CZ401499A3 - Konstrukce rostlinných genů a jejich použití - Google Patents

Abstract

Rostlinná genová konstrukce, která obsahuje celou nebo částečnou sekvenci DNAkódující genový produkt ΑΊΉ1 aje řízena promotoremfunkčnímv rostlinách. Promotorje s výhodou heterologní. Rostlinné buňky transformované uvedenou rostlinnou genovou konstrukcí a rostliny, obsahující takové buňky, mající modifikované vlastnosti kvetení. Dále se popisuje způsob modifikace procesu kvetení v rostlinách tím, že se rostliny transformují konstrukcí podle řešení.

Description

Konstrukce rostlinných genů a jejich použití

Oblast techniky

T>V(Wf- 'iCp v*

Vynález se týká nových konstrukcí rostlinných genů a ^x jejich použití při řízení kvetení rostlin. Dále se týká rostlin, které obsahují takové konstrukce.

a kořenů. Apikální embryogeneze rostlin embryonálními kořeny

Dosavadní stav techniky

Rostliny se liší od.zvířat. Tělo dospělé rostliny se tvoří post-embryonálně stálou aktivitou apikálního meristému výhonků meristém výhonků se tvoří během a spolu s dělohami, hypokotylem, nebo kořenovým meristémem vytváří základní plán těla rostliny.

Apikální meristém výhonků začíná jako cluster přibližně jednoho, sta buněk a je zdrojem celé povrchové části rostliny. Během vegetativní fáze vývoje rostliny tento meristém dává vznik listům, stonku a inaktivnímu axilárnímu meristému. Pak následuje vytvoření sekundárního květenství, stonkových listů a po indukci kvetení dojde k determinaci meristém kvetení. Kvetení zahrnuje komplex interakcí genových produktů, které regulují přepínání identity meristému výhonků. Faktory stanovující sílu exprese těchto genů jsou genotypové stimuly a stimuly prostředí, jako je fotoperioda, teplota a druh světla. Jak tyto stimuly ovlivňují tranzici, zatím není známo.

Jeden z nejdůležitějších bodů v rostlinném životním cyklu je rozhodnutí vstupu do reprodukční fáze. Široké rozmezí signálů prostředí a endogenních signálů řídí tuto tranzici vegetativní fáze do reprodukční fáze. Důležitými signály jsou délka dne, teplota (vernalizace), dostupnost nutrientů a vody a několika fytohormonů, zvláště giberelínu (GA) . Tyto signály indukují posun v identitě vegetativního apikálního meristému označeném rostlinná tranzice a tato tranzice dává vzniku • · · · ·· ·· • · · · • · · · • · · · · meristému květenství. Zatímco produktem vegetativního apikálního meristému jsou primordia, meristém květenství produkuje primordia, která se diferencijuji na sekundární květenství během časného generativního vývoje a na květenství později v uvedeném stádiu. Při výzkumu šlechtění rostlin řízení tohoto procesu je nejdůležitějším faktorem odrůd plodin. To platí zvláště u růžicovitých rostliny, jako je salát, špenát a cukrová řepa, které vykazují prodloužení stonku (kotvení), které následuje po tranzici kvetení, čímž se plodina stává nevyužitelnou.

Tranzice z vegetativního na reproduktivní růst je kritickým bodem vývoje rostliny. Protože je to první krok sexuální reprodukce, je velmi důležitá v zemědělství, v zahradnictví a při šlechtění rostlin. Zemědělci si mohou přát urychlit nebo oddálit dobu kvetení nebo předejít například u salátu a cukrové řepy prodloužení stonku. Když lépe porozumíme molekulární biologii rostlin, budeme moci rostliny ovlivňovat a řídit, což přinese určité praktické výhody v zemědělství.

V dokumentu přihláška PCT WO96/14414 se popisuje použití genu Constans {CO) při modifikaci mechanizmů kvetení rostlin.

Vynález popisuje způsob ovlivnění rostlinné tranzice z vegetativního na reproduktivní růst tím, že se vytvoří rostliny, ve kterých tranzice je zpožděna nebo urychlena expresí specifických transgenů, které ovlivňují tento proces. Takové geny se mohou konstitutivně exprimovat nebo se mohou exprimovat pouze jako odezva na externí stimuly, například na stimuly prostředí nebo chemické stimuly.

ATH1 je gen homeoboxu rostliny Arabidcpsis thaliana. V publikaci Quaedvlieg et al., in Plant Cell 7, 117-129, 1995 se sekvence DNA genu uvádí na obrázku č. 1. Gen se izoloval z kolekce transkribčních faktorů, které se indukují světlem. Exprimuje se v mladých semenáčích a v květech. Množství mRNA ATHl v etiolizovaných semenáčích je silně závislé na světle (fytochrom) a mohou se také na světlo adaptovat.

• ·

Zatím se nezjistilo, zda proteinový produkt ATHl se podílí na přesunutí vývojové fáze z vegetativního na reprodukční růst. Z výsledků studií ATH1::GUS a počátečních studií 35S::ATH1 se vydedukovalo, že ATHl má funkci při tranzici vegetativního apikálního meristému na meristém květenství. Specificky ATHl působí jako anti-giberelin tím, že potlačuje syntézu nebo pravděpodobně dráhu odezvy GA, což se popisuje v příkladu 6.

Naše studie konstrukcí ATH1::GUS ukázala, že ATHl se exprimuje v mladých semenáčích rostoucích na světle ve všech třech vrstvách apikálního meristému výhonků a primordia listů. ATHl se v mladých stále se vyvíjejících listech exprimuje ve vaskulární tkáni. Ve vyvinutých listech tato exprese zmizí. Překvapivě exprese ATHl v meristému je omezena na vegetativní fázi vývoje. Když rostlina Arabídospis začne kvést (tranzice s vegetativního stádia na generativní) a apikální meristém se stává meristémem květenství, exprese ATHl v meristému se zeslabí. Exprese ATHl během fáze květenství je ve vyvíjející se vaskulární tkáni stonku slabá. V pozdější fázi vývoje rostliny, kdy vznikají kvšty, se ATHl exprimuje v různých částech mladého květu (lůžko, kališní list a vaskulární tkáň tyčinek) . Naše hypotéza, že ATHl se podílí na řízení fáze tranzice z vegetativního na generativní růst, je dále potvrzena fenotypy ATHl sense a antisense nadměrných expresorů, které ovlivňují dobu kvetení. Rostliny, které ektopicky nadměrně exprimují antisense ATHl, vykazují fenotyp časného kvtení. Naopak většina rostlin nesoucích konstrukci nadměrné exprese sense ATHl vykazují pozdní kvetení. Malá část rostlin nesoucích konstrukci nadměrné exprese jsou časně kvetoucí rostliny, což je způsobeno redukcí ATHl pomocí kosuprese, podobně jako antisense ATHl nadměrné expresory a fenotyp těchto rostlin se podobá fenotypu terminálního květního mutantu (Shannon and Meeks-Wagner, 1991: The Plant

Cell: 877-892) a fenotypům LEAFY- (Weigel and Nilsson, 1995:

• · · · ·

Nátuře 377: 495-500), APETALA 1- (Mandel and Yanofsky, 1995: Cell 80: 847-857) a CONSTANS- (Putteril et al., 1995: Cell 80: 847-857) nadměrným expresorům. Na základě uvedených výsledků kombinovaných s daty ARH1::GUS se dedukovalo, že ATH1 se podílí na řízení fáze tranzice z vegetativního růstu na generativní u rostliny Arabidopsis thaliana a pravděpodobně je genem ovlivňující dobu kvetení.

Tato tranzice se může podpořit inhibici exprese genu ATH1 nebo naopak zpomalit nebo předejít podpořením takové exprese.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje konstrukci rostlinného genu, která obsahuje celou nebo část sekvence DNA kódující genový produkt ATH1 za řízení promotoru, který je funkční v rostlinách. Promotor je s výhodou heterologní. Vynález dále obsahuje rostlinné buňky transformované takovou konstrukcí rostlinného genu a rostliny, které obsahují buňky vykazující modifikované vlastnosti květenství. Vynález dále zahrnuje postup modifikace procesu kvetení v rostlinách transformací rostlin konstrukcí podle vynálezu.

Použití genových sekvencí při inhibici nebo podpoře exprese genu je docela dobře jasné. Celá genová sekvence řízená promotorem, který účinně funguje v rostlině, bude v obecném případě nadměrně exprimovat genový produkt, což povede k amplifikaci účinku takto produkovaného proteinu. Někdy se genový produkt redukuje. Tento jev se nazývá „kosuprese. Redukce genového produktu je možné také v obecném případě dosáhnout použitím dominanntí negativní mutace nebo obrácením orientace genové sekvence s ohledem na promotor tak, že vzniká antisense RNA.

Konstrukce DNA podle vynálezu může být „antisense konstrukce, která dává vzniku „antisense RNA nebo „sense konstrukce (kódující alespoň část funkčního proteinu) generující „sense RNA. „Antisense RNA je sekvence RNA, která • · · ·

c. · Z Z Z ··· ·· u ·ί·» Z · · · · · je komplementární se sekvencí v odpovídající mRNA. To znamená, že je komplementární ve smyslu, že každá báze (nebo většina baží) v antisense sekvenci (čtené ve směru 3'konce k 5'konci) je schopna párování s odpovídající baží (G s C, A s U) v sekvenci mRNA čtené ve smyslu 5'konce k 3'konci. Taková antisense RNA se může produkovat v buňce transformací vhodnou konstrukcí DNA,uspořádanou tak, aby vznikl transkript alespoň části její sekvence komplementární alespoň s částí kódujícího řetězce relevantního genu (nebo sekvence DNA, která s ní vykazuje podstatnou homologii). „Sense RNA je sekvence RNA, která je v podstatě homologní alespoň s částí odpovídající sekvence mRNA. Taková „sense RNA se může produkovat v buňce transformací vhodnou konstrukcí DNA uspořádanou v normální orientaci tak, že vzniká transkript se sekvencí, která je shodná alespoň s částí kódujícího řetězce relevantního genu (nebo sekvence DNA, která vykazuje s ní podstatnou homologii). Vhodné „sense konstrukce se mohou použít při inhibici genové exprese (jak se popisuje v dokumentu International Patent Publication WO91/08299) nebo „sense konstrukce kódující a exprimující funkční protein se mohou transformovat do rostliny za účelem nadměrné exprese proteinu.

Konstrukce DNA vhodná pro transkripci do RNA podle vynálezu mohou obsahovat základní sekvenci zahrnující alespoň 10 baží (upřednostňuje se alespoň 35 baží) . Pro základní sekvenci neexistuje teoreticky horní limit. Může být tak dlouhá, jako je relevantní mRNA produkovaná buňkou. V obecném případě je výhodné, aby se použily sekvence s délkou mezi 100 až 1000 baží. Příprava takových konstrukcí se popisuje dále v textu.

Jako zdroje základní sekvence DNA je možné použít vhodnou cDNA nebo genomovou DNA nebo syntetický polynukleotid. Izolace vhodných sekvencí ATHl z rostliny Arabidopsis se popisuje v publikaci Quaedvlieg et al., in Plant Cell 7, 117-129, 1995. Podobné metody se mohou použít k izolaci sekvencí ATHl

9

4 4 • 4 4

4 9 4« » 4 4 9 4 • 4

444 • 4 4 • 4 4 » 4 4 I * 44 z jiných rostlin. Tyto sekvence mohou vykazovat vyšši nebo nižší stupeň homologie se sekvencemi ATHl z rostliny Arabidopsis. Mohou se tak získat sekvence kódující celý nebo v podstatě celý protein. Tyto sekvence DNA se mohou štěpit restrikčními enzymy a tak se vytvoří fragmenty s vhodnou délkou pro další použití. Když se použije genomová DNA, jako zdroj částečné základní sekvence pro transkripci, je možné použít buď oblasti intronu nebo exonu nebo jejich kombinace.

Aby se získaly konstrukce vhodné pro úpravu exprese ATHl v rostlinných buňkách, může se použít sekvence cDNA, kterou je možné nalézt v proteinové cDNA nebo sekvence genu, který se nachází v rostlinném chromozomu. Rekombinantní konstrukce DNA se mohou připravit za použití standardních technik. Například sekvence DNA vhodná pro transkripci se může získat štěpením vektoru obsahujícího uvedenou sekvenci restrikčními enzymy, aby se odštěpil příslušný segment. Sekvence DNA vhodná pro transkripci se může vytvořit tepelnou hybridizací a ligací syntetických oligonukleotidů nebo použitím syntetických oligonukleotidů v polymerázové řetězcové reakci (PCR), přičemž na každém konci vzniknou vhodná restrikční místa. Sekvence DNA se pak klonuje do vektoru, který obsahuje proti směru exprese genu promotorovou a po směru exprese genu terminační sekvenci. Jestliže je nutná antisense RNA, pak se klonování provádí tak, že se štěpená sekvence DNA obrátí s ohledem na svou orientaci v řetězci, ze kterého se získala.

V konstrukci exprimující antisense RNA se řetězec, který byl dříve templářovým řetězcem, stává kódujícím řetězcem a obráceně. Konstrukce bude tak kódovat RNA v základní sekvenci, která je komplementární s částí nebo celou sekvencí proteinové

RNA mRNA. Tak dvě řetezce v jejich základní sekvenci, (5'konce k 3'konci).

V konstrukci exprimující sense jsou komplementární ne pouze ale také v jejich orientaci

RNA zůstává templát a kódující řetězce ve stejném uspořádání a orientaci jako je • * tomu u původního rostlinného genu. Konstrukce exprimující sense RNA kóduje RNA se základní sekvencí, která je homologní s částí nebo celou sekvencí mRNA. V konstrukcích, které exprimují funkční protein, celá kódující oblast genu je spojena s transkripčními řídícími sekvencemi schopnými se exprimovat v rostlinách.

Například konstrukce podle vynálezu se mohou připravit následovně. Vhodný vektor, který obsahuje požadovanou základní sekvencí vhodnou pro transkripci (jako je klon cDNA pATHl) se ošetří restrikčními enzymy, aby se odštěpila uvedená sekvence. Získaný řetězec DNA se klonoval (je-li to nutné v reverzní orientaci) do druhého vektoru obsahujícího požadovanou promotorovou sekvenci a požadovanou terminační sekvenci. Vhodné promotory zahrnují promotor 35S květákového mozaikového viru a promotorovou sekvenci genu rajčatové polygalakturonázy (popisuje se v publikaci Bird et al., 1988, Plant Molecular Biology 11: 651-662) nebo jiné rostlinné promotory regulované vývojovým stádiem. Vhodné terminační sekvence zahrnují ty pocházející z genu syntézy nopalinu rostliny Agrobacterium tumefaciens (nos 3'konec).

V konstrukci DNA podle vynálezu se může transkripční iniciační oblast odvodit od libovolného promotoru, který je funkční v rostlinách. Oblast iniciace transkripce se může umístit tak, aby proběhla transkripce sekvence DNA kódující RNA, která je komplementární s podstatným okruhem bází v mRNA kódující protein ATH1 ( připravující konstrukci DNA , která je zcela nebo částečně antisense konstrukcí).

Iniciační oblast transkripce (nebo promotor) funkční v rostlinách může být konstitutivní promotor (takový, jako je promotor 35S květákového mozaikového viru) nebo indukovatelný nebo vývojově redukovatelný promotor podle okolností. Například může být nutné modifikovat proteinovou aktivitu v jistých stádiích vývoje rostlin. Použití konstitutivního promotoru má tendence ovlivňovat množství proteinu a funkce ve • · · · ·· * · · · · · ·

·· všech částech rostliny, zatímco použití tkáňově specifického promotoru umožňuje více selektivní řízení genové exprese a ovlivňuje funkce. Tak antisense nebo sense RNA se produkuje pouze v orgánu, ve kterém se jeho působení vyžaduje.

Konstrukce DNA podle vynálezu se mohou začlenit do rostlin za účelem regulace exprese genu ATH1, což vede k modifikaci rostlinných charakteristik (zvláště u květů). V závislosti na podstatě konstrukce se může produkce genového produktu ATH1 zvýšit nebo snížit buď během určitých stádiích nebo v určitém stádiu života rostliny. V obecném případě, jak se očekávalo, produkce proteinu se zesílí pouze konstrukcemi, které exprimují homolog RNA v podstatě úplné endogenní proteinové mRNA. Sense konstrukce v plné délce také mohou inhibovat expresi proteinu. Konstrukce obsahující neúplnou sekvenci DNA, která je kratší než sekvence odpovídající úplnému genu v obecném případě ínhíbuje expresi genu a produkci proteinů v případě, že jsou uspořádány tak, aby se exprimovala sense nebo antisense RNA.

Konstrukce DNA podle vynálezu se transformovala do cílové rostlinné buňky. Cílová rostlinná buňka může být částí celé rostliny nebo může být izolovanou buňkou nebo částí tkáně, která se může regenerovat do celé rostliny. Cílová rostlinná buňka se může vybrat z libovolných jednoděložných nebo dvouděložných rostlinných druhů. Rostliny se mohou získat z transformované rostlinné buňky regenerací tranformantů a produkcí úspěšných generací potomstva transformantů.

Konstrukce podle vynálezu se mohou použít pro transformaci rostliny za použití libovolné vhodné techniky transformace za účelem připravit rostliny podle vynálezu. Jednoděložné a dvouděložné rostlinné buňky se mohou transformovat různými způsoby, které jsou dobře známy v oboru. V mnoha případech takové rostlinné buňky (zvláště, když jde o buňky dvouděložných rostlin ) se mohou kultivovat tak, aby se regenerovaly celé rostliny, které se reprodukují, aby vznikla • * ··· ♦ ·· · » · · · • · · · • «··«*« • · · • · · · · generace geneticky upravených rostlin. Může se použit libovolná metoda transformace rostlin. Dvouděložné rostliny, jako je rajče nebo meloun se mohou transformovat technologii plazmidu Ti mukroorganizmu Agrobacterium, jak se popisuje v publikaci Bevan, Nucleic Acid Research 12: 8711-8721 (1984) nebo Fillatti et al., Biotechnology, July 1987, 5: 726-730). Takové transformované rostliny se mohou reprodukovat sexuálně nebo buněčnou nebo tkáňovou kulturou. Jednoděložné rostliny se mohou transformovat použitím genového děla. Jiné metody transformace rostlin zahrnují mikroijekce nebo elektroporaci.

Příklady geneticky upravených rostlin podle vynálezu zahrnují obilniny, například rýži, pšenici, ječmen, oves a žito. Dalším důležitým semenným produktem je kanola, cukrová řepa, slunečnice, sója a čirok. Většina plodin se pěstuje jako jednoletky ze semen a produkce semen libovolného druhu závisí na schopnosti rostliny kvést, být opylována a tvořit semena. V zahradnictví řízení doby květenství se může provádět u rostlin, jako je salát, čekanka a brukvovitá zelenina zahrnující zelí, brokolici květák, dále pak u květin, jako je karafiát a pelargonie.

Hlavní charakteristikou modifikovaných rostlin podle vynálezu je časné nebo zpožděné kvetení. Genotypy , ve kterých se inhibuje produkce proteinu ATHl, obvykle kvetou časně. Genotypy, u kterých se produkce proteinu ATHl stimuluje kvetou pozdě. Mohu se pozorovat také jiné změny fenotypu. Mohou to být například zakrnění rostliny, jak je tomu u tabáku.

Řízení doby kvetení se může použít z několika důvodů. Doba kvetení se například řídí za účelem dosáhnout květu nebo plodů v období, které je nejvýhodnější z obchodního hlediska. Při produkci hybridů je nutné koordinovat dobu kvetení samičího a samčího rodiče. Toho se nejlépe dosáhne použitím indukovatelných promotorů, které odpovídají na vnější stimuly, například na aplikaci chemikálií. Takovým promotorem je například izoforma ΊΙ genového promotoru kukuřičné glutathion10 · ♦ * 0 • · • 0 0 0 0 0 • 0 0 • · 000

S-transferázy aktivované aplikací známého činidla bránící rostlinu před působením herbicidu (WO93/01294, ICI).

Řízení „kotvení může být ekonomicky důležité u několika druhů plodin. Například u cukrové řepy vznikají odrůdy, které vykazují sníženou tendenci prodlužovat stonek při uchovávání v chladu. Továrny na zpracování takových plodin mohou rozložit své aktivity na delší období s úsporou režijních nákladů. Odrůdy rezistentní vůči kotvení je možné sít velmi časně (v únoru) nebo dokonce o rok dříve na podzim (kdy zimní mrazy nepůsobí problém). Dále odrůdy, u kterých kotvení je problém se mohou urychlovat šlechtěním. Křížení se může provádět ročně místo jednou za dva roky .jak doposud.

Časně kvetoucí slunečnice se může vysít v širokém geografickém rozmezí. Může se pěstovat dále na severu (sever Paříže) a také pravděpodobně v sušších oblastech, jako je například oblast Španělska, přičemž nedojede k vyschnutí v období pozdního léta.

U zeleniny lze kotvení řídit například u salátu a čekanky. To umožní během léta jednoduší pěstování uvedené plodiny. Existující odrůdy vykazují tendence kotvení spíše v letních podmínkách. V případě travin je výhodnější, aby pícniny redukovaly prodloužení stonku (zlepší se kvalita krmení) a u okrasných typů se například zlepší kvalita trávníku.

V případě potřeby bude výhodné zastavit expresi transgenů, když květiny začnou kvést, nebo do tohoto období potlačit přirozeně se vyskytující geny. To je možné provést za použití promotoru ATHl, čímž se řídí exprese trangenu nebo transkripce homologní DNA k přirozenému genu. Dalším separovaným rysem vynálezu je provedení konstrukce DNA, která obsahuje promotor ATHl spojený s heterogenní DNA tak, aby proběhla v rostlinných buňkách její transkripce a rostlinné buňky se pak transformovaly takovými konstrukcemi DNA.

ATHl se exprimuje ve vegetativním apikálním meristemu a zeslabení uvedené exprese souvisí s rostlinou tranzicí.

9 • 9 9

9 9 9 9 999

9

9 9 9 ** 9999 • » • 999

9 9 9

9 9

9 9 99

99

9 9

9 9 •9 9 9

9 9

99

Zesílená konstitutivní ATH1 vede k dramatickému potlačení rosltinné tranzice v rostlině tabáku a Arabidopsis. Tak v případě Arabidopsis kotvení je opožděné. Naopak potlačení ATHl vede k vytvoření časně kvetoucího fenotypu. Naše výsledky naznačují, že ATHl vykonává svou funkci prostřednictvím modulace biosyntézy GA nebo citlivosti. Očekáváme, že gen ATHl je základ zvláště použitelného řídícího systému prodlužování stonku.

obdobím kvetení klonování genů, rostlinné rostlina, se podílejí na řízení je typická brukvovitá

Délka dne a rostlinná tranzice

Rostlinná tranzice se zvláště dobře zkoumala u rostliny

Arabidopsis thaliana. Tento druh se stal modelovým systémem pro studium rostlinné tranzice. Studie se provedla na genetické úrovni prostřednictvím izolace mutantů s upraveným a na molekulové úrovni prostřednictvím jejichž produkty tranzice. Arabidopsis ve které jsou vegetativní listy umístěny velmi blízko, což způsobuje zkrácená délka vnitřních kolének. Po rostlinné tranzici se nově vytvořené vnitřní kolínka rychle prodlužují („kotvení)· U většiny ekotypů Arabidopsis délka dne je nejdůležitější ve stanovení rostlinné tranzice. Arabidopsis je fakultativně rostlina, která potřebuje dlouhý den (LD), který znamená, že rostlinná tranzice se dá urychlit dlouhými dny (cyklus 16 hodin světla/8 hodin tmy), ale v případě, že nelze dosáhnou dlouhých dnů, není to kritické. Za podmínek dlouhých dní (LD) se rychle iniciuje rostlinná tranzice a vytvoří se pouze několik listů (přibližně 7 listů, za 16 až 20 dní v případě ekotypu Col-0) . Když růst probíhá při krátkých dnech (SD), například 8 hodin světla/16 hodin tmy, rostlinná tranzice trvá daleko déle (přibližně 60 dní) a vytvoří se zcela olistěná růžice, která má přibližně 30 růžicových listů (ekotyp Col-0).

• 9 • · 9

I 9 9·· * · 9 9 * · » 9 9 • 9 9 9 9 »9 9 ► 9 9 • · 9 9 9

9 9 9 • 9 9 <

• ·9 I » 9 9 « » 9 9 fl

99

Kyselina giberelová (GA) a rostlinná tranzice

Po dlouhou dobu je známo, že ošetřeni GA podporuje rostlinnou tranzici druhů, ve kterých u různých rostlinných druhů. Většina aplikovaná GA může indukovat kveteni rostliny vyžadující dlouhý den nebo chladno a řada z nich roste v normálním případě za neinduktivních podmínek jako růžice. Řade experimetnů však naznačuje, že množství endogenní GA se podílí na řízené rostlinné tranzice. Podmínky, které indukují rostlinnou tranzici mohou projevit svůj účinek prostřednictvím zvýšení množství endogenní GA pravděpodobně v apikálním meristému nebo blízko něj .

Rostlina Arabidopsis mutans, která je nedostatečná v biosyntéza GA (GA série) nebo není citlivá vůči tomuto hormonu (série GAI) vykazuje za neinduktivních podmínek pozdě kvetoucí fenotyp . Několik mutantů GAl.3 je za induktivních podmínek také pozdě kvetoucích (Wilson, R. N., Heckman, J. W., and Sommerville, C. R. (1992). Gibberellin is required for flowering in Arabidopsis thaliana under short days. Plant. Phys. 100, 403-408).

Zahrnutí GA do řízení rostlinné tranzice ATH1

Testovalo se, zda exogenní GA může předejít inhibičnímu účinku konstitutivní exprese ATH1 u rostliny tabáku. GA nanesená sprejem byla schopna „zachránit pozdně kvetoucí fenotyp u konstitutivních expresorů ATH1 u rostliny tabáku. Podíl GA také indikuje fenotyp s omezeným prodloužením vnitřních kolínek u rostliny tabáku, které exprimují ATH1. Tato zjištění naznačují, že ATH1 funguje jako represor biosyntézy ATH1 nebo v jiném případě jako represor GA odezvy. Dominantní účinek nadměrné exprese ATH1 na rostlinnou tranzici v kombinaci s obratem tohoto účinku exogenně přidané GA naznačuje několik možných použití u různých plodin. To je zvláště zajímavé, protože deregulovaná exprese ATH1 nevede k pleiotropním fenotypům a dokončila se reverze fenotypu *· 9 ·· ·

9« 9 • 9 9

9 9

» •9 ·

999 · • 9 9 · ♦99

s nadměrnou expresí. Úplná záchrana znamená, že neexistují problémy s ohledem na reprodukci nebo multiplicitu ATHltransformantů. Takové udržování transgeních linií, které může být vážným problémem u kvetoucích mutantů, je zřejmé. Za použití přepínače exprese GA se rostliny mohou obrátit na vývoj divokého typu v každém okamžiku. Rostliny pak normálně kvetou a vytvoří se zde normální sada semen.

Dalším rysem vynálezu je inhibice nadměrné exprese ATHl v rostlinách, které se geneticky modifikují podle vynálezu, ošetřením rostlin giberelinem. Může se například použít giberelin A3 nebo A4/A7.

Zvýšení indexu sklizně

Když rostliny rostou v těsné blízkosti dochází k syndromu vyhnutí se stínu, při kterém rostliny reagují na záření v daleké červené oblasti odražené od okolních rostlin. To ve většině případů vede k rychlému a dramatickému zvýšení rozsahu růstu stonku a řapíků na úkor růstu listů, produkci zásobních orgánů a reprodukčního vývoje. Je známo, že nadměrná exprese genů phyA u rostliny tabáku může překonat odezvu na nedostatek světla, což vede ke zvýšenému indexu sklizně (Robson, P. R. H., McCormac, A. C., Irvine, A. S., and Smith, H. (1996). Genetic engeneering of harvest index in tabacco through overexpression of a phytochrome gene. Nátuře Biotechnology 14(8), 995-998). Index sklizně se exprimuje jako poměrná část biomasy listů z celkové biomasy. Nadměrná exprese ATHl v rostlině tabáku způsobuje omezení růstu stonku, zatímco listy rostou a počet listů není ovlivněn nebo je dokonce ve srovnání s rostlinou divokého typu vyšší. Fenotypy s nadměrnou expresí ATHl a fenotypy s nadměrnou expresí phyA jsou podobné. To naznačuje, že použití nadměrné exprese ATHl u plodin zvyšuje index sklizně.

Obecné metody • ♦ • · · > ΦΦΦ· ♦ * 9999 > « Φ ► » 999 • Φ 999 φφ • ·· 1 • · · 4 » · Φ 4 · · <

·· ΦΦ

Rostlinný materiál a podmínky růstu rostlin

Užívané genotypy divokého typu byly Arabidopsis thaliana Columbia a C24. Gen ATH1 se nachází na chromozomu 4 mezi RFLP markéry mi431 (96,9 cM) a 06455 (97,9 cM). Arabidopsis thaliana Columbia se používal v experimentech transformace rostliny za použití protokolu vakuové infiltrace, zatímco Arabidopsis thaliana C24 se používá v experimentech transformace rostlin za použití protokolu kořenové transformace.

Rostliny se pěstují v růstové komoře s fluorescentním světlem s fotoperiodou 16 hodin, která následuje po 8 hodinách tmy při teplotě 22 °C.

Aby se změřila doba květenství, semena se uchovávala při teplotě 4 °C po dobu 4 dní, aby se porušilo období klidu, a pak se semena vysela do půdy. Naklíčené semenáče se obvykle pro první 1 až 2 týdny přikryly krytem propagátoru, aby se předešlo dehydrataci.

Transformace rostlin Arabidopsis

Binární konstrukce obsahující chimérové geny ATHl-GUS a geny 35S-antisense ATH1 se transformovaly do rostliny Arabidopsis thaliana ekotyp C24 za použití metody kořenové transformace zprostředkované Agrobacterium tumefaciens (popisuje se v publikaci Valvekens et al., 1988). Transformantů se selektovaly na kultivačním médiu, které obsahuje 50 mg/1 kanamycinu.

Binární konstrukce obsahující chimérové geny 35S-ATH1 se transformovaly do rostliny Arabidopsis thaliana ekotypu Columbia za použití protokolu vakuové infiltrace (popisuje se v publikaci Bent et al., 1994: Science 265: 1856-1960, Bechtold et al., 1993: C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316: 1194-1199) s některými úpravami. Rostliny se pěstovaly odděleně v květináčích o velikosti 5,5 cm. Rostliny se ·«·· ·· ·« • * · · · *·· ♦ « · · • · * ♦ · · • · · · · ·*· ·· ·· transformovaly do doby objevení prvních šešulí na sekundárních výhoncích.

Kultury Agrobacterium tumefaciens o objemu 900 ml obsahující vhodnou konstrukci se kultivovaly přes noc před dnem infiltrace. Buňky se sklidily centrifugací a resuspendovaly se ve vhodném objemu infiltračního média, které obsahuje 2 % místo 5 % sacharózy. Rostliny se infiltrovaly ponořením celé růžice po dobu 10 minut při tlaku vakua 100 mm rtuťového sloupce.

Transformovaná semena se vybrala na kultivačním médiu, které obsahuje 50 mg/1 kanamycinu.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 se popisuje DNA sekvence cDNA ATH1.

Na obrázku č. 2 je znázornění plazmidu pWP90.

Na obrázku č. 3 je znázornění plazmidu pMOG23.

Na obrázku č. 4 je znázornění plazmidu pVDH275.

Na obrázku č. 5 je sloupcový graf znázorňující zakrněné způsobené konstitutivní expresí ATH1 u rostlin tabáku starých 90 dní.

Na obrázku č. 6 je graf vyjadřující účinek ošetření giberelinu na výšku rostlin tabáku, které nadměrně exprímují ATH1.

Na obrázku č. 7 je sloupcový graf vykazující dobu květenství (vyjádřeno v počtu vytvořených listů v růžici) při nízké a nadměrné expresi ATH1 v porovnání s Arabidopsis divokého typu (ekotyp C24).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Analýza exprese ATH1

Izolace celkové RNA

Celková RNA z rostlin se izolovala způsobem popsaným v publikaci De Vries et al. (1988) s některými malými • · ···» ·* ··· · • © · • · · · · • ♦ · « • · © • · · ·· ·· «« • · © · * · © * • « · · • · · · ·♦ ♦· úpravami. (1) rostlinná tkáň se rozmělnila v kapalném dusíku v přítomnosti polovičního objemu fenol/extrakčního pufru a směs se zahřála na teplotu 65 °C ve vodní lázni a (2) RNA se srážela směsí etanolu a acetátu sodného před a po srážení LÍCI.

Analýza ochrany RNázou

Fragment HindlI-Xhol fágemidu ATH1 se klonoval do pBluescriptSK(-) (Stratagene) a štěpil se restrikčním enzymem HindlII za vzniku templátu pro T7 RNA polymerázu. Sonda ATHl RNA chrání fragment tvořený 140 nukleotidy. Sonda RNA se syntetizovala za použití T7 RNA polymerázy (Pharmacia) a pufru, jak popisuje výrobce, s tou výjimkou., že se použije 160 μϋί [₃₂P]UTP (800 Ci/mmol) . Ochrana RNázou se provedla za použití 10 μς celkové RNA a 10 μρ tRNA podle protokolu popsaného v publikaci Sambrook et al., (1989). Štěpená směs obsahuje 600 jednotek/ml RNázi TI (Gibco BRL) a 20 μg/ml RNázi A (Boehringer). Hybridy RNA:RNA se analyzovaly sekvenční gelovou elektroforézou na 6 % polyakrylovém gelu se 7% močovinou a vizualizace proběhla autoradiografií.

Konstrukce chimérových konstrukcí ATH1-GUS

Izoloval se fragment restrikčních enzymů Spel-Ncol obsahující přibližně 1 300 nukleotidů sekvence promotoru ATHl. Po zaplnění restrikčního místa Ncol ošetřením Klenow polymerázou se tento fragment začlenil do jediného místa Smal/Xba binárního vektoru pBilOl.l, který obsahuje gen GUS (Jefferson et al., 1987: EMBO J. 6: 3901-3907) za vzniku translační fúze mezi promotorem ATHl a genem GUS. Protein kódovaný tímto chimérovým genem obsahuje 42 aminokyselin ATHl, který je fúzován s proteinem GUS. Tato binární konstrukce se nazývá tH1.4. Konstrukce tH1.4 se transformovala do kompetentních buněk Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Gelvin and Schilperoort, 1988: Plant Molecular Biology Manual:

····

Μ ·«·« • - * • * ·· • · » ♦ · · • ···· «

Dordrecht: Kluwer Academie Publisher). Linie Arabidopsis (ekotyp C24) se transformoval, jak se popisuje dále v textu.

In šitu lokalizace aktivity GUS v transgenních liniích ATH1GUS Arabidopsis thaliana.

Získaly se semenáče a rostlinné tkáně a barvily se po dobu 1 až 16 hodin při teplotě 37 °C v roztoku, který obsahuje 0,5 mg/ml X-Gluc (Biosynth AG) rozpuštěné v pufru, který obsahuje n-dimetyl-formamid, 0,1 % Triton X-100, 0,5 mM K4Fe(CN)6.H2O, 0,5 mM K3Fe(CN)6 a 50 mM fosforečnan sodný, pH 7,2.

Po barvení se rostlinné tkáně fixovaly přes noc v roztoku, který obsahuje 1% glutaraldehyd a 4 % formaldehyd v 50 mM pufru fosforečnanu sodného pH7,2. Následně se postupně dehydratovaly semenáče v krocích: 10 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % a 2x 100 % etanolu. Velké rostlinné tkáně se nejdříve zalily do 1% agarózy (Sigma). Infiltrace a impregnace v přípravku Technovete 7100 (Kulzer, Hereaus) se uskutečnila podle instrukcí výrobce. Sekce o velikosti 4 μιη se připravily na rotačním zařízení Reichert-Jung 1140, které je opatřeno ocelovým Adamsovým nožem na jedno použití. Sekce se obarvily 0,1 % rutheniovou červení (Sigma) v destilované vodě po dobu 2 minut při teplotě místnosti a fotografovaly se zařízením Zeiss Axioskop za použití filmu Kodak Professional Ektar 25.

Semenáče se fixovaly a dehydratovaly, jak se uvádí shora v textu. Technovit 7100 se infiltroval po dobu 1 dne. Semenáče se pak přenesly na konstrukci tvořenou celuloidovým diapozitivem (Amovis), dvoustranou páskou, diapozitivem a opět dvoustranou páskou. Ve druhých třech vrstvách se centrální oblast vystřihla, aby obsahovala semenáč. Pak se semenáče daly do roztoku Technovit 7100 a centrální oblast se pokryla dalším diapozitivem. Po celonoční polymerizaci při teplotě místnosti se získala plastová destička obsahújící semenáč. Za účelem rozdělit zalité semenáče na destičky se celuloidový materiál odstranil a destička se řezala, aby se získaly podélné sekce *c · »·» »9*1

9 9«9 • · · 9 9 999

9»·« 999 « * 9«9<

'·· · 99 999 «9 99 * 9 9 9 • 9 9 9

9 9 < <

9 9 » • 9 »k relevantních oblastí semenáčů. Dělení na sekce, barvení a fotografování se uskutečnilo, jak se popisuje shora v textu.

Lokalizace exprese ATH1

Exprese genu ATH1 se analyzovala za použití analýzy ochrany RNázou (Quaedvlieg et al., 1995: The Plant Cell7: 117129) . Během časného vývoje semenáčů (2 až 6 dní) a ve květech zralých rostlin Arabidopsis se detekovalo velké množství mRNA ATH1. Buněčná lokalizace exprese genu ATH1 se stanovila zavedením chimérové konstrukce ATH1-GUS označené tHl. 4 do Arabidopsis thaliana. Různé tkáně se obarvily X-gluc a připravilo se velké množství sekcí tkání za účelem vizualizace aktivity GUS (popisuje se dále v textu).

Exprese ATHl během vegetativního vývoje

Výhonkový apex 5 dní starých semenáčů vyrostlých na světle je plochý a obsahuje dvouvrstvý obal uzavírající spodní korpus. V tomto stádiu meristém inicioval primordium prvního páru listů (Mischke and Brown, 1965).

V rostlinách transformovaných tHl. 4 je ve výhonkovém apexu přítomno velké množství aktivity GUS. Sekce výhonkového apexu ukázaly, že vysoká aktivita GUS se objevuje ve třech vrstvách výhonkového apikálního meristému a zvyšuje se skrz subapikální oblast, pokračuje dolů, kde se vaskulární řetězec hypokotylu větví do děloh. Vysoké množství aktivity GUS se také nachází v primordiu prvního páru listů.

Exprese ATHl během rostlinné tranzice a vývoj květenství

Během fáze kvetení z výhonkového apikálního meristému vzniká stonek, stonkové listy a sekundární květenství. Jak pokračuje vývoj květenství, meristém květenství produkuje primordia květu. V rostlinách transformovaných konstrukcí tHl.4 se během fáze tranzice v meristému květenství snížila aktivita GUS. V meristému se nedetekovala žádná aktivita GUS.

« · · • · · • ··· • · ···· · ·· ···· • « · • · ··« • · · » · 4 ·· ·<· ·· • · · • · · · 4 • · 4 ··

Slabá aktivita GUS se projevoval v oblasti žebra. Později, když se začaly tvořit květy, aktivita GUS se projevila v různých částech mladého kvetu (lůžko rostliny, kališní list a vaskulárni tkáň tyčinky).

Přiklad 2: Konstrukce promotorové fúze s otevřeným čtecím rámcem ATHl cDNA ATH1 se klonovala do jediného restrikčniho místa EcoRI/Xhol dobře známého a komerčně dostupného vektoru pBluscript SK(-) (Stratagene).

2.1. Fúze promotoru CaMV 35S s otevřeným čtecím rámcem ATH1

Izoloval se fragment BamHI/SnaBI obsahující 1 573 nukleotidů sekvence cDNA ATH1 (restrikční místo BamHI vzniklo PCR mutagenezí 35 nukleotidů po směru exprese genu od počátku translace) a začlenil se do jediných klonovacích míst BamHI/Smal vektoru pWP90, který obsahuje zdvojený promotor CaMV 35S a terminátor NOS (zobrazuje obrázek č. 2). Výsledkem je transkripční fúze mezi zdvojeným promotorem 35S CaMV a cDNA ATH1. Tato konstrukce nazývaná cH1.24 se pak štěpila restrikčními enzymy Sstl/EcoRV. Pak následovalo začlenění z vzniku inzertu Sstl/EcoRV do jediných restrikčních míst Sstl/Smal binárního vektoru pMOG23 (obrázek č. 3). Binární konstrukce se nazývá tHl.2. Konstrukce tHl.2 se transformovala do kompetentních buněk Agrobacterium tumefaciens pGV2260 (Caplan et al., 1985: J. Bacteriology 161: 655-664). Linie Arabidopsis (ekotyp Col-0) se transformovala prostřednictvím vakuové infiltrace, jak se popisuje dále v textu.

2.2 Konstrukce fúze promotoru CaMV 35S s rámcem antisense ATH1 Fragment EcoRV/SnaBl obsahující přibližně 1830 nukleotidů sekvence cDNA ATHl se izoloval a začlenil se do jediných klonovacích míst vektoru pW90 (zobrazeno na obrázku č. 2), což vede k transkripční fúzi mezi zdvojeným promotorem CaMV 35 S a • · · · · • · · · · · « • · · · · · • · · · · • · · · · · · rámcem antisense ATHl. Výsledná konstrukce se nazývá cHl.22. EcoRV/Sstl inzert konstrukce cHl.22 se klonoval do jediných restrikčních míst Smal/SacI binárního vektoru pMOG23 (MOGEN) (zobrazuje obrázek č. 3). Tato binární konstrukce nazývaná thl.l se transformovala do kompetentních buněk Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Linie rostliny Arabidopsis (ekotyp C24) se transformovaly způsobem popsaným dále v textu.

2.3. Fúze promotoru s otevřeným čtecím rámcem ATH1 teplotním šokem.

PCR mutagenezí se ve vektoru pTT19 vytvořilo restrikční místo BamHI. Vektor obsahuje promotor, vedoucí sekvenci a 77 nukleotidů kódující sekvence genu teplotního šoku Arabidopsis thaliana Hspl8.2 (popisuje se v publikaci Takahashi and Komeda, 1989: Mol. Gen. Genet. 219: 365). Další restrikční místo BamHI se nachází v nepřekládané vedoucí sekvenci v poloze nukleotidu -710 od počátku translace Hspl8.2.

Pomocí štěpení restrikčním enzymem BamHI se odstranila 5' nepřekládaná vedoucí sekvence a 77 nukleotidů kódující sekvence Hspl8.2. Zbývající konstrukce, která neobsahuje vedoucí sekvenci se nazývá pTT19. Fragment HindlII/BamHI uvedené konstrukce pTT19, která neobsahuje vedoucí sekvenci a obsahuje pouze promotorovou sekvenci Hspl8.2 se fúzoval s fragmentem BamHI/EcoRI obsahující celou sekvenci cDNA ATHl. Výsledkem je transkripční fúze promotoru Hspl8.2 s

5'nepřekládanou vedoucí sekvencí ATHl a kódující sekvencí. Restrikční místa BamHI a EcoRI se vytvořily PCR mutagenezí, přičemž restrikční místo BamHI je na začátku sekvence cDNA restrikční místo EcoRI je bezprostředně po směru genu terminačního kodonu TAA. Výsledný fragment ;e začlenil do jediných restrikčních míst

HíndlII/EcoRI vektoru pW90 (zobrazuje obrázek č. 2) a tato nová konstrukce se pak částečně štěpí restrikčními enzymy HindlII a EcoRV. Největší restrikční fragment HindlII/EcoRV se

ATHl a exprese HindiII/EcoRI • 4 pak začlenil do binárního vektoru pBIN 19 štěpeného restrikčními enzymy HindlII/Smal (Frisch et al., 1995: Plant Mol. Biol. 27: 405-409). Tato konstrukce se nazývá HspHl.

Připravila se také transkripční fúze mezi promotorem Hspl8.2 a kódující sekvencí ATHl, která neobsahuje vedoucí sekvenci. V cDNA ATHl se vytvořilo PCR mutagenezí další restrikční místo BamHI bezprostředně proti směru exprese genu od počátku translace. Štěpení tohoto restrikčního místa BamHI’ kombinované se štěpením jediného restrikčního místa Xhol v cDNA ATHl vede ke vzniku fragmentu obsahujícího přibližně 680 nukleotidů, který zahrnuje kódující sekvenci ATHl. Tento fragment obsahující 680 nukleotidů se zaměnil za fragment o velikosti 980 nukleotidů, který se vytvořil po štěpení HspHlB restrikčními enzymy BamHI/XhoI. To vede ke vzniku HspHlB, což je transkripční fúze mezi kódující sekvencí ATHl, která neobsahuje vedoucí sekvenci, a promotorem Hspl8.2.

Obě konstrukce HspHl a HspHlB se transformovaly do kompetentních buněk Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Linie rostliny Arabidopsis (ekotyp C24) se transformovaly, jak se popisuje dále v textu.

2.4 Fúze promotoru plastocyaninu hrášku s otevřený čtecím rámcem ATHl.

Transkripční fúze mezi promotorem plastocyaninu hrášku a kódující sekvencí ATHl se může vytvořit začleněním kódující sekvence ATHl do jediných restrikčních míst BamHI a Sáli pVDH275 (Pwee and Gray, 1993: Plant J. 3: 437-449) (zobrazeno na obrázku č. 4). V kódující sekvenci ATHl se PCR mutagenezí vytvořila další restrikční místa Sáli (bezprostředně vedle počátečního kodonu ATG proti směru exprese genu ) a BamHI (bezprostředně za stop kodonem ATG ATHl). Výsledná konstrukce, ve které se kódující sekvence ATHl začlenila mezi promotor plastocyaninu hrášku a terminátoru nos Agrobacterium, se může • ·

transformovat do buněk Agrobacterium tumefaciens. Pak následuje transformace rostliny.

Zavedení kopií ATH1 do Arabidopsís

Kopie ATH1 se mohou zavést do rostlin Arabidopsís jejich transformováním s extra loci ATH1, které obsahují promotor ATHl a kódující sekvenci ATH1. To se může provést fúzí SnaBI/NcoI fragmentu cDNA ATHl o velikosti přibližně 1 000 nukleotidů a Sstl/EcoRI restrikčního fragmentu pBHOl.l o velikosti přibližně 250 nukleotidů, který obsahuje terminátor nos Agrobacterium (Jefferson et al. , 1987: EMBO J. 6: 39013907). Výsledný fragment se může fúzovat s Ncol retsrikčním fragmentem o velikosti 3,5 kb genomového klonu ATHl (Quaedvlieg et al., in Plant Cell 7, 117-129, 1995). Tak vznikne NcoI/EcoRV fragment o velikosti přibližně 4 750 nukleotidů, který obsahuje promotor. ATHl, kódující sekvenci ATHl a terminátor nos. Tento fragment je možné začlenit do klonovacího vektoru pMTL23 štěpeného restrikčními enzymy Ncol a EcoRI (Chambers et al., 1988: Gene 68: 139-149). Restrikční fragment StuI/EcoRI výsledné konstrukce se pak může začlenit do binárního vektoru pMOG23 štěpeného restrikčními enzymy EcoRI a Smál. Pak se transformují buňky Agrobacterium následuje transformace rostlin.

Příklad 3: Ovlivnění charakteristik květenství použitím fúze promotoru CaMV 35S a genu ATHl

Měření doby kvetení

Doba kvetení se měřila počítáním počtu listů v růžici, s vyloučením děložních lístků, v době, kdy byl květ viditelný. Demonstrovala se blízká korelace mezi počtem listů a dobou kvetení (Koorneef et al., 1991: Mol. Gen. Genet. 229: 57-66, Bagnall, 1993: Ann. Bot. 71: 75-83).

Nadměrná exprese ATHl vede ke zpoždění kvetení

Za účelem hlouběji prozkoumat úlohu ATH1 při vývoji rostlin, se sekvence cDNA ATH1 v plné délce fúzovala s konstitutivním promotorem 35S květákového mozaikového viru a vzniklý chimerový gen 35S::ATH1 se transformoval do rostliny Arabidopsis ekotyp Col-0 prostřednictvím metody vakuové infiltrace. Získalo se šest nezávislých primárních transformantů.

Všechny tyto transgenní linie se samooplodnily. Z každé nezávislé transgenní linie naklíčilo v půdě 40 jednotlivých semen a určil se počet změněných fenotypů ve srovnání s rostlinami divokého typu. Čtyři ze šesti linií vykazují fenotyp změněný s ohledem na dobu kvetení. Ve třech z těchto linií všechny rostliny byly pozdě kvetoucí (přibližně 14 listů růžice ve srovnání s přibližně 19 listy růžice u rostlin divokého typu Col-0). Ve zbývající linii přibližně 85 % rostlin vykazuje stejný pozdě kvetoucí fenotyp , zatímco 15 % rostlin vykazuje časně kvetoucí fenotyp (přibližně 7 listů růžice). Tuto skutečnost způsobila nepřítomnost RNA ATHl. Tyto časně kvetoucí rostliny také vykazují fenotyp koncového květu, často s neúplnými květy a s mutovanými orgány květů.

Příklad 4: Časné kvetení způsobené antisense expresí ATHl.

Podobně jako ektopická nadměrná exprese ATHl také inhibice funkce genu ATHl se může také použít pro ovlivnění doby kvetení. Inhibici funkce genu způsobila konstitutivní nadměrná exprese antisense ATHl.

Antisense cDNA ATHl v plné délce se fúzovala s konstitutivním promotorem 35S květákového mozaikového viru a takto produkovaný chimerový gen 35S::antisense ATHl se transformoval do Arabidopsis ekotyp C24 prostřednictvím protokolu kořenové transformace podle Valvekens. Získalo se 22 nezávislých transformantů a všechny z nich se samooplodnily. Z každé linie se 10 jednotlivých semen naklíčilo v zemi a • « • 0 ··· · · · · 0

Λ ···♦···· ·

4- 4 0 · · · · •••0 ♦ ·0 0·· určil se počet změněných fenotypů ve srovnání s rostlinami divokého typu C24. U pěti z těchto linií rostliny vykazují fenotyp časného kvetení·. Kvetení začíná když se vytvoří až 10 listů růžice ve srovnání s dvaceti listy, jak je tomu u rostlin divokého typu.

Příklad 5: Změna doby kvetení u rostliny Nicotiana tabacum nadměrnou expresí ATH1.

Jako v případě Arabidopsis, také u rostliny tabáku (Nicotiana tabacum cv. Samsun) ektopická nadměrná exprese cDNA ATH1 (řízená promotorem 35S květákového mozaikového viru) vede ke zpoždění doby kvetení ve srovnání s rostlinou tabáku divokého typu. U rostlin tabáku 35S::ATH1 se kvetení opozdilo o týdny nebo měsíce. Tyto rostliny také zakrněly. Toto zakrnění stejně jako fenotyp kvetení jasně koreluje ze sílou exprese transgenu. Rostliny z nejsilnější expresí ATH1 vůbec nekvetou a dosahují pouze jedné pětiny své normální výšky, zatímco u rostlin s méně silnou expresí se kvetení opozdilo pouze o jeden nebo dva týdny. Tyto rostliny dosahují přibližně jedné pětiny jejich normální výšky. Počet listů a tvar je u všech těchto transformovaných rostlin normální.

Příklady 6 až 8:

Následující příklady ilustrují účinek GA na transgenní rostliny podle vynálezu. Jak se uvádí shora v textu, nadměrná exprese ATH1 účinně omezuje „kotvení (vyvolání květu). Byla vyřčena hypotéza, že ATH1 může být represorem syntézy GA nebo dráhy odpovídající na GA. Následující příklady demonstrují a podporují uvedenou hypotézu.

Obecné metody

Rostliny tabáku (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) se transformovaly za použití postupu listových disků (Horsch, R., Fry, F. , Hoffman, N., Eichholtz, D. , Rogers, S. and Fraley, R.

»Β · Β Β « • ♦ · » · Β Β Β • Β Β Β Β

Β ΒΒΒ ' Β Β · Β (1985). A simple and generál method for transferring genes into plants. Science 227, 1229-1231). Transgenní rostliny se selektovaly na MS-médiu (Murashige, T. and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue ciltures. Physiol. Plant. 15, 473-479) obsahujícím 300 mg/ml kanamycinu a 2 % sacharózu. Po přenosu na půdu se rostliny pěstovaly ve skleníku při teplotě 22 °C při režimu světla 16 hodin denní světlo, které je nutno doplňovat umělým světlem. Účinky giberelinu (GA) se testovaly mimokořenovou aplikací (nanesením sprejem) 100 mM GA3 v roztoku obsahujícím 100 ml/1 Tritonu X-100. Na kontrolní rostliny se sprejem nanesl roztok obsahující pouze 100 ml/1 Tritonu X-100. Aplikace sprejem začalo 60 dní po vysetí, když rostliny divokého typu byly přibližně 5 cm vysoké a rostliny 35S::ATH1 byly přibližně 2., 5 cm vysoké a pokračovalo se v 3 až 4 denních intervalech. Výška rostliny se měřila každé 3 až 4 dny, což bude pokračovat až do doby, kdy rostliny začnou kvést, což určuje vznik primordia kvetu.

Příklad 6: Konstitutivní nadměrná exprese sense ATHl vede k oddálení kvetení

6.1. Nadměrná exprese ATHl u rostlin tabáku

Za účelem exprimovat gen ATHl v transgenních rostlinách konstitutivně, jejich kódující oblast je řízena promotorem 35S CaMV, a výsledná konstrukce se transformovala do rostliny tabáku (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN). Získalo se čtyřicet nezávislých rostlin rezistentních na kanamycin, z nichž pouze pět vykazuje detekovatelnou expresi transgenu. Množství mRNA ATHl kolísá od vysokého množství, které vykazují rostliny H10E#4, #10 a #30 ke střednímu množství a k nízkému množství a to v rostlinách H10E#35 a #37. V závislosti na síle exprese ATHl kvetení těchto rostlin se zpozdilo o týdny až měsíce v porovnání s rostlinami divokého typu, které kvetou po 3 až 5 měsících v závislosti na sezóně. V případě rostlin • * ♦ * · · · · * · · · « · · · · ' · • ······ · *·· 9 · • · · · · · · · •*· · · · · · · « · s nej silnější expresí (H10E#4) se nikdy nevytvoří květ až do zestárnutí rostliny (více jak 15 měsíců do vysetí). Rostliny H10E#10 a #30, které vykazují silnou expresi ATHl kvetly po 15 měsících, zatímco rostliny H10E#35 a #37 vykazující střední/nízkou expresi začaly kvést až po 6 měsících. Stejně jako fenotyp se změněnou dobou kvetení také rostliny s nadměrnou expresí ATHl vykazují omezený růst stonku, což vede k zakrnění rostlin. Existuje zde jasná korelace mezi vážností fenotypu zakrnělého růstu a síly exprese transgenů (popisuje se na obrázku č. 5). U nejvážnějších případů rostliny dorůstají pouze přibližně jedné pětiny své normální výšky. Počet listů kolísá z hodnoty, která je dvojnásobkem hodnoty u rostliny divokého typu, na hodnotu, která je normální u všech transgenů.

6.2 Nadměrná exprese ATHl se může obrátit pomocí GA3

Fenotypy nadměrné exprese ATHl se mohou obrátit na fenotyp divokého typu aplikací GA3. Mimokořenová aplikace GA3 na rostliny tabáku popsané v příkladu 6.1 (aplikace sprejem 100 mM GA3 ve tří až čtyř denních intervalech) vede k úplnému obnovení délky stonku divokého typu (zobrazeno na obrázku č.

6) . To také platí pro fenotyp pozdě kvetoucích rostlin ( data nejsou uvedena).

Příklad 7: Nadměrná exprese ATHl v Arabidopsis

Za účelem více porozumět úloze ATHl při vývoji rostlin, cDNA v plné délce se fúzovala do konstitutivního promotoru 35S květákového mozaikového viru. Chimerový gen 35S:ATH1 se transformoval do rostliny Arabidopsis prostřednictvím vakuové infiltrační metody. Může se získat šest nezávislých primárních transformantů a všechny transgenní linie byly inbrední.

Z každé nezávislé transgenní linie v půdě vyklíčilo 40 jednotlivých semen. Stanovil se počet jedinců se změněným fenotypem ve srovnání s rostlinami divokého typu. S ohledem na dobu kvetení čtyři ze šesti linií vykazují změněný fenotyp. Semena z těchto linií klíčí špatně, jestliže se z nich tvoří rostliny, jejich vývoj se zastavil ve stádiu semenáčů. Oba účinky lze obejít přenosem rostlin do růstového média, které obsahuje 10 až 5 M GA3 a tyto rostliny rostou na tomto médiu po dobu 3 dní. Když se rostliny přenesou do normálního média rostlou už normálním způsobem s výjimkou fenotypu pozdního kvetení. Za podmínek krátkého dne tvoří daleko více listů růžice (vegetativní listy), než je tomu u rostlin divokého typu (přibližně 40 listů růžice a 100 dní po klíčení; rostliny stále nekvetou ve srovnání s 30 listy růžice rostlin divokého typu). Za podmínek dlouhého dne u většiny těchto rostlin se objeví obrácení z generativní fáze na vegetativní, což se projeví aeriálními růžicemi (vegetativní listy) na stonku s květenstvím. Rostliny (ekotyp C24) obsahující extra kopii cDNA ATHl za řízení promotoru teplotního šoku Hspl8.2 (rostliny HspHIB) také vykazují fenotyp pozdního květenství. Dokonce aniž dojde k teplotnímu šoku (je známo, že uvedený promotor má základní aktivitu, aniž dojde k indukci) rostliny nesoucí uvedenou konstrukci kvetou daleko později za podmínek dlouhého dne ve srovnání s rostlinami divokého typu (30,5 listů růžice vytvořených u rostlin divokého typu versus 61 listů růžice vytvořených u rostlin HspHIB; zobrazeno na obrázku č. 7).

Příklad 8: Časné kvetení způsobené expresí ATHl

Podobně jako ektopická nadměrná exprese ATHl, zrušení funkce genu ATHl může také ovlivňovat funkci ATHl při vývoji rostliny. Zrušení funkce genu se provedlo konstitutivní nadměrnou expresí antisense ATHl. Antisense cDNA ATHl v plné délce se fúzovala s konstitutivním promotorem květákového mozaikového viru a chimérový gen 35S::antisense ATHl se transformoval do rostliny Arabidopsis ekotypu C24 prostřednictvím protokolu kořenové transformace podle

Valvekens. Získalo se 22 nezávislých transformantů a všechny z nich byly samooplodněny. Z každé linie vyklíčilo v půdě 10 jednotlivých semen a stanovil se počet rostlin se změněným fenotypem ve srovnání s rostlinami divokého typu C24. U pěti z těchto linií rostliny vykazují časně kvetoucí fenotyp. Kvetení začne po vytvoření přibližně deseti listů růžice ve srovnání s přibližně 30 listy vytvořenými u rostliny divokého typu (zobrazeno na obrázku č. 7).

Příklad 9: Odezva na vyhýbání se stínu

Jestliže rostliny rostou blízko sebe dochází k syndromu vyhýbání se stínu, kdy rostliny reagují na snížení poměru červené oblasti světla/dlouhovlnná oblast červeného světla, což způsobilo odfiltrování červeného světla listy. To vede k rychlému a dramatickému zrychlení růstu stonku a řapíků na úkor růstu listů, zásobních orgánů a reproduktivního vývoje. Což způsobuje snížení indexu sklizně (v případě, že index sklizně se vyjádří jako biomasa listů jako část celkové biomasy). Uvažuje se, že odezva na vyhýbání se stínu je zprostředkována převážně fytochromem B. Ukázalo se, že nadměrná exprese fytochromu eliminuje odezvu na vyhýbání se stínu, což vede ke zvýšení indexu sklizně rostlin tabáku pěstovaného na poli (Robson, P. R. H., McCormac, A. C., Irvine, A. S., and Smith, H. (1996).

tabacco through

Nátuře Biotechnology 14(8), 995-998).

Nedostatek fytochromu B také vede ke ztrátě odezvy na vyhýbání se stínu a za induktivních podmínek to dokonce vede k redukci prodloužení stonku ve srovnání s neinduktivními podmínkami.

V laboratoři situaci způsobující odezvu na vyhýbání se stínu může napodobit zvýšení hustoty dlouhovlnného červeného záření (Frc) ke klidnému bílému světlu (Wc) . Za těchto podmínek rostliny Arabidopsis divokého typu (C24 wt) vykazují typickou odezvu na vyhnutí se stínu (prodloužené hypokotyly u

Genetic engeneering of overexpression of a harvest index in phytochrome gene.

* · » * · · * * ♦ • · · · « • · * » * · · • » · »· »9 9 • w ·

Wc + Frc ve srovnání s délkou hypokotylu u Wc), zatímco mutanti fotoreceptoru fytochromu B, kterým nevykazují odezvu na vyhýbání se stínu , vykazovaly opačnou odezvu (prodloužila se délka hypokotylu). Rostliny antisense ATHl také vykazují zkrácení délky hypokotylu a u nejvíce postižených antisense rostlin (asAtHl#3)je toto zkrácení podobné jako u semen mutantů phyB. Tak je možné vytvořit závěr, že podobně jako nedostatek aktivního fytochromu B ztráta Athlvede ke ztrátě odezvy na vyhýbání se stínu.

Analýza vyhýbání se stínu antisense AtHl rostlin (asAtHl), rostlin C24 divokého typu (C24 wt) a phy B fytoreceptorového mutantu (phyB) se uvádí dále v textu. Semenáče se nechaly růst po dobu dvou dnů v klidném bílém světle, pak se ponechají po dobu 4 dní ve stejném světelném režimu nebo se po dobu 4 dní nechají růst v bílém světle doplněném dlouhovlnným červeným světlem. Délka hypokotylu se měřila po 6 dnech růstu. Získaly se následující výsledky:

C24wt	Wc	=	délka	hypokotylu	5,5	mm
	Wc+Frc	=	délka	hypokotylu	7,5	mm
Phy B	Wc .	=	délka	hypokotylu	9,5	mm
	Wc+frc	=	délka	hypokotylu	7,3	mm
Anti-sense	Wc	=	délka	hypokotylu	9,0	mm
AtHl#3	Wc+Frc	=	délka	hypokotylu	5,0	mm
Anti-sense	Wc	=	délka	hypokotylu	9,8	mm
AtHl#7	Wc+Frc	=	délka	hypokotylu	8,0	mm
Anti-sense	Wc	=	délka	hypokotylu	7,5	mm
AtHl#23	Wc+Frc	=	délka	hypokotylu	7,0	mm

Claims (17)

1. Způsob modifikace kvetení u rostlin, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje transformaci rostlin konstrukcí, která obsahuje celou nebo částečnou sekvenci DNA, která kóduje produkt genu ATHl a je řízena promotorem funkčním v rostlinách.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e proces kvetení u rostlin je podporován transformací rostlin za použití konstrukce, která inhibuje produkci proteinu ATHl.

3. Způsob podle nároku 2, vyzn. ačující se tím, že se konstrukce přizpůsobila expresi RNA, která je „antisense vůči RNA produkované genem ATHl.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e proces kvetení v rostlinách je zpožděn transformací rostlin za použití konstrukce, která podporuje produkci rekombinantního proteinu ATHl.

5. Rostlinná genová konstrukce použitelná při způsobu podle nároku 1 obsahující celou nebo částečnou sekvenci DNA kódující produkt genu ATHl řízenou indukovatelným promotorem, který je funkční v rostlinách.

6. Rostlinná genová konstrukce, která je použitelná při způsobu podle nároku 2 a obsahuje celou nebo částečnou sekvenci DNA kódující produkt genu ATHl řízenou promotorem, který je funkční v rostlinách, a jejíž produkt inhibuje produkci proteinu ATHl.

7. Rostlinná genová konstrukce podle nároku 6, kde genovým produktem je „antisense RNA.

8. Transformované rostlinné buňky, vyznačující se tím, že obsahují konstrukce podle libovolného z nároků 5 až 7 .

• · • •♦Φ » ♦ • φφφ

9. Rostlina, vyznačující se tím, že obsahuje rostlinné buňky podle nároku 8.

10. Geneticky upravená rostlina, vyznačující se tím, ž e se produkuje způsobem podle libovolného z nároků 1 až 4 .

11. Rostlina podle nároku 9 nebo 10, vyznačuj ící se t i m, ž e je rostlina plodiny.

12. Rostlina podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e je rýží, kukuřicí, pšenicí, ječmenem, ovsem, žitem, salátem, čekankou, řepkou olejnou (kanola), cukrovou řepou, slunečnicí, sojou a čirokem.

13. Způsob inhibice nadměrné exprese ATH1 v rostlinách podle libovolného z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že obsahují ošetřeni rostlin giberelinem.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, ž e giberilin je A3 nebo A4/A7.

15. Rostlina, vyznačující se tím, že odezva na vyhýbání se stínu se inhibuje působením transgenu kódujícím genový produkt, který inhibuje tvorbu proteinu ATH1.

16. Rostlina podle nároku 16, vyznačující se tím, že transgen je konstrukce přizpůsobená pro expresi „antisense RNA.

17. Způsob produkce rostliny podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím, že obsahuje transformaci buněk rostliny vykazující odezvu na vyhýbání se stínu rostlinnou genovou konstrukcí podle nároku 7 a regeneraci rostlin z uvedených tranformovaných rostlinných buněk.