CN101381729A - 甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列，是以近源物种水分胁迫相关锌指蛋白基因CDS序列的保守区设计简并引物，从受干旱处理的甘蔗组织中提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘蔗受水胁迫相关的锌指蛋白(ShZFP1)基因的全长表达序列。本发明为研究甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因在抗旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理及为甘蔗抗旱性遗传改良的研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于甘蔗水分胁迫相关的锌指蛋白基因序列。
背景技术
甘蔗是我国最重要的糖料作物，甘蔗糖占我国食糖总量的90％以上，同时甘蔗也是一种重要的能源植物。但我国甘蔗生产的立地条件差，旱地蔗面积占全国植蔗面积的85％以上，因此干旱是我国甘蔗生产上长期存在的主要的非生物胁迫因素，并严重影响甘蔗的产量和品质。克隆与表达甘蔗干旱胁迫相关的某些基因，已经成为当前研究热点之一。
干旱会导致植物失水而引发渗透势的变化，引起渗透胁迫。植物感受干旱后，胁迫信号经历一系列传递过程，最后诱导特定功能基因的表达，在生理生化上作出调节反应。研究表明，转录因子在抗旱基因表达调控中起着重要的作用。其中锌指蛋白是一类在真核细胞中普遍存在，作为基因转录因子参与细胞内基因表达调控的核酸结合蛋白质，是真核细胞基因调控中起关键作用的一类调控因子。目前，人们已经从拟南芥、矮牵牛、水稻、大豆、棉花等植物中克隆了许多编码锌指蛋白的基因，并对其结构及功能进行了研究；利用转基因技术，也将一些与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因在目标植物中过量表达后，能对植物起到增强抗逆性的作用，说明锌指蛋白在增强植物逆境抗性方面有着广阔的应用前景。因此，克隆甘蔗水分胁迫相关的锌指蛋白基因将有利于研究甘蔗锌指蛋白基因在甘蔗抗旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理及为甘蔗抗旱性遗传改良的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列，是通过以近源物种水分胁迫相关锌指蛋白基因的CDS序列保守区设计简并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因的全长表达序列。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
本发明的目的通过以下技术措施实现：
1、总RNA的提取
甘蔗茎节总RNA的提取采用Invitrogen公司的TRIzol试剂，试验步骤参照TRIzol试剂说明书。
2、cDNA第一链的合成
采用Invitrogen公司的SuperScript TM III反转录试剂盒进行反转录合成cDNA第一链(方法见说明书)。
3、引物设计与引物合成
从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻等)的水分胁迫相关锌指蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为256bp。引物设计后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
引物序列为：
ShZFP1F：5′-AGATGATAATGARGCAGGAGC-3′
ShZFP1R：5′-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC-3′
4、锌指蛋白基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用简并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。
在此3’RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物作为模板，利用内侧引物和接头引物再进行PCR扩增。
基因外侧引物：5’-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3’
基因内侧引物：5’-ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3’
接头引物：5’-GGCCACGCGACTAGTAC-3’
在5’RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。
基因外侧引物：5’-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3’
基因内侧引物：5’-TGCAAGTGCTGCACCGGTTC-3’
Oligo-dG：5’-GGGGGGGGGGGGGGGH-3’
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化并克隆到pMD-18T载体中转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，交给上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，测序所得序列再与简并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对甘蔗锌指蛋白基因的测定
将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为甘蔗锌指蛋白基因序列。比对结果：
Score E
Sequences producing significant alignments： (Bits) Value
ref|NP_001105248.1|hypothetical protein LOC542155 [Zea mays]... 335 2e-90
gb|AAX14637.1|zincfinger protein[Zea mays]>gb|ABS83244.1|...3 23 9e-87
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gb|ABK92782.1|unknown[Populus trichocarpa] 242 4e-62
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gb|ABI31653.1|zinc finger protein[Camellia sinensis] 214 1e-53
本发明的优点：
干旱是我国甘蔗生产上长期存在的主要的非生物胁迫因素，严重影响甘蔗的产量和品质。培育丰产优质抗旱的甘蔗新品种、提高甘蔗的水分利用效率是提高我国甘蔗糖业国际竞争力的核心技术。因此，本基因的获得，不仅为研究甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因在甘蔗抗旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理奠定基础，而且还将为甘蔗抗旱遗传改良提供参考。
具体实施方式
下面用实施例对本发明作进一步说明。
1、总RNA的提取
取甘蔗茎节约0.1g于液氮中研磨成粉，加入1ml Trizol进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。
2、cDNA第一链的合成
取甘蔗总RNA约5ug与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer5μL，10mmol/L dNTP混合液2.5μL，Ribonuclease inhibitor0.5μL，M-MLV反转录酶0.5μL，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，最后放入-80℃保存备用。
3、引物设计与引物合成
从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻等)的锌指蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为256bp。引物设计后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
引物序列为：
ShZFP1F：5′-AGATGATAATGARGCAGGAGC-3′
ShZFP1R：5′-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC-3′
4、锌指蛋白基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守引物进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物ShZFP1F和ShZFP1R各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环，94℃变性2min；30个循环，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸7min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经酶切检测后，将具有插入片段的质粒DNA交上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。
在3’RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物稀释100倍后，取1μL作为模板，利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L正反向引物各2μL，Taq酶1.2U，用PCR水将反应体系补充至50μL。
反应条件为：1个循环，94℃变性5min；30个循环，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸7min；4℃保温。
基因外侧引物：5’-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3’
基因内侧引物：5’-ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3’
接头引物：5’-GGCCACGCGACTAGTAC-3’
在5’RACE中，利用末端转移酶和dATP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1μL作为模板，再利用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。反应体系及反应条件同3’RACE。
基因外侧引物：5’-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3’
基因内侧引物：5’-TGCAAGTGCTGCACCGGTTC-3’
Oligo-dG：5’-GGGGGGGGGGGGGGGH-3’
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，交上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，测序所得序列再与保守区引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白(ShZFP1)基因的测定
将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为甘蔗锌指蛋白基因序列。比对结果：
Score E
Sequences producing significant alignments： (Bits) Value
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gb|ABN08135.1| Zinc finger，AN1-type；Zinc finger，A20-type[... 221 6e-56
gb|ABI31653.1| zinc finger protein[Camellia sinensis]2 214 1e-53
序列表
<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120>甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列
<160>2
<210>1
<211>1008
<212>RNA
<213>甘蔗(SaccharumofficinarumL.)
<220>
<221>3’UTp
<222>(643)...(1008)
<220>
<221>5’UTp
<222>(1)...(126)
<220>
<221>CDS
<222>(127)...(642)
<220>
<221>PolyA site
<222>(984)...(1008)
<400>1
<210>2
<211>171
<212>PRT
<213>甘蔗(SaccharumofficinarumL.)
<400>2
Claims (2)
1、一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008101090762A CN101381729A (zh) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | 甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CNA2008101090762A CN101381729A (zh) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | 甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101381729A true CN101381729A (zh) | 2009-03-11 |
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| CNA2008101090762A Pending CN101381729A (zh) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | 甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101381729A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875689A (zh) * | 2009-04-08 | 2010-11-03 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 水稻锌指蛋白转录因子新基因及抗旱耐盐应用 |
-
2008
- 2008-05-22 CN CNA2008101090762A patent/CN101381729A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875689A (zh) * | 2009-04-08 | 2010-11-03 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 水稻锌指蛋白转录因子新基因及抗旱耐盐应用 |
| CN101875689B (zh) * | 2009-04-08 | 2013-06-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 水稻锌指蛋白转录因子新基因及抗旱耐盐应用 |
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090311 |