales:
la Figura 1 da la secuencia de DNA del cDNA de
ATH1;
la Figura 2 es un diagrama del plásmido
pWP90;
la Figura 3 es un diagrama del plásmido
pMOG23;
la Figura 4 es un diagrama del plásmido
pVDH275;
la Figura 5 es un gráfico de barras que muestra
el enanismo causado por la expresión constitutiva de ATH1 en plantas
de tabaco de 90 días;
la Figura 6 es un gráfico de barras que muestra
el tiempo de floración (en términos de números de hojas de roseta
formadas) para los infra- y sobreexpresores de ATH1 en comparación
con Arabidopsis de tipo salvaje (ecotipo C24).
Los fenotipos de tipo salvaje utilizados fueron
Arabidopsis thaliana Columbia y C24. El gen ATH1 está
localizado en el cromosoma 4, entre los marcadores RFLP mi431 (96,9
cM) y 06455 (97,9 cM). Se utilizó Arabidopsis thaliana
Columbia en los experimentos de transformación de plantas que
utilizaron el protocolo de infiltración a vacío, mientras que se
utilizó Arabidopsis thaliana C24 en los experimentos de
transformación de plantas que utilizaron el protocolo de
transformación de las raíces.
Las plantas se cultivaron en una cámara de
cultivo bajo luz fluorescente con un fotoperiodo de 16 horas seguido
por un periodo de 8 horas de oscuridad a una temperatura continua de
22ºC.
Para medir el tiempo de floración, las semillas
se embebieron y se pusieron a 4ºC durante 4 días para interrumpir el
reposo vegetativo y se sembraron luego en tierra vegetal. Las
plantas de semillero que germinaron se cubrieron usualmente con
tapas propagadoras durante las primeras 1-2 semanas
para impedir la deshidratación.
Constructos binarios que contenían genes
quiméricos ATH1-GUS y genes de ATH1
35S-antisentido se transformaron en Arabidopsis
thaliana ecotipo C24 utilizando el método de transformación de
raíces mediado por Agrobacterium tumefaciens de Valvekens
et al. (1988). Los transformantes se seleccionaron en medio
que contenía 50 mg/l de kanamicina.
Constructos binarios que contenían genes
quiméricos 35S-ATH1 se transformaron en
Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia utilizando el protocolo
de infiltración a vacío (Bent et al. (1994); Bechtold et
al. (1993)) con algunas modificaciones. Las plantas se
cultivaron por separado en tiestos de 5,5 cm. Las plantas se
transformaron después de la aparición de las primeras silicuas en
las "espigas" secundarias.
Cultivos de 900 ml de Agrobacterium
tumefaciens que contenían el constructo apropiado se cultivaron
la noche anterior al día de infiltración, se cosecharon las células
por centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de medio
de infiltración, que contenía 2% en lugar de 5% de sacarosa. Las
plantas se infiltraron por inmersión de las rosetas enteras y las
"espigas" durante 10 minutos bajo una presión de vacío de 100
mm de Hg.
Las semillas transformantes se seleccionaron en
medio que contenía 50 mg/l de kanamicina.
El RNA total de las plantas se aisló de acuerdo
con De Vries et al. (1988) con algunas modificaciones de
menor importancia: (1) el tejido vegetal se trituró en nitrógeno
líquido en presencia de la mitad del volumen de fenol/tampón de
extracción y se calentó a 65ºC en un baño de agua y (2) el RNA se
precipitó con etanol/acetato de sodio antes y después de la
precipitación con LiCl.
El fragmento HindIII-XhoI del
fagémido ATH1 se clonó en pBluescript SK(-) (Stratagene) y se
digirió con HindIII para producir un molde de
RNA-polimerasa T7. La sonda de RNA de ATH1 protege
un fragmento de 140 nucleótidos. La sonda de RNA se sintetizó
utilizando una RNA polimerasa T7 (Pharmacia) y tampón como se
describe por el fabricante, excepto que se utilizaron 160 \muCi de
[-^{32}P]UTP (800 Ci/mmol). La protección contra las
RNAsas se realizó utilizando 10 \mug de RNA total y 10 \mug de
tRNA de acuerdo con el protocolo descrito por Sambrook et al.
(1989). La mezcla digerida contenía 600 unidades/ml de RNAasa T1
(Gibco BRL) y 20 \mug/ml de RNAasa A (Boehringer). Se analizaron
los híbridos RNA:RNA por electroforesis en gel de secuencia (6%
poliacrilamida/urea 7M) y se visualizaron por autorradiografía.
Se aisló un fragmento SpeI-NcoI
que contenía aproximadamente 1300 nucleótidos de la secuencia
promotora de ATH1. Después de rellenado del sitio NcoI con
polimerasa Klenow, este fragmento se insertó en los sitios
singulares SmaI/XbaI del vector binario pBi 101.1 que
contiene el gen GUS (Jefferson et al., 1987), creando una
fusión de traducción entre el promotor de ATH1 y el gen GUS. La
proteína codificada por este gen quimérico está constituida por 42
aminoácidos de ATH1 fusionados a la proteína GUS. El constructo
binario se denominó tH1.4. Se transformó tH1.4 en células
competentes de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Gelvin y
Schilperoort, 1988). Las líneas de Arabidopsis (ecotipo C24)
se transformaron como se describe más adelante.
Plantas de semillero y tejidos vegetales se
recogieron y se tiñeron durante 1 a 16 horas a 37ºC en una solución
que contenía 0,5 mg/ml de X-Gluc (Biosynth AG)
disuelto en n-dimetil-formamida,
Triton X-100 al 0,1%,
K4Fe(CN)6.H_{2}O 0,5 mM, K3Fe(CN)6 0,5
mM y tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2.
Después de la tinción con X-Gluc
los tejidos vegetales se fijaron durante una noche en una solución
que contenía 1% de aldehído glutárico y 4% de formaldehído en tampón
de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2. Subsiguientemente, las plantas de
semillero se deshidrataron en pasos graduales: etanol al 10%, 30%,
50%, 70%, 90% y 2x 100%. Los tejidos grandes de las plantas se
embebieron previamente en primer lugar en agarosa al 1% (Sigma). La
infiltración e imbibición en Technovite 7100 (Kulzer, Hereaus) se
realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se
prepararon secciones de 4 \mum en un equipo rotativo
Reichert-Jung 1140 que llevaba una cuchilla de
acero Adams desechable. Las secciones se tiñeron con rojo de rutenio
al 0,1% (Sigma) en agua destilada durante 2 minutos a la tem-
peratura ambiente y se fotografiaron en un equipo Zeiss Axioskop, utilizando película Kodak Professional Ektar 25.
peratura ambiente y se fotografiaron en un equipo Zeiss Axioskop, utilizando película Kodak Professional Ektar 25.
Las plantas de semillero se fijaron y
deshidrataron como anteriormente. Se infiltró Technovit 7100 durante
1 día. Las plantas de semillero se transformaron luego a una
construcción de transparacencia de celuloide (Amovis), cinta de
doble cara, transferencia, cinta de doble cara. En las tres últimas
capas se cortó una región central que alojaba la planta de
semillero. Subsiguientemente, las plantas de semillero se añadieron
en solución de Technovit 7100 y la región central se cubrió por otra
transparencia. Después de polimerización durante una noche a la
temperatura ambiente, se obtuvo una laminilla de plástico que
contenía la planta de semillero. A fin de seccionar las plantas de
semillero embebidas en la laminilla, se retiró el material de la
hoja de celuloide y se cortó la laminilla para permitir el
seccionamiento longitudinal de regiones relevantes de la planta de
semillero. El seccionamiento, la tinción y el fotografiado se
realizaron como se ha descrito arriba.
La expresión del gen ATH1 se realizó utilizando
análisis de protección contra RNA-asas (Quaedvlieg
et al., 1995). Se detectaron niveles elevados de mRNA de ATH1
durante el desarrollo inicial de la planta de semillero (días
2-6) y en las flores de las plantas maduras de
Arabidopsis. La localización celular de la expresión del gen
ATH1 se determinó por introducción del constructo quimérico tH1.4
ATH1-GUS en Arabidopsis thaliana. Se tiñeron
diferentes tejidos con X-gluc, y se realizaron
preparaciones de portaobjetos y seccionamiento de los tejidos para
visualizar la actividad de GUS (véase más adelante).
El ápice del brote de una planta de semillero de
5 días cultivada en presencia de luz es plano y está constituido por
una túnica de dos capas que encierra el corpus subyacente. En esta
etapa, el meristemo ha iniciado los primordios del primer par de
hojas (Mischke y Brown, 1965).
En las plantas transformadas con tH1.4, estaban
presentes niveles elevados de actividad de GUS en el ápice del
brote. El seccionamiento del ápice del brote demostró que la
actividad alta de GUS se muestra en la totalidad de las tres capas
del meristemo apical del brote y se extiende a través de la región
subapical, progresando hacia abajo hasta donde el cordón vascular
del hipocótilo se ramifica en los cotiledones. Estaban también
presentes niveles elevados de actividad de GUS en los primordios del
primer par de hojas.
Inicialmente, durante la fase de inflorescencia,
el meristemo apical del brote da lugar al tallo, las hojas
caulíferas y las inflorescencias secundarias. A media que progresa
el desarrollo de la inflorescencia, el meristemo de la
inflorescencia produce primordios de flor. En las plantas
transformadas con tH1.4, la actividad de GUS estaba regulada
decrecientemente en el meristemo de la inflorescencia durante la
fase de transición. No se detectaba actividad alguna de GUS en el
meristemo. Estaban presentes niveles bajos de actividad de GUS en la
zona del nervio. Posteriormente, cuando aparecieron las flores,
estaba presente actividad de GUS en diferentes partes de la flor
joven (receptáculo, sépalos y tejido vascular de los estambres).
El cDNA de ATH1 se clona a los sitios de
restricción singulares EcoRI/XhoI del vector bien conocido y
disponible comercialmente pBluescript SK(-) (Stratagene).
Un fragmento BamHI/SnaBI que contiene 1573
nucleótidos de la secuencia de cDNA de ATH1 (el sitio BamHI fue
creado por mutagénesis PCR, 35 nucleótidos aguas abajo del comienzo
de la traducción) se aisló y se insertó en los sitios de clonación
singulares BamHI/SmaI del vector pWP90, que contiene un promotor
doble 35S CaMV y un terminador NOS (véase la Figura 2), dando como
resultado una fusión de transcripción entre el promotor doble 35S
CaMV y el cDNA de ATH1. Este constructo, denominado cH1.24, se cortó
luego con las enzimas de restricción SstI/EcoRV, seguido por
inserción del inserto SstI/EcoRV resultante en los sitios de
restricción singulares SstI/SmaI del vector binario pMOG23 (véase la
Figura 3). El constructo binario se denominó tH1.2. Se transformó
tH1.2 en células competentes de Agrobacterium tumefaciens
pGV2260 (Caplan et al., 1985). Las líneas de
Arabidopsis (ecotipo Col-0) se transformaron
por infiltración a vacío como se describe a continuación.
Un fragmento EcoRI/SnaB1 que contenía
aproximadamente 1830 nucleótidos de la secuencia de cDNA de ATH1 se
aisló y se insertó en los sitios de clonación singulares SmaI/EcoRI
del vector pWP90 (véase la Figura 2), dando como resultado una
fusión de transcripción entre el promotor doble 35S de CaMV y el
marco de ATH1 antisentido. El constructo resultante se denominó
cH1.22. Una inserción EcoRV/SstI de cH1.22 se clonó luego en los
sitios de restricción singulares SmaI/SacI del vector binario pMOG23
(MOGEN) (véase Figura 3). Este constructo binario, denominado tH1.1,
se transformó en células competentes de Agrobacterium
tumefaciens LBA4404. Las líneas de Arabidopsis (ecotipo
C24) se transformaron como se describe más adelante.
Por mutagénesis PCR, se creó un sitio BamHI
adicional en pTT19, un vector que contiene el promotor, el conductor
y 77 nucleótidos de la secuencia codificante del gen del choque
térmico Hsp18.2 de Arabidopsis thaliana (Takahashi y Komeda,
1989). El sitio BamH1 adicional está localizado en el conductor de
Hsp18.2 no traducido en el nucleótido -710 del comienzo de la
traducción de Hsp18.2.
Por digestión de restricción con BamHI, se
eliminaron el conductor 5' no traducido y 77 nucleótidos de la
secuencia codificante de Hsp18.2. El constructo restante se denominó
pTT19 sin conductor. Un fragmento HindIII/BamHI de este pTT19 sin
conductor, que contenía solamente la secuencia promotora de Hsp18.2,
se fusionó a un fragmento BamHI/EcoRI que contenía la secuencia
entera del cDNA de ATH1, lo que da como resultado una fusión de
transcripción del promotor de Hsp18.2 con el conductor no traducido
5' de ATH1 y la secuencia codificante. Se crearon los sitios BamHI y
EcoRI por mutagénesis PCR, dando como resultado un sitio de
restricción BamHI al comienzo de la secuencia de cDNA de ATH1 y un
sitio de restricción EcoRI inmediatamente aguas abajo del codón de
parada TAA. El fragmento resultante HindIII/EcoRI se insertó en los
sitios de restricción singulares HindIII/EcoRI del vector pWP90
(véase la Figura 2) y este nuevo constructo se digirió luego
parcialmente con las enzimas de restricción HindIII y EcoRV. El
fragmento de restricción más grande HindIII/EcoRV se insertó luego
en el vector binario pBIN19 cortado con HindIII/SmaI (Frisch et
al., 1995). Este constructo se denominó HspH1.
Se realizó también una fusión de transcripción
entre el promotor Hsp18.2 y la secuencia codificante de ATH1 sin la
secuencia conductora. En el cDNA de ATH1 se creó un sitio adicional
BamHI por mutagénesis PCR inmediatamente aguas arriba del comienzo
de la traducción. La digestión de este sitio BamHI combinada con la
digestión del sitio singular XhoI en el cDNA de ATH1 da como
resultado un fragmento de aproximadamente 680 nucleótidos, que
contiene la secuencia codificante de ATH1. Este fragmento de 680
nucleótidos se intercambió con un fragmento grande de
aproximadamente 980 nucleótidos que se forma después de la digestión
de HspH1 con las enzimas de restricción BamHI/XhoI. Esto da como
resultado HspH1B, una fusión de transcripción entre la secuencia
codificante de ATH1 sin conductor y el promotor Hsp18.2.
Tanto HspH1 como HspH1B se transformaron a
células competentes de Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Las
líneas de Arabidopsis (ecotipo C24) se transformaron como se
describe más adelante.
Puede realizarse una fusión de transcripción
entre el promotor de plastocianina del guisante y la secuencia
codificante de ATH1 por inserción de la secuencia codificante de
ATH1 en los sitios de restricción singulares de BamHI y SalI de
pVDH275 (Pwee y Gray, 1993; Last y Gray, 1989) (véase también la
Figura 4). En la secuencia codificante de ATH1, pueden crearse
sitios adicionales de restricción SalI (inmediatamente aguas arriba
del ATG de comienzo de ATH1) y BamHI (inmediatamente después del TAA
de parada de ATH1) por mutagénesis PCR. El constructo resultante en
el que se inserta la secuencia codificante de ATH1 entre el promotor
de plastocianina del guisante y el terminador nos de
Agrobacterium, puede transformarse a células de
Agrobacterium tumefaciens, seguido por transformación de las
plantas.
Pueden introducirse copias adicionales de ATH1 en
plantas de Arabidopsis por transformación de las mismas con
loci adicionales de ATH1 que contienen el promotor de ATH1 y
la secuencia codificante de ATH1. Esto puede hacerse por fusión del
fragmento grande SnaBI/NcoI de aproximadamente 1.000 nucleótidos de
longitud del cDNA de ATH1 al fragmento de restricción grande
SstI/EcoRI de aproximadamente 250 nucleótidos de pBI101.1, que
contiene el terminador nos de Agrobacterium (Jefferson et
al., 1987). El fragmento resultante puede fusionarse al
fragmento de restricción grande NcoI de aproximadamente 3,5 Kb del
clon genómico de ATH1 (Quaedvlieg et al., 1995). El fragmento
grande NcoI/EcoRI de aproximadamente 4750 nucleótidos así formado,
que contiene el promotor de ATH1, la secuencia codificante de ATH1 y
el terminador nos, puede insertarse en el vector de clonación pMTL23
cortado con NcoI/EcoRI (Chambers et al., 1988). Un fragmento
de restricción StuI/EcoRI del constructo resultante puede insertarse
luego en el vector binario pMOG23 cortado con EcoRI/SmaI, y las
células de Agrobacterium pueden transformarse, seguido
subsiguiente-mente por transformación de
plantas.
El tiempo de floración se midió contando el
número de hojas, con la exclusión de los cotiledones en la roseta en
el momento en que se hizo visible el capullo de la flor. Se ha
demostrado previamente una correlación estrecha entre el número de
hojas y el tiempo de floración (Koorneef et al., 1991;
Bagnall (1993)).
A fin de comprender mejor el papel de ATH1 en el
desarrollo de la planta, la secuencia de cDNA de ATH1 de longitud
total se fusionó al promotor constitutivo 35S del virus del mosaico
de la coliflor y el gen quimérico 35S::ATH1 así producido se
transformó en Arabidopsis, ecotipo Col-0 por
el método de infiltración a vacío. Se obtuvieron seis transformantes
primarios independientes.
Todas estas líneas transgénicas se
autofecundaron. De cada línea transgénica independiente se
germinaron en tierra vegetal 40 semillas individuales y se evaluaron
respecto a fenotipos alterados comparados con plantas de tipo
salvaje. Cuatro de seis líneas exhibían un fenotipo alterado con
respecto al tiempo de floración. En tres de estas líneas todas las
plantas eran de floración tardía (aproximadamente 14 hojas de roseta
hasta la floración comparado con aproximadamente 10 hojas de roseta
en las plantas Col-0 de tipo salvaje). En la línea
restante, aproximadamente el 85% de las plantas exhibían este mismo
fenotipo de floración tardía, mientras que el 15% de las plantas
exhibían un fenotipo de floración temprana (después de
aproximadamente 7 hojas de roseta), como se ensayó debido a la
ausencia de RNA de ATH1. Estas plantas de floración temprana exhiben
también un fenotipo de flor terminal, a menudo con flores
incompletas y órganos florales mutantes.
Al igual que la sobreexpresión ectópica de ATH1,
la inhibición de la función del gen ATH1 puede utilizarse también
para influir en el tiempo de floración. La inhibición de la función
del gen se efectuó por sobreexpresión constitutiva de ATH1
antisentido.
Se fusionó cDNA de ATH1 antisentido de longitud
total al promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la
coliflor, y el gen quimérico 35S::ATH1 antisentido así producido se
transformó en el ecotipo C24 de Arabidopsis por el protocolo
de transformación de las raíces de Valvekens. Se obtuvieron 22
transformantes independientes y se autopolinizaron todos ellos. De
cada línea se germinaron 10 semillas individuales en tierra vegetal
y se evaluaron respecto a fenotipos alterados en comparación con las
plantas de tipo salvaje C24. En cinco de estas líneas, las plantas
exhibían un fenotipo de floración temprana: la floración se iniciaba
después de la formación de entre 6 y 10 hojas de roseta, comparada
con aproximadamente 20 hojas en las plantas de tipo salvaje.
Como en Arabidopsis, la sobreexpresión
ectópica de cDNA de ATH1 (impulsada por el promotor 35S del virus
del mosaico de la coliflor) en el tabaco (Nicotiana tabacum
cv. Samsun) conducía también a un retardo en el tiempo de
floración comparada con el tabaco de tipo salvaje. En las plantas de
tabaco 35S::ATH1, la floración se retardaba en semanas o meses.
Estas plantan tenían también una constitución enana. Esta forma
dominante enana, al igual que el fenotipo de floración, está
claramente en correlación con el nivel de expresión del transgén. En
el caso más grave, las plantas no florecían en absoluto, y
alcanzaban únicamente una quinta parte de su altura normal, mientras
que en los casos menos graves las plantas se retardaban en la
floración solamente en una a dos semanas y alcanzaban
aproximadamente las cuatro quintas partes de su altura normal. El
número y la forma de las hojas eran normales en todas estas plantas
transformadas.
Se transformaron plantas de tabaco (Nicotiana
tabacum L. cv. Samsun NN) utilizando el procedimiento de los
discos de hojas (Horsch et al., 1985). Se seleccionaron
plantas transgénicas en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) que
contenía 300 mg/ml de kanamicina y 2% de sacarosa. Después de
transferencia a tierra vegetal, las plantas se cultivaron en un
invernadero a 22ºC bajo un régimen de luz de 16 horas de luz diurna
complementada en caso necesario con luz artificial. Se midió la
altura de las plantas cada 3 a 4 días y se continuó haciéndolo así
hasta el comienzo de la floración, tal como se determinó por la
aparición de los primordios florales.
Con objeto de expresar el gen ATH1
constitutivamente en plantas transgénicas, se puso su región
codificante bajo el control del promotor 35S de CaMV y el constructo
resultante se transformó a tabaco (Nicotiana tabacum cv.
Samsun NN). Se obtuvieron 40 plantas independientes resistentes a la
kanamicina, de las cuales únicamente 5 exhibían una expresión
detectable del transgén. Los niveles de mRNA de ATH1 variaban desde
altos en las plantas H1OE#4, #10 y #30 hasta niveles
intermedios/bajos en plantas H1OE#35 y #37. Dependiendo del nivel de
expresión de ATH1, la floración de estas plantas se retardaba en
semanas hasta meses, cuando se comparó con las plantas de tipo
salvaje, que florecen al cabo de 3-5 meses
dependiendo de la estación. En el caso más grave (H1OE#4), las
plantas no florecían nunca hasta la senescencia (>15 meses
después de la siembra). Las plantas H1OE#10 y #30, que exhiben una
expresión alta de ATH1, florecían al cabo de 15 meses, mientras que
las plantas que exhibían la sobreexpresión intermedia/baja, H1OE#35
y #37 no florecían hasta después de 6 meses. Al igual que el
fenotipo de tiempo de floración alterado, las plantas
sobreexpresoras de ATH1 exhiben un crecimiento reducido del tallo,
dando como resultado plantas enanas. En este caso existe una
correlación clara entre la gravedad del fenotipo de crecimiento
enano y el nivel de expresión del transgén (véase la Figura 5). En
el caso más grave las plantas alcanzan sólo aproximadamente la
quinta parte de su altura normal. El número de hojas varía desde 2
veces mayor que el tipo salvaje hasta el número normal en todos los
transgénes.
Con objeto de comprender mejor el papel de ATH1
en el desarrollo de las plantas, se fusionó el cDNA de ATH1 de
longitud total al promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de
la coliflor y el gen quimérico 35S::ATH1 se transformó en
Arabidopsis por el método de infiltración a vacío. Pudieron
obtenerse seis transformantes primarios independientes, y todas las
líneas transgénicas se autopolinizaron. A partir de cada línea
transgénica independiente se germinaron 40 semillas individuales y
se evaluaron respecto a fenotipos alterados comparadas con plantas
de tipo salvaje. Cuatro de seis líneas exhibían un fenotipo alterado
respecto al tiempo de floración. Las semillas de estas líneas no
germinaban bien y, si lo hacían, las plantas se detenían en una
etapa de planta de semillero. Ambos efectos pudieron resolverse
transfiriendo las plantas a un medio de crecimiento que contenía GA3
10^{-5}M y dejándolas crecer en este medio durante 3 días. Una vez
rescatadas y transferidas a tierra vegetal, las plantas se
desarrollaban normalmente, excepto en lo que respecta a un fenotipo
de floración tardía. En condiciones de día corto, las plantas
transgénicas forman un número mucho mayor de hojas de roseta (hojas
vegetativas) que las plantas de tipo salvaje (aproximadamente 40
hojas de roseta y 100 días después de la germinación, y las plantas
no florecen todavía, comparado con aproximadamente 30 hojas de
roseta en las plantas de tipo salvaje hasta la floración). En
condiciones LD, en la mayoría de estas plantas ocurre una inversión
parcial de generadora a vegetativa, demostrada por la formación de
rosetas aéreas (hojas vegetativas) en el tallo de la inflorescencia.
Las plantas (ecotipo C24) que contienen una copia adicional del cDNA
de ATH1 bajo control del promotor del choque térmico Hsp18.2
(plantas HspH1B) exhiben también un fenotipo de floración tardía.
Incluso sin un choque térmico (es sabido que este promotor tiene una
actividad basal sin inducción) las plantas que albergan este
constructo florecen mucho más tarde en condiciones LD que las
plantas de tipo salvaje (30,5 hojas de
roseta formadas en el tipo salvaje frente a 61 hojas de roseta formadas en las plantas HspH1B - véase la Figura 7).
roseta formadas en el tipo salvaje frente a 61 hojas de roseta formadas en las plantas HspH1B - véase la Figura 7).
Al igual que la sobreexpresión ectópica de ATH1,
la desactivación ("knocking-out") de la función
del gen ATH1 puede ayudar también a la comprensión de la función de
ATH1 en el desarrollo de las plantas. La desactivación de la función
del gen se estableció por sobreexpresión constitutiva de ATH1
antisentido. El cDNA de ATH1 antisentido de longitud total se
fusionó al promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la
coliflor y el gen quimérico 35S::ATH1 antisentido se transformó en
el ecotipo C24 de Arabidopsis por el protocolo de
transformación de la raíz de Valvekens. Se obtuvieron 22
transformantes independientes y se autopolinizaron todos ellos.
De cada línea se germinaron 10 semillas
individuales en tierra vegetal y se evaluaron respecto a fenotipos
alterados comparados con plantas C24 de tipo salvaje. En cinco de
estas líneas las plantas exhibían un fenotipo de floración temprana:
la floración se iniciaba después de la formación de aproximadamente
10 hojas de roseta en comparación con aproximadamente 30 hojas en
las plantas de tipo salvaje (véase la Figura 7).
Bagnall, 1993: Ann. Bot.
71:75-83
Bechtold et al., 1993: C. R.
Acad. Sci. París, Life Sciences
316:1194-1199
Bent et al., 1994:
Science 265:1856-1960
Caplan et al., 1985: J.
Bacteriology 161:655-664
Chambers et al., 1988:
Gene 68:139-149
Frisch et al., 1995:
Plant Mol. Biol. 27:405-409
Gelvin and Schilperoort,
1988: Plant Molecular Biology Manual:Dordrecht: Kluwer
Academic Publisher.
Jefferson et al., 1987:
EMBO J. 6:3901 –3907
Koorneef et al., 1991:
Mol. Gen. Genet. 229:57-66
Last and Gray, 1989:
Plant Mol. Biol. 12:655-666
Mandel and Yanofski, 1995:
Nature 377:523-524
Putteril et al., 1995:
Cell 80:847-857
Pwee and Gray, 1993:
Plant J. 3:437-449
Quaedvlieg et al., 1995:
The Plant Cell 7:117-129
Shannon and
Meeks-Wagner, 1991: The Plant
Cell:877-892
Takahashi and Komeda, 1989:
Mol. Gen. Genet. 219:365
Takahashi et al., 1992:
Plant J. 2:751-761
Weigel and Nilsson, 1995:
Nature 377:495-500
Horsch, R., Fry, F.,
Hoffman, N., Eichholtz, D., Rogers, S. and
Fraley, R. (1985), A simple and general method for
transferring genes into plants. Science
227,1229-1231.
Murashige, T. and Skoog, F.
(1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15,
473-479.
Robson, P.R.H., McCormac, A.C.,
Irvine, A.S., and Smith, H. (1996). Genetic
engineering of harvest index in tobacco through overexpression of a
phytochrome gene. Nature Biotechnology 14(8),
995-998.
Wilson, R.N., Heckman, J.W., and
Sommerville, C.R. (1992). Gibberellin is required for
flowering in Arabidopsis thaliana under short days. Plant.
Phys. 100, 403-408.
Claims (4)
1. Un proceso para modificar la floración en las
plantas, que comprende transformar las plantas con un constructo que
comprende una secuencia de DNA completa o parcial que codifica un
producto del gen ATH1 bajo el control de un promotor funcional en
las plantas.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
por el cual el proceso de floración en las plantas se promueve por
transformación de las plantas utilizando un constructo que inhibe la
producción de la proteína de ATH1.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2,
en el cual el constructo está adaptado para expresar RNA antisentido
respecto al RNA producido por el gen ATH1.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
por el cual el proceso de floración en las plantas se retarda por
transformación de las plantas utilizando un constructo que promueve
la producción de la proteína de ATH1 recombinante.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9709789 | 1997-05-14 | ||
| GBGB9709789.3A GB9709789D0 (en) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | Plant gene constructs and their use |
| GBGB9727458.3A GB9727458D0 (en) | 1997-12-30 | 1997-12-30 | Plant gene constructs and their use |
| GB9727458 | 1997-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2255158T3 true ES2255158T3 (es) | 2006-06-16 |
Family
ID=26311533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98919436T Expired - Lifetime ES2255158T3 (es) | 1997-05-14 | 1998-05-14 | Proceso para modificacion de la floracion de las plantas. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6864051B1 (es) |
| EP (2) | EP0981621B1 (es) |
| AR (1) | AR015667A1 (es) |
| AT (1) | ATE311454T1 (es) |
| AU (1) | AU753726B2 (es) |
| CA (1) | CA2288641A1 (es) |
| DE (1) | DE69832600T2 (es) |
| DK (1) | DK0981621T3 (es) |
| ES (1) | ES2255158T3 (es) |
| HU (1) | HU225301B1 (es) |
| NZ (1) | NZ500737A (es) |
| WO (1) | WO1998051800A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001287697B2 (en) * | 2000-08-18 | 2006-07-13 | Advanta Seeds B.V. | Inhibition of generative propagation in genetically modified herbicide resistant grasses |
| DE10043902A1 (de) * | 2000-09-06 | 2002-03-14 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierung des Phänotyps von Pflanzen durch ektopische Expression von Homöoboxgenen |
| US20110055946A1 (en) * | 2008-02-12 | 2011-03-03 | Dow Agrosciences Llc | Dominant earliness mutation and gene in sunflower (helianthus annuus) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5744693A (en) * | 1992-10-02 | 1998-04-28 | California Institute Of Technology | Plants having altered floral development |
| GB9422083D0 (en) * | 1994-11-02 | 1994-12-21 | Innes John Centre | Genetic control of flowering |
| GB9518731D0 (en) | 1995-09-13 | 1995-11-15 | Innes John Centre | Flowering genes |
-
1998
- 1998-05-14 HU HU0001909A patent/HU225301B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-05-14 ES ES98919436T patent/ES2255158T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-14 EP EP98919436A patent/EP0981621B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-14 NZ NZ500737A patent/NZ500737A/en unknown
- 1998-05-14 EP EP05109849A patent/EP1647598A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-14 AT AT98919436T patent/ATE311454T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-14 AU AU72298/98A patent/AU753726B2/en not_active Ceased
- 1998-05-14 WO PCT/IB1998/000821 patent/WO1998051800A1/en not_active Ceased
- 1998-05-14 US US09/423,575 patent/US6864051B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 DK DK98919436T patent/DK0981621T3/da active
- 1998-05-14 DE DE69832600T patent/DE69832600T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 CA CA002288641A patent/CA2288641A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-14 AR ARP980102242A patent/AR015667A1/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69832600T2 (de) | 2006-09-21 |
| NZ500737A (en) | 2001-06-29 |
| AU7229898A (en) | 1998-12-08 |
| DE69832600D1 (de) | 2006-01-05 |
| HUP0001909A2 (hu) | 2000-09-28 |
| EP0981621B1 (en) | 2005-11-30 |
| DK0981621T3 (da) | 2006-04-03 |
| HU225301B1 (en) | 2006-09-28 |
| EP1647598A1 (en) | 2006-04-19 |
| EP0981621A1 (en) | 2000-03-01 |
| WO1998051800A1 (en) | 1998-11-19 |
| AR015667A1 (es) | 2001-05-16 |
| ATE311454T1 (de) | 2005-12-15 |
| HUP0001909A3 (en) | 2002-04-29 |
| AU753726B2 (en) | 2002-10-24 |
| CA2288641A1 (en) | 1998-11-19 |
| US6864051B1 (en) | 2005-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2321349T3 (es) | Procedimiento y medios para el control de la floracion de las plantas. | |
| ES2307491T3 (es) | Metodos y medios para la modificacion de caracteristicas de la planta usando la vernalizacion gen vrn2. | |
| CN112322654B (zh) | 玉米转录因子ZmMYB42基因在植物抗旱育种中的应用 | |
| JP2018078909A (ja) | タバコに開花抑制特性を提供するｆｔファミリーの核酸及びペプチド／タンパク質並びにそれで形質転換された遺伝子組み換え植物 | |
| WO2000032760A1 (en) | Method of increasing growth and yield in plants | |
| US20120131691A1 (en) | Light-regulated promoters | |
| JP2009540822A (ja) | 植物の構造及び成長を調節するための植物クロマチンリモデリング遺伝子の使用 | |
| ES2400540T3 (es) | Promotores inducibles por deficiencia de agua | |
| CN108456683B (zh) | 一个调控水稻抽穗期基因sid1的功能及应用 | |
| CN103789322B (zh) | 植物转录因子dst在调控植物结实率及提高植物抗高温能力中的应用 | |
| BRPI0318314B1 (pt) | vetor, célula hospedeira de fungo ou bactéria, e método para a produção de uma planta transgênica tolerante ao stress de água. | |
| ES2255158T3 (es) | Proceso para modificacion de la floracion de las plantas. | |
| JP6292572B2 (ja) | アブシジン酸非感受性遺伝子を用いた植物の耐冷性強化法 | |
| CN115896130A (zh) | 一种马铃薯块茎发芽基因在调控植物生长和增加植物地上生物量的用途 | |
| Iezzoni et al. | Enhancement of freezing tolerance of strawberry by heterologous expression of CBF1 | |
| CN104673803A (zh) | 基因甲基化在调控基因表达方面的应用 | |
| CN102220347B (zh) | 小麦TaTOC1基因及其克隆方法和应用 | |
| CN103088036B (zh) | 大豆 GmMADS2基因及其应用 | |
| KR100897763B1 (ko) | 파이토시스타틴 유전자 발현에 의한 발아 지연 및 시스테인단백질 분해효소 활성 억제가 가능한 형질전환 식물체 | |
| JP2003310071A (ja) | 増強されたストレス耐性を有する遺伝子組換え植物 | |
| PL190228B1 (pl) | Sposób modyfikowania kwitnienia w roślinach | |
| KR101444215B1 (ko) | 배추 유래 ＢｒＳＴＹ１ 프로모터 및 상기ＢｒＳＴＹ１ 프로모터로 형질 전환된 식물 | |
| CZ401499A3 (cs) | Konstrukce rostlinných genů a jejich použití |