CN108129556B

CN108129556B - 水稻来源的金属镉结合蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN108129556B
Application number: CN201711386885.3A
Authority: CN
Inventors: 田�健; 伍宁丰; 余小霞; 赵金彤; 初晓宇
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: CN108129556A

Abstract

本发明公开了一种水稻来源的金属镉结合蛋白及其编码基因和应用。本发明首先公开了一种水稻来源的金属镉结合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明在大肠杆菌中异源表达所述金属镉结合蛋白基因，可以在重金属镉存在条件下快速高效的降低镉的含量。本发明进一步公开了所述的金属镉结合蛋白或其编码基因在修复镉污染土壤、培育镉抗性提高植物新品种、培育镉超富集性植物新品种以及降低水稻稻谷中镉含量等方面的应用。

Description

水稻来源的金属镉结合蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种水稻(Oryza sativa)来源的金属镉结合蛋白及其编码基因，还涉及所述金属镉结合蛋白及其编码基因在修复镉污染土壤、培育镉抗性提高植物新品种、培育镉超富集性植物新品种以及降低水稻稻谷中镉含量等中的应用，属于水稻来源的金属镉结合蛋白的分离及应用领域。

背景技术

镉是毒性最强的重金属之一，由于人类活动导致一些地区农田土壤受到不同程度的污染，导致粮食和蔬菜的镉污染问题日益突出。据统计，中国约有114万公顷土地受到镉污染，其中耕地面积为1.3万公顷，涉及11个省(市)的25个地区。2010年的统计年鉴数据表明，中国稻谷年产量约为2亿吨，可生产稻米约为1.3亿吨，若按照前期抽检发现10％稻米镉超标计算，则有1300万吨稻米存在镉超标问题。如此严重的稻米镉超标问题已成为粮食安全甚至社会稳定的严重隐患和粮食安全风险。针对稻米镉污染的研究目前多集中在土壤改良，低富集水稻品种筛选和后期镉污染稻米的加工等。其中，土壤改良技术是最上游最重要的一种修复方法。目前主要的土壤改良技术是采用物理化学修复技术，其往往伴随着高能耗、高费用、二次污染等问题，因而不适用于大规模污染土壤的修复。而近年来发展起来的利用植物和微生物修复污染土壤的生物修复方法，因其绿色环保、高效、低成本等优点而受到广泛关注。

在生物修复方法中往往需要使用具有超富集重金属的植物和微生物，但是大多数富集重金属的植物生长缓慢且需要特定的生长环境，而超富集的微生物在加入重金属污染土壤中面临着与土壤土著微生物的竞争。为此，利用基因工程的方法在生长势好、适应性强的植物和微生物异源表达金属结合蛋白基因可以解决此问题，使原本不是超富集重金属的植物和微生物成为超富集重金属的植物和微生物。例如，2000年，Valls等将在细菌Ralstonia eutropha CH34的表面展示来源于老鼠的金属硫蛋白基因(mts)，构建的工程菌株以固定土壤中的重金属离子，结果表明当土壤镉浓度为150μmol时，工程菌株可固定土壤中70％的镉，使其不被植物吸收(Valls，Nature biotechnology，2000)。金属硫蛋白MTs是金属结合蛋白中的一种，因其低分子量、高巯基含量，可以大量结合重金属离子的蛋白，因此称之为金属硫蛋白。MTs是1957年由美国哈佛大学的Margoshes和Vallee首次从马的肾脏中分离得到，之后发现此蛋白广泛存在动物、植物和微生物中。

MTs的结构特点包含高半胱氨酸和缺少芳香族氨基酸，且半胱氨酸残基是MTs对金属离子高亲和性结合能力的原因，现发现的MTs一般具有高度的氨基酸序列相似性。分离鉴定一种水稻来源的金属镉结合蛋白，利用异源表达金属镉结合蛋白基因来降低水稻稻谷中的镉含量，将有效提高安全性及可靠性。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种水稻来源的金属镉结合蛋白及其编码基因；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述水稻来源的金属镉结合蛋白在降低水稻稻谷中的镉含量中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种水稻来源的金属镉结合蛋白A3AGZ4，其氨基酸序列为SEQID No.1所示。

本发明从水稻中分离鉴定的金属镉结合蛋白A3AGZ4，其分子量为28.82kDa。现发现的金属硫蛋白MTs一般具有高度的氨基酸序列相似性。本发明所述水稻来源的金属镉结合蛋白A3AGZ4的蛋白序列和氨基酸组成与现有的MTs差异很大。

本发明进一步公开了编码所述金属镉结合蛋白A3AGZ4的基因，其多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有结合镉的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有结合镉的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有结合镉的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有结合镉的功能或活性。

本发明还公开了含有编码所述金属镉结合蛋白A3AGZ4的基因的重组载体。所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

本发明还公开了含有编码所述金属镉结合蛋白A3AGZ4的基因的重组宿主细胞或重组菌。其中，所述重组菌包括但不限于重组大肠杆菌。

为了进一步验证所分离鉴定出来的金属镉结合蛋白A3AGZ4是否有结合镉的功能，本发明将蛋白基因序列构建在大肠杆菌表达载体上，转入大肠杆菌表达菌株中构建得到重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21，通过测定重组菌株镉去除力评估该基因的功能。同时将来源于小鼠的金属硫蛋白MTs的编码基因mt作为对照基因，构建重组菌株mt-pET30a:ΔzntA-BL21。结果表明，相同培养条件下，对照菌株镉的去除率为13.61％，而重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21和mt-pET30a:ΔzntA-BL21镉的去除率分别为59.13％和47.47％。说明，金属硫蛋白MTs和金属结合蛋白A3AGZ4都有镉结合能力，且在大肠杆菌中，来源水稻的金属结合蛋白A3AGZ4结合能力较来源于小鼠的金属硫蛋白MTs要强，说明本发明从水稻中分离得到金属结合蛋白A3AGZ4同样可以起到镉结合的作用。

为了进一步探索重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21镉的最大结合能力，本发明测定其在不同镉浓度条件下镉残余量。结果表明，重组大肠杆菌a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21在0.01mM、0.03mM、0.05mM、0.07mM和0.09mM的CdCl₂条件下，镉结合浓度分别为0.00671mM、0.0202mM、0.0252mM、0.0273mM和0.0251mM。说明，该重组菌株最大结合的镉浓度约为0.025mM，培养基中添加0.05mM即达到饱和。

因此，本发明所分离的金属镉结合蛋白A3AGZ4或其编码基因能够应用于吸附或降解土壤中的重金属镉，作为参考，具体有以下几种应用方式：

(1)将本发明金属镉结合蛋白A3AGZ4编码基因转化到微生物菌株中构建得到重组工程菌株，将该重组工程菌株施到土壤中进行吸附或降解土壤中的重金属镉；譬如，将本发明金属镉结合蛋白A3AGZ4编码基因可操作的与原核表达载体连接构建得到原核表达载体，将所构建的原核表达载体转化到微生物菌株中得到具有镉结合性能的工程菌株，将该重组工程菌株施到含有镉的土壤中可有效的吸附或降解土壤中的重金属镉，达到修复土壤的效果。

(2)培育抗镉性的植物新品种：将本发明金属镉结合蛋白A3AGZ4编码基因转化到植物细胞或组织中，培育筛选得到对镉抗性增强的植物新品种；譬如，将本发明金属镉结合蛋白A3AGZ4编码基因可操作的与植物表达载体连接后转化到植物细胞或组织中，通过培育筛选得到对镉抗性增强的植物新品种；所述的植物包括单子叶植物或双子叶植物；例如，可以是玉米、水稻、大麦、小麦、高粱等农作物。

(3)培育具有镉超富集性的植物新品种：将本发明金属镉结合蛋白A3AGZ4编码基因转化到植物细胞或组织中，培育筛选得到能够有效富集或吸附土壤中镉的植物新品种；将这些镉超富集性的植物新品种种植到含有镉的土壤中，通过植物修复的方式对土壤中的镉进行降解或吸附；譬如，将本发明金属镉结合蛋白A3AGZ4编码基因可操作的与植物表达载体连接后转化到植物细胞或组织中，通过培育筛选得到对镉富集性强、转运系数大的植物新品种，将这些对镉超富集性的植物新品种种植在镉污染的土壤中可达到修复土壤的效果；所述的植物包括单子叶植物或双子叶植物。

在本发明中，可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等。

将本发明的SEQ ID No.2所示的基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴。含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。

通过本发明所披露的方法获得的转基因植物细胞和植物也可以进一步用于后续的转化程序中，例如用来引入其它的嵌合基因。

本发明所述水稻来源的金属镉结合蛋白A3AGZ4，来源于水稻自身，利用异源表达该金属镉结合蛋白基因来降低水稻稻谷中的镉含量，安全且可靠。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明分离鉴定了一种对重金属镉具有结合亲和力的水稻来源的金属镉结合蛋白A3AGZ4。本发明在大肠杆菌中异源表达该金属镉结合蛋白基因，可以在重金属镉存在条件下快速高效的降低镉的含量。本发明所述水稻来源的金属镉结合蛋白A3AGZ4，其蛋白序列和氨基酸组成与现有的金属硫蛋白MTs差异很大，且该蛋白来源于水稻自身，利用异源表达该金属镉结合蛋白基因来降低水稻稻谷中的镉含量，安全且可靠。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“可操作地连接”指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区可以相对于编码感兴趣表达产物的核酸序列如此安置，从而所述核酸序列的转录由该启动子区指导。因此，启动子区“与该核酸序列可操作地连接”。

术语“转化”在此指的是用于将异源DNA引入到植物细胞、植物组织、或植物中的过程。转化植物细胞、植物组织、或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，也包括其子代。

术语“转化”、“转基因”、和“重组体”在此指的是其中已经被引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体例如细菌或植物细胞(例如植物)。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以以染色体外分子的形式存在。这样一种染色体外分子可以是自我复制的。转化细胞、组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，还包括其转基因子代。“未转化”、“未转基因”、或“未重组的”宿主指的是野生型生物体例如细菌或植物，它不包含异源核酸分子。

术语“异源”指衍生自不同来源的两个或更多个核酸序列或蛋白质序列之间的关系。例如，启动子相对于可操作地连接的核酸序列(如编码序列)是异源，如果这种组合正常情况下不存在于自然界中。此外，特定序列可以相对于插入该序列的细胞或生物是“异源”的(即不天然存在于这种特定细胞或生物中)。例如，本文所披露的嵌合基因是异源核酸。

术语“启动子”指下述的任何核酸序列(如DNA序列)：这种序列在转录起始期间被DNA依赖性RNA聚合酶识别并(直接或间接)结合，导致生成与转录的DNA互补的RNA分子；这种区域也可以称作“5'调节区”。启动子通常位于在待转录的编码序列前方存在的5'非翻译区(UTR)的上游并且具有多个区域，这些区域充当RNA聚合酶II和其他蛋白质如转录因子的结合位点以引发可操作地连接的基因的转录。启动子本身可以含有调节可操作地连接的基因的转录的子元件(即启动子基序)如顺式元件或增强子结构域。该启动子和连接的5'UTR也称作“启动子区”。

附图说明

图1为重组载体a3agz4-pET30a构建流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1水稻来源的金属镉结合蛋白A3AGZ4的分离与鉴定

水稻种子(秋田小町，由沈阳农业大学水稻研究所提供)经H₂O₂(10％)和NaClO(0.1％)分别浸泡30min和10h后，用去离子水清洗干净，置于孵化箱中30℃，育苗24h。种苗在石英砂盘中继续培育，当出现第三片叶子时，选取株高相似的种苗移栽入30L(30×30×40cm)的土盆中，每盆3穴，每穴2株。土壤镉含量为100mg/kg。大棚中常规培育至成熟后，收获稻谷样品。取100g含镉大米粉用500ml正己烷浸泡2次，每次4h，弃去上层有机相，在通风厨内通风挥发24h，得到脱脂米粉样品。在室温条件下，称取15g干燥后的脱脂大米粉，用150mLTris-HCl水溶液提取可溶性蛋白。

镉亲和柱制作：金属螯合亲和层析是一种有效的蛋白质分离纯化方法，其原理是利用Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺等过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸、色氨酸或半胱氨酸配位结合。本实验采用金属鳌合介质Ni-IDA，用强螯合剂0.1mol/L EDTA溶液将金属鳌合介质上的Ni²⁺洗去，再将没有螯合金属离子的介质置于0.05mmol/L Cd(NO₃)₂溶液中，使Cd螯合到介质上，用去离子水洗掉游离的Cd²⁺得到金属鳌合介质Cd-IDA。

将制备好的Cd-IDA金属螯合介质装柱(

CV＝10.0mL)，连接到层析系统中，利用IMAC平衡缓冲液冲洗5个柱体积，将制备好的水稻可溶性蛋白质样品上样，流速为0.5mL/min，流穿液达到饱和后停止上样，用IMAC脱缓冲液(0.05mol/L Tris-HCl+0.15mol/L NaCl⁺0.5mol/L咪唑，pH 7.4)洗脱，收集洗脱蛋白质峰，进一步通过质谱鉴定和分析后，得到编号为A3AGZ4的蛋白(其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示)，其分子量为28.82kDa，占水稻籽粒镉结合蛋白总量的1.56％，是一种功能未知蛋白(uniprot数据库显示为Putative uncharacterized protein OS＝Oryza sativa subsp.japonica GN＝OsJ_10480PE＝4SV＝1)。

实施例2镉结合蛋白基因a3agz4在大肠杆菌中的表达

为了进一步验证分离鉴定出来的镉结合蛋白A3AGZ4是否有结合镉的功能，将蛋白基因序列构建在大肠杆菌表达载体pET30a上，转入大肠杆菌表达菌株ΔzntA-BL21中，通过测定重组菌株镉去除力评估该基因是否有功能。

构建之前对该蛋白序列进行跨膜螺旋预测(预测网站http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)，发现该蛋白序列第1-6位氨基酸于膜内，7-24位是跨膜螺旋区，25-258区域位于膜外。为避免膜蛋白难表达，选取蛋白A3AGZ4 25-258区域进行合成，编码该蛋白基因序列经优化后在南京金斯瑞公司合成，其基因序列为SEQ ID No.2所示。

合成的基因a3agz4经限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切，同时载体pET30a也使用Kpn I和Xho I双酶切处理，回收后的目的片段a3agz4和载体pET30a通过T4DNA连接酶连接。具体的构建流程如图1所示。将连接体系转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，挑取阳性克隆子送测序公司测序。将测序正确的克隆子提取质粒转化大肠杆菌表达菌株ΔzntA-BL21，再次对其阳性鉴定。得到的重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21用于下一步评估其镉去除率。

同时来源于小鼠的金属硫蛋白MTs的编码基因mt作为对照基因，该基因来自文献Valls,M.,Atrian,S.,de Lorenzo,V.,Fernández,L.A.Engineering a mousemetallothionein on the cell surface of Ralstonia eutropha CH34forimmobilization of heavy metals in soil.Nature biotechnology 18,661-665(2000)。该基因经优化后在南京金斯瑞公司合成，其基因序列为SEQ ID No.3所示。

按上述重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21的构建流程同时构建重组菌株mt-pET30a:ΔzntA-BL21，也用于下一步评估其镉去除率。

此外重组菌株pET30a:ΔzntA-BL21作为阴性对照，也用于下一步评估其镉去除率。

实施例3重组大肠杆菌a3agz4/mt-pET30a:ΔzntA-BL21镉去除率的评估

将重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21和mt-pET30a:ΔzntA-BL21接种于3mL50μg/mL Kana抗性的LB液体培养基中，37℃200rpm过夜培养，第二天以1％的接种量转接至50mL 50μg/mL Kana抗性的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养约2h至OD₆₀₀≈0.6左右取出，加入终浓度为0.1mM IPTG和终浓度为0.05mM CdCl₂，混匀后取出适量菌液立即13000rpm离心10min，留上清液待测镉含量(此时测定的镉含量为初始加入的镉浓度)。剩余菌液于30℃200rpm诱导12h后取出测定其OD值及培养基上清镉残余含量(此时测定的镉含量为诱导12h培养基上清残余的镉浓度)。镉含量检测方式为：取适量菌体，13000rpm离心10min，取上清液用0.6mM HCl稀释合适浓度后经原子吸收分光光度计测定其残余镉含量。每个处理3个平行。

镉去除率计算公式为：

镉去除率C＝100-A/B*100

A为诱导12h培养基上清残余的镉浓度；

B为培养基中初始加入的镉浓度。

其结果见表1。

表1重组大肠杆菌a3agz4/mt-pET30a:ΔzntA-BL21镉去除率

由表1可以看出，相同培养条件下，对照菌株pET30a:ΔzntA-BL21镉的去除率为13.61％，而重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21和mt-pET30a:ΔzntA-BL21镉的去除率分别为59.13％和47.47％。说明金属硫蛋白MTs和金属结合蛋白A3AGZ4都有镉结合能力，且在大肠杆菌中，来源水稻的金属结合蛋白A3AGZ4结合能力较来源于小鼠的金属硫蛋白MTs略强，说明水稻来源的金属结合蛋白A3AGZ4同样可以起到镉结合的作用。

实施例4重组大肠杆菌a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21不同镉浓度条件下镉结合力评估

为了进一步探索将重组菌株a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21镉的最大结合能力，测定其在不同镉浓度条件下镉残余量。首先将重组菌株接种于50μg/mL Kana抗性的LB液体培养基中，37℃200rpm过夜培养，第二天以1％的接种量转接至50mL 50μg/mL Kana抗性的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养约2h至OD₆₀₀≈0.6左右取出，加入终浓度为0.1mM IPTG和终浓度分别为0.01mM、0.03mM、0.05mM、0.07mM和0.09mM的CdCl₂，混匀后取出适量菌液立即13000rpm离心10min，留上清液待测镉含量(此时测定的镉含量为初始加入的镉浓度)。剩余菌液于30℃200rpm诱导12h后取出测定其OD值及培养基上清镉残余含量(此时测定的镉含量为诱导12h培养基上清残余的镉浓度)。镉含量检测方式为：取适量菌体，13000rpm离心10min，取上清液用0.6mM HCl稀释合适浓度后经原子吸收分光光度计测定其残余镉含量。每个处理3个平行。

镉结合浓度计算公式为：

镉结合力D＝A-B

A为诱导12h培养基上清残余的镉浓度；

B为培养基中初始加入的镉浓度。

其结果见表2。

表2重组大肠杆菌a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21不同镉浓度条件下镉结合力

由表2可以看出，重组大肠杆菌a3agz4-pET30a:ΔzntA-BL21在0.01mM、0.03mM、0.05mM、0.07mM和0.09mM的CdCl₂条件下镉结合浓度分别为0.00671mM、0.0202mM、0.0252mM、0.0273mM和0.0251mM，说明该重组菌株最大结合的镉浓度约为0.025mM，培养基中添加0.05mM即达到饱和。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 水稻来源的金属镉结合蛋白及其编码基因和应用

<130> BJ-2002-171022A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 234

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 1

Glu Gly Lys Lys Gly Gly Lys Val Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Glu Ser

1 5 10 15

Leu Cys Pro Tyr Ser Ala Met Phe Val Val Gly Ser Leu Ala Lys Val

20 25 30

Phe Arg Asp Gly Leu Leu Asp Ala Val Asp Leu Ser Leu Val Pro Tyr

35 40 45

Gly Asn Ala Arg Val Lys Asp Gly Lys Ile Ser Cys Gln Val Glu His

50 55 60

Gly Ser Glu Glu Cys Phe Leu Asn Thr Val Glu Ala Cys Ala Ile Asp

65 70 75 80

Ala Trp Pro Asp Leu Arg Val His Phe Arg Phe Ile Tyr Cys Val Glu

85 90 95

Asp Leu Val Val Asn His Lys Gln Arg Glu Trp Glu Ser Cys Phe Gly

100 105 110

Lys Leu Asn Leu Asp Pro Lys Pro Val Thr Asp Cys Tyr Lys Gly Glu

115 120 125

Arg Gly His Gln Leu Ser Leu Lys Tyr Gly Arg Gln Thr Asp Ala Leu

130 135 140

Gln Pro Pro His Lys Tyr Val Pro Trp Val Val Val Asp Gly Gln Pro

145 150 155 160

Leu Tyr Glu Asp Tyr Glu Asn Phe Glu Ala Tyr Ile Cys Lys Ala Tyr

165 170 175

Lys Gly His Pro Pro Lys Val Cys Glu Gly Leu Ala Arg Pro Pro Thr

180 185 190

Pro Thr Val Leu Glu Val Ala Glu Ala Val Asn Arg Val Ser Tyr Tyr

195 200 205

Asp Ser Gly Asp Ile Arg Leu Lys Pro Asp Glu Asp Gly His Ala Lys

210 215 220

Ile Lys Lys Val Val Pro Asp Asp Asp Asp

225 230

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 2

gaagggaaga agggtggcaa agtggatgtt gcgctatatt acgaatccct gtgtccatat 60

tcggcgatgt tcgtggtcgg atcgctggca aaggtgtttc gcgacggtct gctggatgct 120

gtcgatttat ctctggtgcc ttatggcaac gcgcgtgtga aagatggaaa aatatcttgc 180

caggttgagc acggcagcga ggaatgtttt ttaaacaccg tcgaagcatg cgcgattgac 240

gcctggccag atctgcgcgt acatttccgt ttcatatact gtgtggaaga cttagtggtc 300

aaccacaagc agcgcgagtg ggagtcctgt ttcggtaaat taaatctcga tccgaagcct 360

gtaaccgact gttacaaggg cgagcgaggg catcagctgt cattaaaata tggtcggcaa 420

acagacgcgc tccaaccacc tcataagtat gtaccctggg tagttgtcga tggtcagcct 480

ctttatgagg actatgaaaa tttcgaggcg tatatctgta aggcgtataa gggacatccg 540

ccaaaggtct gtgaaggttt agcgagaccg ccaacgccga ccgtactgga ggtggcggag 600

gcagtaaatc gcgtgtctta ttatgattct ggcgatatcc gcttaaaacc agacgaagac 660

ggtcatgcaa aaataaagaa agtagtccct gacgacgatg actaa 705

<210> 3

<211> 186

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 3

atggatccga actgcagttg ttccaccggc ggttcctgca cctgtacgag ctcttgcgcc 60

tgtaaaaatt gcaaatgtac gagctgcaaa aaatcatgct gttcgtgctg tccggtgggc 120

tgctctaaat gtgcacaggg ctgcgtttgt aagggtgcgg ccgacaaatg tacctgctgt 180

gcttaa 186

Claims

1.一种水稻（Oryza sativa）来源的金属镉结合蛋白或其编码基因在降低镉污染土壤中镉含量中的应用，其中，所述金属镉结合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：将所述编码基因转化到微生物菌株中构建得到重组工程菌株，将所述重组工程菌株施到镉污染的土壤中。