CN103789322B - 植物转录因子dst在调控植物结实率及提高植物抗高温能力中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻转录因子dst在调控高温下植物结实率以及植物抗高温能力中的应用，其中，所述转录因子dst包括含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了水稻转录因子dst调控高温下植物结实率的方法以及提高植物抗高温能力的方法。本发明克隆得到一个调控水稻高温胁迫下结实率和提高植物耐高温能力的主效基因。本发明在农业领域特别是提高作物对高温的耐受性和提高作物结实率方面具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物学及功能基因组学领域，尤其涉及一种水稻转录因子DST作为一种负调控因子，在提高高温情况下的水稻结实率以及抗高温能力的方法及应用。
背景技术
在全球气候变暖的大环境下，极端天气频繁发生，高温已经成为制约水稻产量和品质的主要因素之一。2013年许多地区的温度和保持高温的天数均创历史新高，严重影响了稻米产量与品质。然而要寻求在日益飙高的温度下水稻产量受到较小的威胁，培育耐高温的水稻品种是防止高温热害最简便有效的途径，现代分子技术的发展和水稻功能基因组研究的深入，为水稻耐高温遗传机制的剖析提供了有效手段，而水稻耐热性机制的阐明和耐热相关基因的克隆、鉴定及功能解析是水稻耐热育种的重要基础。
水稻热害形成是由多种因素共同作用的结果，其中气候因子是造成水稻高温热害的最主要原因之一，在水稻营养生长期和生殖生长期，外界温度高于其最适生长温度一定范围，就可能造成热害。在水稻生殖生长期受到热害造成产量的损失要远大于营养生长期，其中又以水稻开花期受到高温影响最大，籽粒灌浆期次之。大量的研究表明高温胁迫影响水稻的生长发育、产量、品质以及生理生化特性。
在水稻耐热性遗传研究方面，早期研究发现遗传因素是决定水稻品种间耐热性差异的主要原因之一。近年来，随着分子标记技术的发展和广泛应用，出现了一些利用分子标记对水稻耐热性进行数量性状基因定位研究的报道。曹立勇等对水稻籼粳交IR64×Azucena的DH群体以高温处理后的结实率与大田结实率差值为指标，定位了开花结实期6个耐热性主效QTL，在8条染色体间还检测到8对上位性QTL。Zhu etal.(Zhu CL，Xiao YH，Wang C M，etal.Mapping QTL for heat2tolerance at grain filling stage in rice[J].Rice Science，2005，12(1)：33-38.)利用98个回交重组自交群体，以适温粒重与高温粒重差值除以适温粒重的百分比作为水稻耐热性指标，在第1、4、7号染色体上共定位到3个灌浆期耐热性的主效QTL、8对上位性QTL。Craufurd etal.(Craufurd PQ，Jagadish SV，Wheeler TR，et al.Heat tolerance atflowering[C].Abstract，an international workshop on“cool rice for a warmerwold”，2007.)在用Bala与Azucena为亲本构建的186个RILs中，共定位到6个水稻耐热性QTL和1个细胞膜热稳定性QTL。陈庆全利用人工气候室模拟自然高温条件，在水稻开花期对水稻籼籼交202个重组自交系群体进行了耐热性鉴定，共检测到7个抽穗开花期耐热性主效应QTL以及7对上位性QTL。在不同时期处理和采用不同鉴定指标进行的这些研究中，检测的耐热位点在第1、2、4、5和8染色体上分布较多，但这些研究定位QTLs的图谱精确性不强，贡献率不高，因此有待于进一步研究验证其结果。另外检测的耐热位点在12条染色体上均有分布，耐热QTL的区间较大，多个区间的上位性效应也影响水稻的耐热性，且定位的耐热位点对表型性状的解释率也有很大的差异，说明水稻耐热性的遗传基础非常复杂。因此要开展分子标记辅助选择分子育种尚需对这些区域进行精确定位。
近年来随着植物中一些热胁迫相关突变体的获得和转基因实验的进展，人们对植物耐热性有了更加深入和全面的了解。从植物中获得了一些与耐热相关基因，其中以热激蛋白基因与热激转录因子基因为多。
热激蛋白(Hsp)是一个大的基因家族，包括Hsp100、Hsp90、Hsp70(Dnak)、Hsp60(GroE)和Hsp20或sHsp等成员(Nover L，Bharti K，D□ring P，et al.Arabidopsis and the Hsf world：Howmany heat stress transcription factors do we need？[J]Cell Stress Chaperones，2001，6：177-189.)，多数参与生物体正常的生长发育过程(Satyal et al，1998)。蛋白质组学分析发现，水稻耐热品种N22在38℃高温胁迫下Hsp的表达量很高，其中Hsp20或sHsp在高温胁迫下表达量最高，表明其在细胞抵抗热胁迫中发挥重要的作用(Sanieev K B，Kwan Y C，Markus F，et al.Heatstress response in plants：a complex game with chaperones and more than twenty heat stresstranscription factors[J].J.Biosci.2004，29(4)：471-487；Port M，Tripp J，Zielinski D，et al.Role ofHsp17.4-CII as coregulator and cytoplasmic retention factor of tomato heat stress transcriptionfactor HsfA2[J].PlantPhysiol.2004，135：1457-1470)。Hong等报道拟南芥HSP101的一个突变系表现为热敏感，将HSP101的反义链转入拟南芥后检测到HSP101的表达量下降，植株耐热性丧失；过表达HSP101的植株对极端高温的耐受性明显高于野生型，对玉米HSP101突变体的研究也得到了与拟南芥相似的结果。通过半定量RT-PCR分析了水稻中9个热激蛋白基因的表达模式，它们在不同的组织中存在各自不同的表达方式。所有的9个OsHSP基因受热处理强烈诱导，不受到冷处理诱导。现有研究表明热应激转录因子(Hsfs)是热胁迫防御响应中的中心调节子。Liu等(Jin-Ge Liu，Qiu-lin Qin，Zhen Zhang，Ri-He Peng，Ai-sheng Xiong，Jian-Min Chen，Quan-Hong Yao.OsHSF7 gene in rice，Oryza sativa L.，encodes a transcriptionfactor that functions as a high temperature receptive and responsive factor[J].BMB reports，2009，42(1)：16-21)利用酵母杂交的方法从水稻中克隆到3个A类热激转录因子基因，其中OsHSF7被发现其表达水平对温度迅速响应，过量表达OsHSF7的单子叶转基因植物，能够在热处理时上调保护作用的基因如热休克蛋白。Yamanouchi等通过图位克隆定位水稻斑点叶基因Spl7的候选基因时在第5染色体上发现1个ORF和热胁迫转录因子高度相似，编码HSF蛋白。籼粳稻基因组中至少共存在25个Hsf基因，其中OsHsfA2a，OsHsfA2c，OsHsfA2e，OsHsfA4a，OsHsfB2b，OsSHFC1b专一性地受热胁迫诱导表达。根据OsHsfs蛋白的结构将Hsf分为HsfA，B，C三个家族，热胁迫下A类Hsfs比B，C两类有更高的表达。水稻中已经鉴定克隆19种Hsf，拟南芥中有21种，但对Hsf功能了解尚浅。
当热胁迫发生时植物体内的活性氧含量在较短时间内(约15min)上升并超过其阈值，这一信号可被组氨酸激酶和热激转录因子所感受，热激转录因子中感受H2O2信号主要是HsfA4a，HsfA5对该通路起到负调控的功能，当活性氧信号减弱，HsfA5与HsfA4a形成异聚体，阻止HsfA4a形成有活性的同源三聚体，将调控通路中止。Hsfs可将信号通过促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路传递到下游的转录因子，主要包括锌指蛋白Zat家族、WRKY转录因子家族、MBF1c，和NADPH过氧化物酶(Rboh)。已有报道锌指蛋白Zat家族成员中对热胁迫响应的主要是Zat7、Zat10和Zat12。其中Zat12是APX调控通路所必需的，并且控制了下游42个胁迫响应相关的基因。Zat12对Zat7的表达起到直接的调控作用。WRKY转录因子家族中WRKY25对氧化胁迫进行响应，并且该响应依赖Zat12的协助。MBF1c是高度保守的转录辅激活物，在热胁迫下表达量提高。将MBF1c基因敲除的植株表现出热敏感性，并且不能积累SA和海藻糖，表明MBF1c位于SA和海藻糖热胁迫响应通路的上游，对其起到调控作用。
AP2/ERF家族是植物中存在的一类特殊转录因子，拥有共同的保守DNA结合结构域，并且多个成员在植物逆境胁迫响应中发挥重要的作用，其中，DREB家族成员可在胁迫条件下激活胁迫响应基因的表达，而DREB2类调节因子主要响应热胁迫，DREB2转录因子包括DREB2A和DREB2B两类。在在水稻中起主要作用的是OsDREB2B基因编码的蛋白，并且该基因具有选择性剪接的功能。在正常生长条件下，该基因则剪接形成终止密码子，产生无功能的蛋白，在热胁迫条件下，该基因编码产生全长蛋白，调控下游热胁迫响应基因。
同时，一些研究者开展了高温胁迫下水稻花器相关性状的基因定位研究，涉及到花药发育过程、花药裂药的基因控制及逆境条件下与花粉发育密切相关的基因，以期调控花期，减少或避免高温对水稻花器的伤害，提高水稻结实率。Zhu等在粳稻品种日本晴的花药不开裂突变体中发现了一个控制花药开裂的基因aid1，此基因存在于叶和穗中，是一个能编码一个262个氨基酸的蛋白，目前该基因已被定位于水稻第六染色体上。已有的研究发现控制花药开裂的基因可能有多个，表明水稻开花裂药是一个非常复杂的过程，需要进一步的研究来揭示其分子机理。
目前，有关DST作为锌指转录因子发挥功能的报道仅来自两个方面：Huang等研究发现在水稻中DST功能的缺失增加气孔关闭的程度，减少了叶片气孔的密度，从而提高水稻的耐盐性和抗干旱的能力，并认为这一过程是通过调控体内H2O2的稳态而实现的(Xinyuan Huang，Daiyin Chao，Jiping Gao，et al.A previously unknown zinc finger protein，DST，regulates droughtand salt tolerance in rice via stomatal aperture control[J].GENES & DEVELOPMENT，2009，23：1805-1817)。Yuan等发现DST作为转录因子通过直接调控水稻体内细胞分裂素氧化酶基因OsCKX2的表达，影响内源细胞分裂素的合成，来增加水稻的结实率(Shuyu Li，Bingran Zhao，Dingyang Yuan，et al.Rice zinc finger protein DST enhances grain production through controllingGn1a/OsCKX2expression[J].PNAS，2013，110：3167-3172)。在其它方面的功能研究均未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种转录因子dst的新功能及新用途，即所述转录因子dst调控高温下植物结实率的用途以及所述转录因子dst调控提高植物抗高温能力的用途。
本发明提供了一种分离的转录因子dst基因，该基因至少含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；其为一种锌指转录因子。本发明转录因子dst基因可以根据无性系突变体库中筛选得到。
本发明中，所述转录因子dst基因还可以是含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的高同源性的核苷酸序列，其中，所述高同源性是指同源性＞60％；较佳地，同源性＞80％；更佳地，同源性＞90％或更高。
本发明还提出一种转录因子dst突变体的重组表达载体的构建方法，具体步骤为通过数据库中已报道的DST基因的序列设计引物，通过使用KOD高保真PCR酶克隆得到该基因全长(包括启动子区域)为3966bp，利用pCAMBIA1300构建该基因的回复表达载体，测序正确后将载体转化到农杆菌感受态中，通过农杆菌介导法将基因导入到突变体愈伤组织中，再通过抗生素的筛选、分化和鉴定获得转基因植株。观察花期高温处理下回复材料的结实率及发育状况，明确目的基因与耐高温表型的相关性。
本发明转录因子dst可作为在花期高温情况下的负调控因子，对高温胁迫起到负调控作用，其突变体在40℃15d的花期处理条件下结实率明显优于野生型，证明该基因在花期高温情况下可作为负调控因子，对高温胁迫起到负调控作用。
本发明还提出了转录因子dst在调控高温下植物结实率中的应用。所述植物为水稻。
本发明还提供了一种调控高温下植物结实率中的方法，分别选取突变体和野生型各300颗饱满的种子，破休眠诱导生芽生根后，在营养液中进行培养，在抽穗前一天进行38℃，7d，40℃，7d和40℃，15d的高温处理，每个处理条件选取50个株系。处理结束后继续进行正常培养直至成熟，分别统计处理的和正常培养植株的首穗的结实率。其结实率比野生型分别高将近10％、20％和30％。而在40℃15d的高温处理条件下野生型(ZH11)结实率为0。表明该突变体在高温胁迫条件下，在结实率方面具有明显的优势。
本发明还提出了转录因子dst在提高植物抗高温能力中的应用。所述植物为水稻。
本发明还提出了一种调控提高植物抗高温能力的方法，分别选取突变体和野生型各300颗饱满的种子，破休眠诱导生芽生根后，在营养液中培养到18天，高温(day/night：42/37℃，13h/11h；Rh30％)处理幼苗3天，然后移至正常培养条件下培养15天，统计结果发现突变体存活率明显高于野生型。
本发明还提出一种所述转录因子dst的回复表达载体，该载体为pCAMBIA1300-dst。
本发明还提出了一种遗传工程化的宿主细胞，其含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或所述的载体。
本发明有益效果包括：可以提高作物在高温胁迫条件下的结实率，并且可以提高植物对高温的耐受能力。本发明可应用于植物培育中，选育出具有特定品质性状的优良品种。本发明克隆得到调控水稻高温胁迫下结实率和提高植物耐高温能力的主效基因。本发明在农业领域特别是提高作物对高温的耐受性和提高作物结实率方面具有重要的应用前景。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1表示3d高温处理，15d回复培养后野生型和突变体的生长情况。
图2表示ZH11和hst在40℃15d和正常条件下的结实率。
图3表示ZH11和hst在40℃15d和正常条件下的结实情况。
图4表示F2代处理和未处理后的结实情况。
图5表示部分分子标记聚丙烯酰胺凝胶电泳情况和分子标记发生交换的比率。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明经过深入研究，首次提出转录因子dst可作为在花期高温情况下的负调控因子，对高温胁迫起到负调控作用，其突变体在40℃15d的花期处理条件下结实率明显优于野生型，证明该基因在花期高温情况下可作为负调控因子，对高温胁迫起到负调控作用。例如，本发明中，在高温(day/night：42/37℃，13h/11h；Rh30％)条件下处理第18天的突变体幼苗3天，然后移至正常培养条件下生长15天，统计结果发现突变体存活率明显高于野生型。本发明中，对该突变体植株在花期进行高温(40℃，15d，每天6小时)处理，结果显示突变体结实率达30％，而野生型结实率为0。
本发明中，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明中，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
本发明中，转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得高温下结实率或抗高温能力发生改变的植物。制备转基因植物的方法可以是：将携带启动子序列和目的基因(可操作地连接)的表达载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、小麦、大麦和玉米。
本发明中，转录因子dst多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。重组表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中转录因子dst的表达。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了转录因子dst或其同源基因的转基因植物等。
本发明还涉及利用转录因子dst及其表达蛋白作为一种基因转化植株后代的追踪标记。或将其作为分子标记，通过检测植物中转录因子dst及其表达蛋白的表达情况，鉴定禾本科植物在高温下的结实率或抗高温能力的提高。还可利用将其作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。
本发明还提供筛选可提高在高温下的植物结实率或提高植物抗高温能力的物质的方法，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节高温下的植物结实率及抗高温能力的潜在物质。所述的方法包括：将候选物质与表达转录因子dst的体系接触，检测候选物质对转录因子dst的表达的影响；若所述候选物质可提高或降低转录因子dst的表达，或促进或抑制转录因子dst的活性，则表明其是可用于调节植物在高温下的植物结实率及抗高温能力。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节植物高温下的结实率及抗高温能力有用的物质。本发明还提供依所述筛选方法获得的物质。
实施例1 转录因子dst的重组表达载体的构建
通过数据库中已报道的DST基因的序列设计引物，通过使用KOD高保真PCR酶克隆得到该基因全长(包括启动子区域)为3966bp，利用pCAMBIA1300构建该基因的回复表达载体，测序正确后将载体转化到农杆菌感受态中，通过农杆菌介导法将基因导入到突变体愈伤组织中，再通过抗生素的筛选、分化和鉴定获得转基因植株。观察花期高温处理下回复材料的结实率及发育状况，明确目的基因与耐高温表型的相关性。
回复引物：
ACGCGTCGACtcgttttatccccttgcact(SEQ ID NO.2)
ACGCGTCGACctagaggctcaagttgaggtcgag(SEQ ID NO.3)
克隆序列(包括启动子区域)，如SEQ ID NO.4所示。
实施例2
分别选取突变体和野生型各300颗饱满的种子，破休眠诱导生芽生根后，在营养液中培养到18天，高温(day/night：42/37℃，13h/11h；Rh30％)处理幼苗3天，然后移至正常培养条件下培养15天，统计结果发现突变体存活率明显高于野生型。如图1所以，表明DST基因失活可提高水稻苗期对高温的抵抗能力，提高存活率。
本实施例中，突变体为本实验室筛选得到，遗传背景为常规粳稻品种中花11，在DST基因编码区第194个碱基处有四个碱基的插入造成移码突变。
本实施例中，野生型为本实验保留水稻品种，常规粳稻品种中花11。
实施例3
从常规粳稻ZH11的无性系突变体库中筛选出一份突变体材料，将其与野生型ZH11同时进行38℃，7d，40℃，7d和40℃，15d的高温处理，其结实率比野生型分别高将近10％、20％和30％。而在40℃15d的高温处理条件下ZH11几乎不结实。因此将该突变体命名为hst。并且处理条件采用40℃15d的高温处理条件。实验结果如图2所示，表明在40℃，15d的处理条件下，突变体在结实率方面比野生型有明显优势，而在正常生长条件下两个品种的结实率差距不大，也表明DST基因失活条件下可提高水稻花期对高温的抵抗能力，并提高结实率。如图3的结实情况照片也可表明DST作为一种负调控因子，在失活情况下可提高水稻的结实率。
本实施例中，正常温室的条件为：白天：28℃13h；夜晚：23℃11h。高温处理条件为(模拟自然条件下的高温情况)：白天：30℃3h；40℃6h；30℃4h。夜晚：23℃11h。
本实施例中，突变体为本实验室筛选得到，遗传背景为常规粳稻品种中花11，在DST基因编码区第194个碱基处有四个碱基的插入造成移码突变。
本实施例中，野生型为本实验保留水稻品种，常规粳稻品种中花11。
实施例4
将突变体作为母本，常规籼稻IR29作为父本，杂交获得F1代，进行自交获得F2代。选取260颗F2代饱满的种子进行催根催芽，在温室条件下进行营养液培养直至开花前1d，将F2代中130株移入40℃的高温处理15d，然后将处理后的材料移入正常温室下进行继续生长，待灌浆结束统计结实率。实验结果如图4所示，表明有40株经过处理的F2代植株有不同程度的结实，部分结实率达到40％。而在正常条件下培育的F2代植株结实正常。
本实施例中，突变体为本实验室筛选得到，遗传背景为常规粳稻品种中花11，在DST基因编码区第194个碱基处有四个碱基的插入造成移码突变。
本实施例中，IR29从中国农业科学院水稻研究所获得，为常规籼稻品种。
实施例5 基因的定位
提取40℃15d处理后有结实的F2代40个单株的DNA。从数据库和已报道的材料中在不同染色体上挑选了大量的分子标记，使用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳在亲本IR29和hst中进行分子标记多态性的筛选。用具有多态性的分子标记对从F2代中筛选出的植株进行定位，最终将目的基因定位在RM6970这个分子标记附近(图5为部分分子标记聚丙烯酰胺凝胶电泳情况和分子标记发生交换的比率)。通过数据库筛选，发现在该区域存在一个已报道的转录因子dst基因。该基因对盐胁迫和干旱胁迫起到一定的调控作用，可能与热胁迫具有一定的相关性。因此，对突变体中的该基因进行了测序，结果发现突变体中该基因在编码区第194个碱基处有四个碱基的出入造成了移码突变，并且该突变位点位于dst的锌指结构区域，该区域是dst正常功能所必需，造成了dst基因功能的缺失。
分子标记
RM6970Type Forward primer(5′-3′)：TCGCTTGTGTTTTCTGGGTC(SEQ ID NO.5)
Reverse primer(5′-3′)：TGGAGAATTTGGAGGCTGC(SEQ ID NO.6)
实施例6 hst突变体的回复
提取水稻基因组DNA，设计引物克隆得到包括上游启动子区域和完整的DST基因序列共3966bp，连接到表达载体pCAMBIA1300上，通过农杆菌介导法将构建的表达载体转到突变体hst的愈伤组织中，获得转基因株系T0代。将T0代的种子选取三个株系在温室条件下培养得到F1代植株，到开花前一天一半进行高温处理15d，另一半继续进行正常培养。15d后将处理的材料然后移到正常生长条件下培养，直至灌浆结束。统计结实率。
实验结果：高温处理后，回复材料结实率为0％，与野生型中花11的结实率相近。而正常生长条件下结实率为60％-80％。
结果表明：将高温处理条件下具有30％结实率的突变体经过回复后，回复材料的处理后的结实率为0％，而正常生长条件下的突变体的回复材料的结实率正常。高温情况下，突变体中该基因失活，结实率达到30％，突变体的回复材料结实率为0％。但在正常条件下，突变体和突变体回复材料的结实率均为60％-80％之间。表明hst突变体为单基因隐性突变体，并且该基因为热胁迫条件下结实性状的重要的负调控因子。
回复到耐热突变体内的基因序列，如SEQ ID NO.7所示。
实施例7 野生型中花11中DST基因的干涉材料的获得
使用Gateway的方法构建干涉载体：在DST基因的CDS区域选取一段205bp大小的基因片段，从两端设计引物，在正向引物的5′端加入CACC四个碱基序列，作为与入门载体配对连接的位点。进行PCR扩展，琼脂糖凝胶电泳和割胶回收纯化目的片段。通过TOPO反应将205bp大小的片段连接到Invitrogen公司的pET Directional TOPO入门载体上，将构建好的载体转到E.coli感受态中。采用菌落PCR的方法来鉴定阳性菌。把鉴定得到的阳性菌提取质粒，与终载体pH7GWIWIG2(实验室内部构建)进行LR融合反应，将目的片段以一段正向序列和一段反向序列的形式连接到终载体上。通过农杆菌介导法将终载体转到野生型中花11的愈伤组织中，获得中花11的干涉株系T0代。将获得的T0代的种子水培获得F1代的植株，在培养到开花前一天一部分正常培养，一部分进行40℃，15d的处理，处理结束恢复正常培养直至灌浆结束，统计结实率。
实验结果：中花11干涉材料正常培养的结实正常，经过热胁迫后结实率在中花11和突变体结实率之间。
分析：突变体中由于四个碱基的插入导致移码突变，造成DST基因功能的完全丧失。通过Gateway方法获得的中花11干涉材料只能达到DST基因功能的部分丧失，所以表型介于中花11和突变体之间。但也能够充分说明，DST基因为热胁迫条件下结实性状的重要的负调控因子。
干涉序列如SEQ ID NO.8所示
gactccccgtcgcctatggcggcgcaggcggccgacctgtcgctgacgctggcgccgtcgggagggggtggtgggggaggaggaggcggcggcggtggtgggtcgtcgtcggcgtgcatcgacggcaaggacgtgcggctgttcccgtgcttgttctgcaacaagaagttcttgaagtcgcaggcgctgggcgggcaccagaacg
正向引物：CACC gactccccgtcgcctatggc(SEQ ID NO.9)
反向引物：cgttctggtgcccgcccagcgcct(SEQ ID NO.10)
Claims (6)
1.转录因子dst作为在花期高温情况下的负调控因子在调控高温胁迫下提高植物结实率的应用，其特征在于，所述转录因子dst的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述植物为水稻；所述转录因子dst是利用粳稻ZH11的无性系突变体库中筛选出的突变体材料，所述转录因子dst在编码区第194个碱基处有四个碱基的出入造成了移码突变，该突变位点位于dst的锌指结构区域。
2.转录因子dst作为在花期高温情况下的负调控因子在调控高温胁迫下提高植物抗高温能力的应用，其特征在于，所述转录因子dst的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述植物为水稻；所述转录因子dst是利用粳稻ZH11的无性系突变体库中筛选出的突变体材料，所述转录因子dst在编码区第194个碱基处有四个碱基的出入造成了移码突变，该突变位点位于dst的锌指结构区域。
3.一种以转录因子dst作为在花期高温情况下的负调控因子调控高温胁迫下提高植物抗高温能力的方法，其特征在于，所述方法包括：使所述转录因子dst失活来提高植物抗高温能力，所述转录因子dst是利用粳稻ZH11的无性系突变体库中筛选出的突变体材料，所述转录因子dst在编码区第194个碱基处有四个碱基的出入造成了移码突变，该突变位点位于dst的锌指结构区域；其中，所述转录因子dst的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述植物为水稻。
4.一种以转录因子dst作为在花期高温情况下的负调控因子调控高温胁迫下植物结实率中的方法，其特征在于，所述方法包括：使所述转录因子dst失活来提高在高温下的植物结实率，所述转录因子dst是利用粳稻ZH11的无性系突变体库中筛选出的突变体材料，所述转录因子dst在编码区第194个碱基处有四个碱基的出入造成了移码突变，该突变位点位于dst的锌指结构区域；其中，所述转录因子dst的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述植物为水稻。
5.一种含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的转录因子dst的重组载体，其特征在于，所述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的转录因子dst是利用粳稻ZH11的无性系突变体库中筛选出的突变体材料，通过初步图位克隆的方法克隆得到的；所述转录因子dst在编码区第194个碱基处有四个碱基的出入造成了移码突变，并该突变位点位于dst的锌指结构区域。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，其含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如权利要求5所述的载体，其中，所述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的转录因子dst是利用粳稻ZH11的无性系突变体库中筛选出的突变体材料，通过初步图位克隆的方法克隆得到的；所述转录因子dst在编码区第194个碱基处有四个碱基的出入造成了移码突变，并该突变位点位于dst的锌指结构区域；所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞。
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