CN101875689A

CN101875689A - 水稻锌指蛋白转录因子新基因及抗旱耐盐应用

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Publication number: CN101875689A
Application number: CN201010161188XA
Authority: CN
Inventors: 林鸿宣; 黄新元; 晁代印; 朱美珍; 施敏; 高继平
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2009-04-08
Filing date: 2010-04-07
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2030-04-07
Also published as: EP2418215A1; JP5758376B2; BRPI1013891A2; AU2010234125A1; AU2010234125B2; JP2012523219A; CN101875689B; CA2758310A1; KR20120098975A; KR101372114B1; RU2558249C2; MX2011010695A; EP2418215A4; US20120102588A1; UA106489C2; ZA201107007B; WO2010115368A1; RU2011145015A

Abstract

本发明提供了水稻锌指蛋白转录因子新基因及其抗旱耐盐的应用。本发明具体涉及包含具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、或其同源多肽的分离的锌指蛋白转录因子；该转录因子的编码序列及包含该编码序列的载体或宿主；与该转录因子结合的顺式作用元件；以及所述转录因子或编码序列的拮抗剂。本发明还涉及提高植物抗旱耐盐性的方法和筛选具有高抗旱耐盐性植物的方法。本发明提供了改善和研究植物抗旱耐盐性的新方法，具有广阔的应用前景。

Description

水稻锌指蛋白转录因子新基因及抗旱耐盐应用

技术领域

本发明涉及植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及水稻锌指蛋白转录因子新基因及其编码的蛋白或多肽在增强植物抗旱耐盐性中的用途，以及通过抑制所述基因或其表达的蛋白来改进植物对盐和/或干旱胁迫的抗性的方法及转基因植物。

背景技术

全球粮食需求的增加和耕地面积的不断减少对各国粮食安全形成持续的压力。在粮食生产中，干旱、盐碱等是最主要的非生物胁迫，每年造成农作物大量减产及品质下降。并且，干旱和盐碱常相伴出现，例如土壤盐碱化是干旱地区常见的一种土地退化现象。

有资料表明，中国每年由于干旱造成的水稻损失价值至少为20亿美元，而农田的盐碱化也是减产、低产的主要原因。干旱和盐碱已成为我国农业面临的两个严重问题。

因此，如何提高作物对干旱和/或盐碱的抗性能力对于提高产量，解决中国乃至世界的粮食问题具有重大的意义，对于这些非生物逆境的研究是植物研究领域最迫切且最具挑战性的工作之一。

目前已经有一部分抗旱、耐盐相关基因包括一些转录因子被克隆，而且通过基因工程技术获得一些抗逆植物或农作物品系。抗逆基因工程就是通过调控基因的转录表达来改善植物的抗逆能力，而在转录水平的调控中，转录因子起着关键作用。

目前，已发现一些参与胁迫应答基因表达的转录因子。但是，由于有众多的转录因子参与复杂的植物逆境响应过程，现在所发现的参与胁迫应答基因表达的转录因子只是冰山一角，还有许多转录因子有待发现和研究、并进一步应用于农作物抗逆分子育种。

因此，本领域迫切需要对参与胁迫应答基因表达的转录因子进行研究，开发出可用于农作物抗逆育种的新方法和新品种，从而提高农作物产量和质量。

发明内容

本发明的目的之一正是提供一种新的与植物(尤其是作物)耐盐抗旱性密切相关的基因——水稻锌指蛋白转录因子DST，明确了该转录因子是植物耐盐抗旱性的负调控因子。本发明的另一目的是为增强植物对盐碱和/或干旱胁迫的抗性提供了一种新的途径。本发明的另一目的是提供具有增强的抗旱耐盐性的转基因植物的制备方法及转基因植物。本发明的另一目的是提供筛选具有优异抗旱耐盐性植株的方法及用该方法筛选获得的植物。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的锌指蛋白转录因子，其包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、或其同源多肽。

在一个优选例中，所述多肽具有Cys-2/His-2型锌指结构域。

在另一个优选例中，所述多肽参与调控过氧化物酶相关基因、控制过氧化氢的累积和/或调控叶片气孔的开度，从而影响水稻的抗旱和耐盐性。

在本发明的一个实施方式中，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物感旱感盐性的由(a)衍生的多肽；或

(c)具有Cys-2/His-2型锌指结构域，且具有提高植物感旱感盐性的(a)和(b)中所述多肽的同源多肽。

在一个优选例中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选作物。

在另一个优选例中，所述植物选自：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物，优选禾本科植物。

在另一个优选例中，所述植物选自：水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗、高粱、拟南芥、棉花或油菜，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗或高粱。

在另一优选例中，所述盐是指：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。

在本发明的第二方面中，提供了一种分离的多核苷酸，它包含编码本发明多肽的核苷酸序列。

在一个优选例中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽或其同源多肽。

在本发明的一个实施方式中，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-435位的核苷酸序列；或

(c)与(a)-(b)中任一种核苷酸序列互补的多核苷酸。

在本发明的第三方面中，提供了一种载体，它含有本发明的多核苷酸。

在一个优选例中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒，优选pCAMBIA1301、pEGFP-1、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301或pHB，更优选pCAMBIA1301。

在本发明的第四方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的载体或基因组中整合有本发明的多核苷酸。

在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优选细菌细胞、酵母细胞或植物细胞，更优选大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母菌，最优选农杆菌，所述农杆菌包括但不限于：EHA105、SOUP1301或C58，优选EHA105。

在本发明的第五方面，提供了一种顺式作用元件，其具有SEQ ID NO：3所述的序列，且能够与本发明所述的转录因子结合。

在一个优选例中，所述顺式作用元件的序列为TGCTANN(A/T)TTG，其中N选自A、C、G或T。

在另一优选例中，所述顺式作用元件与本发明的转录因子的锌指结构域结合。

在另一个优选例中，所述顺式作用元件与本发明的转录因子的结合具有提高植物感旱感盐性的作用。

在本发明的第六方面，提供了本发明的锌指蛋白转录因子或多核苷酸的拮抗剂。

在一个优选例中，所述拮抗剂是小分子干扰RNA、抗体或反义寡核苷酸。

在本发明的第七方面，提供了一种提高植物抗旱耐盐性的方法，所述方法包括抑制本发明的锌指蛋白转录因子、抑制本发明的多核苷酸的表达、或抑制本发明的所述顺式作用元件与本发明的锌指蛋白转录因子的结合。

在另一优选例中，所述抑制采用缺失、突变、RNAi、反义或显性负调节方法进行。

在一个优选例中，所述抑制包括使得本发明转录因子或本发明的多核苷酸序列发生一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加，从而使得所述植株具有提高的抗旱而盐性。

在另一优选例中，以SEQ ID NO：2中的氨基酸计数为准，所述抑制是使得具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第69位的天冬酰胺突变为天冬胺酸、第162位的丙氨酸突变为苏氨酸，从而使得含有该突变序列的植株具有提高的抗旱耐盐性。

在另一个优选例中，所述方法包括将本发明的拮抗剂作用于植物。

在另一优选例中，所述抑制包括：用含有针对本发明的锌指蛋白转录因子的小分子干扰RNA的载体或含有所述载体的宿主细胞转化植物。

在另一优选例中，所述方法还包括使得通过上述方法获得的具有提高抗旱耐盐性的植株与非转基因植物或其它转基因植物杂交。

在本发明的第八方面，提供了一种筛选抗旱耐盐性植株的方法，所述方法包括：

(i)检测候选植株中本发明锌指蛋白转录因子的水平、本发明多核苷酸的表达水平、和/或本发明的顺式作用元件与本发明的锌指蛋白转录因子的结合水平；

(ii)将步骤(i)所检测到的候选植株中的水平与对照植株中相应的水平相比，如果候选植株中的水平较对照植株有所降低，则表明所述植株是抗旱耐盐性植株。

在一个优选例中，所述盐是指：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。

在本发明的第九方面，提供了一种本发明的锌指蛋白转录因子的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述锌指蛋白转录因子。

在本发明的另一方面，提供了本发明的锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的抑制剂或非保守性突变序列在提高植物抗旱耐盐性中的用途。

在一个优选例中，所述抑制剂是针对所述转录因子或核苷酸序列的小分子干扰RNA、抗体或反义寡核苷酸。

在另一优选例中，所述非保守性突变序列使得包含所述非保守性突变序列的植株中本发明锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的翻译或表达受到抑制，从而使其抗旱耐盐性优于不包含所述非保守性突变的野生型植株。

在另一优选例中，所述非保守性突变序列是SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第205位碱基A突变为G和第484位碱基G突变为A、或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第69位天冬酰胺突变为天冬胺酸和第162位的丙氨酸突变为苏氨酸。

在本发明的一个实施方式中，所述提高植物抗旱耐盐性包括：

(i)将所述抑制剂直接作用于植物；

(ii)将所述非保守性突变序列导入植物；或

(iii)设计针对所述非保守性突变序列的分子标记，并用该分子标记对包含所述非保守性突变序列的突变体与其它水稻品种的杂交后代进行选择，从而筛选出携带所述非保守性突变序列的个体。

在本发明的一个优选例中，所述分子标记为序列如SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11所示的引物对，和/或序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对。

在本发明的又一方面，提供了一种提高植物抗旱耐盐性的方法，所述方法包括：(A)提供本发明的锌指蛋白转录因子或核苷酸序列的抑制剂或非保守性突变序列；(B)对植物进行选自下组的一种或多种处理：(i)将所述抑制剂直接作用于植物；(ii)将所述非保守性突变序列导入植物；或(iii)设计针对所述非保守性突变序列的分子标记，并用该分子标记对包含所述非保守性突变序列的突变体与其它水稻品种的杂交后代进行选择，从而筛选出携带所述非保守性突变序列的个体。

在本发明的另一方面，提供了一种制备转基因植物的方法，所述方法包括：

(1)用含有本发明锌指蛋白转录因子的非保守性突变序列或本发明多核苷酸的非保守性突变序列的构建物转化植物细胞、组织或器官；

(2)选择转入所述非保守性突变序列的植物细胞、组织或器官；和

(3)将步骤(2)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，

其中，所得的转基因植物的抗旱耐盐性较未转化的植物有所增强。

在另一优选例中，所述方法还包括使所得的转基因植物与非转基因植物或其它转基因植物杂交，从而获得包含所述非保守性突变序列的杂交后代，所述杂交后代的抗旱耐盐性较未转化的植物有所增强，优选所述杂交后代具有稳定的遗传性状。

在另一优选例中，所述方法还包括用设计针对所述非保守性突变序列的分子标记对转基因植物的杂交后代进行筛选，以获得具有改良的抗旱耐盐性的植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：水稻DST基因序列(图1A)及其编码的氨基酸序列(图1B)。

图2：水稻DST基因的突变体dst与野生型在干旱和盐碱条件下的表型比较。各照片的左侧为野生型(中花11，ZH11)，右侧为突变体dst。

图3：野生型、通过互补转基因转入DST基因的dst突变体、以及通过RNAi降低DST功能的植株在干旱和盐碱条件下的表型比较。

图4：采用Matchmaker GAL4酵母双杂交系统3(Clontech)的DST转录激活分析。

图5：凝胶滞后实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)结果。

图6：禾本科作物DST同源蛋白锌指结构域的序列比对分析。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，发现了一种水稻锌指蛋白转录因子新基因DST，抗旱耐盐性相关基因DST(Drought and Salt Tolerance gene)，并证明了该基因为抗旱、耐盐的负调控因子，可控制植物抗旱和耐盐性，其表达抑制可增强植物对盐或干旱胁迫的抗性，因而在植物的抗旱和耐盐等抗逆性的分子育种中起重要作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。

具体而言，本发明人通过在盐胁迫下大规模筛选水稻突变体库(EMS诱变)和图位克隆技术克隆了控制水稻抗旱、耐盐的新基因DST。DST基因的基因组长度为906bp，没有内含子，全长ORF(open reading-frame)长度为906bp。该基因编码301个氨基酸、约29KDa的具有保守锌指结构域的锌指蛋白，该蛋白为一个转录因子。

表型鉴定结果表明该基因的突变体(例如DST基因存在2个碱基变异，引起2个氨基酸发生了替换)表现既抗旱又耐盐，同时通过RNAi把该基因表达下调时也产生较强的抗旱和耐盐性。

生化实验结果表明DST是一个既有转录激活域，又有DNA结合域的转录因子；基因芯片分析表明DST作为转录因子调控下游一系列基因。

功能研究显示突变体与野生型相比，在气孔周围累积较多的过氧化氢(H₂O₂)，气孔开度较小，在干旱胁迫下叶片保持较高的相对含水量，因此突变体的抗旱性较强；另外，由于突变体的气孔开度较小，气孔导度较低，水分蒸腾速度较慢，从而减少Na⁺离子从根部运到地上部(叶片等)，降低Na⁺毒害，因此提高耐盐性。该研究表明DST参与调控过氧化物酶相关基因、控制过氧化氢(H₂O₂)的累积、调控叶片气孔的开度，从而影响水稻的抗旱和耐盐性。

通过上述研究表明：DST基因为抗旱、耐盐的负调控因子，其表达抑制可增强植物对盐或干旱胁迫的抗性，该特性可用于生产对盐胁迫和干旱抗性明显提高的转基因植物。因此，DST基因在提高作物对盐和干旱等逆境胁迫能力方面具有较大的应用潜力。

并且，通过数据库搜索发现，在高梁(Sorghum bicolor)的基因组中有一个DST的同源基因，蛋白的相似性为54.3％；在玉米(Zea mays)的基因组中有三个DST的同源基因，蛋白的相似性分别为51.7％、36.1％和33.5％；在大麦(Hordeumvulgare)的基因组中有一个DST的同源基因，蛋白的相似性为38.4％；在甘蔗(Saccharum officinarum)的基因组中有三个DST的同源基因，蛋白的相似性分别为38.2％、38.2％和34.5％。这些同源基因都具有保守的C2H2类型锌指结构域，同时在N端的相似性较高，推测其它植物(优选禾本科植物)的DST同源基因具有与水稻DST基因相似的功能。

DST蛋白或多肽及其编码序列

在本发明中，术语“DST蛋白或多肽”、“DST基因编码的蛋白质或多肽”或“锌指蛋白转录因子”是指由本发明的DST基因编码的蛋白质或多肽，该定义中也包括所述蛋白质或多肽的保守性变异多肽、或其同源多肽。它们均具有Cys-2/His-2型锌指结构域，且所述蛋白或多肽表达受到抑制后，可提高植物干旱或盐胁迫抗性。

在本发明的一个实施方式中，所述转录因子参与调控过氧化物酶相关基因、控制过氧化氢的累积和/或调控叶片气孔的开度，从而影响水稻的抗旱和耐盐性。

所述DST蛋白质或多肽的序列可选自：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物感旱感盐性的由(a)衍生的多肽；或(c)具有Cys-2/His-2型锌指结构域，且具有提高植物感旱感盐性的(a)和(b)中所述多肽的同源多肽。优选所述蛋白质或多肽能与TGCTANN(A/T)TTG结合，其中N代表A、C、G或T。

本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中DST蛋白或多肽优选由禾本科植物(优选水稻)DST基因或其同源基因或家族基因编码。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的DST蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有增强植物重金属或盐胁迫抗性的活性。本领域技术人员可根据本领域常识和/或常规试验很容易地确定这些变异方式，而不会影响蛋白或多肽的活性。

在本发明中，“保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生：

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代	Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu	Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu	Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala	Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala	Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser	Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因植物，并观察该转基因植物的性状是否发生变化来筛选和鉴别所得蛋白质或多肽。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与DST蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗DST蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含DST蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了DST蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有DST蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括DST蛋白的活性片段和活性衍生物。

如本文所用，术语“DST基因”、“植物DST基因”或“本发明转录因子的编码序列”可互换使用，均是指一种编码本发明所述的DST蛋白或多肽的序列，其与水稻DST基因序列(参见SEQ ID NO：1)可高度同源或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因表达受到抑制对植物干旱或盐胁迫抗性具有一定的改善作用。

在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸是：(a)具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-435位的核苷酸序列；或(c)与(a)-(b)中任一种核苷酸序列互补的多核苷酸。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的DST基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的DST基因优选获自水稻，获自其它植物的与水稻DST基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

植物及其对盐和/或干旱胁迫的抗性

如本文所用，所述的“植物”包括(但不限于)：禾本科植物、锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或伞形科植物等，优选所述植物为禾本科植物，更优选为禾本科作物。例如，所述植物可选自：水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗、高粱、拟南芥、棉花或油菜，更优选水稻、玉米、小麦、大麦、甘蔗或高粱。

如本文所用，术语“作物”是指在粮、棉、油等农业和工业中具有经济价值的植物，其经济价值可体现在该植物的种子、果实、根、茎、叶等有用部位上。作物包括但不限于：双子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物为禾本科植物，更优选水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。优选的双子叶植物包括但不限于：锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物等，更优选棉花、油菜等。

如本文所用，术语“盐胁迫”是指：指植物在含有高浓度盐分的土壤或者水体中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。造成盐属胁迫的盐类包括(但不限于)：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠。本发明的DST基因或其编码的蛋白质或多肽可增强植物对盐胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽处理的对照植物相比：所述植物在高浓度盐分存在下的生长发育未受影响或受影响程度降低、或可在更高的盐浓度下存活。

如本文所用，术语“干旱胁迫”是指：植物在缺水的土壤或者其它干旱环境中生长时，其生长发育受到抑制，甚至死亡的现象。本发明的DST基因或其编码的蛋白质或多肽可增强植物对干旱胁迫的抗性，该抗性的提高可表现为与未经所述基因、蛋白质或多肽处理的对照植物相比：所述植物在缺水条件下的生长发育未受影响或受影响程度降低、或可在更干旱的条件下存活。

载体、宿主及转基因植物

本发明还涉及包含DST基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达DST的转基因植物。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的DST蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码DST蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。

本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DST编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pEGFP-1、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301或pHB。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用农杆菌作为宿主细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗病性提高的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

顺式作用元件

如本文所用，术语“顺式作用元件”是指存在于基因旁侧序列中，能影响基因表达的序列，其作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，其要与反式作用因子相互作用而起作用。

本发明人通过研究发现：本发明的DST蛋白具有DNA的结合能力，其结合的核心元件为顺式作用元件TGCTANN(A/T)TTG，N代表A、C、G或T。本发明的顺式作用元件与DST转录因子结合，并使得植物的感旱感盐性提高，从而降低了植物的抗旱耐盐性。优选所述顺式作用元件与DST的锌指结构域结合。

反之，如果本发明顺式作用元件与DST转录因子的结合受到抑制，则可使得植物的抗旱耐盐性提高。

提高植物抗旱耐盐性的方法

如本文所述，本发明的DST蛋白、其编码序列或DST蛋白与其顺式作用元件的结合与植物的抗旱耐盐性有密切的联系：DST蛋白、其编码序列或DST蛋白与其顺式作用元件的结合受到抑制，则植物的抗旱耐盐性有所提高。

因此，本发明还提供了通过抑制DST蛋白、其编码序列、或DST蛋白与其顺式作用元件的结合来提高植物抗旱耐盐性的方法。

在本发明的一个实施方式中，可通过使用本发明DST蛋白或其编码序列的拮抗剂来抑制其表达。所述拮抗剂包括但不限于：小分子干扰RNA、抗体、显性负调节或反义寡核苷酸。本领域普通技术人员在知晓了DST蛋白及其编码序列的前提下，可通过常规方法和试验筛选并获得所述的拮抗剂。

如本发明所用，术语“非保守性突变”是指使得本发明的DST蛋白或其编码序列发生一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加(优选为非保守)，从而使得所述植株具有提高的抗旱耐盐性。

在本发明的另一个实施方式中，可通过本领域已知的方法使得本发明的DST蛋白或其编码序列发生非保守性突变。例如，可通过DST蛋白编码序列中核苷酸的突变，使得具有SEQ ID NO：2的DST蛋白中的氨基酸序列发生非保守突变，从而使得含有该突变序列的植株具有提高的抗旱耐盐性，例如使得氨基酸序列的第69位的天冬酰胺突变为天冬胺酸、第162位的丙氨酸突变为苏氨酸。

在本发明的另一个实施方式中，可制备DST基因或蛋白表达受到抑制的转基因植物，并任选地用所述转基因植物与非转基因植物或其它转基因植物杂交。例如，可用含有针对DST蛋白或其编码蛋白的小分子干扰RNA的载体、反义载体、显性负调节载体或含有所述载体的宿主细胞转化植物。

筛选抗旱耐盐性植株的方法

根据本发明DST蛋白及其编码蛋白的特性，本发明还进一步包括筛选抗旱耐盐性植株的方法。

在一个实施方式中，本发明的筛选方法包括：(i)检测候选植株中本发明DST锌指蛋白转录因子的水平、其编码多核苷酸的表达水平、和/或本发明顺式作用元件与DST锌指蛋白转录因子的结合水平；(ii)将步骤(i)所检测到的候选植株中的水平与对照植株中相应的水平相比，如果候选植株中的水平较对照植株有所降低，则表明所述植株是抗旱耐盐性植株。

在另一实施方式中，可运用本领域已知的分子标记选择技术将抗旱耐盐DST基因导入其它品种中以筛选和培育抗旱耐盐新品种，该方法通过常规的杂交育种方法，不需要转基因，避免转基因安全评价，因此具有优势。所述方法可包括：设计针对所述非保守性突变序列的分子标记，并用该分子标记对包含本发明非保守性突变序列的突变体与其它水稻品种的杂交后代进行选择，从而筛选出携带所述非保守性突变序列的个体。

本发明的主要优点

本发明的主要优点在于：

(1)鉴别了DST基因及其编码的蛋白质或多肽，并明确了其与植物抗旱耐盐性之间的关系，从而为研究植物的抗旱耐盐性提供了一种新的方法；

(2)提供了具有改良盐或干旱胁迫抗性的转基因植物，为粮、棉、油等生产和加工提供了优良原料和产品；

(3)提供了利用分子标记对抗旱耐盐杂交后代的选择方法，可实现通过常规的杂交育种方法，不需要转基因，避免转基因安全评价。

本发明提供了改善植物盐或干旱胁迫抗性的新途径，因而具有巨大的应用前景。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(例如可参照如Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第三版，英文名称为《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(2001，Cold Spring Harbor Laboratory press)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例部分中使用的各种培养基(YEB液体培养基、AB液体培养基、AAM液体培养基、N6D₂培养基、N6D₂C培养基、共培养培养基、选择培养基N6D₂S 1、N6D₂S2、预分化培养基、分化培养基、1/2 MS0H培养基、水稻培养液、SD培养基等)按照相关文献的记载配制(分子克隆：实验室指南(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989；Hiei，Y.等，Plant J.，1994，6，271-282)。

实施例1：DST的水稻转基因实验

1.高抗旱耐盐的DST突变体的获得、性状和亚细胞定位

用0.6％浓度的EMS处理水稻种子构建包含有约9000个株系的水稻突变体库。在140mM氯化钠浓度的盐胁迫下大规模筛选水稻突变体库，经过多次用140mM氯化钠浓度的盐胁迫和20％PEG4000模拟干旱胁迫对候选突变体进行验证、观察耐盐抗旱表型，获得一份表现高度抗旱、耐盐的突变体(dst)。

用分子标记将DST基因初定位在水稻第三号染色体上。用dst突变体与感盐品种杂交构建大规模F2群体，用分子标记从该群体中筛选交换个体并结合交换个体的基因型和表型，开展图位克隆，成功克隆了DST基因。该DST基因编码一个具有保守的C2H2类型锌指结构域的功能未知锌指蛋白(转录因子)，在水稻基因组中没有找到DST的同源拷贝，在植物拟南芥基因组中没有发现同源基因。该基因的基因组长度为906bp，没有内含子，全长ORF(open reading-frame)长度为906bp，编码301个氨基酸，蛋白产物分子量估计为29KDa(图1)。通过序列比较分析表明，在突变体中DST基因存在2个碱基变异，引起2个氨基酸发生了替换(第69位的天冬酰胺突变为天冬胺酸和第162位的丙氨酸突变为苏氨酸)，产生抗旱、耐盐表型，这表明DST为抗旱、耐盐的负调控因子。

将DST与GFP(绿色荧光蛋白)进行融合，通过基因枪的方法转到洋葱表皮细胞进行瞬时表达，在荧光共聚焦显微镜下观察荧光在细胞内的位置，来考察DST的亚细胞定位。通过亚细胞定位表明：DST特异性定位于细胞核。

2.DST基因组片段的转基因质粒构建：

将野生型水稻BAC克隆用ApaLI单切后用T4DNA聚合酶补平，然后再用SalI进行酶切，回收4.6-kb的野生型品种基因组片段(包含DST的全长ORF、启动子区以及终止密码子的下游区)。植物表达双元载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA)用EcoRI酶切后用T4DNA聚合酶补平，再用SalI进行酶切，然后与上述回收片段进行连接，从而成功构建p-DST质粒，用于转化突变体，进行互补实验。所用工具酶均购自New England Biolabs。

3.DST-RNAi表达质粒构建：

用5′和3′端的寡核苷酸为引物(SEQ ID NO：4和5)，用PCR进行扩增DST的特异性编码区(535-bp)片段，连接到载体p1300RNAi(用pCAMBIA1300改造获得，增加了过氧化氢酶内含子(Catalase intron)作为连接子，两侧各有poly-A和poly-T。这样成功构建DST-RNAi质粒。

5′端寡核苷酸引物序列为：

5′-AAGCTTTCCTTGCGAAGCCAAATAGC-3′(SEQ ID NO.4)

3′端引物序列为：

5′-GGATCCCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGA-3′(SEQ ID NO.5)

4.DST转化水稻：

将上述二种重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105。在每200μlEHA105感受态细胞中加入0.5-1μg(约10μl)质粒DNA，混匀，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)的YEB平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含Kan(50μg/ml)的YEB平板上划单菌，连续划3次。从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含50μg/ml Kan抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜。第2天，按1％接种量转接入50ml含抗生素50μg/ml Kan的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实验采用常规的农杆菌转化方法转化水稻中花11(或它的突变体)的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的中花11未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1∶3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D₂培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。

将如上获得的幼胚愈伤组织浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到铺有无菌滤纸的N6D₂C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Vir基因活化物，使用浓度为100μmol/L。

3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D₂S1(含25mg/l Hyg的N6D₂培养基)进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D₂S2(含50mg/l Hyg的N6D₂培养基)选择培养基上继续筛选。

10-12天后，将生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS0H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。

获得的再生植株移栽成活后，用本领域已知的方法，通过检测β-葡萄糖苷酶(beta-glucuronidase，GUS，参见文献Jefferson等.EMBO J.6，3901-3907，1987)或用0.1％的除草剂涂抹叶片，鉴定阳性转化植株；提取阳性植株叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。

在后继的试验中，用上述方法获得的转基因植物的T2代进行干旱、盐胁迫(140mM NaCl)处理，观察抗旱、耐盐性表型，验证DST基因的功能。

实施例2：转基因植物的培养及干旱、盐胁迫试验

取实施例1中获得的转基因水稻的种子，于45℃烘箱内打破休眠一周后，用室温自来水浸种3天，37℃催芽2天。等萌发后点播于96孔板。然后移入光照培养箱，30℃培养，每天光照13小时。1天后，温度逐步降低到28℃、26℃再各培养一天，夜间以20℃进行培养。等幼苗基本出齐后自来水换成水稻培养液培养。

培养约14天后，幼苗长至两叶一心期，用含有140mM的NaCl的水稻培养进行盐处理12天，或用含20％(m/v)PEG-4000的水稻培养液进行PEG处理7天，以模拟干旱胁迫。

对于在PVP管(聚乙烯吡咯烷酮管，高1.2米，直径20厘米，管的底部有两个可以排水的孔)中进行的干旱处理，将在培养箱中水培了25天的苗移栽到装有土壤的PVP管中，置人工气候室中进行培养。温度为24℃～30℃，湿度为50％～60％。移栽30天后将水倒掉，并打开底部的排水孔进行排水，进行干旱处理12天。

试验结果如图2和图3所示。如图2所示，水稻突变体dst比野生型(中花11，ZH11)明显提高抗旱性和耐盐性。通过观察比较还发现：突变体与野生型相比，在气孔周围累积较多的过氧化氢(H₂O₂)，气孔开度较小，在干旱胁迫下叶片保持较高的相对含水量，因此突变体的抗旱性较强；另外，由于突变体的气孔开度较小，气孔导度较低，水分蒸腾速度较慢，从而减少Na⁺离子从根部运到地上部(叶片等)，降低Na⁺毒害，因此提高耐盐性。

由图3可见：把野生型(中花11，ZH11)的DST基因组片段通过转基因转入dst突变体中，转基因互补(complemented)株系恢复了野生型的感旱感盐的表型；而通过RNAi(转化中花11)把DST的表达量降低时，使中花11的抗旱性和耐盐性明显提高。

该结果表明：成功克隆了DST基因和通过DST的基因工程可显著提高水稻的抗逆性。

实施例3：DST的转录激活活性分析实验

用Matchmaker GAL4酵母双杂交系统3(Clontech)对DST的转录激活进行分析。为了构建阳性对照载体pAD，将NLS和GAL4的激活域序列和GAL4的DNA结合域融合，构建到pGBKT7载体(购自Clontech)上，其中pAD是将pGADT7的NLS和AD用PCR方法扩增连到pGBKT7的BamHI和SalI上(引物为SEQ ID NO：6和7)。

然后用PCR方法扩增DST的全长ORF(引物为SEQ ID NO：8和9)，经测序正确后构建到pGBKT7载体的BamHI和SalI上，从而与GAL4的DNA结合域融合，获得pGBKT7-DST载体。将各种载体转化到酵母菌种AH109中，稀释生长过夜的菌种，涂在缺Trp或缺少三种氨基酸(-Trp/-His/-Ade)的SD培育基上，然后观测菌种生长情况，测定DST的转录激活活性。

引物寡核苷酸序列为：

5′-AAAGGATCCAAGCGGAATTAATTCCCGAG-3′(SEQ ID NO：6)；

5′-AAAGTCGACCCTCTTTTTTTGGGTTTGGTGG-3′(SEQ ID NO：7)；

5′-AAAGGATCCTGATGGACTCCCCGTCGCCT-3′(SEQ ID NO：8)；

5′-AAAGTCGACCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGAG-3′(SEQ ID NO：9)。

结果如图4所示。由图可见：水稻的DST蛋白具有转录激活活性；而突变的DST蛋白和缺失N端的蛋白则丧失了转录激活活性。

该结果显示pGBKT7-DST具有较强的转录激活活性，并且转录激活在N端，表明DST是具有转录激活的转录因子。

实施例4：DST蛋白质分析和凝胶滞后实验

1、原核蛋白表达：

从pGBKT7-DST载体上用EcoRI和SalI将DST的全长cDNA切下，然后重组到pET32a(+)。将重组有DST的原核表达载体pET32a(+)转化入BL21，IPTG诱导原核表达，然后用His-tag柱(珠)纯化蛋白。

2、抗体制备：

用以上的纯化蛋白采用常规方法对兔进行免疫以制备DST的抗体。

3、合成探针，用生物素进行标记，PAGE胶进行纯化，电洗脱进行回收。

4、将标记的探针与原核表达并纯化的DST蛋白进行反应，然后跑Native-PAGE电泳，用半干转膜法将探针转到尼龙膜上后压到X-光片进行放射自显影，观察滞后条带。

试验结果如图5所示。由图5可见：DST具有DNA的结合能力(DNA-binding)，DST结合的核心元件为：顺式作用元件TGCTANN(A/T)TTG(SEQ ID NO：3)。

本研究表明DST与该顺式作用元件的结合，可调节其下游基因的表达，从而影响植物的抗旱耐盐性。因此，DST与顺式作用元件的结合对其在抗旱耐盐的负调控中发挥重要作用。

实施例5.不同植物中DTS同源基因的存在

数据库搜索(http://plantta.jcvi.org/index.shtml)发现，在高梁(Sorghumbicolor)的基因组中有一个DST的同源基因，蛋白的相似性为54.3％；在玉米(Zeamays)的基因组中有三个DST的同源基因，蛋白的相似性分别为51.7％、36.1％和33.5％；在大麦(Hordeum vulgare)的基因组中有一个DST的同源基因，蛋白的相似性为38.4％；在甘蔗(Saccharum officinarum)的基因组中有三个DST的同源基因，蛋白的相似性分别为38.2％、38.2％和34.5％。

这些同源基因都具有保守的C2H2类型锌指结构域，它们的锌指结构域完全一样，同时在N端的相似性较高(图6显示了这些同源基因所共有的序列，该序列为DGKDVRLFPCLFCNKKFLKSQALGGHQNAHKKERSIGWNPYFYM，即SEQ ID NO：2的第42-85位)。C2H2类型锌指蛋白由锌指结构域与顺式作用元件相结合，因此这些同源基因与顺式作用元件均存在对应关系，这表明其它禾本科作物的DST同源基因具有与水稻DST基因相似的功能。

实施例6.水稻等农作物DST基因的分子标记辅助选择技术在农作物抗逆性育种改良中的应用

通过化学诱变(EMS)使DST基因发生2个碱基变异(第205位碱基A突变为G和第484位碱基G突变为A)，引起2个氨基酸发生了替换(第69位的天冬酰胺突变为天冬胺酸和第162位的丙氨酸突变为苏氨酸)，产生抗旱、耐盐表型。在该基因内设计如下所示的二对引物SNP5和SNP3，使得扩增产物分别包含第一个点突变和第二个点突变。

SNP-5S：ATGGACTCCCCGTCGCCT (SEQ ID NO：10)

SNP-5A：GTGCGCCGGGAGAAGCCC (SEQ ID NO：11)

SNP-3S：GCGGTGCCGACGTCGTTCCC (SEQ ID NO：12)

SNP-3A：GCCGCCGTCGTCGTCGTCTTC (SEQ ID NO：13)

第一个突变位点形成了ScrFI的酶切位点，而第二个点突变使BstUI的酶切位点丧失。引物SNP5扩增的产物用ScrFI进行酶切，野生型片段可以切下311bp+85bp+31bp，而突变体片段可以切下202bp+109bp+85bp+31bp，从而产生多态性；引物SNP3扩增的产物用BstUI进行酶切，野生型片段可以切下66bp+40bp+25bp，而突变体片段可以切下91bp+40bp，从而也产生多态性。由此，这两对引物SNP5和SNP3可以作为分子标记，应用于分子标记辅助选择育种中。

利用该抗旱耐盐的dst突变体与水稻推广品种杂交，通过其中一个分子标记或二个分子标记对杂交后代进行选择，选出了携带DST突变基因的个体，从而培育抗旱、耐盐增强的新品种(系)。

该方法通过常规的杂交育种方法，不需要转基因，避免转基因安全评价，因此具有优势。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>水稻锌指蛋白转录因子新基因及抗旱耐盐应用

<130>091096Z1

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>906

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(906)

<400>1

atg gac tcc ccg tcg cct atg gcg gcg cag gcg gcc gac ctg tcg ctg 48

Met Asp Ser Pro Ser Pro Met Ala Ala Gln Ala Ala Asp Leu Ser Leu

1 5 10 15

acg ctg gcg ccg tcg gga ggg ggt ggt ggg gga gga gga ggc ggc ggc 96

Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

ggt ggt ggg tcg tcg tcg gcg tgc atc gac ggc aag gac gtg cgg ctg 144

Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Cys Ile Asp Gly Lys Asp Val Arg Leu

35 40 45

ttc ccg tgc ttg ttc tgc aac aag aag ttc ttg aag tcg cag gcg ctg 192

Phe Pro Cys Leu Phe Cys Asn Lys Lys Phe Leu Lys Ser Gln Ala Leu

50 55 60

ggc ggg cac cag aac gcg cac aag aag gag cgg agc atc ggg tgg aat 240

Gly Gly His Gln Asn Ala His Lys Lys Glu Arg Ser Ile Gly Trp Asn

65 70 75 80

ccc tac ttc tac atg ccg ccg acg ccg cac ccc gcc ggc aat gcc gcc 288

Pro Tyr Phe Tyr Met Pro Pro Thr Pro His Pro Ala Gly Asn Ala Ala

85 90 95

gcc gcc gcc gcg gcg gcg acg ccc ggt ggg atg tcg tcc gtc acg acg 336

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Pro Gly Gly Met Ser Ser Val Thr Thr

100 105 110

cca tcc ggg agc tac ggc gtc gtc ggt ggt gcc gcc gtc ggg gct act 384

Pro Ser Gly Ser Tyr Gly Val Val Gly Gly Ala Ala Val Gly Ala Thr

115 120 125

gct ggc gtt ggg ggc gga ggt gga gtg gga ggg ggg ctt ctc ccg gcg 432

Ala Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Gly Gly Leu Leu Pro Ala

130 135 140

cac gcg tac gcc ggg cac ggg tac gcc gcg gtg ccg acg tcg ttc ccc 480

His Ala Tyr Ala Gly His Gly Tyr Ala Ala Val Pro Thr Ser Phe Pro

145 150 155 160

atc gcg tcg cac agc tcg agc gtg gtt ggc tcc ggt ggg ctg cag tac 528

Ile Ala Ser His Ser Ser Ser Val Val Gly Ser Gly Gly Leu Gln Tyr

165 170 175

tac gct ggt acc gac tgc ggc gcg gcg gcg gcg ggt gcg gcg aag acg 576

Tyr Ala Gly Thr Asp Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Lys Thr

180 185 190

acg acg acg gcg gcg gcg gcg gcg acg gcc gtg gcg ggg agc gag agc 624

Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Val Ala Gly Ser Glu Ser

195 200 205

ggc gtg cag gtg ccc cgg ttc gcg acg cac cag cac cat ctc ctg gcg 672

Gly Val Gln Val Pro Arg Phe Ala Thr His Gln His His Leu Leu Ala

210 215 220

gtg gtg agc agc ggg cgc gcg atg ctg gcg gcg ccc gac cag ccg ggc 720

Val Val Ser Ser Gly Arg Ala Met Leu Ala Ala Pro Asp Gln Pro Gly

225 230 235 240

gcc ggg cgc gac gac atg atc gac atg ctc aac tgg agg cga ggc tcc 768

Ala Gly Arg Asp Asp Met Ile Asp Met Leu Asn Trp Arg Arg Gly Ser

245 250 255

cac ggc ccc acc gcc tcc gcc gcc gcc acc acg ccc tcc ccg gca agc 816

His Gly Pro Thr Ala Ser Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ser Pro Ala Ser

260 265 270

acc acc acc acg ctc acc acc ttc gcc agc gcc gac ggc agc aac aac 864

Thr Thr Thr Thr Leu Thr Thr Phe Ala Ser Ala Asp Gly Ser Asn Asn

275 280 285

ggc gag gag aac gag gag ctc gac ctc aac ttg agc ctc tag 906

Gly Glu Glu Asn Glu Glu Leu Asp Leu Asn Leu Ser Leu

290 295 300

<210>2

<211>301

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Asp Ser Pro Ser Pro Met Ala Ala Gln Ala Ala Asp Leu Ser Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ala Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Cys Ile Asp Gly Lys Asp Val Arg Leu

35 40 45

Phe Pro Cys Leu Phe Cys Asn Lys Lys Phe Leu Lys Ser Gln Ala Leu

50 55 60

Gly Gly His Gln Asn Ala His Lys Lys Glu Arg Ser Ile Gly Trp Asn

65 70 75 80

Pro Tyr Phe Tyr Met Pro Pro Thr Pro His Pro Ala Gly Asn Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Pro Gly Gly Met Ser Ser Val Thr Thr

100 105 110

Pro Ser Gly Ser Tyr Gly Val Val Gly Gly Ala Ala Val Gly Ala Thr

115 120 125

Ala Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Gly Gly Leu Leu Pro Ala

130 135 140

His Ala Tyr Ala Gly His Gly Tyr Ala Ala Val Pro Thr Ser Phe Pro

145 150 155 160

Ile Ala Ser His Ser Ser Ser Val Val Gly Ser Gly Gly Leu Gln Tyr

165 170 175

Tyr Ala Gly Thr Asp Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Lys Thr

180 185 190

Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Val Ala Gly Ser Glu Ser

195 200 205

Gly Val Gln Val Pro Arg Phe Ala Thr His Gln His His Leu Leu Ala

210 215 220

Val Val Ser Ser Gly Arg Ala Met Leu Ala Ala Pro Asp Gln Pro Gly

225 230 235 240

Ala Gly Arg Asp Asp Met Ile Asp Met Leu Asn Trp Arg Arg Gly Ser

245 250 255

His Gly Pro Thr Ala Ser Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ser Pro Ala Ser

260 265 270

Thr Thr Thr Thr Leu Thr Thr Phe Ala Ser Ala Asp Gly Ser Asn Asn

275 280 285

Gly Glu Glu Asn Glu Glu Leu Asp Leu Asn Leu Ser Leu

290 295 300

<210>3

<211>11

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(7)

<223>n＝A、C、G或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>n＝A或T

<400>3

tgctannntt g 11

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aagctttcct tgcgaagcca aatagc 26

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggatcccgag gctcaagttg aggtcga 27

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aaaggatcca agcggaatta attcccgag 29

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

aaagtcgacc ctcttttttt gggtttggtg g 31

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

aaaggatcct gatggactcc ccgtcgcct 29

<210>9

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aaagtcgacc gaggctcaag ttgaggtcga g 31

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atggactccc cgtcgcct 18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gtgcgccggg agaagccc 18

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gcggtgccga cgtcgttccc 20

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gccgccgtcg tcgtcgtctt c 21

Claims

1.一种锌指蛋白转录因子，其特征在于，它包含：具有SEQ ID NO：2第42-85位氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、或其同源多肽。

2.如权利要求1所述的转录因子，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物感旱感盐性的由(c)衍生的多肽；或

(c)具有Cys-2/His-2型锌指结构域，且具有提高植物感旱感盐性的(a)-(b)中所述多肽的同源多肽。

3.一种多核苷酸，其特征在于，它包含编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-435位的核苷酸序列；或

(c)与(a)-(b)中任一种核苷酸序列互补的多核苷酸。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种顺式作用元件，其具有SEQ ID NO：3所述的序列，且能够与权利要求1所述的转录因子结合。

8.权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求3所述的多核苷酸的抑制剂或非保守性突变序列。

9.一种提高植物抗旱耐盐性的方法，所述方法包括抑制权利要求1所述锌指蛋白转录因子、抑制权利要求3所述多核苷酸的表达、或抑制权利要求7所述顺式作用元件与权利要求1所述锌指蛋白转录因子的结合。

优选所述方法包括使用权利要求8中所述的表达抑制剂或在植物中产生权利要求8中所述的非保守性突变序列，更优选使得SEQ ID NO：1的核苷酸序列或SEQ ID NO：2的氨基酸序列发生非保守突变、或使用所述核苷酸序列或氨基酸序列的抑制剂，更优选使得SEQ ID NO：1的核苷酸序列的第205位碱基A突变为G和第484位碱基G突变为A或使得SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第69位天冬酰胺突变为天冬胺酸和第162位的丙氨酸突变为苏氨酸。

10.一种筛选抗旱耐盐性植株的方法，所述方法包括：

(i)检测候选植株中权利要求1所述锌指蛋白转录因子的水平、权利要求3所述多核苷酸的表达水平、和/或权利要求7所述顺式作用元件与权利要求1所述锌指蛋白转录因子的结合水平；

11.权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求3所述的核苷酸序列的抑制剂或非保守性突变序列在提高植物抗旱耐盐性中的用途。

12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述提高植物抗旱耐盐性包括：

(i)将所述抑制剂直接作用于植物；

(ii)将所述非保守性突变序列导入植物；或

13.一种提高植物抗旱耐盐性的方法，所述方法包括：

(A)提供权利要求1所述的锌指蛋白转录因子或权利要求3所述的核苷酸序列的抑制剂或非保守性突变序列；

(B)对植物进行选自下组的一种或多种处理：

(i)将所述抑制剂直接作用于植物；

(ii)将所述非保守性突变序列导入植物；或

14.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)用含有权利要求1所述的锌指蛋白转录因子的非保守性突变序列或权利要求3所述的多核苷酸的非保守性突变序列的构建物转化植物细胞、组织或器官；

(3)将步骤(2)中的植物细胞、组织或器官再生成植株，