CN108728452B

CN108728452B - 一种白桦抗旱基因BpbZIP36及其表达载体、蛋白和应用

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Publication number: CN108728452B
Application number: CN201810631010.3A
Authority: CN
Inventors: 王艳敏; 王玉成; 杨传平; 王超; 梁福生; 张一鸣
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2038-06-19
Also published as: CN108728452A

Abstract

本发明涉及基因领域，提供一种白桦抗旱基因BpbZIP36，所述白桦抗旱基因BpbZIP36的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。试验表明，将本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36构建为表达载体pROK2‑BpbZIP36后转入到白桦苗中得到转基因白桦，白桦抗旱基因BpbZIP36在转基因白桦中过量表达。在非生物胁迫条件下，转基因白桦与野生白桦的生长状况无显著差异；干旱条件下胁迫7d后，转基因白桦的长势明显优于野生白桦，表明本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36具有显著的抗旱作用，能够用于培育获得抗旱性能优异的转基因林木。

Description

一种白桦抗旱基因BpbZIP36及其表达载体、蛋白和应用

技术领域

本发明涉及基因领域，具体涉及一种白桦抗旱基因BpbZIP36及其表达载体、引物对，以及所述抗旱基因表达的抗旱调控蛋白和应用。

背景技术

转录因子，也称反式作用因子，是一类能识别真核生物基因启动子区域中的顺式作用元件，并与之发生特异性结合的蛋白质。通过转基因技术使一个特定转录因子在植物体内过量表达，就可通过它促使多个功能基因发挥作用，从而达到植物性状获得综合改良的效果。与过量表达个别功能基因相比，在植物体内过量表达一个转录因子是提高植物抗逆性更为有效的方法和途径。通过转基因技术和遗传分析手段的有力结合，鉴定出更多的对植物改良有重大意义的转录因子，将为未来选育和改良抗逆植物奠定基础。

应用基因工程手段对植物进行遗传改良已成为提高植物抗逆性的有效途径。干旱、盐碱等逆境条件下bZIP转录因子通过识别ABRE(ABA-responsive element，ABA应答元件)元件，调控一系列基因的表达。ABRE是一种重要的顺式作用元件，属于ABA依赖型，该元件是ABA诱导的基因启动子中的一段保守的ACGTGGC序列。bZIP转录因子能够识别此段保守序列，并调控下游基因的表达，在依赖于ABA的信号传导途径中起重要作用。

转基因研究表明，bZIP基因具有优良的抗逆能力。例如，转bZIP基因植物在盐等逆境胁迫下光合效率明显提高，而对ABA的敏感性降低^[2]。转bZIP基因植物与野生型对照相比表现出明显的耐盐、抗冻^[1,2]、抗干旱和高温能力^[2-4]。最新研究发现，水稻bZIP基因(OsbZIP72)能够被盐、旱等胁迫诱导，该基因在水稻中过量表达，不仅可以增强转基因水稻的抗旱性，还能调控一些ABA信号途径的基因，如Lea、SAPK等的表达量^[5]。

然而，不同植物中的bZIP功能有所差异，一些bZIP家族的基因仅具有抗盐性能，另一些bZIP家族的基因则兼具抗旱、抗盐等性能，并且来源于不同植物之间的bZIP基因能够提供的抗性程度也各有不同，目前尚未发现一种能显著提升林木抗旱性能的bZIP基因。

参考文献：

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[3]Zhang X，Wollenweber B，Jiang D，Liu F，Zhao J.Water deficits and heatshock effects on photosynthesis of a transgenic Arabidopsis thalianaconstitutively expressing ABP9，a bZIP transcription factor.J Exp Bot.2008，59(4):839～848.

[4]Wu X，ShirotoY，Kishitani S，Ito Y，Toriyama K.Enhanced heat anddrought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY11 underthe control of HSP101 promoter.Plant CellRep，2009，28(1):21～30.

[5]Lu G，Gao C，Zheng X，Han B.Identification of OsbZIP72 as a positiveregulator of ABA response and drought tolerance in rice.Planta.2009，229(3):605～615.

发明内容

本发明为了解决现有技术bZIP基因对林木抗旱性能提升不显著的问题，提供了一种白桦抗旱基因BpbZIP36，在林木中过表达后能够显著提高其抗旱性能，并且对于植株正常情况下的生长无影响。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种白桦抗旱基因BpbZIP36，所述白桦抗旱基因BpbZIP36的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述白桦抗旱基因BpbZIP36的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种前述技术方案所述白桦抗旱基因BpbZIP36的表达载体pROK2-BpbZIP36，所述表达载体中包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种前述技术方案所述白桦抗旱基因BpbZIP36表达的抗旱调控蛋白，所述抗旱调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了前述技术方案所述白桦抗旱基因BpbZIP36在培育转基因抗旱林木中的应用。

优选的，所述白桦抗旱基因BpbZIP36在转基因抗旱林木中进行过表达。

优选的，所述过表达通过农杆菌介导法将前述技术方案所述的表达载体pROK2-BpbZIP36转入林木外植体后，进行组织培养获得过表达白桦抗旱基因BpbZIP36的林木组培苗，培育所述林木组培苗即得转基因抗旱林木。

优选的，所述林木为白桦。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了一种白桦抗旱基因BpbZIP36，所述白桦抗旱基因BpbZIP36的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36的全长1269bp，包含有保守的bZIP结构域，为bZIP家族基因。该白桦抗旱基因BpbZIP36所表达的蛋白与其他已知植物中bZIP基因表达的蛋白同源性低(最高也仅在60％左右)，但是过表达白桦抗旱基因BpbZIP36后的转基因植株抗旱能力显著。

试验表明，将本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36构建为表达载体pROK2-BpbZIP36后转入到白桦苗中得到转基因白桦，白桦抗旱基因BpbZIP36在转基因白桦中过量表达。在非生物胁迫条件下，转基因白桦与野生白桦的生长状况无显著差异；干旱条件下胁迫7d后，转基因白桦的长势、相对电导率、相对含水量以及丙二醛含量均明显优于野生型白桦，表明本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36具有显著的抗旱作用，能够用于培育获得抗旱性能优异的转基因林木。

附图说明

图1为白桦抗旱基因BpbZIP36的保守区预测图；

图2为白桦抗旱基因BpbZIP36编码的蛋白与其他6种植物bZIP蛋白的多序列比对图；

图3为实施例2中卡那霉素(kan)筛选过表达转基因白桦植株；

图4为实施例2中转BpbZIP36基因白桦表达量柱状图；

图5为实施例3中不同条件下转基因白桦株系与野生型株系的生长发育状况图；

图6为实施例4中不同条件下转基因白桦株系与野生型株系的相对电导率变化；

图7为实施例4中不同条件下转基因白桦株系与野生型株系的丙二醛含量变化；

图8为实施例4中不同条件下转基因白桦株系与野生型株系的相对含水量变化。

具体实施方式

本发明提供的白桦抗旱基因BpbZIP36能够明显提高植物抗旱能力，本发明将所述抗旱基因在植物中过表达后能够使转基因植物获得显著的抗旱能力，提高植物在干旱条件下的存活能力，减少逆境对植物生长状况的不利影响。

本发明所述白桦抗旱基因BpbZIP36从白桦cDNA中扩增获得，所述白桦抗旱基因BpbZIP36的编码区cDNA全长1269bp，核苷酸序列如下：

ATGAACTTGAAGAATTTCGGGACAGACCCACCGGGCGATGGAAACGGAAGGCCGCCGGGGAACTTTCCGTTGATACGGCAATCGTCGATCTACTCCTTGACCTTCGACGAGTTGCAGAACACGATGGGGGGGAGCATAGGCAAGGACTTCGGGTCCATGAACATGGACGAGCTACTCAAGAACATTTGGAGCGCCGAGGATGCTCAGAGCATTATGGCCAAGCCGTCCTGGACTACCGGACCAGAAGGGACTGTCCCACCTGGTGGGTACCTACAGAGGCAGGGCTCACTGACTCTGCCGAGGACGCTGAGCCAGAAGACCGTGGACGAGGTCTGGAGAGATATATCCCAGGATGGGGCTGGAAATGGAAGCTCAAGCTTGCCGCAGCGGCAGCATACCTTAGGGGAGATGACTTTGGAGGAGTTCTTGTTCAGAGCTGGGGTTGTGAGAGAGGACACCCAATTGGATGCCAAGCCTGCTGGTGGTAGTGCTAGTACCGGAGGGTTCTTAGGCAATACTGGTTTGGGAATTGGGTTTCAGCAGACTGGTGGGGGTACCGGGTTGATGGGGAATCGGATTGCAGAGAGTAATAATCAGTTTTCGATTCAGTCTTCGAATTTGCCACTGAATGTGAATGGGGTCAGATCGGATCAGACACAGTTGTCTCGGCCCCAGCAGCCGCAGATTTTTCCAAAGCCGGTTACGATGGCTTATGGTACACATCAGATGCCTCAGCTGGGTAGTCCAGGAATGAGGGGTGGGATTGTCGGGATAGGAGATCAGGGTTTGAGTAGTGGGTTGATTCAGAGTGCCGCACTGCAGGGTGGAGGAATGGGAATGGTGGGGTTAGGAGCTGGAGCTGGAGCTGGAGGTGTTAGCGTTGGGACGGGGTCGCCGGCAAACCAGCTGTCGTCGGATGGGCTTGGGAAGAGTAATGGTGATATGTCGTCGGTGTCGCCAGTTCCTTATGCGTTTAATGGTGGTTTGAGGGGGAGGAGGTCAGGTGGGCCTGTGGAAAAGGTCGTTGAGAGGAGGCAGAGGAGGATGATTAAGAATAGGGAGTCAGCTGCAAGATCACGAGCTCGAAAGCAGGCTTATACCATGGAATTGGAAGCTGAAGTTGCAAAGTTAAAGGAGGACAACGAAGAATTGCAGAAAAAACAGGAAGAAATTATGGAAATGCAAAAGAATCAGGTCTTGGAGATCATGAATCTCCAACGGGGAGTTAAGAAACAATGCTTGAGAAAAACACTCAGTGGTCCATGGTAA

本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述白桦抗旱基因BpbZIP36的引物对，其中，引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明中，所述用于扩增白桦抗旱基因BpbZIP36的上下游引物序列如下所示：

上游引物：5′-ATGAACTTGAAGAATTTCGGG-3′；

下游引物：5′-TTACCATGGACCACTGAGTG-3′。

利用本发明提供的引物对能够从白桦中扩增得到白桦抗旱基因BpbZIP36，所述引物对能够用于白桦抗旱基因BpbZIP36的表达载体构建以及转基因抗旱林木的构建中。

具体的，本发明表达载体pROK2-BpbZIP36的构建包括以下步骤：

(1)以白桦cDNA为模板，利用上述技术方案所述的引物对PCR扩增得到白桦抗旱基因BpbZIP36；

(2)将扩增得到的白桦抗旱基因BpbZIP36连接到pMD18-T载体上，得到pMD18-T-BpbZIP36载体；

(3)以pMD18-T-BpbZIP36载体为模板，利用pROK2-BpbZIP36引物对进行PCR扩增，得到目的基因片段；

(4)将pROK2载体用限制性内切酶SmaⅠ酶切，将其与目的基因片段连接，得到表达载体pROK2-BpbZIP36。

在本发明中，所述步骤(1)中PCR扩增体系为：cDNA 2.0μL、10×Ex Taq RCPbuffer2.0μL、10mmol/L dNTP Mix 0.4μL、10μmol/L上下游引物各1.0μL、5U/μL Ex Taq酶0.2μL，补齐水至20.0μL。

在本发明中，所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min，得到PCR扩增产物。

得到所述PCR扩增产物后，本发明对其进行电泳检测(以DL2000DNA Marker为参照)，回收目的条带，连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌进行阳性克隆验证，从阳性克隆中提取质粒，得到pMD18-T-BpbZIP36。

得到pMD18-T-BpbZIP36后，本发明以pMD18-T-BpbZIP36为模板，利用pROK2-BpbZIP36引物对进行PCR扩增，得到含有SEQ ID NO.1所示BpbZIP36基因的目的基因片段。

在本发明中，所述pROK2-BpbZIP36引物对中，上游引物序列的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，下游引物序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

具体的，所述pROK2-BpbZIP36引物对为：

上游引物：5'-TCGAGCTCGGTACCCATGAACTTGAAGAATTTCGGG-3'；

下游引物：5'-CTCTAGAGGATCCCCTTACCATGGACCACTGAGTG-3。

本发明所述的pROK2-BpbZIP36引物对中，划线部分为pROK2质粒线性化末端的同源互补序列，利用所述pROK2-BpbZIP36引物对来扩增BpbZIP36基因，使其目的基因两端带有能够与pROK2载体融合的末端，便于构建表达载体。

在本发明中，所述步骤(3)中的PCR扩增体系为：DNA2.0μl，10×Ex Taq PCRbuffer2.0μl，10mmol/L dNTP Mix 0.4μl，10μmol/LpROK2-BpbZIP36引物各1.0μl，5U/μl Ex Taq0.2μl，补水至20.0μl。

在本发明中，所述步骤(3)中的PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min。

本发明扩增得到目的基因片段(含有BpbZIP36基因片段)后，将pROK2载体用限制性内切酶SmaⅠ酶切，将其与目的基因片段连接，得到表达载体pROK2-BpbZIP36。

本发明构建的表达载体pROK2-BpbZIP36能够用于表达BpbZIP36编码的抗旱调控蛋白，也可用于转导入植物中构建转基因抗旱植物。

本发明提供了一种前述技术方案所述白桦抗旱基因BpbZIP36表达的抗旱调控蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；具体的为：

MNLKNFGTDPPGDGNGRPPGNFPLIRQSSIYSLTFDELQNTMGGSIGKDFGSMNMDELLKNIWSAEDAQSIMAKPSWTTGPEGTVPPGGYLQRQGSLTLPRTLSQKTVDEVWRDISQDGAGNGSSSLPQRQHTLGEMTLEEFLFRAGVVREDTQLDAKPAGGSASTGGFLGNTGLGIGFQQTGGGTGLMGNRIAESNNQFSIQSSNLPLNVNGVRSDQTQLSRPQQPQIFPKPVTMAYGTHQMPQLGSPGMRGGIVGIGDQGLSSGLIQSAALQGGGMGMVGLGAGAGAGGVSVGTGSPANQLSSDGLGKSNGDMSSVSPVPYAFNGGLRGRRSGGPVEKVVERRQRRMIKNRESAARSRARKQAYTMELEAEVAKLKEDNEELQKKQEEIMEMQKNQVLEIMNLQRGVKKQCLRKTLSGPW

本发明所述的抗旱调控蛋白共422个氨基酸序列，与其他植物中的bZIP蛋白氨基酸序列进行同源性比较发现，本发明提供的抗旱调控蛋白与其他各植物中的bZIP基因表达的蛋白同源性并不高，与水稻OsbZIP23的同源性最高，为69％，但都具有保守的bZIP结构域。

本发明还提供了一种前述技术方案所述白桦抗旱基因BpbZIP36在培育转基因抗旱林木中的应用。

本发明优选的，所述白桦抗旱基因BpbZIP36在转基因抗旱林木中进行过表达。具体来说，所述过表达通过农杆菌介导法将前述技术方案所述的表达载体pROK2-BpbZIP36转入林木外植体后，进行组织培养获得过表达白桦抗旱基因BpbZIP36的林木组培苗，培育所述林木组培苗即得转基因抗旱林木。

本发明将白桦抗旱基因BpbZIP36转入到林木中，使白桦抗旱基因BpbZIP36在转基因植株中过量表达，从而获得抗旱性能好的转基因林木，并且转基因林木在非胁迫条件下生长发育无显著影响。

在本发明中，所述转基因抗旱林木优选为白桦。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、白桦BpbZIP36基因的克隆

PCR扩增引物：

BpbZIP36-F：5′-ATGAACTTGAAGAATTTCGGG-3′

BpbZIP36-R：5′-TTACCATGGACCACTGAGTG-3′，

以白桦cDNA为模板进行PCR，PCR扩增体系：

cDNA2.0μL，10×Ex Taq PCRbuffer2.0μL，10mmol/LdNTP Mix0.4μL，10μmol/L引物各1.0μL，5U/μLEx Taq0.2μL，补水至20.0μL。

PCR反应程序：

94℃预变性30s；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

取5μLPCR产物进行电泳检测，以DL2000DNAMarker为参照。回收目的条带，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌，对阳性克隆进行PCR验证，验证成功的大肠杆菌菌液进行测序验证。保存阳性克隆，提取质粒，记为pMD18-T-BpbZIP36。

经分析，最终获得BpbZIP36基因编码区全长序列如SEQ ID NO.1所示：

BpbZIP36基因的cDNA序列编码422个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

通过BLAST对BpbZIP36基因编码的抗旱调控蛋白进行相似性分析，结果如图1所示，BpbZIP36基因编码的蛋白包含有保守的bZIP结构域，为bZIP家族基因。

2、利用生物信息学软件和在线网络资源对克隆得到的BpbZIP36基因进行序列特性分析：

运用ExPASy(http://www.expasy.org/tools/protparam.htmL)在线软件，对白桦抗旱基因BpbZIP36编码的蛋白质进行了基本理化性质的预测分析，如下：

编码的氨基酸数：422

等电点(PI)：9.21

分子量(MW)：44.84KD

负电荷残基(Asp+Glu)：39

正电荷残基(Arg+Lys)：44

分子式：C1920H3103N579O621S19

不稳定系数(II)：49.18

平均疏水性(GRAVY)：-0.569

脂肪系数(AI)：67.25

利用Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列同源性搜索，选择与其相似程度高的其他6种不同植物的bZIP基因氨基酸序列，所选择的6种植物的bZIP氨基酸分别为：AtbZIP36(Q9M7Q4.1)、OsBZIP23(Q6Z312.1)、AtbZIP35(Q9M7Q5.1)、OsBZIP46(Q69TW5.1)、AtbZIP67(Q8RYD6.1)、AtbZIP15(Q9FMM7.1)。

通过Clustal软件对白桦抗旱基因BpbZIP36编码的抗旱调控蛋白序列与其他相似程度高的6种植物的bZIP蛋白氨基酸的序列同源性比较发现：

如图2所示，白桦bZIP36蛋白序列与其它6种植物的bZIP蛋白的同源性分别为：56％、69％、48％、66％、41％、36％，其中与水稻OsBZIP23的同源性最高，为69％。白桦的bZIP36蛋白与其他各植物中bZIP蛋白的同源性并不高，但都具有保守的bZIP结构域。

实施例2转BpbZIP36基因植株的获得

1、BpbZIP36过表达载体构建

所用引物及测序委托苏州金唯智生物科技有限公司(https://www.genewiz.com.cn/)合成及完成，引物序列:

pROK2-BpbZIP36-F:5'-TCGAGCTCGGTACCCATGAACTTGAAGAATT TCGGG-3'；

pROK2-BpbZIP36-R:5'-CTCTAGAGGATCCCCTTACCATGGACCACTG AGTG-3'；

以实施例1构建得到的阳性克隆pMD18-T-BpbZIP36质粒为模板，pROK2-BpbZIP36-F和pROK2-BpbZIP36-R为引物(下划线为引入pROK2同源互补序列)，利用PCR方法引入pROK2质粒线性化末端的同源互补序列。

PCR扩增体系：

DNA2.0μl，10×Ex TaqPCRbuffer 2.0μl，10mmol/L dNTP Mix 0.4μl，10μmol/L引物各1.0μl，5U/μl Ex Taq 0.2μl，补水至20.0μl。

PCR反应程序：

94℃预变性2min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

取5μl PCR产物进行电泳检测，以DL2000DNAMarker为参照。回收PCR产物，用限制性内切酶SmaI对pROK2载体进行单酶切。将目的基因(含有BpbZIP36目的基因片段)片段与pROK2载体的连接反应。连接产物转化大肠杆菌，阳性克隆PCR检测。挑取阳性克隆送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，得到pROK2-BpbZIP36表达载体。

将测序成功的重组质粒(pROK2-BpbZIP36表达载体)转化农杆菌，进行农杆菌菌液检测，得到含有pROK2-BpbZIP36表达载体的农杆菌。

2、转BpbZIP36基因白桦的获得

利用农杆菌介导的植物遗传转化体系，以白桦的嫩茎、叶片为外植体，将过植物表达载体pROK2-BpbZIP36，通过农杆菌介导法转化野生型白桦组培苗，获得白桦BpbZIP36基因的过表达株系。具体过程为：

(1)将保存的含有pROK2-BpbZIP36表达载体的农杆菌菌种活化，并用1/2WPM液体重悬菌体。选生长旺盛，5～6片真叶期白桦的上部叶片作为转化材料，将叶片剪成小块(0.5cm×0.5cm)；1/2WPM液体培养基中加入乙酰丁香酮(终浓度为150μM)，将剪好的叶片转入到其中浸染5min，期间轻轻晃动菌液，使叶片和菌液充分接触；

浸染后取出叶片用灭菌的滤纸吸干；将叶面展开，正面朝上，放在WPM固体分化培养基(含6-BA1.0mg/L)上，使伤口处贴在培养基表面；用封口膜将培养皿封好，放于恒温箱中23℃暗培养2～3d。

(2)在WPM固体分化培养基(WPM培养基基础上添加6-BA1.0mg/L)中加入头孢霉素(Cef，终浓度为200mg/L)，羧苄青霉素(Car，终浓度为200mg/L)和卡那霉素(kan，终浓度为50mg/L)，把暗培养平板上的叶片转接到诱导培养基上，让伤口处贴在培养基表面，正面朝上；将培养皿用封口膜封好，置于组培室中培养(28℃，光照培养周期16h/8h)；观察愈伤组织的生长情况，将生长旺盛的愈伤组织(壮且颜色较绿)转到WPM固体分化培养基(WPM培养基基础上添加6-BA1.0mg/L)中继续生长；观察不定芽分化情况，待不定芽生长至1cm左右，将成簇的不定芽掰开，注意不要损伤芽体，将其再次转到WPM固体分化培养基(WPM培养基基础上添加6-BA1.0mg/L)中；

在WPM固体分化培养基(WPM培养基基础上添加6-BA1.0mg/L)中加入Cef(终浓度为150mg/L)、Car(终浓度150mg/L)和Kan(终浓度仍为40mg/L)；将长至2～3cm的不定芽转到WPM培养基中(Cef和Car的终浓度逐渐降低最后为零，Kan终浓度仍为40mg/L)。通过卡那霉素(kan)对过表达转基因白桦植株进行抗性筛选，最后得到长势良好的抗性苗。提取得到的抗性苗DNA进行PCR检测，含有BpbZIP36基因的为阳性转基因白桦株系。

如图3所示，(A)为卡那抗性丛生芽，(B)为卡那抗性生根苗，(C)为卡那抗性生根苗根部。

选取pROK2-BpbZIP36转基因白桦7个株系(编号分别为5、6、8、9、1、12和1D)检测其中的BpbZIP36基因的表达量，同时以未转基因的野生型白桦作为对照组(BpCK)：

对过表达转基因白桦株系中BpbZIP36基因的表达量进行实时荧光定量RT-PCR的具体过程为：

以白桦的cDNA为模板，设计基因引物和内参引物(Tubulin,GenBank number:FG067376；Ubiquitin,GenBanknumber:FG065618)进行实时荧光定量RT-PCR。荧光实时定量RT-PCR扩增引物为：

DL-BpbZIP36-F：ATGAACTTGAAGAATTTCGG；

DL-BpbZIP36-R：GCCATAATGCTCTGAGCA；

Ubiquitin F：TCTGACAGGGAAGACCATA；

Ubiquitin R：TCAATTAGAGCTGACCACC；

tubulin F：TGGCTCGAATGCACTGTTGG；

tubulin R：TCAACCGCCTTGTCTCTCAGG。

RT-PCR反应程序：

94℃，30s；94℃，12s；58℃，30s；72℃，45s；79℃，1s；Plate read，go to 2，44moretime，55℃to 99℃read every 0.5℃，hold 1s。

RT-PCR反应体系：

SYBR Green Realtime PCRMastermix10.0μL；cDNA2.0μL；10μMPrimer F 1.0μL；10μM Primer R 1.0μL；dd H₂O补足至20μL。

以BpCK植株中BpbZIP36基因表达量为1，计算其他各株系中BpbZIP36基因相对表达量，结果如图4和表1所示。

表1各株系中BpbZIP36基因表达量

株系编号	BpCK	5号	6号	8号	9号	11号	12号	1D号
									BpbZIP36基因相对表达量	1	3.66	24.24	40.72	12.99	8.42	8.51	4.14

基于图4和表1的数据，选择其中的6号、8号、9号株系用于后续试验的研究，并将它们分别命名为：OE6、OE8、OE9。

实施例3BpbZIP36转基因植株的抗逆性分析

1、转基因白桦苗非生物胁迫下的形态学分析

将实施例2中选择的三株转BpbZIP36基因白桦植株和野生型白桦植株(WT)移至土中，在人工气候室中培养一个半月，观察各植株的长势情况，再将转BpbZIP36基因白桦植株和野生型白桦植株进行干旱胁迫7天，结果如图5所示。

由图5可以看出，在非胁迫条件下(control)，OE6、OE8、OE9转基因白桦株系的生长状况与野生型白桦(WT)基本一致；而在干旱胁迫条件下，BpbZIP36基因的过表达株系OE6、OE8、OE9的白桦长势明显优于野生型白桦(WT)。实验结果表明，BpbZIP36基因具有良好的抗旱功能，且不影响植物的生长。

2、非生物胁迫下转基因白桦的生理生化指标分析

(1)相对电导率

相对电导率是衡量细胞膜损伤情况的一个重要生理指标，逆境胁迫下细胞膜受损导致电解质外渗增加，破坏细胞膜结构的完整性直接影响植物的抗逆能力。电解质渗出率的变化可直接反映细胞膜透性的改变和细胞被破坏情况，因此相对电导率是衡量在逆境胁迫下细胞膜受损伤的程度和植物抗逆能力的重要指标之一。

分别取非胁迫条件及干旱胁迫下的各转基因植株和野生型白桦叶片(每个株系取3个重复)进行相对电导率测定，具体方法为：

用去离子水洗净50mL玻璃三角瓶，灭菌，烘干，用灭菌的去离子水平衡24h，在烘箱内烘干备用；将植物材料用自来水洗去表面的灰尘，再用双蒸水和超纯水分别冲洗3次，用洁净滤纸吸净表面的水分。取面积相等的叶片分别放入烧杯内，加超纯水50mL，用抽真空仪器抽15min，用电导仪测其电导值，记录S1；然后放入90℃水浴中20min，冷却至室温，测其电导率，记录S2；计算公式：相对电导率＝(S1/S2)×100，结果如图6和表2所示。

表2各株系的相对电导率(％)

株系编号	WT	OE6	OE8	OE9
					普通条件下(CK)	5.65	5.28	4.86	5.80
干旱条件下	36.19	14.72	13.90	8.26

由图6和表2可以看出，在正常生长条件下OE6、OE8、OE9转基因白桦株系的相对电导率与野生型白桦(WT)基本一致，在干旱胁迫后OE6、OE8、OE9转基因白桦株系相对电导率低于野生型白桦(WT)，表明BpbZIP36基因的过表达能显著降低植物在逆境胁迫下的相对电导率。试验结果说明BpbZIP36基因在转基因白桦体内能保护细胞膜结构的完整性，从而增加植物的抗逆能力。

(2)丙二醛

植物逆境下，发生膜酯化氧化作用，MDA(丙二醛)是其产物之一，因此，逆境胁迫下，MDA含量越低，其抗逆能力越强，因此通过检测在干旱的胁迫下的MDA含量，以检测BpbZIP36基因的抗逆能力。

具体方法为：研样，称重0.05g～0.1g；1.5mL 10％三氯乙酸抽提，4℃30min，11000rpm离心20min，取上清；测值管：1mL酶液+1mL 0.6％TBA；调零管：1mL水+1mL 0.6％硫代巴比妥酸(TBA)沸水浴15min，冷却，测OD₅₃₂和OD₄₅₀；计算公式C(μM)＝6.45OD₅₃₂-0.56OD₄₅₀，每克样品中丙二醛的含量计算公式为y＝(C×v)/w，单位为μmol/g。结果如图7和表3所示。

表3各株系的丙二醛含量(μmol/g)

株系编号	WT	OE6	OE8	OE9
					普通条件下(CK)	9.44	10.09	15.21	13.53
干旱条件下	31.49	15.66	18.46	15.04

从图7中可以看出，WT、OE6、OE8、OE9在正常生长条件下，MDA含量大致相同，而在干旱胁迫下，WT、OE6、OE8、OE9各株系MDA含量都有所增加，而OE6、OE8、OE9转基因白桦株系MDA含量的比野生型白桦(WT)少，说明在逆境胁迫下，OE6、OE8、OE9转基因白桦株系的植物细胞膜酯化氧化低，抗逆能力较高。

(3)相对含水量

相对含水量反映了树木叶片的保水能力。在干旱胁迫下，抗旱性强树种叶片含水量下降速度往往比抗旱性弱树种的叶片要迟缓，以维持植物体生理生化的正常运转。具体方法为：

称量鲜质量(初始鲜质量)后迅速将叶片插入清水中浸泡5h后，从水中取出，擦拭掉叶片表面多余水分并称取饱和鲜质量。经105℃，30min杀青后，75℃烘到恒质量，称质量(干质量)并计算其叶片含水量和相对含水量。叶片相对含水量＝(初始鲜质量-干质量)/(饱和鲜质量-干质量)×100％，结果如图8和表4所示。

表4各株系的相对含水量(％)

株系编号	WT	OE6	OE8	OE9
					普通条件下(CK)	55.70	55.82	51.53	43.50
干旱条件下	7.92	29.96	30.89	32.72

从图8和表4中可以看出，WT、OE6、OE8、OE9在正常生长条件下，相对含水量含量大致相同，而在干旱胁迫下，WT、OE6、OE8、OE9各株系相对含水量都有所下降，而OE6、OE8、OE9转基因白桦株系相对含水量下降程度比野生型白桦(WT)低，说明在逆境胁迫下，OE6、OE8、OE9转基因白桦株系的保水能力高于野生型白桦(WT)，具有更强的抗逆能力。

综上所述，上述试验表明BpbZIP36基因在白桦中具有明显的抗旱能力，且不影响白桦的生长。因此将该基因也可用于培养转基因抗旱林木尤其是转基因双子叶抗旱林木的构建。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种白桦抗旱基因BpbZIP36及其表达载体、蛋白和应用

<130> GW2018I1279

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1269

<212> DNA

<213> Betula platyphylla Suk.

<400> 1

atgaacttga agaatttcgg gacagaccca ccgggcgatg gaaacggaag gccgccgggg 60

aactttccgt tgatacggca atcgtcgatc tactccttga ccttcgacga gttgcagaac 120

acgatggggg ggagcatagg caaggacttc gggtccatga acatggacga gctactcaag 180

aacatttgga gcgccgagga tgctcagagc attatggcca agccgtcctg gactaccgga 240

ccagaaggga ctgtcccacc tggtgggtac ctacagaggc agggctcact gactctgccg 300

aggacgctga gccagaagac cgtggacgag gtctggagag atatatccca ggatggggct 360

ggaaatggaa gctcaagctt gccgcagcgg cagcatacct taggggagat gactttggag 420

gagttcttgt tcagagctgg ggttgtgaga gaggacaccc aattggatgc caagcctgct 480

ggtggtagtg ctagtaccgg agggttctta ggcaatactg gtttgggaat tgggtttcag 540

cagactggtg ggggtaccgg gttgatgggg aatcggattg cagagagtaa taatcagttt 600

tcgattcagt cttcgaattt gccactgaat gtgaatgggg tcagatcgga tcagacacag 660

ttgtctcggc cccagcagcc gcagattttt ccaaagccgg ttacgatggc ttatggtaca 720

catcagatgc ctcagctggg tagtccagga atgaggggtg ggattgtcgg gataggagat 780

cagggtttga gtagtgggtt gattcagagt gccgcactgc agggtggagg aatgggaatg 840

gtggggttag gagctggagc tggagctgga ggtgttagcg ttgggacggg gtcgccggca 900

aaccagctgt cgtcggatgg gcttgggaag agtaatggtg atatgtcgtc ggtgtcgcca 960

gttccttatg cgtttaatgg tggtttgagg gggaggaggt caggtgggcc tgtggaaaag 1020

gtcgttgaga ggaggcagag gaggatgatt aagaataggg agtcagctgc aagatcacga 1080

gctcgaaagc aggcttatac catggaattg gaagctgaag ttgcaaagtt aaaggaggac 1140

aacgaagaat tgcagaaaaa acaggaagaa attatggaaa tgcaaaagaa tcaggtcttg 1200

gagatcatga atctccaacg gggagttaag aaacaatgct tgagaaaaac actcagtggt 1260

ccatggtaa 1269

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacttga agaatttcgg g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaccatgga ccactgagtg 20

<210> 4

<211> 422

<212> PRT

<213> Betula platyphylla Suk.

<400> 4

Met Asn Leu Lys Asn Phe Gly Thr Asp Pro Pro Gly Asp Gly Asn Gly

1 5 10 15

Arg Pro Pro Gly Asn Phe Pro Leu Ile Arg Gln Ser Ser Ile Tyr Ser

20 25 30

Leu Thr Phe Asp Glu Leu Gln Asn Thr Met Gly Gly Ser Ile Gly Lys

35 40 45

Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Lys Asn Ile Trp Ser

50 55 60

Ala Glu Asp Ala Gln Ser Ile Met Ala Lys Pro Ser Trp Thr Thr Gly

65 70 75 80

Pro Glu Gly Thr Val Pro Pro Gly Gly Tyr Leu Gln Arg Gln Gly Ser

85 90 95

Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp Glu Val Trp

100 105 110

Arg Asp Ile Ser Gln Asp Gly Ala Gly Asn Gly Ser Ser Ser Leu Pro

115 120 125

Gln Arg Gln His Thr Leu Gly Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Phe

130 135 140

Arg Ala Gly Val Val Arg Glu Asp Thr Gln Leu Asp Ala Lys Pro Ala

145 150 155 160

Gly Gly Ser Ala Ser Thr Gly Gly Phe Leu Gly Asn Thr Gly Leu Gly

165 170 175

Ile Gly Phe Gln Gln Thr Gly Gly Gly Thr Gly Leu Met Gly Asn Arg

180 185 190

Ile Ala Glu Ser Asn Asn Gln Phe Ser Ile Gln Ser Ser Asn Leu Pro

195 200 205

Leu Asn Val Asn Gly Val Arg Ser Asp Gln Thr Gln Leu Ser Arg Pro

210 215 220

Gln Gln Pro Gln Ile Phe Pro Lys Pro Val Thr Met Ala Tyr Gly Thr

225 230 235 240

His Gln Met Pro Gln Leu Gly Ser Pro Gly Met Arg Gly Gly Ile Val

245 250 255

Gly Ile Gly Asp Gln Gly Leu Ser Ser Gly Leu Ile Gln Ser Ala Ala

260 265 270

Leu Gln Gly Gly Gly Met Gly Met Val Gly Leu Gly Ala Gly Ala Gly

275 280 285

Ala Gly Gly Val Ser Val Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asn Gln Leu Ser

290 295 300

Ser Asp Gly Leu Gly Lys Ser Asn Gly Asp Met Ser Ser Val Ser Pro

305 310 315 320

Val Pro Tyr Ala Phe Asn Gly Gly Leu Arg Gly Arg Arg Ser Gly Gly

325 330 335

Pro Val Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn

340 345 350

Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Met

355 360 365

Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys Leu Lys Glu Asp Asn Glu Glu Leu

370 375 380

Gln Lys Lys Gln Glu Glu Ile Met Glu Met Gln Lys Asn Gln Val Leu

385 390 395 400

Glu Ile Met Asn Leu Gln Arg Gly Val Lys Lys Gln Cys Leu Arg Lys

405 410 415

Thr Leu Ser Gly Pro Trp

420

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgagctcgg tacccatgaa cttgaagaat ttcggg 36

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctctagagga tccccttacc atggaccact gagtg 35

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaacttga agaatttcgg 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccataatgc tctgagca 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctgacaggg aagaccata 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaattagag ctgaccacc 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggctcgaat gcactgttgg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcaaccgcct tgtctctcag g 21

Claims

1.白桦抗旱基因BpbZIP36在培育转基因抗旱林木中的应用；其特征在于，所述白桦抗旱基因BpbZIP36的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦抗旱基因BpbZIP36在转基因抗旱林木中进行过表达。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述过表达通过农杆菌介导法将表达载体pROK2-BpbZIP36转入林木外植体后，进行组织培养获得过表达白桦抗旱基因BpbZIP36的林木组培苗，培育所述林木组培苗即得转基因抗旱林木；

所述表达载体pROK2-BpbZIP36中包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述林木为白桦。